Ameliyat Sonrası İleus Murin Modeli

Özet

Bu çalışmada, intestinal manipülasyon ile oluşturulan postoperatif ileusun bir murin modeli tanımlanmıştır. Gastrointestinal geçiş fonksiyonu, patolojik değişiklikler ve immün hücre aktivasyonu ameliyattan 24 saat sonra değerlendirildi.

Özet

Çoğu hasta, ameliyattan sonra artmış morbidite, mortalite ve hastanede kalış süresi ile ilişkili olan postoperatif ileus (POI) yaşar. POI, ameliyat sırasında mekanik hasarın bir sonucudur ve gastrointestinal sistemde motilitenin bozulmasına neden olur. POI mekanizmaları anormal nöronal duyarlılık, bozulmuş epitel bariyer fonksiyonu ve artmış lokal inflamasyon ile ilişkilidir. Ancak, ayrıntılar esrarengiz olmaya devam ediyor. Bu nedenle, deneysel murin modelleri, POI hasarının patofizyolojisi ve mekanizmasının aydınlatılması ve yeni tedavilerin geliştirilmesi için çok önemlidir.

Burada, klinik cerrahiye benzer şekilde bağırsak manipülasyonu (IM) yoluyla oluşturulan bir fare POI modelini tanıtıyoruz; Bu, pamuklu çubukla karın bölgesine 1-3 kez masaj yapılarak ince bağırsağa mekanik hasar verilmesiyle elde edilir. IM, segmental sindirim sisteminin FITC-dekstran gavajı ve floresan tespiti ile değerlendirildiği gibi, ameliyattan 24 saat sonra gastrointestinal geçişi geciktirdi. Ayrıca, submukozanın doku şişmesi ve immün hücre infiltrasyonu hematoksilen ve eozin boyaması ve akım sitometrisi ile araştırıldı. IM'nin uygun basıncı ve bağırsak üzerinde hiperemik bir etki prosedür için kritik öneme sahiptir. Bu murin POI modeli, abdominal cerrahi sonrası bağırsak hasarı ve iyileşme mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Postoperatif ileus (POI), insan sağlığı alanında, özellikle abdominal cerrahi geçiren hastaların yönetiminde önemli bir sorun teşkil eden bir sendromdur. Gastrointestinal motilitenin gecikmiş iyileşmesi ile karakterize edilen POI, hastanede kalış sürelerinin uzamasına ve sağlık bakım maliyetlerinin artmasına katkıda bulunur, ancak yerleşik bir tanım, etiyoloji veya tedavi yoktur¹. Son araştırmalar, POI ^2,3,4'ün ilerlemesinde bağışıklık hücrelerinin önemli rolüne ışık tutmuştur, ancak ilgili altta yatan mekanizmaları aydınlatmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Bu protokolde, karın içi cerrahinin neden olduğu ve karın cerrahisinin sindirim sistemi üzerindeki etkisini yakından taklit eden bir murin POI modeli sunuyoruz. Amacımız, farelerde POI'yi modellemek için standart bir yöntem sağlamak, araştırmacıların patofizyolojisini araştırmalarını ve yeni terapötik müdahaleleri keşfetmelerini sağlamaktı.

Bu tekniğin geliştirilmesi ve kullanılmasının ardındaki mantık, POI'yi incelemek için güvenilir preklinik modellere duyulan ihtiyaçta yatmaktadır. POI'yi incelemeye yönelik geleneksel yaklaşımlar genellikle çeviri ilgisinden yoksundur veya duruma katkıda bulunan faktörlerin karmaşık etkileşimini yakalayamaz. Araştırmacılar, klinik senaryoyu yakından kopyalayan bir fare modeli sunarak, POI'nin altında yatan mekanizmaları daha doğru bir şekilde araştırabilir ve kontrollü bir deneysel ortamda potansiyel terapötik müdahaleleri test edebilir.

