Yöntem makalesi

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

DOI:

10.3791/66246

⸱

22 Aralık 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese PLA, 2Senior Department of Ophthalmology, The Third Medical Center of Chinese PLA General Hospital, 3Stem Cell and Regenerative Medicine Lab, Beijing Institute of Radiation Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, retinal organoidlerin yapışmasını ve füzyonunu yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle azaltan optimize edilmiş bir 3D nöral retina indüksiyon sistemini tanımlamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinopati, dünya çapında körlüğün ana nedenlerinden biridir. Retinopatinin erken tanısı ve zamanında tedavisi için patogenezinin araştırılması esastır. Ne yazık ki, etik engeller insanlardan kanıt toplanmasını engellemektedir. Son zamanlarda, çok sayıda çalışma, insan pluripotent kök hücrelerinin (PSC'ler), hastalık modellemesi, ilaç taraması ve kök hücre bazlı tedaviler için retinopatide muazzam potansiyele sahip olan farklı indüksiyon protokolleri kullanılarak retinal organoidlere (RO'lar) farklılaştırılabileceğini göstermiştir. Bu çalışma, vezikülasyon ve füzyon olasılığını önemli ölçüde azaltan ve 60. güne kadar üretimin başarı oranını artıran nöral retina (NR) oluşturmak için optimize edilmiş bir indüksiyon protokolünü açıklamaktadır. PSC'lerin ayrışmadan sonra kendi kendini yeniden düzenleme yeteneğine dayanarak, bazı tamamlayıcı faktörlerle birlikte, bu yeni yöntem özellikle NR farklılaşmasını sağlayabilir. Ayrıca, yaklaşım karmaşık değildir, uygun maliyetlidir, kayda değer tekrarlanabilirlik ve verimlilik sergiler, kişiselleştirilmiş retina hastalıkları modelleri için cesaret verici beklentiler sunar ve hücre tedavisi, ilaç taraması ve gen terapisi testi gibi uygulamalar için bol miktarda hücre rezervuarı sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Göz, insan duyu organları arasında birincil bilgi kaynağı olarak hizmet eder ve retina, memeli gözlerinde başlıca görsel duyu dokusudur1. Retinopati, körlüğe yol açan göz hastalıklarının başlıca küresel nedenlerinden biridir2. Dünya çapında yaklaşık 2,85 milyon insan retinopati nedeniyle çeşitli derecelerde görme bozukluğundan muzdariptir3. Sonuç olarak, patogenezinin araştırılması erken tanı ve zamanında tedavi için çok önemlidir. İnsan retinopatisi üzerine yapılan çalışmaların çoğu öncelikle hayvan modellerine odaklanmıştır 4,5,6. Bununla birlikte, insan retinası, çeşitli hücre tiplerini içeren karmaşık, çok katmanlı bir dokudur. Geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü ve hayvan modeli sistemleri tipik olarak doğal insan retinasının normal uzay-zamansal gelişimini ve ilaç metabolizmasını aslına uygun olarak özetlemekte başarısızolur 7,8.

Son zamanlarda, pluripotent kök hücrelerden (PSC'ler) doku benzeri organlar üretmek için 3D kültür teknikleri gelişmiştir9,10. Bir 3D süspansiyon kültürü sisteminde insan PSC'lerinden üretilen retinal organoidler (RO'lar) sadece yedi retinal hücre tipi içermekle kalmaz, aynı zamanda insan retinasına benzer farklı bir tabakalı yapı sergiler in vivo 11,12,13. İnsan PSC'den türetilen RO'lar popülerlik ve yaygın kullanılabilirlik kazanmıştır ve şu anda insan retinasının gelişimini ve hastalığını incelemek için en iyi in vitro modellerdir14,15. Son birkaç on yılda, çok sayıda araştırmacı, embriyonik kök hücreler (ESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) dahil olmak üzere insan PSC'lerinin çeşitli indüksiyon protokolleri kullanarak RO'lara farklılaşabileceğini göstermiştir. Bu gelişmeler, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve kök hücre bazlı tedaviler için retinopatide muazzam bir potansiyele sahiptir 16,17,18.

