Method Article

Farelerden Vasküler Duvarda Yerleşik CD34+ Kök Hücrelerin İmmünomanyetik İzolasyonu

DOI:

10.3791/66193

⸱

December 22nd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education and Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province, Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, vasküler duvarda yerleşik CD34+ kök hücrelerin (CD34+ VW-SC'ler) izolasyonu, kültürü ve fonksiyonel tayini için stabil ve verimli bir yöntem oluşturmuştur. Bu takip etmesi kolay ve zaman açısından etkin izolasyon yöntemi, kardiyovasküler hastalıklarda yer alan potansiyel mekanizmaları incelemek için diğer araştırmacılar tarafından kullanılabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yerleşik CD34+ vasküler duvarda yerleşik kök ve progenitör hücreler (VW-SC'ler), vasküler yaralanma ve onarımı düzenlemedeki önemli rolleri nedeniyle giderek daha fazla tanınmaktadır. Fonksiyonel murin CD34+ VW-SC'leri kültürlemek için kararlı ve verimli bir yöntem oluşturmak, bu hücrelerin çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullar altında çoğalması, göçü ve farklılaşmasında rol oynayan mekanizmaların daha fazla araştırılması için gereklidir. Açıklanan yöntem, birincil kültürlenmiş yerleşik CD34+ VW-SC'leri saflaştırmak için manyetik boncuk taramasını ve akış sitometrisini birleştirir. Saflaştırılmış hücreler daha sonra immünofloresan boyama ve Ca2 + görüntüleme yoluyla fonksiyonel olarak tanımlanır. Kısaca, murin aort ve mezenterik arterin adventitisinden elde edilen vasküler hücreler, doku bloğu bağlanması yoluyla elde edilir, ardından en az 1 × 107'lik bir hücre sayısına ulaşana kadar subkültürasyona tabi tutulur. Daha sonra, CD34+ VW-SC'ler manyetik boncuk sıralama ve akış sitometrisi kullanılarak saflaştırılır. CD34+ VW-SC'lerin tanımlanması, hücresel immünofloresan boyamayı içerirken, fonksiyonel çok potansiyellilik, yönlendirilmiş farklılaşma için hücrelerin spesifik bir kültür ortamına maruz bırakılmasıyla belirlenir. Ayrıca, fonksiyonel dahili Ca2 + salınımı ve harici Ca2 + girişi, ATP, kafein veya tapsigargin (TG) 'ye maruz kalan Fura-2 / yüklü hücrelerde ticari olarak temin edilebilen bir görüntüleme iş istasyonu kullanılarak değerlendirilir. Bu yöntem, vasküler duvarda yerleşik CD34+ kök hücrelerin izole edilmesi, kültürlenmesi ve tanımlanması için stabil ve verimli bir teknik sunarak, VW-SC'lerin düzenleyici mekanizmaları ve hedefe yönelik ilaçların taranması üzerine in vitro çalışmalar için bir fırsat sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vasküler duvar, vasküler gelişimde, homeostatik regülasyonda ve vasküler hastalıkların ilerlemesinde çok önemli bir rol oynar. Son yıllarda, çok sayıda çalışma, arterlerde çeşitli kök hücre soylarının varlığını ortaya koymuştur. 2004 yılında, Profesör Qingbo Xu'nun grubu ilk olarak yetişkin vasküler duvarın çevresinde CD34, Sca-1, c-kit ve Flk-11 eksprese eden vasküler kök / progenitör hücrelerin varlığını bildirdi. Bu vasküler kök hücreler çok yönlü farklılaşma ve çoğalma potansiyeli gösterirler. Normal koşullar altında, nispeten hareketsiz kalırlar; Bununla birlikte, belirli faktörler tarafından aktive edildiklerinde, düz kas hücrelerine, endotel hücrelerine ve fibroblastlara farklılaşabilirler. Alternatif olarak, yaralı damarların 2,3,4,5,6 onarımını veya yeniden şekillenmesini teşvik etmek için parakrin etkiler yoluyla perivasküler matris ve mikrodamar oluşumunu düzenleyebilirler. Son zamanlarda, vasküler duvardaki yerleşik CD34+ kök hücrelerin, femoral arter kılavuz tel yaralanması sonrası endotel hücre rejenerasyonunda rol oynadığı bulunmuştur2. Sonuç olarak, CD34+ VW-SC'lerin izolasyonu ve miktar tayini ve CD34+ kök hücrelerinin temel biyolojik özelliklerinin incelenmesi, CD34+ VW-SC'lerin regülasyonunda yer alan sinyal yollarının daha fazla incelenmesi için çok önemlidir.