Alternatif tekniklerle karşılaştırıldığında, bu protokolde sunulan POI'nin murin modeli çeşitli avantajlar sunmaktadır. Başlangıçta, deney hayvanlarında POI'yi indüklemek için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir protokol oluşturmak için deneysel bulgularımızı son gelişmelerle bütünleştirdik. Bu protokol, gastrointestinal geçiş fonksiyonunun tutarlı bir şekilde değerlendirilmesini kolaylaştırır. İkincisi, histolojik boyama ve akış sitometrisinin kullanılması, doku şişmesinin, bağışıklık hücresi proliferasyonunun ve aktivasyonunun değerlendirilmesini sağlayarak, POI^5'in altında yatan inflamatuar süreçler hakkında değerli bilgiler verdi.

Literatürün daha geniş bağlamında, bir fare POI modeli oluşturmak, bu durumun patofizyolojisini anlamayı amaçlayan genişleyen araştırma grubuna katkıda bulunur. Klinik öncesi modeller, temel bilim ve klinik uygulama arasındaki boşluğu doldurarak, POI⁶ için yeni terapötik stratejiler geliştirmede çok önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca, standartlaştırılmış hayvan modellerinin mevcudiyeti, araştırma bulgularının farklı laboratuvarlarda tekrarlanabilirliğini ve karşılaştırılabilirliğini artırır. Bununla birlikte, bu POI modeli, cerrahi prosedür sırasında mekanik stimülasyona dayanır. Stimülasyona bağlı ileusun diğer formları bu model için uygun olmayabilir. Ek olarak, araştırmacılar bu modeli kullanarak deneyleri planlarken hayvan refahı düzenlemeleri, etik hususlar ve kaynak mevcudiyeti gibi faktörleri göz önünde bulundurmalıdır.

Özetle, bir fare POI modelinin tanıtılması, bu zayıflatıcı durumla ilgili klinik öncesi araştırmalarda kayda değer bir ilerlemeyi ifade etmektedir. Ek olarak, doku şişmesini ve bağışıklık hücresi proliferasyonunu ve aktivasyonunu değerlendirmek için H&E boyama ve akış sitometrisi kullandık. Bir murin POI modelinin oluşturulması, POI mekanizmalarının keşfini kolaylaştıracak ve POI için yeni tedavilerin geliştirilmesini teşvik edecektir.

Protokol

Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, Hayvanların Bakımı ve Kullanımında Yol Gösterici İlkelere (Çin) uygun olarak yürütülmüş ve Pekin Dostluk Hastanesi Etik İnceleme Komitesi (NO. 20-2056) tarafından onaylanmıştır. Çalışma için C57BL / 6 fareler (8-12 haftalık) kullanıldı.

1. Ameliyat için hazırlık

1. Deneysel koşulların standardizasyonunu karşılamak için planlanan modellemeden önce tüm fareleri 12 saat boyunca hızlı bir şekilde çalıştırın (Şekil 1A).
2. Cerrahi aletleri hazırlayın ve sterilize edin.
3. Anestezik tribromoetanolü ve ısıtma yastığını hazırlayın. Aşırı ısınmayı önlemek için ısıtma yastığını izleyin ve sabit bir sıcaklıkta (37,5 °C) tutun.