Bununla birlikte, insan pluripotent kök hücrelerinden (PSC'ler) nöral retina (NR) üretimi karmaşık, zahmetli ve zaman alıcı bir süreçtir. Ayrıca, doku organoidlerindeki partiden partiye varyasyonlar, sonuçların daha düşük tekrarlanabilirliğine yol açabilir19,20. Başlangıç hücrelerinin sayısı veya türü ve transkripsiyon faktörlerinin ve küçük moleküllü bileşiklerinkullanımı gibi çok sayıda içsel ve dışsal faktör retinal organoidlerin (RO'lar) verimini etkileyebilir 21,22,23. İlk insan RO'su Sasai laboratuvarı11 tarafından üretildiğinden beri, indüksiyon işleminin 13,21,24,25 kolaylığını ve etkinliğini artırmak için yıllar içinde çok sayıda modifikasyon önerilmiştir. Ne yazık ki, bugüne kadar, tüm laboratuvarlarda RO üretmek için altın standart bir protokol oluşturulmamıştır. Gerçekten de, farklı indüksiyon yöntemlerinden kaynaklanan RO'larda belirli bir derecede tutarsızlık ve ayrıca retinal belirteçlerin ekspresyonunda ve yapılarının sağlamlığında geniş farklılıklar vardır22,26. Bu sorunlar, örneklem toplamayı ve çalışma bulgularının yorumlanmasını ciddi şekilde zorlaştırabilir. Bu nedenle, RO üretiminin minimum heterojenliği ile verimliliği en üst düzeye çıkarmak için daha konsolide ve sağlam bir farklılaşma protokolüne ihtiyaç vardır.

Bu çalışma, Kuwahara ve ark.12 ve Döpper ve ark.27'nin ayrıntılı talimatlarla bir kombinasyonuna dayanan optimize edilmiş bir indüksiyon protokolünü açıklamaktadır. Yeni yöntem, organoid vezikülasyon ve füzyon olasılığını önemli ölçüde azaltarak NR üretme başarı oranını artırır. Bu gelişme, retina bozuklukları için hastalık modellemesi, ilaç taraması ve hücre tedavisi uygulamaları için büyük umut vaat ediyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Helsinki Bildirgesi'nin İlkelerine uygun olarak yürütülmüş ve Çin PLA Genel Hastanesi Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. WA09 (H9) ESC hattı, WiCell Araştırma Enstitüsü'nden alınmıştır.

