Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

Genetik değişikliğe veya in vivo ilaç tedavisine yanıt olarak tümörlerin davranışının analizi, kanser araştırmalarının önemli bir unsurudur 1,2,3,4. Bu tür çalışmalar çoğunlukla bağışıklığı baskılanmış fare (Mus musculus) modellerinin^{kullanımını içerir 5}; Bununla birlikte, farelerde ksenotransplantasyon çalışmaları, sınırlı kapasite, uzun süre, önemli masraf ve iç tümörlerin ilerlemesini izlemek için sofistike görüntüleme ekipmanı gereksinimi dahil olmak üzere birçok açıdan sınırlıdır ^6,7. Buna karşılık, zebra balığı modeli (Danio rerio) daha fazla kapasite, daha kısa süre, daha düşük masraf ve şeffaflıkları sayesinde hastalığın ilerlemesinin basit bir şekilde izlenmesini sağlar ^8,9.

Zebra balığı, rahim dışı gelişimi ve yüksek doğurganlığa sahip, bireysel dişilerin 100'den fazla embriyo ürettiği iyi gelişmiş bir omurgalı model sistemidir¹⁰. Ayrıca, zebra balığı embriyoları şeffaftır ve raportörler gibi floresanla ilgili teknikler kullanılarak gelişimsel süreçlerin kolayca görselleştirilmesini sağlar. Son olarak, kritik gelişimsel süreçlerin korunması, onları nakledilen malign hücrelerin davranışı da dahil olmak üzere birçok çalışma türü için ideal bir model haline getirir^11,12. Yabani tip zebra balığı embriyoları, onları 2 haftalıkken optik olarak opak hale getiren melanositler geliştirir, ancak bu, casper embriyolarının üretilmesiyle aşılmıştır (Roy^A9; Mitfa^W2), yaşam boyu saydam kalan¹³. Optik özellikleri nedeniyle, casper zebra balığı, nakledilen tümör hücrelerinin ideal alıcılarıdır 14,15,16. Tümör hücrelerinin zebra balığına ksenotransplantasyonu son 2 yılda önem kazanmıştır ^{17,18,19,20,21}. Zebra balığı embriyoları doğuştan gelen bağışıklığa sahiptir; Bununla birlikte, larva evrelerinde adaptif bağışıklıktan yoksundurlar, bu da onları fonksiyonel olarak bağışıklığı baskılanmış hale getirir, bu da nakledilen tümör ksenogreftleri için etkili konakçılar olarak hizmet etmelerini sağlar²².

Zebra balığı embriyolarında ve bir dizi farklı değişkeni dikkate alan yetişkinlerde tümör aşılaması için protokoller geliştirilmiştir 23,24,25,26,27. Bunlar, yumurta sarısı, peri-vitellin boşluğu ve kalbe yapılan enjeksiyonlar dahil olmak üzere zebra balıklarında ve farklı gelişim aşamalarında çok sayıda tümör birikimi bölgesini araştırmıştır ^16,28. Zebra balığı yetiştiriciliği tipik olarak 28 °C'de gerçekleşirken, memeli hücreleri 37 °C'de büyüdüğü için zebra balığı ksenogreftleri için su ürünleri yetiştiriciliğinin ortam sıcaklığı da önemlidir. Sonuç olarak, balık tarafından tolere edilen ancak tümör büyümesini destekleyen bir uzlaşma sıcaklığı kullanılmalıdır ve 34 ° C'nin her iki hedefe de ulaştığı görülmektedir²⁹. Ksenotransplantasyonu takiben tümörlerin davranışının ve ilerlemesinin analizi bir diğer önemli odak alanıdır ve bu, sağkalım analizinin yanı sıra çeşitli görüntüleme modalitelerinin kullanımını içerir³⁰. Zebra balığı modelinin en büyük avantajlarından biri, tümör davranışının in vivo çalışmalarına muazzam istatistiksel güç sağlamak için çok sayıda çalışma hayvanının mevcudiyetidir; Bununla birlikte, önceki yaklaşımlar, enjeksiyonlar için sıkıcı montaj prosedürlerinin gerekliliği nedeniyle bu potansiyeli ciddi şekilde sınırlamıştır.