2. Anestezi

1. Her fareyi tribromoetanol ile uyuşturun.
   1. Normal tuzlu su içinde 20 mg / mL'lik bir çözelti hazırlamak için tribromoetanolü seyreltin. İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla 10 g vücut ağırlığı başına 0.2 mL tribromoetanol çalışma solüsyonu uygulayın. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için farelerin gözlerine oftalmik merhem kullanın.
   2. Farelerin 5 dakika içinde tamamen uyuşturulduğundan ve 20 dakika boyunca anestezi altında kaldığından emin olun.
2. Farenin dik duramadığını gözlemleyerek anestezi derinliğini değerlendirin ve kas gevşemesini kontrol edin. İstemli hareket kaybını, göz kırpma refleksini ve refleks stimülasyonuna yanıtı (sıkı bir basınçla ayak parmağı veya kuyruk tutam) gözlemleyin.
3. Göğüs duvarının ve karnın hareketini izleyerek farenin solunum hızını ve modelini değerlendirin. Optimal anestezi altında solunum hızının ~ 55-65 nefes / dak olduğundan emin olun.
4. Anestezi uygulanmış fareyi bir tahtaya yerleştirin ve bantla sabitleyin.
5. Fareler tamamen uyuşturulduktan sonra, karın bölgesindeki tüyleri almak için elektrikli bir saç tıraş makinesi kullanın. Tıraştan sonra, tuzlu suyla nemlendirilmiş bir pamuk top kullanarak karın bölgesindeki tüm gevşek tüyleri silin.
   NOT: Maruz kalma risklerini en aza indirmek için tribromoetanolü kullanırken uygun havalandırmayı ve çeker ocak veya biyogüvenlik kabininin kullanılmasını sağlayın. Prosedür sırasında, kimyasallar ve biyolojik malzemelerle kazara teması önlemek için eldivenler ve laboratuvar önlükleri de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.

3. Cerrahi

1. Karnı ortaya çıkarmak için uzuvları tamamen uzatın. Farenin kafasının temiz bir hava yolu sağlayacak şekilde konumlandırıldığından emin olun (Şekil 1B).
2. % 75 alkolle ıslatılmış bir pamuk top kullanarak cerrahi alanın cildini iki kez dezenfekte edin. Dezenfeksiyondan sonra, fazla alkolü karın bölgesinden çıkarmak için kuru, steril bir tıbbi gazlı bez kullanın. İnsizyondan önce amaçlanan bölgeye lidokain (deri altından 10 mg / kg) uygulayın.
3. Deride bir kesi yapmak için steril bir neşter kullanın ve cımbız kullanarak karnın ortasındaki rektus abdominis kasını kaldırın.
   1. Karın bölgesindeki çeşitli organların yaralanmasını önlemek için rektus abdominis kasının medyan çizgisi boyunca küçük bir kesi yapın.
   2. İnsizyonun yaklaşık aralığının aşağıdaki gibi olduğundan emin olun. Kesinin üst kenarının sternumun ksifoid işleminden 6-8 mm, alt kenarın dış genital bölgeden 6-8 mm ve kesi uzunluğunun ~1 cm olduğundan emin olun.
4. Karın kesisinin her iki tarafına bir parça steril cerrahi örtü veya steril gazlı bez yerleştirin. Steril gazlı bezi insizyonun üst ve alt kenarlarına sabitlemek için hemostatik forseps kullanın ve insizyonu açığa çıkarın (Şekil 1C).
   NOT: Sahte grupta herhangi bir cerrahi işlem yapılmadan kesi 5 dakika süreyle ıslak gazlı bez ile kapatıldı.
5. Steril örtüyü veya gazlı bezi düzgün bir şekilde sabitleyin, ardından insizyona bitişik karın duvarının her iki tarafına hafifçe bastırmak için tuzlu su ile önceden nemlendirilmiş iki pamuklu çubuk kullanın. Kesiden küçük bir miktar bağırsak tüpünü sıkın ve steril örtü veya gazlı bez üzerine yerleştirerek açığa çıkarın (Şekil 1D).
6. İki steril pamuklu çubuğu normal tuzlu su ile tamamen nemlendirin. Nemli pamuklu çubuklarla bağırsak dokusunu nazikçe kavrayın ve ince bağırsağı dikkatlice çıkarın.
   1. Çekumu bulun ve ardından pankreasa dokunmamak için mideden 2 cm öncesine kadar steril pamuklu çubuklarla bağırsağı çıkarın. Bağırsağı pankreato-duodenal ligamanın proksimal ucundan ileoçekal bölgenin distal ucuna kadar uzatın.
7. Proksimal kısımdan distal uçlara kadar tüm ince bağırsak boyunca tutarlı bir basınç uygulayın. Bağırsak yüzeyinde küçük kanama noktaları oluşana kadar 5 dakika boyunca düzgün kuvvet uygulamasını sağlayın (Şekil 1E).
8. 5 dakika sonra, ince bağırsağın normal fizyolojik anatomik pozisyonunu takip ederek tüm ince bağırsakları dikkatlice karın boşluğuna geri yerleştirmek için önceden nemlendirilmiş steril pamuklu çubuklar kullanın.
9. Bağırsağın doğal anatomik konumuna geri dönmesini sağlamak ve ameliyattan sonra yapay mekanik bağırsak tıkanıklığını veya mezenterik torsiyonu önlemek için steril gazlı bez ve karın duvarı boyunca karnı 3-5 saniye boyunca nazikçe masaj yapın.
10. Ameliyat sırasında kaybedilen sıvıları yerine koymak ve karın dokusunu yağlamak için karın boşluğuna 100 μL salin enjekte edin.
11. 6-0 cerrahi sütür kullanarak karnı kapatın ve karın kesisinde iki katmanlı bir kapatma gerçekleştirin. Karın organlarına zarar vermemeye özen göstererek, kas tabakasını sürekli dikişlerle kapatarak başlayın. Dikiş sırasında rektus abdominis kasını kaldırın (Şekil 1F).
12. Rektus abdominis kasını tamamen kapattıktan sonra 6-0 cerrahi dikiş kullanılarak basit aralıklı dikişlerle tamamen dikilir. ~0,5 mm'lik bir dikiş uzunluğunu ve ~2 mm'lik bir iğne aralığını koruyun.
13. Karın kesisini kapattıktan sonra, kesiğin yakınındaki alanı kuru ve kan, doku sıvısı veya normal tuzlu sudan temiz tutmak için kuru steril tıbbi gazlı bezle nazikçe silin.
14. Ameliyattan sonra ayrılmayı önlemek için insizyonun üzerine ve çevresine az miktarda tıbbi insizyon yapıştırıcısı sürün.
15. Tıbbi insizyon yapıştırıcısı tamamen kuruduktan sonra, fareleri bir kağıt havluya aktarın ve kafes kağıt havlusunu, fareler tamamen iyileşene kadar 37,5 ° C'lik sabit bir sıcaklıkta tutulan ısıtılmış bir battaniyenin üzerine yerleştirin. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanları gözetimsiz bırakmayın.
16. Uyanık fareleri hayvan besleme bariyeri ortamına aktarın ve algılama zamanına kadar serbestçe içmelerine izin verin.