Hücre kültürü özelliklerine veya hücrelerin fiziksel özelliklerine dayalı teknikler de dahil olmak üzere, yoğunluk gradyan santrifüjleme gibi hücre ayırma için çeşitli yöntemler şu anda mevcuttur, bu da birçok hedef olmayan hücre içeren ve nispeten düşük saflıktasıralanmış hücrelerle sonuçlanır 7,8,9,10,11,12 . Yaygın olarak kullanılan bir başka teknik, floresan / manyetik destekli hücre sıralamasıdır. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS), yüksek teknik gereksinimlere sahip karmaşık bir sistemdir ve nispeten pahalıdır, zaman alıcıdır ve potansiyel olarak sıralanmış hücrelerinaktivitesini etkiler 13,14. Bununla birlikte, manyetik olarak etkinleştirilen hücre sınıflandırma (MACS), yüksek geri kazanım oranı ve hücre aktivitesi ve sonraki uygulamalar üzerinde daha az etki ile daha verimli ve kullanışlıdır8. Bu nedenle, bu protokolde, CD34+ VW-SC'leri saflaştırmak için MACS uyguladık ve hücreleri akış sitometrisi ile daha fazla tanımladık. Damar duvarı kök hücrelerinin incelenmesi için MACS tabanlı izolasyon yöntemlerinin oluşturulması paha biçilmez olacaktır. İlk olarak, deneysel genetik ve hücre biyolojik çalışmalarına izin verir. İkinci olarak, vasküler duvarda yerleşik kök hücrelerin etkin izolasyonu ve kültürü, kök hücre fonksiyonlarını düzenleyen sinyal faktörlerinin sistematik olarak değerlendirilmesine ve taranmasına olanak tanır. Üçüncüsü, kök hücrelerdeki önemli fenotiplerin tanımlanması, hücre durumunun değerlendirilmesinde önemli bir 'kalite kontrolü' sağlar. Bu nedenle, saflaştırma yöntemlerinin belirlenmesi, damarlardan elde edilen benzer kök hücrelere benzer uygulamalar için yararlı olabilir.

Bu rapor, akış sitometrisi, immünofloresan boyama ve Ca 2+ sinyal ölçümü ile gerçekleştirilen hücre tanımlama ve fonksiyonel değerlendirme dahil olmak üzereCD34+ VW-SC'lerin kültürü için kararlı ve güvenilir bir yöntemin ayrıntılı bir gösterimini sağlar. Bu çalışma, CD34+ VW-SC'lerin işlevi ve fizyolojik ve patolojik koşullardaki düzenleyici mekanizmaları hakkında daha derinlemesine araştırmalar için bir temel oluşturmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma onaylandı ve hayvanlar, Çin'deki Laboratuvar Hayvanlarının Yönetimi ve Kullanımı Kılavuzuna uygun olarak ele alındı. Araştırma, Hayvan Etik Kurulu'nun onayı ile hayvan deneylerinin etik gerekliliklerine sıkı sıkıya bağlı kalmıştır (Onay No: SWMU2020664). Bu çalışma için her iki cinsiyetten 18-20 g ağırlığında sekiz haftalık sağlıklı C57BL / 6 fareleri kullanıldı. Hayvanlar, Southwest Tıp Üniversitesi (SWMU) Laboratuvar Hayvanları Merkezi'ne yerleştirildi.