Burada, şeffaf casper zebra balığı hattını kullanarak yüksek verim ve enjeksiyon kalitesinin izlenmesini sağlayan embriyoları evrelemek için basit ve hızlı bir yöntem geliştirerek bu sınırlamayı ele alıyoruz. Bu, döllenmeden 2 gün sonra (dpf) casper zebra balığı embriyolarının yumurta sarısı kesesine ksenogreftlerin enjekte edilmesini gerektirir. Tümör davranış analizinin bir parçası olarak ksenotransplantasyonu takiben embriyoların sağkalımını gözlemliyoruz. Ayrıca, tek hücreli süspansiyonlar yaparak ve akış sitometrisi ile analiz ederek ksenotransplantasyon sonrası hastalık yükünün değerlendirmesini gösteriyoruz (Şekil 1).

Zebra balığı bakımı, beslenmesi ve yetiştirilmesi,³¹ açıklandığı gibi 28,5 ° C'de standart su ürünleri yetiştiriciliği koşulları altında gerçekleşmiştir. Zebra balığı ile ilgili tüm deneyler bu sıcaklıkta yapıldı; bununla birlikte, ksenotransplantasyonu takiben hayvanlar, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak deney süresince 34 °C'de kültürlendi.

1. Üreme (enjeksiyondan 3 gün önce)

1. Hayvan sağlığını en üst düzeye çıkarmak ve üreme çiftleri tarafından üretilen embriyo sayısını artırmak için üremeden bir hafta önce balık çiftlerine kuru yem (ekstra yem; balık başına 5-6 granül) sağlayın.
2. Embriyo hasadından önceki akşam, damızlık hayvanları, her erkek için 2 dişinin harem çiftleşmelerini kullanarak, erkek ve dişi balıkları ayıran bir bölücü ile üreme tanklarına yerleştirin.
   NOT: Kol başına 100 hayvanın 4 kolu ile yapılan deneyler için, deney başına 20 üreme çifti kullanın. İhtiyaç duyulan üreme çiftlerinin sayısını belirlemek için, casper üreme çifti başına 50 embriyo iyi bir tahmindir. Diğer bir seçenek de daha sağlam, pigmentli bir zebra balığı türü kullanmak ve pigmentasyonu önlemek için 1-fenil 2-tiyoüre (PTU) ile muamele etmektir³¹. Pratikte, deney, enjeksiyondan 1 gün sonra (dpi) istenen sayının iki katı enjekte etmek için yeterli embriyoya sahip olacak şekilde ölçeklendirilmelidir.

2. Embriyo toplama (enjeksiyondan 2 gün önce)

1. Ertesi sabah, bölücüleri çıkarın ve balığın üremesine izin verin.
2. Bölücüleri çıkardıktan 20 dakika (dk) sonra tanklardaki embriyoları görselleştirin.
3. Embriyoları, Zebra Balığı Kitabı^31'de anlatıldığı gibi yapılmış embriyo suyu içeren 90 mm'lik bir Petri kabında bir elek kullanarak toplayın.
   1. Embriyo suyu yapmak için, 1 L damıtılmış suya 1,5 mL stok tuzu ve %0,1 finale kadar metilen mavisi ekleyin. 40 g deniz tuzunu (Malzeme Tablosu) 1 L damıtılmış suda çözerek stok tuz çözeltisini yapın. Embriyo suyunun iyonik bileşimi K⁺ (0.68 mg/L), Cl^- (31.86 mg/L), Na⁺ (17.77 mg/L), SO₄^- (4.47 mg/L), Mg₂⁺ (2.14 mg/L) ve_Ca2⁺ (0.68 mg/L).
4. Zebra balığının bir saat daha üremesine ve elde edilen embriyoları toplamasına izin verin.
5. Deney için embriyoları bir araya getirin.
6. Akşamları, anormal morfolojileri ile tanınabilen tüm döllenmemiş veya ölü embriyoları çıkarın ve taze embriyo suyu sağlayın.