4. Gastrointestinal geçiş testi

1. Ameliyattan 22.5 saat sonra açlık farelere 200 μL FITC-dekstran solüsyonu (PBS'de 5 mg / mL) uygulayın (Şekil 1A).
2. CO₂ inhalasyonu ve ardından servikal çıkık gibi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan bir yöntem kullanarak farelere ötenazi yapın.
   1. Sindirim sistemini izole etmek için, diyaframdan pelvise orta hat kesisi yapın ve çevredeki bağ dokularını ve organlarını dikkatlice çıkarın.
   2. Sindirim sistemini çevre doku ve organlardan ayırın, mideden anüse kadar olan tüm yolun dahil edilmesini sağlayın.
3. Sindirim sistemini fizyolojik pozisyona göre 1'den 15'e kadar sırayla numaralandırılmış 15 eşit bölüme (mideden kolona) bölün (sıra: St -S1: S10-Ce-L1: L3) (Şekil 2A).
4. Bağırsak dokusunun her bir segmentini içeriğiyle birlikte 1-4 mm'lik parçalar halinde kesin ve bunları 1 mL DPBS içeren ayrı 1.5 mL santrifüj tüplerine yerleştirin.
5. Numuneleri homojenize etmek için santrifüj tüplerini 10 saniye boyunca vorteksleyin.
6. Tüpleri 500 × g'da 1 dakika santrifüjleyin. Çok modlu bir mikroplaka okuyucu kullanarak FITC floresan ölçümü için süpernatanı toplayın.
7. FITC-dekstran'ın geometrik merkezini (GC) hesaplayarak gastrointestinal geçişi tanımlayın ve aşağıdaki formülü kullanarak hesaplayın: (Σ [segment x segment numarası başına % FITC]) / 100.