1. Kültür ortamı ve reaktif hazırlama

  1. İnsan ESC kültür ortamı ve geçiş çözümü
    1. Bakım ortamı (MM): Aseptik olarak 500 mL tam MM (Bazal Ortam + 5x ek; Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. 5x takviyesini oda sıcaklığında (RT) veya gece boyunca 2-8 °C'de çözdürün. RT'ye önceden ısıtın. Ek bulanıklık giderene kadar kullanmadan önce iyice karıştırın.
    2. %1 hücre dışı matris (ECM): Buz üzerinde tüp başına 200 μL ECM ( Malzeme Tablosuna bakın) dağıtmak için önceden soğutulmuş bir pipet ucu ve steril tüpler kullanın. Tüpleri -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın. ECM'yi buz üzerinde eritin ve 1:100'de önceden soğutulmuş DMEM/F12 ile seyreltin.
    3. 0.5 mM pH = 8.0 EDTA: 500 mL 0.5 mM EDTA hazırlamak için, 500 mL 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinine (DPBS) 500 μL 0.5 M EDTA ve 0.9 g NaCl ekleyin (bkz. İyice karıştırın ve 2-8 °C'de saklayın.
  2. Retina farklılaşma ortamı
    1. Büyüme faktörü içermeyen kimyasal olarak tanımlanmış ortam (gfCDM): %45 Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco'nun orta-GlutaMAX'ını (IMDM-GlutaMAX), %45 Jambon'un F12-GlutaMAX'ını (F12-Glutamax), %10 nakavt serum replasmanı (KSR), %1 kolesterol lipid konsantresi ve 450 μM tiyogaliserol'ü birleştirerek gfCDM'yi hazırlayın (bkz.
  3. Küçük moleküllü bileşikler
    1. Y-27632 2HCl: 3.122 mL dimetil sülfoksite (DMSO) 50 mg Y-27632 tozu ekleyin. Y-27632'yi ( Malzeme Tablosuna bakın) 50 mM konsantrasyonda -80 °C'de 2 yıl boyunca ışıktan uzak tutarak dağıtın ve saklayın. Stoku kullanım için 2.500 kez (20 μM) seyreltin, bu da mL gfCDM başına 0,4 μL Y-27632'ye eşdeğerdir.
    2. IWR1-endo: 10 mM'lik bir stok çözeltisi elde etmek için 10 mg IWR1-endo'yu çözmek için 2.4424 mL DMSO ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Alikotları dağıtın ve -80 °C'de 2 yıla kadar saklayın. İndüksiyon için 3 μM konsantrasyonu için mL gfCDM başına 0.3 μL 10 mM IWR1-endo ekleyin.
    3. SB431542: 50 mM SB431542 hazırlamak için, 0.5203 mL DMSO'ya 10 mg SB431542 ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve iyice karıştırın. -80 °C'de solvent içinde en fazla 2 yıl saklayınız. 10 μM'lik bir çalışma konsantrasyonunda SB431542 hazırlanması için, 10 mL gfCDM'ye 2 μL 50 mM stok çözeltisi ekleyin.
    4. LDN-193189 2HCl: 1 mM stok çözeltisi elde etmek için 5 mg LDN-193189 2HCl'yi ( Malzeme Tablosuna bakınız) 10.4297 mL DMSO içinde çözün. -20 °C veya -80 °C'de saklayın (üretici tarafından önerildiği gibi). Her 10 mL gfCDM'ye 0,1 μL stok ekleyin, bu da indüksiyon için 100 nM LDN-193189 ile sonuçlanır.
    5. Rekombinant İnsan kemiği morfogenetik proteini 4 (BMP4): 4 mM HCl'de 50-200 μg/mL'de sulandırılır (bkz. Sulandırıldıktan sonra 2 °C ila 8 °C'de 1 ay veya -20 °C'de 1 yıl saklayın. 1.5 nM BMP4 kullanarak NR indüksiyonunu gerçekleştirin.
  4. Uzun süreli NR kültür ortamı
    1. Retinoik asit (RA): 6 mg RA tozu ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3.9941 mL DMSO'ya ekleyin. −80 °C'de 5 mM'lik alikotlarda saklayın ve 3 ay içinde kullanın. 0.5 μM'lik bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için, 100 mL nöral retina farklılaşma ortamına (NRDM) 10 μL ana karışım ekleyin. Kullanmadan hemen önce ekleyin.
      NOT: Hazırlama ve saklama sırasında ışıktan uzak tutun.
    2. Taurin: 200 mM'lik bir stok çözeltisi elde etmek için 200 mg ila 7.9904 mL DMSO ağırlığında taurin tozu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. 2-8 °C'de dağıtın ve saklayın. 100 mL NRDM başına 50 μL stok çözeltisi eklenerek 0.1 mM taurin çalışma konsantrasyonu elde edilir.
    3. NRDM: NRDM'YI DMEM / F12-GlutaMAX ortamı,% 1 N2 takviyesi,% 10 fetal sığır serumu, 0,5 mM RA ve 0,1 mM taurin ile birleştirin (bkz. Bileşenlerin aktivitesini sağlamak için 2-8 °C'de 2 haftaya kadar veya -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.
  5. Engelleme tamponu: Kullanım için% 10'luk bir çalışma çözeltisi elde etmek için DPBS ile 1: 9 oranında seyreltin (Malzeme Tablosuna bakın). -20 °C'de 5 yıla kadar saklayın.
    NOT: Steriliteyi sağlamak için tartım hariç diğer tüm prosedürleri Sınıf II Biyogüvenlik Kabininde gerçekleştirin. Hazırlama işlemi sırasında tartılan reaktiflerin eklenmesi gerekiyorsa, filtrasyon için 0,22 μm filtreler kullanın.