1. Aort ve mezenterik arterlerden adventiti doku blok kültürü

  1. Yerleşik CD34+ VW-SC izolasyonu
    1. % 3 izofluran inhalasyonu ile iki fareyi uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Ayak parmağınızı kıstırarak yeterli anesteziyi onaylayın. Fareyi tıbbi bantla sırtüstü yatırın ve farenin kürkünü dezenfekte etmek için %70 etanol dezenfektanı püskürtün. Kalbi ve bağırsakları ortaya çıkarmak için steril oftalmik makas ve forseps kullanarak göğüs ve karın boşluklarını açın. İzole aort ve mezenterik arterleri diseke ettikten sonra, aort ve mezenterik yatağı silikon elastomer içeren ve fizyolojik bir tuz çözeltisi ile doldurulmuş bir petri kabına sabitleyin. Başka bir sterilize makas ve forseps seti ile aort ve mezenterik arterlerin etrafındaki yağları hızla inceleyin.
    2. Diseke edilen dokuları %1 Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B solüsyonu içeren 6 cm'lik bir Petri kabına aktarın (bkz. İki kez duruladıktan sonra, arterleri stereo mikroskop altında bir doku kültürü başlığına aktarın.
    3. Arterleri uzunlamasına kesin ve aortun dış tabakasını ve mezenterik arterlerin ilk dalını soymak için ince forseps kullanın. Dış katmanları 0.1-0.2 mL kültür ortamı içeren 3.5 cm'lik bir Petri kabına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Dış katmanları küçük parçalar halinde kesin (yaklaşık 1 mm3).
    4. Doku parçalarını jelatin kaplı bir T25 şişesine aktarın ve şişenin tabanında eşit dağılım sağlayın. Hücre taramasını ve büyümesini kolaylaştırmak için doku parçaları arasında orta bir mesafe bırakın. Doku bloklarının şişenin tabanına yapışmasını sağlamak için şişeyi 3 saat boyunca bir inkübatöre (37 °C,% 5 CO2) dikey olarak yerleştirin.
    5. 3 saat sonra, doku bloklarını batırmak için 5 mL DMEM yüksek glikoz büyüme ortamı ekleyin. T25 şişesini yatay olarak yönlendirin. Doku blokları etrafındaki hücre göçünü 3 günlük aralıklarla mikroskopla izleyin.
      NOT: Ortam% 20 fetal sığır serumu,% 0.2 Lösemi İnhibitör Faktörü (LIF), 0.2 mM β-Merkaptoetanol ve% 1 penisilin / streptomisin içermelidir (bkz. Fetal sığır serumu hücre proliferasyonunu desteklerken, LIF ve β-Merkaptoetanol hücre farklılaşmasını engeller 7,8.
    6. T25 şişesindeki hücreler yaklaşık% 80 birleşime ulaştığında, bunları bir veya iki T75 şişesine geçirin ve kültürleyin. Uygun büyüme ve sağlığı sağlamak için hücreleri beş geçit boyunca alt kültürleyin.
  2. Yerleşik CD34+ kök hücrelerin manyetik olarak ayrılması
    1. Bir veya iki T75 şişesindeki hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında, hücreleri Tripsin ile ayırın ve 1 mL ayırma tamponunda (2 mM EDTA ve% 0.5 FBS) yeniden süspanse edin. Hücre sayısını (107 / T75 şişesi) belirleyin ve hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca (oda sıcaklığında) 300 x g'da santrifüjleyin.
    2. Süpernatanı tamamen atın ve hücre peletini toplam 107 hücre başına 98 μL ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. 2 μL CD34 antikoru ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). İyice karıştırın ve ara sıra çalkalayarak karanlıkta 4°C'de 30 dakika inkübe edin.
    3. Hücreleri 2 mL ayırma tamponu ekleyerek yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    4. Süpernatanı dikkatlice ve tamamen çıkarın ve hücreleri 80 μL ayırma tamponunda yeniden süspanse edin.
    5. Tampona 20 μL Anti-FITC MicroBeads (toplam 107 hücre başına, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Tekrarlayan pipetleme ile iyice karıştırın ve aralıklı çalkalayarak karanlıkta 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.
    6. Hücreleri 2 mL tampon ekleyerek iki kez yıkayın ve hücreleri yeniden canlandırmak için 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen atın ve hücreleri 1 mL tamponda yeniden süspanse edin.
    7. Ayrılan bileşenleri toplamak için MS kolonunun altına bir toplama tüpünün (örn. 15 mL'lik bir santrifüj tüpü) yerleştirildiğinden emin olarak, bir MS sütununu uygun bir ayırıcının manyetik alanı içine yerleştirin. ( Bkz. Malzeme Tablosu). Kolonu 500 μL tampon ile durulayın ve tamamen bitene kadar bekleyin.
    8. Hücre süspansiyonunu kolona yükleyin ve etiketlenmemiş hücreler içeren akışı 15 mL'lik tüpe toplayın.
    9. Kolonu ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Kolona 500 μL tampon yerleştirin, ardından pistonu kolona iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri hemen yıkayın.
    10. CD34 + hücrelerinin saflığını arttırmak için, ayrıştırılan fraksiyon ikinci bir MS sütunu kullanılarak zenginleştirilebilir. Ayırma işlemini yukarıda belirtildiği gibi tekrarlayın. Akış sitometrisi ile sıralanan hücrelerin saflığını değerlendirin.
      NOT: Tipik olarak, yaklaşık% 70 -% 80 negatif hücreler ve boyama ve santrifüj prosedürleri nedeniyle yaklaşık% 10 kayıpla% 10 -% 20 CD34 + hücreleri elde edilir.
    11. Vasküler duvar CD34 + kök hücrelerinin saflığını daha da doğrulamak için, sıralanan hücreleri akış sitometrisi ile tanımlayın. Bu çalışma% 90'dan fazla bir saflık göstermiştir.