5. Parafin gömme ve hematoksilen ve eozin (HE) boyama

1. Fareleri CO₂ inhalasyonu ile ötenazi yapın ve ardından 24 saat sonra servikal çıkık yapın. Aynı hayvan üzerinde parafin gömme ve gastrointestinal testler yapın.
2. Karın boşluğunu açın ve daha fazla analiz için ince bağırsak dokusunu toplayın.
3. Tüm bağırsağı bağırsak içeriği ile Carnoy'un fiksatifinde (%60 metanol + %10 asetik asit + %30 kloroform) 4 ° C'de 2 saat sabitleyin.
4. Her seferinde 30 dakika boyunca metanol ile iki kez durulayarak dokuyu asitten arındırın.
5. Metanolü her seferinde 30 dakika boyunca iki kez etanol ile değiştirin.
6. Her seferinde 30 dakika boyunca metanol ile iki kez durulayarak dokuyu asitten arındırın. Ksilen ile doku şeffaflığı elde etmek için, dokuyu ksilene daldırın ve 1 saat inkübe edin.
7. Bir parafin gömme makinesi kullanarak dokuyu parafin mumuna gömün. Gömülü dokuyu bir mikrotom kullanarak 4 μm kalınlığında dilimler halinde kesin.
   NOT: Daha iyi performans için ince bağırsağı farklı mumlara bölün. Konumlarını belirlemek için segmentleri uygun şekilde etiketleyin.
8. HE boyama kitini kullanarak HE boyama işlemini gerçekleştirin. Slaytları kapatın ve analiz için mikroskop altında inceleyin.

6. İmmün hücre izolasyonu ve akış sitometrisi

1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
   1. Ön sindirim çözeltisi: Hank'in dengeli tuz çözeltisini 1 mM ditiotreitol (DTT) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile Ca¹ + ve Mg¹⁰ + olmadan hazırlayın.
   2. Sindirim çözeltisi: RPMI 1640'ta 200 μg/mL DNAaz I, 500 μg/mL kollajenaz IV, %4 FBS ve 100 μM HEPES tamponu içeren bir çözelti hazırlayın.
   3. Manyetik ile aktive edilen hücre sıralama işleri (MACS) tamponu: Ca²⁺ veya Mg 2⁺ olmadan PBS'de 5 g/L BSA ve 2 mM EDTA içeren bir tampon hazırlayın.
2. Bağırsakları normal tuzlu su ile yıkayarak dışkı içeriğini çıkarın. Peyer'in yamalarını ve ince bağırsağın bağ dokusunu çıkarın. İnce bağırsakları uzunlamasına kesin ve ardından buz gibi PBS'de 1 cm'lik segmentler halinde kesin.
3. Bağırsak segmentlerini ön sindirim solüsyonu ile 37 ° C'de 20 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcıda yıkayın. Ön sindirim solüsyonunu toplayın ve intraepitelyal lenfositler (IEL'ler) elde etmek için 70 μm hücre süzgeçlerinden süzün.
4. Sindirim solüsyonundaki segmentleri 30 dakika boyunca sindirin ve ardından lamina propria lenfositleri (LPL'ler) elde etmek için süspansiyonu 70 μm hücre süzgeçlerinden süzün.
5. LPL hücrelerini 500 × g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
6. Hücreleri 1 x 10⁶ hücre / 100 μL konsantrasyonda DPBS (sodyum azid, Tris ve protein içermeyen) ile yıkayın ve askıya alın.
7. Hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca floresan canlılık boyası (1:500) ile inkübe edin.
8. Hücreleri MACS tamponu ile askıya alın ve 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleyin.
9. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak lekeli hücreleri sayın. Hücreleri 1 x 10⁶ hücre / 100 μL MACS tamponu konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonuna uygun hacimde antikor ekleyerek ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe ederek antikor boyaması (1: 200-1: 400) gerçekleştirin.
10. Hücreleri adım 6.8'de anlatıldığı gibi yıkayın.
11. Akış sitometrisi kullanarak numuneleri tespit edin ve ilgili akış sitometrisi yazılımı ^7,8 ile verileri analiz edin.