2. H9-ESC'lerin Kültürlenmesi

  1. H9-ESC'lerin Çözülmesi
    1. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL %1 ECM ekleyin. %5CO2 atmosferinde 37 °C'de bir inkübatörde 1 saat inkübe edin.
      NOT: Yüzeye yapışabileceğinden, kuyu duvarları boyunca ECM eklemekten kaçının.
    2. Sıvı nitrojen tankından bir H9-ESC kriyoviyal stoğu alın ve 37 °C suda 30 saniye boyunca hızlıca çalkalayın.
      NOT: Şişenin tamamen çözülmesine izin vermeyin.
    3. Şişeyi çıkarın ve% 75 dezenfektan alkol spreyi kullanarak dikkatlice sterilize edin. Çözülmüş H9-ESC'yi kriyoviyalden 10 μM Y-27632 ile 9 mL MM içeren 15 mL'lik bir tüpe ekleyin.
    4. Tüpü RT'de 5 dakika boyunca 190 × g'da santrifüjleyin. Hücre kaybını önlemek için süpernatantın çoğunu 1 mL'lik bir pipetle dikkatlice çıkarın ve yaklaşık 50 μL süpernatan bırakın.
    5. Hücre tortusuna 10 μM Y27632 içeren 1 mL MM ekleyin ve 5-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre tortusunu 1 mL'lik bir pipetle nazikçe yeniden süspanse edin.
    6. 1 saatlik inkübasyondan sonra ECM kaplamasını çıkarın. Her kuyucuğa 10 μM Y-27632 içeren 2 mL önceden ısıtılmış MM ekleyin.
    7. Kuyucuk başına 0.5 mL hücre süspansiyonu dağıtın. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı yanal olarak hafifçe sallayın.
    8. Plakayı 37 °C'de %5CO2 altında dokunmadan en az 24 saat inkübe edin.
    9. Ortamı günlük olarak değiştirin. Klon yoğunluğu %70 ve üzerine ulaştığında pasaj gereklidir.
  2. H9-ESC'lerin Geçişi
    1. ECM kaplı plakayı yukarıda açıklandığı gibi hazırlayın (adım 2.1.1) ve oyuk başına 2 mL MM ekleyin.
    2. Harcanan ortamı 6 oyuklu plakalardan çıkarın. Her kuyuyu iki kez 1 mL DPBS ile yıkayın.
    3. Yavaşça 1 mL EDTA ekleyerek ve RT'de 4-7 dakika boyunca 1 mL EDTA ile inkübe ederek her bir kuyuyu iki kez yıkayın.
      NOT: İnkübasyon sırasında, 6 oyuklu plakayı mikroskop altında 3 dakika inceleyin. Çoğu hücre çanaktan ayrılmaya yakınsa hemen bir sonraki adıma geçin. Hücreler üzerindeki olumsuz etkiyi azaltmak için uzun süre inkübasyondan kaçının.
    4. EDTA'yı atın ve sindirimi durdurmak için 1 mL MM ekleyin.
    5. Hücrelerin çoğu ayrılana kadar kuyu plakasına hafifçe vurun.
    6. Hücre süspansiyonunu 5 mL'lik bir pipetle 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın. H9-ESC kolonilerini bir Pasteur pitette ile karıştırmak için 3-5 kez yukarı ve aşağı hafifçe yeniden süspanse edin. 20-100 μL hücre süspansiyonunu yeni bir ECM kaplı 6 oyuklu kültür kabına aktarın ve ileri geri sallayın.
    7. Mikroskop altında hücre yoğunluğunun yeterli olduğu gözlendiğinde, plakayı 37 °C'de %5CO2 altında en az 24 saat dokunmadan inkübe edin.
    8. Medyayı günlük olarak değiştirin. %70 klon yoğunluğu ve üzerinde geçiş gereklidir.

3. İnsan NR'lerinin üretilmesi

NOT: Koloniler yaklaşık% 70 birleşme elde ettikten sonra, Şekil 1'de özetlenen prosedür adımları kullanılarak retinal organoidlere (RO'lar) farklılaşmaya yönlendirilebilirler.