3. Embriyo bakımı ve enjeksiyonlar için alet hazırlığı (enjeksiyondan 1 gün önce)

1. Ertesi sabah, fazladan ölü embriyoları çıkarın ve taze embriyo suyu sağlayın.
2. %1.5'lik agarozu embriyo suyunda ısıtarak bir agaroz plakası hazırlayın ve ısıtılmış karışımı 90 mm'lik bir Petri plakasına dökün. 90 mm'lik bir tabak 30-35 mL karışım gerektirir.
3. İğne çekiciyi kullanarak filament olmayan iğneleri cam kılcal damarlardan (Borosilikat) çekin. İğneler çekilir (ısı basıncı altında) kapalı bir uç oluşturur; Optimal bir delik oluşturmak için bunları forseps ile kırpın. Birim zamanda yer değiştiren sıvının hacmini belirleyerek iğne deliğinin uygunluğunu değerlendirin (aşağıya bakınız, bölüm 6.3).
   NOT: Cam kılcal damarlar, merkezi filamentli veya filamansız olarak satın alınabilir. Hücre enjeksiyonları için merkezi filamentleri olmayan kılcal damarlar tercih edilir.
4. İğneleri, kullanılana kadar kil (çocuk modelleme kili) kullanılarak yapılan oluklara 90 mm'lik kapalı bir Petri plakasına yerleştirin (Şekil 2A).

4. Lösemi hücrelerinin CM-Dil ile hazırlanması ve etiketlenmesi (enjeksiyon günü)

1. Nakledilecek hücreleri, büyümeleri için en uygun koşullar altında tutun. Burada kullanılan murin lösemi hücreleri ya yeterliydi (M82; Rpl22+/+) veya eksik (M109; Rpl22-/-) bir tümör baskılayıcı olarak işlev gören ribozomal protein Rpl22 için³².
2. 50 mL'lik bir konik tüpte pelet hücreleri. Sayın, ardından oda sıcaklığında (RT) 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
   NOT: İhtiyaç duyulan hücre sayısı deneysel kapsam ve koşullar tarafından belirlenecektir, ancak 1 x 10⁶ hücre iyi bir başlangıç noktasıdır.
3. CM-Dil boyama gerçekleştirin
   NOT: CM-Dil boyama, enjeksiyon bolusunun izlenmesini sağlar.
   1. 50 μL'lik bir CM-Dil şişesini 50 μL dimetil sülfoksit (DMSO; 1 mg / mL veya ~ 1 mM final) içinde yeniden süspanse ederek bir CM-Dil stok çözeltisi yapın.
   2. Kullanılacak hücrelerin ihtiyaç duyduğu destekleyici takviyeleri içeren% 1 fetal sığır serumu (FBS) / Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içindeki stoğu (4.8 μL leke / mL) seyrelterek çalışan bir çözelti üretin.
4. Lekenin çalışma çözeltisinde hücreleri 1 x 10⁶/100 μL'de yeniden süspanse edin.
5. 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.
   NOT: Boyama koşulları, kullanılan hücreler için optimize edilmelidir (zaman vb.). Burada kullanılan hücreler, optimum boyamayı elde etmek için farklı sıcaklıklarda iki ayrı 10 dakikalık inkübasyon gerektiriyordu.
6. Oda sıcaklığında (RT) 10 mL 1x HBSS ile yıkayın.
7. Pelet hücreleri (RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme), süpernatanı boşaltın, ardından 10 mL HBSS ile yeniden süspanse edin ve ikinci bir yıkama için aynısını tekrarlayın.
8. Lekeli tümör hücrelerini% 1 FBS / PBS'de 40.000 hücre / μL'de ve gereken destekleyici takviyeleri yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu enjeksiyona kadar 34 ° C'de tutun.
   NOT: Bu çalışmada kullanılan hücre hatlarının bakımı için destekleyici takviyeler gerekliydi (ör.% 1 FBS ve sitokinler). Takviyelerin ve ksenotransplantasyonun, incelenen belirli hücre hatlarına uyarlanması gerekebilir. Yumurta sarısında herhangi bir potansiyel toksisiteyi önlemek için ortam yerine burada PBS seçildi.

5. Dekoryonasyon

1. Casper zebra balığı embriyolarını, ışık mikroskobunda 2x büyütme altında insülin enjeksiyon şırıngaları kullanarak 2 dpf'de manuel olarak dekoryonlayın. Koryonu hareketsiz hale getirmek için diğer iğneyi kullanırken bir iğne ile koryonu delin.
   NOT: Dekoryonasyon için pronaz kullanılması önerilmez çünkü bazen embriyo sağlığının azalmasına neden olur. Embriyoların 2 dpf'de dekoryonlanması daha kolay olduğu ve embriyoların önceki zamanlara göre daha az kırılgan olduğu için (1 dpf) tercih edilir.
2. Dekoryonlama sırasında embriyolara iğnelerle dokunmamaya dikkat edin. İğnelerle yanlışlıkla temas ederek embriyoların sarısına dokunmak veya zarar vermek ölüme neden olabilir.
3. Embriyo suyunu değiştirerek soyulmuş koryonları çıkarın.