Sonuçlar

Bu protokolde, POI, klinik cerrahinin etkisine benzer şekilde bağırsak manipülasyonu (IM) ile cerrahi olarak indüklendi. Sahte grupta, IM olmadan bir kesi yapıldı. POI fareleri, sahte kontrol fareleri ile birlikte POI ameliyatından 24 saat sonra sakrifiye edildi. Sindirim sisteminin kritik işlevi olan içerik geçiş işlevi, FITC-dekstran'in gavajı ile tespit edildi. İnce bağırsağın proksimal kısmında FITC yoğunluğu arttığı için POI modeli başarılı kabul edildi (Şekil 2B). Ortalama GC'ler, IM'nin transit disfonksiyonunu ölçmek ve operasyonun tutarlılığını göstermek için hesaplandı (Şekil 2C).

HE boyama, sindirim sisteminin farklı segmentlerinin morfolojisini gösterdi (Şekil 3). Duodenum ve ileumun submukoza ve düz kas tabakası POI indüksiyonundan 24 saat sonra şişti (Şekil 3A,B). Sahte farelerdekilerle karşılaştırıldığında, duodenumun HE boyaması, POI farelerinde artmış bağışıklık hücresi infiltrasyonunu ortaya çıkardı (Şekil 3A).

Çok renkli akış sitometrik analizi, bağışıklık hücrelerinin oranını, durumunu ve işlevini analiz etmek için merkezi yöntemdir. Bağırsak dokusu kollajenaz ve deoksiribonükleaz ile sindirildi ve akış sitometrisi için tek hücreli bir süspansiyona ayrıldı. Geçit stratejisi, LPL'ler arasındaki CD3 T hücrelerinin ve ilgili alt popülasyonların oranlarını belirlemek için kullanıldı (Şekil 4A). Aktivasyon ve adezyon markörü CD69 ve CD4 T hücrelerinin, CD8 T hücrelerinin ve gd T hücrelerinin ekspresyonu POI farelerinde yukarı regüle edilir (Şekil 4B)⁷. Benzer şekilde, CD44+ PD-1 + (aktivasyon, terminal farklılaşması ve tükenme belirteci) alt popülasyonunun oranı artan bir eğilim göstermiştir (Şekil 4C)⁷. Lenfositlere ek olarak, miyeloid hücre alt kümelerinin (nötrofiller, dendritik hücreler ve makrofajlar) oranları da IM cerrahisinden sonra artar (Şekil 4D)⁸.