  1. 0. Gün - Embriyoid cisim (EB) oluşumu
    1. Hücreleri 2 mL DPBS ile yıkadıktan sonra, kuyuya 20 μM Y27632 içeren 0.5 mL CDS ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
      NOT: Mikroskop altında kontrol edin. Hücreler üzerinde zararlı etkilerden kaçınmak için inkübasyon süresini mümkün olduğunca azaltın.
    2. 20 μM Y27632 içeren 3 mL MM ekleyerek sindirimi durdurun. 5 dakika boyunca 190 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    3. Hücre peletini 20 μM Y27632 içeren 1 mL gfCDM'de yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 ve 100 nM LDN-193189 ile önceden dahil edilmiş 10 mL gfCDM'ye 1.2 × 106 hücre (kuyu başına 1.2 × 104 hücre) için karşılık gelen hacmi ekleyin (bkz.
    4. 96 V tabanlı konik kuyucuğun her bir kuyucuğuna 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Plakayı 6. güne kadar nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
      NOT: EB'lerin yapışmasını artırmak için bulaşıkları en az 24 saat hareket ettirmeyin.
  2. 6. Gün - Retina indüksiyonu
    1. 6. günde, EB'lerde kültür ortamının tam bir değişimine izin vermek için 55 ng / mL BMP4 içeren 10 mL gfCDM ekleyin. Plakayı inkübatöre geri koyun.
      NOT: Hava kabarcıklarını önlemek için 96 V tabanlı konik kuyunun duvarlarına doğru pipetleyin. Ortamı değiştirirken herhangi bir organoid almaktan kaçının.
    2. 9. gün, 12. gün ve 15. günde yarı-orta değişim gerçekleştirin. BMP4'ü kademeli olarak seyreltmek için ortamın yarısını taze gfCDM ile değiştirin.
  3. 18. Gün - Uzun süreli NR kültürü
    1. 18. günde, oluşan EB'leri 5 mL Pasteur pipetleri kullanarak dikkatlice 15 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın ve NRDM ile nazikçe tekrar durulayın. EB'leri düşük adsorpsiyonlu 6 oyuklu veya 24 oyuklu plakalara aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Plakayı inkübatöre geri koyun.
    2. Ortamı her 3 günde bir taze NRDM ile değiştirin.
      NOT: RA ışığa duyarlı olduğu için ortam değişimi sırasında ışığı kapatın. Kötü farklılaşmış organoidleri çıkarın ve yapışık organoidleri mikroskop altında ayırın.