2. İmmünofloresan ile hücre tanımlama

  1. Lameller üzerindeki tohum hücreleri (çap 8 mm)% 0.04 jelatin ile önceden kaplanmıştır.
  2. Hücreler yaklaşık% 60 -% 70 birleşime ulaştığında, PBS ile iki kez durulayın ve hücreleri 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
  3. Hücreleri PBS ile 3 dakika (3 kez) yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.2 Triton X-100 (PBS'de) ile geçirgen hale getirin.
  4. Hücreleri PBS ile 3 dakika (3 kez) yıkayın ve antikorların spesifik olmayan bağlanmasını 1 saat boyunca% 5 eşek serumu (PBS'de) ile bloke edin.
  5. Her bir lameli kenarından forseps ile tutarak ve tüy bırakmayan bir mendil tabakasına boşaltarak engelleme tamponunu çıkarın.
  6. Hücreleri 100 kez seyreltilmiş primer antikorlarda (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, Malzeme Tablosuna bakınız) gece boyunca %1 BSA'da (PBS'de) inkübe edin.
  7. Solüsyonu boşaltın ve hücreleri PBS ile 3 dakika (3 kez) yıkayın. Hücreleri Alexa Fluor 488 etiketli ikincil antikor (% 1 BSA'da 1:200) ile karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  8. DAPI stok çözeltisini PBS'de 0,5 μg/mL'ye seyrelterek ve hücreleri 5 dakika inkübe ederek DAPI karşı boyama gerçekleştirin.
  9. PBS ile durulayın ve lamelleri antifade reaktifi ile kapatın. Lazer taramalı konfokal mikroskop altında görüntü yakalayın.