Şekil 1: Postoperatif ileusun murin modeli. (A) Postoperatif ileusun murin modelinin şeması. (B) Anestezi ve tıraştan sonra fare fiksasyonu. (C) Kesi açığa çıkarıldı ve tıbbi steril bir gazlı bezle kapatıldı. (D) Bağırsak tüpleri, karın insizyonu ile karın boşluğundan dışarı sıkıştırıldı ve steril gazlı bez üzerine yerleştirilerek açığa çıkarıldı. (E) İnce bağırsağın tamamı nemlendirilmiş steril bir pamuklu çubuğa maruz bırakıldı. (F) Kas tabakası cerrahi dikişle kapatıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Sindirim sistemi fonksiyon değerlendirmesi için gastrointestinal geçiş testi. Ameliyattan 22.5 saat sonra, sahte veya POI fareleri FITC-dekstran solüsyonu ile gavaj edildi ve 90 dakika sonra sakrifiye edildi. (A) Sindirim sistemi 15 bölüme ayrıldı ve fizyolojik pozisyona göre numaralandırıldı. (B) Sahte ve POI farelerinin sindirim sistemlerinden her segmentin FITC yoğunluğu. (C) Uygulanan FITC-dekstranın geometrik merkezleri hesaplanmış ve keman grafikleri olarak gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: POI farelerinin ince bağırsağının temsili HE boyanması. Sahte ve POI farelerinden (A) duodenum ve (B) ileumun enine kesitlerinin HE boyanması. Ölçek çubukları: 100 μm veya 25 μm (iç kısmın yakınlaştırılmış görüntüsü). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: POI farelerinden ince bağırsak bağışıklık hücrelerinin temsili akış sitometrik analizi. (A) Ameliyattan 24 saat sonra POI farelerinin ince bağırsak dokularından T hücresi popülasyonları için akış sitometrisi geçit stratejisi. (B) CD4 T hücrelerinde, CD8 T hücrelerinde ve sahte ve POI farelerinin ince bağırsağından alınan gd T hücrelerinde T hücresi aktif işaretleyici CD69 ⁺ oranları. (C) Sahte ve POI farelerinin ince bağırsaklarındaki CD4 T hücreleri, CD8 T hücreleri ve gd T hücreleri arasındaki CD44 ⁺ PD-1 ⁺ aktif belirteçlerin oranları. (D) CD45 ⁺ Aqua^- sahte ve POI farelerinin ince bağırsaklarından alınan canlı bağışıklık hücreleri arasındaki nötrofillerin (Ly6G ⁺ CD11b ⁺ CD11b ⁺ ), dendritik hücrelerin (CD11c + MHC-II ⁺) ve makrofajların (CD11b ⁺ F4 / 80⁺) oranları. Her paneldeki sayı, ilgili hücre türlerinin yüzdesini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Cerrahinin başarısı birkaç kritik adıma dayanır. İlk olarak, bağırsak intramural (IM) cerrahisi sırasında tutarlılığı korumak, ince bağırsakta geniş çaplı yaralanmaya neden olmak için zorunludur. IM işlemi sırasında uygulanan uygun basınç ve bunun barsakta ortaya çıkan hiperemik etki cerrahi başarı için çok önemlidir. Pamuklu çubukla ovulduktan sonra tüm sindirim sisteminin pembeye döndüğü ve kırmızı hemorajik lekeler gösterdiği gözlemi, başarılı bir operasyonun göstergesi olarak hizmet etti. Ek olarak, ameliyattan sonra ortalama GC değerinin yaklaşık 5'te kalmasının sağlanması, modelin sahte ameliyatlı farelere kıyasla başarılı olduğunu gösterir. HE boyama ile gösterildiği gibi, submukozadaki doku şişmesinin ve bağışıklık hücresi infiltrasyonunun mikroskobik incelemesi, POI'nin ciddiyetinin doğrulanmasında kritik bir adım olarak da hizmet eder.

Sonuçları optimize etmek veya karşılaşılan zorlukları gidermek için protokolde değişiklikler yapılması gerekebilir. Örneğin, bağırsak epitelindeki morfolojik değişiklikleri doğru bir şekilde göstermek için, bağırsak dokusunun içeriğiyle birlikte Carnoy fiksatifi kullanılarak gömülmesi önerilir⁹. Bu benzersiz gömme protokolü, doku morfolojisini korumak için gerekli olan hızlı fiksasyonu sağlar. Bununla birlikte, araştırmacının hedefleri epitel veya lamina propriaya odaklanıyorsa, bağırsak dokusu hazırlığının balmumu gömülmesi için geliştirilmiş İsviçre haddeleme tekniğinin kullanılması tavsiye edilir¹⁰. Bu teknik, bağırsak dokusunun ara boşluğunu sıkıştırır ve tüm ince bağırsağın balmumu gömülü bir numuneye gömülmesini kolaylaştırarak tutarlı bir villus yönü sağlar.