4. İnsan NR'lerinin analizi

  1. RO'ların montajı
    1. Üç parti RO'yu indüklemek için farklı nesil H9-ESC'ler seçin.
      NOT: İndüksiyon başarı oranını değerlendirmek için değerlendirilen üç yöntemin her biri (Kuwahara ve ark.12, Döpper ve ark.27 ve bu çalışmadaki modifiye yöntem) için oluşturan NR sayısının üç plakası hesaplanmıştır. Işık mikroskobu 30. günde nöroepitel benzeri yapıların oluşumunu ortaya çıkarırsa indüksiyon başarılı kabul edilir.
  2. RO'ların immünofloresan boyanması
    1. 3-5 RO'yu 1.5 mL'lik tüplere aktarın. Fazla ortamı pipetleyin ve RO'ları RT'de 1 mL DPBS ile bir kez yıkayın. RO'ların batmasına izin verin ve DPBS'yi dikkatlice çıkarın. 1.5 mL tüp başına 1 mL %4 paraformaldehit ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 4 °C'de sabitleyin.
      NOT: 6. ve 18. gündeki RO'lar, 2 saat düzeltin. 30. günde 12 saat ve 60. günde 14 saat sabitleyin.
    2. Fiksasyondan sonra, gradyan alkol kullanarak dehidre edin. RO'ları %50, %60 ve %70 alkolde 15 dakika ve ardından %80, %90, %95, %100 ve %100 alkolde 10 dakika bekletin. Ardından, 10 dakika boyunca 1:1 oranında %100 alkol ve ksilen karışımı, ardından her biri 10 dakika boyunca iki kez ksilen ekleyin.
    3. RO'ları 40 dakika boyunca erimiş paraplastla doldurulmuş metal kalıplara yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ardından RO'ları sabitlemek için kalıpları buz üzerinde söndürün. Gömme kutularını kalıplara yerleştirin ve gece boyunca -20 °C'de dondurun. Ardından, gömme kutularını dikkatlice çıkarın. Son olarak, bunları RT'de saklayın.
    4. Parafin dilimleyici ile sürekli kesitler (5 μm kalınlıkta) oluşturun. Dilimleri yapışma mikroskobu slaytlarına sabitleyin, kurutun ve RT'de saklayın.
    5. Antijen onarımından önce mum alma ve rehidrasyon gerçekleştirin12,27.
    6. 190 mLddH2O'ya(çift damıtılmışH2O) 10 mL 20x pH 6.0 Sitrat Antijen Alma Çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Kaynayana kadar 4 dakika mikrodalgada yüksek modda ısıtın. Parafin bölümlerini ekledikten sonra, antijen onarımını tamamlamak için bölümleri düşük modda 20 dakika ısıtın.
    7. Parafin bölümlerinin havalandırılan bir alanda doğal olarak soğumasına izin verin ve ardından nemli bir odaya koyun.
    8. Bölümlerin ana hatlarını çizmek için bir pap kalem kullanın (Malzeme Tablosuna bakın). Membranları kırmak için RT'de% 0.2 Triton X-100 ile 30 dakika inkübe edin, ardından slaytları her biri 5 dakika boyunca TPBS ile üç kez yıkayın.
    9. Boyama alanı başına 10 μL ile nemli bir odada 1 saat boyunca RT'de DPBS'de seyreltilmiş% 10 eşek serumu ile bloklayın.
    10. % 10 eşek serumu ile seyreltilmiş primer antikorları ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de bir nem odasında inkübe edin. Bağlanmamış antikoru çıkarmak için numuneleri TPBS ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
      NOT: Primer antikorlar aşağıdaki gibidir: anti-PAX6 (1: 250), anti-SOX2 (1: 200), anti-KI67 (1: 200), anti-CHX10 (1: 200), anti-β tubulin III (1: 250) ve anti-NESTIN (1: 200) (bkz.
    11. Nemlendirilmiş bir odada RT'de 1 saat boyunca DPBS'de seyreltilmiş ikincil antikorlarla inkübe edin. TPBS ile yıkama adımını her biri 10 dakika boyunca üç kez tekrarlayın.
      NOT: Floresan sekonder antikorun sönmesini önlemek için karanlıkta tutun. İkincil antikorlar, eşek anti-fare IgG ile konjuge Alexa Fluor 488 ve eşek anti-tavşan IgG ile 1:400 seyreltmede konjuge Alexa Fluor 568'dir (bkz.
    12. DAPI içeren DPBS (1: 500; Malzeme Tablosuna bakınız) ile karanlıkta RT'de 10 dakika inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca TPBS ile üç kez yıkayın.
    13. Sürgünün üzerine uygun miktarda anti-floresan sızdırmazlık maddesi ( Malzeme Tablosuna bakın) damlatın ve kapak fişleriyle örtün.
    14. Akış benzeri bir doku hücresi kantitatif analizörü (Malzeme Tablosuna bakın) veya benzerini kullanarak görselleştirin.
    15. Slaytları mikroskobik analizden sonra karanlıkta -20 °C'de saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Değiştirilen protokolün grafiksel bir özeti Şekil 1'de gösterilmektedir. H9-ESC'ler, hücreler p-80'lik bir yoğunluğa büyütüldüğünde RO'ları üretmek için kullanıldı. 96 V tabanlı konik kuyuda H9-ESC'lerin tek hücreli süspansiyonları 1. günde toplandı ve 6. günde iyi sınırlandırılmış yuvarlak EB'ler oluşturdu. Kültür zamanı arttıkça, EB'lerin hacmi giderek arttı. 30. günde, uzun süreli NR farklılaşması sırasında nöroepitel benzeri yapılar açıkça oluştu ve kalınlaştı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan RO'ları, fetal retinanın gelişimini uzamsal ve zamansal olarak özetleyebilir ve erken RO'lar, gelişimin eşdeğer aşamalarında fetal retinaya yüksek derecede benzerlik gösterir15. Doku morfolojisi ve moleküler ekspresyon açısından, insan RO'su retina dokusunun gerçek büyüme durumunu yakından yansıtır ve hastalık modellemesi, ilaç taraması ve rejeneratif tıp alanlarında muazzam ve benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Şu anda, in vitro insan PSC'lerinden RO'lar üretmek için birkaç farklı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiç kimse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,01 M TPBSServicebioG0002Yıkama dilimleri