6. Mikroenjektör ve iğnenin ayarlanması

1. Mikroenjektörü ve pompayı açın ve hücrelerin mikroenjeksiyonları için uygun koşulları ayarlayın. 9-11 psi'lik bir enjeksiyon basıncı ve 0,5 saniyelik (s) bir enjeksiyon süresi, iğneyi kırpmak ve deliği ayarlamak için iyi bir başlangıç noktasıdır.
2. Tümör hücre hattı süspansiyonunu (~ 5 μL) tek bir geçişte dikkatlice mikroiğneye yükleyin ve iğne içindeki hücre akışını bozacak hava kabarcıklarının oluşmasını önleyin.
3. 0.2-0.3 s'de 10-15 nanolitre (nL) hücre süspansiyonunun atılmasını destekleyecek bir delik oluşturmak için iğnenin ucunu forseps (Dumont numarası 5) ile kesin.
   NOT: Yukarıdaki nL hacim hesaplaması, 1 mm = 30 nL olan kalibrasyon kılcal damarları kullanılarak yapılır. Kısacası, zamanı 0,5 saniyeye ayarlayın ve iğnenin her klibinden sonra, enjekte edin ve kalibrasyon kılcal damarındaki hacmi toplayın. Daha sonra toplanan hacmin uzunluğu mikroskop altında ölçek kullanılarak ölçülür ve 0,5 saniyede 30 nL enjekte edildiğinde iğne kliplenmesi durdurulur. Ardından, enjeksiyon süresini 0.2-0.3 s olarak ayarlayın (~ 10-15 nL hücre enjekte ederek)

7. Enjeksiyon için embriyo hazırlığı

1. Mikroskop altında sağlıklı embriyoları seçin, kalp ödemi veya kısa veya kavisli gövde gibi gelişimsel anomalileri olanları ayıklayın.
2. Trikain metansülfonat (MS-222; 0.16 g / L embriyo suyu) kullanarak embriyoları 90 mm'lik bir Petri plakasında 1 dakika boyunca uyuşturun.
3. Embriyoları almak için bir cam Pasteur pipeti kullanın. 10-15 embriyoyu %1.5 agaroz plakası üzerinde yanal pozisyonda düzenleyin (Şekil 2B-D).
4. Pasteur pipetini kullanarak fazla suyu alın ve embriyoları canlı tutmak için gereken minimum miktarda embriyo suyu bırakın.

8. Enjeksiyon prosedürü

1. Hücrelerin iğnenin ucunda biriktiğinden emin olmak için ışık mikroskobu altında kontrol edin.
2. Kalibre edilmiş iğneyi kullanarak 0.2-0.3 s (400-600 hücreye karşılık gelen 10-15 nL ile) embriyoların sarısına embriyoları enjekte edin.
3. Tüm embriyolar için enjeksiyonu tekrarlayın, ardından bunları taze embriyo suyunda toplayın.
   NOT: Hücreler iğne ucunda birikme eğiliminde olduğundan, ucun her 15-20 enjeksiyonda bir hafifçe kırpılması gerekecektir. Bu aynı zamanda, benzer bir hacmin enjekte edilmesini sağlamak için her yeniden kırpmada basıncın ve sürenin sıfırlanmasını gerektirecektir.
4. Aktarılan iki farklı hücre kümesinin davranışının karşılaştırılmasının geçerli olduğundan emin olmak için, aktarılan hücrelerin bolusunu izleyin. Bunu, enjeksiyondan 1 saat sonra (hpi) embriyoları CM-Dil boyamasına (RFP kanalında) göre sıralayarak, optimal boyamaya ("iyi bolus") sahip olanları alt boyamaya sahip olanlardan ("inferior bolus") ayırarak yapın; Şekil 3, sarı ok).
5. Embriyoları daha düşük bir bolusla atın veya farklı bir hücre dozunun hastalığın ilerlemesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanın.
6. Ölümleri tümör büyümesinden ziyade enjeksiyon travması ile ilgili olduğundan, günün sonunda ölü embriyoları çıkarın. Hücreler muhtemelen enjeksiyon bölgesinden sızdığı için hücreleri tutmayan embriyoları analizden çıkarın.
7. Enjekte edilen embriyoları, deney süresince 34 ° C'de, plaka başına ~ 60 embriyo bulunan 90 mm'lik bir tabakta tutun.
   NOT: 5 dpf'den sonra, yumurta sarısı büyüyen embriyolar tarafından tüketilmiş olacaktır, bu nedenle embriyolara deney süresince paramesyum gıdası sağlanmalıdır. Doğru beslenmeyi sağlamak için, embriyolara günlük olarak 6 dpf (4 dpi) ila 9 dpf (7 dpi) arasında paramecia verilmelidir. Paramecia, tarif edildiği gibi optimum beslenme ve sıcaklık koşulları altında şişelerde kültürlenerek çoğaltılır³¹.