3. CD34+ VW-SC'lerin indüklenmiş farklılaşması ve karakterizasyonu

  1. CD34+ kök hücreleri, lameller ve 6 oyuklu plakalar üzerinde sırasıyla uygun bir yoğunlukta (%40-%50 birleşme) tohumlayın.
  2. Hücreleri 1 hafta boyunca endotel hücre kültürü ortamı EBM-2'de kültürleyerek CD34 + hücrelerinden endotel hücre yönelimli farklılaşmayı indükleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  3. Hücreleri fibroblast hücre kültürü ortamı FM-2'de 3 gün boyunca kültürleyerek CD34 + hücrelerinden fibroblast hücre yönelimli farklılaşmayı indükleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
  4. Farklılaşmamış ve farklılaşmış hücreleri, 488 nm'lik lazer uyarımında ve 40x objektifte immünofloresan boyamaya (adım 2'de belirtildiği gibi) tabi tutun. Endotel hücre belirteçlerinin (CD31, VWF) ve fibroblast hücre belirteçlerinin (PDGFRα, Vimentin) ekspresyonunu tespit edin (bkz.
  5. Hücreleri Tripsin ile ayırın ve hücre peletini santrifüjleme yoluyla elde edin (300 x g, 5 dakika, oda sıcaklığı). Hücreleri 100 μL ayırma tamponu ile yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu saflaştırılmış anti-fare CD16 / CD32 mAb (1 μg) (Malzeme Tablosuna bakınız) ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca önceden inkübe edin.
  6. 2 μL PE Sıçan anti-Fare CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) Monoklonal Antikor APC (2 μL, 1:50) ve CD140a (PDGFRa) Monoklonal Antikor FITC (2 μL, 1:50) ekleyin doğrudan Fare Fc Bloğu varlığında önceden inkübe edilmiş hücrelere ve ayrıca 4 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
  7. Hücreleri yeniden canlandırmak için 2 mL tampon ekleyerek iki kez yıkayın ve 300 x g'da 5 dakika (oda sıcaklığında) santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen atın ve hücreleri 300 μL tamponda yeniden süspanse edin. Lekeli hücrelere sahip akış tüplerini Akış sitometrisi için hazır bir buz kutusuna koyun.

4. VaskülerCD34+ kök hücrelerde hücre içi Ca 2+ sinyalizasyonunun saptanması

  1. Lameller üzerindeki tohum hücreleri, deneylerden 10 saat önce% 70'e varan bir yoğunlukta birleşir.
  2. Lamelleri çıkarın ve herhangi bir vazelin ile özel bir haznenin dibine yapıştırın.
  3. Lamelleri bir kez PBS ile yıkayın, Tyrode solüsyonunda (NaCl 137 mM, KCl 5.4 mM, MgCl2 1.2 mM, glikoz 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2.4 mM) Fura-2 / (5 μM) ile değiştirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve hücreleri karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
  4. Fura-2 / de-esterifikasyonuna izin vermek için Tyrode solüsyonu ile 10 dakika muamele ederek boyayı çıkarın.
  5. Odayı, bir monokromatör ve bir CCD kamera içeren geniş alanlı bir görüntüleme sistemi ile donatılmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobunun sahnesine monte edin (bkz. Malzeme Tablosu).
  6. Ana pencereyi açın, Yakalama Ayarları iletişim kutusuna ve kamera sayfasına gidin ve canlı görüntü gösterimi için canlı düğmesine basın.
  7. Optimum görüntü parlaklığı elde etmek için floresan görüntü türünü seçin, 340 nm/380 nm döngü tekrarlama sürelerini, görüntü boyutunu ve kamera pozlama süresini 380 nm ve 340 nm olarak ayarlayın.
  8. Tek anlık görüntüler alın ve hücreleri farklı renklerle daire içine almak için birkaç serbest çizgi çizin ve İlgi Alanlarını (ROI'ler) önceden tanımlayarak arka planı ROI 0 olarak belirtin.
  9. Çalışma alanı görünümünde zaten katıştırılmış bir protokolü yeniden düzenleyin ve yeni bir çalışma alanı oluşturun.
  10. Protokolü yürütün ve "Floresan 340 nm div Floresan 380 nm (Canlı Kinetik)" çevrimiçi kinetik grafiği gösterecektir.
  11. Sayısal görünümde, gri tonlamalı değerlerin sütunlarını ve karşılık gelen zaman bilgilerini sunan bir elektronik tablo görünecektir. Panoyu kullanarak elektronik tablo verilerini dışa aktarın.
  12. Arka plan floresansını (ROI 340) çıkardıktan sonra hücre içi Ca 380+ değişikliklerini gösteren F2 nm/F0'yi hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD34+ VW-SC'lerin izolasyonu ve saflaştırılması
CD34+ VW-SC'lerin yüksek saflığı, doku eki ve manyetik mikroboncuk sıralama ile fare aort ve mezenterik arterinin adventitisinden elde edilir. Damar duvarındaki CD34+ hücrelerinin yüzdesi genellikle -30'dur. Akış sitometrisi, manyetik boncuk ayıklama ile elde edilen CD34+