%4 ParaformaldehitServicebioG1101-500MLRetinal organoidleri düzeltin
5 mL Pasteur pipetiNEST Biyoteknoloji318516Pipet retinal organoidler
96 V tabanlı konik kuyuSumitomo BakelitMS-9096VZ
Yapışma Mikroskobu SlaytlarıCITOTEST188105Dilimleri sabitleyin
AggreWell ortaSTEMCELL Teknolojileri5893Orta
Susuz etanolSINOPHARM10009218Dehidrat 
Anti-CHX10Santa Cruzsc-365519Birincil antikor
Antifade ÇözeltisiZSGB-BIOZLI-9556
Anti-KI67Abcamab16667Birincil antikor
Anti-NESTINSigmaN5413Birincil antikor
Anti-Nöronal Sınıf III β-Tubulin (TUJ1)BeyotimeAT809Birincil antikor
Anti-PAX6Abcamab195045Birincil antikor
Hücre ayrışma çözeltisi (CDS)KÖK HÜCRE Teknolojileri7922Hücre ayrışması
CHIR99021SelleckchemS2924GSK-3 & alfa; /β inhibitör
Kolesterol Lipid KonsantresiGibco12531018250 kez;
Sitrat Antijen Alma ÇözeltisiServicebioG1202-250ML20 kez;, pH 6.0
CS10KÖK HÜCRE Teknolojileri1001061Hücre Dondurma Ortamı
DAPIRoche10236276001Nükleer karşı leke
Dimetil sülfoksit (DMSO)SigmaD2650
DMEM / F12Gibco11330032Orta
DMEM/F12-GlutaMAXGibco10565018Orta Eşek
Anti-Fare Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32766İkincil Antikor Eşek
Anti-Tavşan Alexa Fluor 568InvitrogenA10042İkincil Antikor
Etilen Diamin Tetraasetik Asit (EDTA)BiosharpBL518A0.5 M, pH 8.0, hücre ayrışması
Hücre dışı matris (ECM)Corning354277Kaplama plakaları
F12-GlutamaxGibco31765035Orta Fetal
Sığır SerumuGibcoA5669701
Akış benzeri doku hücresi kantitatif analizörüTissueGnosticsTissueFAXS PlusTarama bölümleri
IMDM-GlutaMAXGibco31980030Orta
IWR1-endoSelleckchemS7086Wnt inhibitörü
KnockOut Serum DeğiştirmeGibco10828028
LDN-193189 2HClSelleckchemS7507BMP inhibitörü
Düşük yapışma 24 oyuklu PlakalarCorning3473
Düşük yapışma 6 oyuklu PlakalarCorning3471
Bakım ortamı (MM)KÖK HÜCRE Teknolojileri85850Orta N2
takviyesiGibco17502048
Normal Eşek SerumuSolarbioSL050Engelleme tamponu
ParaplastLeica39601006Doku gömme
PBS pH 7.4 bazik (1x)GibcoC10010500BTCa +, Mg +
Rekonbinant insan kemiği morfogenetik proteini-4 (rhBMP4)R & D314-BPAnahtar protein faktörü
Retinoik asitSigmaR2625Tozu, ışıktan uzak tutun
SB431542SelleckchemS1067ALK5 inhibitörü
SU5402SelleckchemS7667Tirozin kinaz inhibitörü
Süper PAP KalemiZSGB-BIOZLI-9305
TaurinSigmaT0625-10G
TiyogliserolSigmaM1753
Triton X-100SigmaX100Geçirgenlik
WA09 embriyonik kök hücre hattıWiCell Araştırma EnstitüsüHücre hattı
KsilenSINOPHARM10023418Mum Alma
Y-27632 2HCLSelleckchemS1049KAYA inhibitörü

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  2. Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
  3. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  4. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
  5. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
  6. Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
  7. Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022(2021).
  8. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  9. Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
  10. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
  11. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286(2015).
  13. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047(2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  16. Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205(2019).
  18. Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
  19. Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39(2022).
  20. Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212(2021).
  21. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  22. Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478(2022).
  23. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439(2021).
  24. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  25. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  26. Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
  27. Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120(2020).
  28. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Retinal OrganoidlerRetinal DiferansiyasyonHastal k Modellemela TaramaH cre TedavisiRetinal nd ksiyonEmbriyoid CisimlerBMP4 nd ksiyonu

İlgili makaleler