9. Hayatta kalma analizi

1. Embriyo suyunu günlük olarak değiştirerek sonraki 7 dpi için embriyoları izleyin. Çalışma ilaç tedavisini içeriyorsa, su değişimleri kolaylık sağlamak için alternatif günlere düşürülebilir.
2. Analiz süresince embriyo sağlığını kontrol edin ve ölüm puanını alın.
   NOT: Bu deney için deney süresi 7 gündü, ancak ksenotransplante edilen tümörün agresifliğine bağlı olarak daha kısa veya daha uzun olabilir.
3. Hastalık yükünü değerlendirmek için CM-Dil floresansını kullanın (Şekil 4A) ve Kaplan Meier analizini kullanarak genetik değişikliklerin veya ilaç tedavilerinin sağkalım üzerindeki etkisini belirleyin ve grafiksel olarak tasvir edin (örneğin, GraphPad Prism ile; Şekil 4B) ³³.

10. Akış sitometrisi analizi için embriyoların tek hücreli süspansiyonu

NOT: Hastalık yükü, ksenotransplantasyon sonrası akış sitometrisi analizi ile değerlendirilebilir; Bununla birlikte, bunu yapmak, tümör hücrelerinin silinmez bir şekilde işaretlenmesini gerektirir. Retroviral veya lentiviral olarak verilen kırmızı floresan proteini (RFP) veya mCherry, yeşil floresan proteinden gelen sinyali gizleyen zebra balığı hücrelerinin otofloresansı üzerinde iyi bir sinyal sağladığı için etkilidir.

1. Embriyoları tercih edilen dpi aşamasında izole edin. Burada 5 dpi görüntülenir (Şekil 5).
2. Başlangıç noktası olarak koşul başına 30-40 embriyo toplayın, ancak embriyo sayısı, nakledilen hücrelerin evresine ve agresifliğine bağlı olarak değişebilir. Embriyoları yukarıda tarif edildiği gibi uyuşturun.
   NOT: Embriyolar, burada gösterildiği gibi istatistiksel anlamlılık sağlamak için kopyalar olarak alt bölümlere ayrılabilir (Şekil 5B).
3. Embriyoları 1.5 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın.
4. Sarısı çözmek için numune başına 100 μL kalsiyum içermeyen Ringer solüsyonu (tarif³¹) kullanın, çünkü düşük kalsiyum embriyonik dokuları yumuşatır ve daha etkili doku ayrışması sağlar.
5. 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak yumurta sarısını çıkarmak için 5 dakika boyunca aralıklı olarak yukarı ve aşağı pipetleyin.
6. % 0.05 tripsin / PBS'yi (fenol kırmızı göstergesi olmadan) 29 ° C'ye önceden ısıtın ve mL Tripsin çözeltisi başına 27 μL kollajenaz IV (100 mg / mL) ile destekleyin. Her embriyo örneği için 1 mL çözelti hacmine ihtiyaç duyulacaktır.
7. Sarısı alınmış embriyoların her örneğine 1 mL tripsin / kollajenaz çözeltisi ekleyin ve 29 ° C'de 30-35 dakika inkübe edin.
8. Embriyoların yapısı (omurga) artık görünmeyene kadar her 5 dakikada bir 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak embriyoları bu solüsyonda yukarı ve aşağı pipetleyin.
9. 200 μL FBS kullanarak reaksiyonu durdurun.
10. İyice karıştırın ve tripsinin tamamen inaktivasyonunu sağlamak için 29 ° C'de 5 dakika daha inkübe edin.
    NOT: 37 °C'de meydana gelen zebra balığı hücrelerinin ısı şokuna bağlı ölümünü önlemek için doku ayrışma protokolü için 29 °C'lik bir sıcaklık kullanılır; bununla birlikte, zebra balığı hücrelerinin korunması gerekmiyorsa, sindirim 37 ° C'de gerçekleştirilebilir.
11. Hücre süspansiyonunu 300 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca pelet haline getirin ve süpernatanı atın.
12. Hücre peletini 4 °C PBS'de ve peleti yukarıdaki gibi yeniden süspanse edin.
13. Yıkamayı tekrarlayın, ardından hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
14. Pelet ve akış sitometrisi analizi için boyamaya devam edin.
    NOT: Birincil zebra balığı hücrelerinin kültürü gerekiyorsa, 4 °C PBS ile iki kez daha yıkayın ve L15 ortamında (antibiyotikler ve% 10 FBS ile) yeniden süspanse edin.

11. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS): Ksenotransplante edilen hücrelerin boyanması ve sınıflandırılması

1. Hücre süspansiyonunu bir boyama ortamında (% 1 FBS'li HBSS) ve 5 dakika boyunca 300 x g'da pelet halinde yeniden süspanse edin.
2. Nakledilen hücreleri zebra balığı hücrelerinden ayırt etmek için ikinci bir belirteç (RFP veya mCherry'ye ek olarak) sağlamak için nakledilen hücrelerle reaktif bir antikor ile boyama ortamındaki hücre peletini yeniden süspanse edin. Burada, numune başına 50 μL anti-fare CD45 (APC-CD45) 1:50 seyreltmede kullanılmıştır (Şekil 5).
3. Bağlanmamış antikoru çıkarmak için yukarıdaki gibi 1 mL boyama ortamı ile yıkamadan önce 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
4. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini, canlı/ölü ayrımını sağlayacak hayati boya Helix NP Blue (1 μM) içeren 200 μL boyama ortamında yeniden süspanse edin.
5. Akış sitometrisi analizi için hücre karışımını 5 mL yuvarlak tabanlı polikarbonat tüplere aktarın.
   NOT: Bir tümör hücresi kontrolünün paralel olarak boyanması, akış sitometrisi analizi sırasında kapıların çizilmesi için netlik sağlar.

12. Akış sitometrisi

1. Parametreleri ayarlamak için düşük bir akış hızı (saniyede 500 olay veya daha az) kullanan akış sitometresini açın.
2. FSC (ileri saçılma), SSC (yan saçılma), BV421/CasB (canlılık), CE-594 (mCherry) ve APC (CD45.2) kanallarının voltajını ayarlamak için tümör hücresi kontrolünü (ksenotransplantasyon için kullanılan hücrelerin aynısı) kullanın.
   NOT: Farklı lekeler arasındaki florokrom örtüşmesini ortadan kaldıran telafi ayarlarını oluşturmak için tek tek lekeli numuneler gerekecektir.
3. Hem nakledilen hem de zebra balığı hücrelerini barındıran ayarlar oluşturmak için enjekte edilmemiş embriyo örneğini kullanın.
4. Akış hızını saniyede 8000 olaya yükseltin ve her örnek için 1 milyon olay kaydedin.
5. Elde edilen verileri uygun analiz yazılımı kullanarak analiz edin, önce FSC-H v/s FSC-A'yı (yükseklik v/s alanı) çizerek tekilleri seçin, ardından canlı hücreleri seçmek için bir çizim yapın. FlowJo yazılımı bu tür analizler için yaygın olarak kullanılmaktadır.
6. Tümör hücresi kontrolünü kullanarak, FSC-A v/s SSC-A ile nakledilen hücrelerin etrafına bir kapı çizin, ardından indikatör boyalarını, bu durumda CD45 ve mCherry'yi kullanın (Şekil 5B).
   NOT: Tümör için seçilen boyut kapısı, hastalık yükünün normalizasyonu ve belirlenmesi için temel sağlayan zebra balığı hücrelerini de içerecektir.
7. Embriyo örneklerini yukarıdakiyle aynı kapı ayarlarını kullanarak analiz edin. Tümör lekesi ve floresan protein göstergesinin son grafiği, hastalık yükünün bir ölçüsünü sağlayacaktır (Şekil 5C).
   NOT: Burada, hastalık yükündeki fark, enjekte edilen hücrelerin iyi bir bolusunu alan embriyolar ile daha düşük bir bolus alan embriyolar için çizilmiştir.
8. Gerekirse, embriyolardaki tümör hücrelerini aşağı akış moleküler analizi için akış sitometrisi ile sıralayın.