...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, farelerin aort ve mezenterik arterlerinden fonksiyonel CD34+ VW-SC'lerin elde edilmesi için hızlı ve uygun bir yöntem sağlar. Bu yöntemle elde edilen CD34+ VW-SC'ler, proliferatif aktivite ve çok yönlü farklılaşma özelliklerine sahiptir. Trifosfat inositol 1,4,5-trisfosfat reseptörleri (IP3Rs), riyanodin reseptörleri (RyR'ler) ve mağaza tarafından işletilen kalsiyum kanalları, CD34+ VW-SC'lerde Ca2+ salınımına ve girişine aracılık eder. Bu tekniğin kurulm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82070502, 31972909, 32171099), Sichuan Eyaleti Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (23NSFSC0576, 2022YFS0607) tarafından sağlanan hibelerle finanse edilmiştir. Yazarlar, hücre kültürüne yardımcı olduğu için Zhejiang Üniversitesi'nden Qingbo Xu'ya teşekkür etmek istiyor ve yazarlar, Southwest Tıp Üniversitesi'ndeki akış sitometrisi platformunun bilimsel ve teknik yardımını kabul ediyor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 2 jelatin çözeltisiSigmaG1393
Anti-CD31 antikoruR& DAF3628
Anti-CD34 antikoruAbcamab81289
Anti-c-kit antikoruCST77522
Anti-FITC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-048-701 & nbsp;
Anti-FITC MicroBeads MACSMiltenyi Biotec130-048-701
Anti-Flk-1 antikoruAbcamab24313
Anti-Ki67 antikoruCST34330
Anti-PDGFR ve alfa; antikorAbcamab131591
Anti-Sca-1 antikoruInvitrogen710952
CD140a (PDGFRA) Monoklonal Antikor (APA5), FITCeBioscience   İnvitrojen11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoklonal Antikor (390), APCeBioscience  Invitrogen17-0311-82
CD34 Antikor, anti-fare, FITC, REAfinity Klonu REA383Miltenyi Biotec130-117-775
hücre kültürü başlığıJIANGSU SUJING GROUP CO., LTD SW-CJ-2FD
Santrifüjve nbsp; CENCE   L530
CO2  Kuluçka Makineleri                       Thermofisher Scientific4111
Konfokal lazer tarama mikroskobu Zeiss ZEISS 980   
DMEM Yüksek Glikoz OrtamıATCC30-2002
EBM-2 kültür ortamıLonzaCC-3162
FACSMelody   BD Biosciences
FACSMelodi ve ticaret; Sistem 
Fetal sığır serumuMilliporeES-009-C
FM-2 kültür ortamıScienCell2331
Fura-2 / & nbsp;InvitrogenM1292
Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor Plus 488  Thermofisher Bilimsel     A32731
Lösemi inhibitör faktörMilliporeLIF2010
Mikroskobu OlympusIX71
MiniMACS    Başlangıç KitiMiltenyi Biotec130-090-312
Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B ÇözeltisiBeyotimeC0224
Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16/CD32 (Fare BD Fc Bloğu)BD Pharmingen553141
Stereo Mikroskop OlympusSZX10 
TILLvisION 4.0 programı   T.I.L.L.Photonics GmbHpolikrom V 
VWF Monoklonal Antikoru (F8/86)Thermofisher Scientific  MA5-14029
& beta ; -MerkaptoetanolThermofisher Bilimsel21985023
BD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, Y., et al. Abundant progenitor cells in the adventitia contribute to atherosclerosis of vein grafts in ApoE-deficient mice. J Clin Invest. 113 (9), 1258-1265 (2004).
  2. Jiang, L., et al. Nonbone marrow CD34+ cells are crucial for endothelial repair of the injured artery. Circ Res. 129 (8), e146-e165 (2021).
  3. Tamma, R., Ruggieri, S., Annese, T., Ribatti, D. Vascular wall as a source of stem cells able to differentiate into endothelial cells. Adv Exp Med Biol. 1237, 29-36 (2020).
  4. Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key soxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
  5. Zhang, L., Issa Bhaloo, S., Chen, T., Zhou, B., Xu, Q. Roles of stem cells in vascular remodeling. Chin J Cell Biol. 43 (7), 1352-1361 (2021).
  6. Zhang, L., et al. Role of resident stem cells in vessel formation and arteriosclerosis. Circ Res. 122 (11), 1608-1624 (2018).