Ksenotransplantasyon
Tüm deney ve analizin kapsamlı bir görünümü, embriyo üretiminden akış sitometrisi ile hem sağkalım hem de hastalık yükü analizi ile hastalık ilerlemesinin değerlendirilmesine kadar uzanan Şekil 1'de gösterilmektedir. Bu yaklaşım, ksenotransplantasyonun tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini artıran ve aynı zamanda hastalık yükünü değerlendirmek için yeni bir yol ekleyen çeşitli iyileştirmeler getirmektedir. Bu deneylerin başarısı, nakledilen hücrelerin sağlığına büyük ölçüde bağlıdır, çünkü sağlıklı olmayan ve log fazındaki hücreler transplantasyon sırasında çoğalamaz. Enjeksiyon seansının süresi de kritik bir parametredir. Tümör hücreleri hazırlandıktan sonra, zebra balığına enjeksiyonun 3-4 saat içinde tamamlanması çok önemlidir. Bu çalışmada kullanılan yaklaşım, bu zaman dilimi boyunca daha fazla sayıda embriyonun, bir agaroz plakası üzerinde doğrudan yan taraflarına evrelenmesi ve yumurta sarısına enjekte edilmesi gibi basit bir modifikasyon yoluyla enjekte edilmesini sağlar (Şekil 2C, D). Ayrıca, yeterli sayıda hücrenin enjekte edilmesi (400-600 hücre) için optimum iğne deliğinin seçilmesi, ancak deliğin embriyoların zarar göreceği kadar büyük olmaması şarttır. Diğer bir husus enjeksiyon basıncıdır. 12-13 psi'den daha yüksek basınçların embriyoların sarısını bozduğunu ve ölüme neden olduğunu bulduk. Son olarak, bu prosedüre özgü başka bir değişkenlik, enjeksiyonun tutarlılığıdır. Enjekte edilecek hücreler enjeksiyon iğnesinin ucuna yerleşir ve enjeksiyon bolusunda hassas kontrolü zorlaştırır. Hücreler ksenotransplante edildiğinde, tüm embriyolar aynı enjeksiyon bolusunu alma potansiyeline sahiptir, ancak pratikte almazlar (Şekil 3). Aktarılan hücre sayısı, tümör hücrelerinin davranışına (örn. topaklanma) ve operatörün beceri düzeyine bağlı olarak büyük ölçüde farklılık gösterebilir. Bu belirsizliği, uygun ve tutarlı bir hücre bolusu alan hayvanların yanı sıra daha düşük bir bolus alan hayvanların enjeksiyon sonrası kategorizasyonunu sağlayan CM-Dil boyama/mCherry etiketlemesi yoluyla ele aldık. CM-Dil boyama, ancak bir floresan proteini ile daha etkili bir şekilde işaretlenme, mikroskopi veya akış sitometrisi ile hastalık ilerlemesinin izlenmesini kolaylaştırma avantajına sahiptir (Şekil 4 ve Şekil 5).