  7. Wu, Y., et al. Effects of estrogen on growth and smooth muscle differentiation of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Atherosclerosis. 240 (2), 453-461 (2015).
  8. Tang, J. M., et al. Isolation and culture of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Cardiol Plus. 4 (4), 116-120 (2019).
  9. Sukumaran, P., et al. Calcium signaling regulates autophagy and apoptosis. Cells. 10 (8), 2125(2021).
  10. van der Sanden, B., Dhobb, M., Berger, F., Wion, D. Optimizing stem cell culture. J Cell Biochem. 111 (4), 801-807 (2010).
  11. Rotmans, J. I., et al. In vivo, cell seeding with anti-CD34 antibodies successfully accelerates endothelialization but stimulates intimal hyperplasia in porcine arteriovenous expanded polytetrafluoroethylene grafts. Circulation. 112 (1), 12-18 (2005).
  12. Qu, R., et al. The role of serum amyloid A1 in the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells basing on single-cell RNA sequencing analysis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 187(2022).
  13. Flynn, J., Gorry, P. Flow Cytometry Analysis to Identify Human CD8+ T Cells. Methods Mol Biol. 2048, 1-13 (2019).
  14. Bacon, K., Lavoie, A., Rao, B. M., Daniele, M., Menegatti, S. Past, present, and future of affinity-based cell separation technologies. Acta Biomater. 112, 29-51 (2020).
  15. Ma, H. G., Liu, H. Q., Liu, S. D., Tang, Y. Y. Primary culture and identification of rat glomerular microvascular endothelial cells. Acta Physiol Sin. 73 (6), 926-930 (2021).
  16. Liu, W. H., Wang, P., Yang, J. Isolation, culture and identification of rats hair follicle neural crest stem cells. Chin J Neuroanat. 35 (2), 207-211 (2019).
  17. Kumar, P., Garg, N. Flow cytometry approaches to obtain medulloblastoma stem cells from bulk cultures. Methods Mol Biol. 2423, 87-94 (2022).
  18. Haroon, M. M., Vemula, P. K., Palakodeti, D. Flow cytometry analysis of planarian stem cells using DNA and mitochondrial dyes. Bio Protoc. 12 (2), e4299(2022).
  19. Catchpole, T., Nguyen, T. D., Gilfoyle, A., Csaky, K. G. A profile of circulating vascular progenitor cells in human neovascular age-related macular degeneration. PLOS One. 15 (2), e0229504(2020).
  20. Wang, G., Yu, G., Wang, D., Guo, S., Shan, F. Comparison of the purity and vitality of natural killer cells with different isolation kits. Exp Ther Med. 13 (5), 1875-1883 (2017).
  21. Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. Consortium SI. Isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PLOS One. 14 (3), e0213832(2019).
  22. Jiang, L. H., Mousawi, F., Yang, X., Roger, S. ATP-induced Ca2+-signalling mechanisms in the regulation of mesenchymal stem cell migration. Cell Mol Life Sci. 74 (20), 3697-3710 (2017).
  23. Ong, H. L., Subedi, K. P., Son, G. Y., Liu, X., Ambudkar, I. S. Tuning store-operated calcium entry to modulate Ca2+-dependent physiological processes. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1037-1045 (2019).
  24. Garcia-Carlos, C. A., et al. Angiotensin II, ATP and high extracellular potassium induced intracellular calcium responses in primary rat brain endothelial cell cultures. Cell Biochem Funct. 39 (5), 688-698 (2021).
  25. Reggiani, C. Caffeine as a tool to investigate sarcoplasmic reticulum and intracellular calcium dynamics in human skeletal muscles. J Muscle Res Cell Motil. 42 (2), 281-289 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Immunomagnetic IsolationVascular Wall resident CD34 Stem CellsMagnetic Bead SortingFlow CytometryImmunofluorescence StainingCalcium ImagingMurine AortaSubcellular IdentificationFunctional AssessmentPluripotencyVascular RemodelingPhysiological ConditionsPathological Conditions