Tümör davranış analizi
Tümör ilerlemesi, RFP'ye odaklanan basit floresan mikroskobu kullanılarak kolayca izlenebilir (Şekil 4A). Benzer şekilde, geleneksel sağkalım izlemesi Kaplan-Meier analizi (Log-rank ve Wilcoxon testi) ile gerçekleştirilebilir (Şekil 4B). Etkileyici bir şekilde, çalışma kolu başına tipik olarak 8-10 hayvanın bulunduğu fare tabanlı ksenotransplantasyon çalışmalarının aksine, burada açıklanan zebra balığı yöntemini kullanarak, her biri 60'tan fazla hayvanla çalışma kolları elde etmek zor değildir (Şekil 4B). Bu, in vivo çalışmaların çözme gücünü önemli ölçüde artırır. Son olarak, akış sitometrisi kullanarak hastalık yükü analizi için başka bir yaklaşım uyguladık. Bu, eşdeğer sayıda embriyonun bozulmasını ve elde edilen tek hücreli süspansiyonun tümör hücresi içeriğinin akış sitometrisi ile analiz edilmesini gerektirir. Tümöre özgü bir hücre yüzeyi markörünü floresan protein indikatörü ile birleştirerek, ksenotransplante edilen fareler/insan hücreleri, hastalık yükünü değerlendirmek için bir yaklaşım olarak akış sitometrisi ile güvenle tanımlanabilir (Şekil 5). Bu amaçla, kırmızı floresan proteinler üstündür, çünkü yeşil floresan proteinler, konakçı zebra balığı hücrelerinin otofloresansı üzerinde bir sinyal sağlayamadı. Burada, CD45 ile birlikte FACS analizi için ksenotransplantasyon boyunca hücre etiketleme ve izleme için mCherry kullanıldı. İkili etiketleme, iyi ve düşük bolus inokülasyonu arasındaki tümör yükündeki farklılıkları ölçmemize izin verdi (Şekil 5B, C).

Şekil 1: Tüm ksenotransplantasyon ve enjeksiyon sonrası analiz prosedürlerinin şeması. (A) Üreme kurulumu, embriyo toplama ve döllenmeden 2 gün sonrası (dpf) morfolojisi şematize edilmiştir. (B) Zebra balığı embriyolarının yumurta sarısında ksenotransplantasyon için lösemi hücrelerinin hazırlanması, boyanması ve enjeksiyonları. (C) Sağkalım ve akış sitometrisi dahil olmak üzere ksenotransplantasyon sonrası analizler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Enjeksiyonlar için kullanılan aletlerin temsili görüntüleri. (A) Bir petri plakasına çekilmiş iğneler. (B) Embriyo evrelemesi için agaroz plakası. (C,D) Embriyo yükleme plakasına enjeksiyonlar için aşamalı embriyoları gösteren bir plaka (panel C'de temsili diyagram ve panel D'de gerçek embriyolar (kırmızı daire içine alınmış)). Panel D'nin sağ alt köşesindeki iç kısım, evrelenmiş embriyoların daha yüksek büyütmeli bir görünümünü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Ksenotransplante edilmiş embriyoların temsili görüntüleri. Parlak alan ve immünofloresan görüntüleri, casper embriyolarının yumurta sarısındaki CM-Dil boyası (kırmızı) pozitif hücrelerin 1 dpi'de gösterilmiştir (debriyaj görüntüsü). Alt bolusa sahip embriyolar sarı bir okla gösterilirken, bozulmuş morfolojiye sahip olanlar bir yıldız işareti ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Floresan görüntüleme ve sağkalım analizi ile hastalık ilerlemesinin değerlendirilmesi. (A) Ksenotransplante edilen embriyoların 4 dpi ve 7 dpi'de temsili görüntüsü. (B) Genetik olarak farklı iki lösemi hattına sahip embriyoların sağkalım analizini gösteren Kaplan Meier grafiği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Ksenotransplante edilmiş zebra balıklarında hastalık yükünün akış sitometrik analizi. (A) Hücre süspansiyonu hazırlığının şematik gösterimi ve akış sitometrisi analizi. Kısaca, 4 dpi'deki embriyolar, tripsin ve kollajenaz kullanılarak tek hücreli süspansiyonlara ayrıştırılır, ardından akış sitometrisi yapılır. (B) Her paneldeki sol görüntünün FSC-A v/s SSC-A grafiği ve sağdaki görüntünün CD45 v/s mCherry sinyalleri olduğu akış sitometrisi analizi için temsili çizimler. (C) Enjekte edilmemiş, iyi ve düşük embriyolar için CD45 v/s mCherry grafiğinden elde edilen ksenotransplante edilen hücreler için hücre istatistiklerini gösteren çubuk grafik (her replike için n = 45, 40 ve 40 (n = 3); p değeri * ≤ 0.05, GraphPad Prism 9'da Welch düzeltmesi ile eşleşmemiş t-testi kullanılarak hesaplanmıştır). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar hiçbir rakip çıkar beyan etmezler.