Faydasına rağmen, protokolün sınırlamaları vardır. Bir sınırlama, insan patofizyolojisinin karmaşıklığını tam olarak kopyalayamayan hayvan modellerine güvenmektir. Ek olarak, cerrahi teknikteki ve bireysel fare tepkilerindeki farklılıklar sonuçlarda değişkenliğe neden olabilir. Son çalışmamıza göre, tutarlı bir operatör kullanmak, operatöre bağlı değişkenliği azaltmak için önemli bir ilkedir. Ayrıca, Van ve ark. bağırsağa belirli bir ağırlık uygulayabilen ve farklı fareler arasında IM üzerinde tutarlı bir basınç sağlayan kendi kendine yapılmış bir cihaz tanıttı¹¹. Bu yaklaşım gerçekten de modelin tutarlılığını korumada değerli olduğunu kanıtlıyor.

Bu protokol, farelerde IM cerrahisi yoluyla POI'yi indüklemek için standartlaştırılmış bir yöntem sağlayarak alana değerli bir katkıyı temsil eder. Bu protokol, kritik adımları açıklığa kavuşturarak ve doku yerleştirme ve bağışıklık hücresi izolasyonu için modifikasyonlar sunarak, POI modellemesinde tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği artırır. İmmün hücre analizi için akış sitometrisi ^7,8'in kullanılması, POI patogenezinin altında yatan immün yanıtın kapsamlı bir şekilde araştırılmasına olanak tanır, mevcut teknikleri tamamlar ve bu karmaşık sendrom hakkındaki anlayışımızı genişletir.

Burada sunulan protokol, POI'yi anlama ve tedavi etmeye odaklanan gelecekteki klinik öncesi araştırmalar için umut vaat etmektedir. Araştırmacılar, cerrahi teknikleri rafine ederek ve doku işleme yöntemlerini optimize ederek, POI gelişiminin altında yatan mekanizmaları daha fazla keşfedebilir ve yeni terapötik hedefleri belirleyebilirler. Ek olarak, protokolün akış sitometrisi ile uyumluluğu, POI semptomlarını hafifletmeyi amaçlayan bağışıklık modüle edici müdahaleleri araştırmak için yollar açarak derinlemesine bağışıklık profili oluşturmayı mümkün kılar. Genel olarak, protokol, POI bilgimizi ilerletmek ve hasta sonuçlarını iyileştirmek için hedefe yönelik terapötik stratejiler geliştirmek için zemin hazırlamaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 M HEPES	Thermo	15630080
APC anti-fare I-A/I-E (MHC-II)Biolegend		107614
APC anti-fare TCRb	Biolegend	109212
APC/Cy7 anti-fare CD4	Biolegend	100414
APC/Cy7 anti-fare Ly6G	Biolegend	127624
Brilliant Violet 421 anti-fare CD69	Biolegend	104545
Brilliant Violet 421 anti-fare F4/80	Biolegend	123132
Brilliant Violet 785 anti-fare/insan CD44	Biolegend	103041
BUV395 anti-fare CD8a	BD	563786
BUV737 anti-fare CD3e	BD	612771
Kollajenaz IV	Sigma-Aldrich	C5138
Kültür Mikroskobu	CKX53	Sığır
Deoksiribonükleaz I (DNaz I)	Sigma-Aldrich	DN25-5G
DL-Dithiothreitol çözeltisi	Sigma-Aldrich	43816-10ML
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G
FITC anti-fare CD45	Biolegend
FITC-dekstran (70 kWM)	Sigma-Aldrich	FD70-100MG	Gastrointestinal Transit Testi
HE boyama kiti	solarbio	G1120
PE anti-fare CD11b	Biolegend	101208
PE anti-fare PD-1	Biolegend	114118
PE / Cy7 anti-fare CD11c	Biolegend	117318
Percoll	GE (Eczacı)	17-0891-01
Senfoni A5 Akış sitometresi	BD-İmmün		hücre tespiti ve sınıflandırması
Tribromoetanol	Sigma-Aldrich	T48402	Anestezi
Varioskan LUX	Thermo	N16699	Çok modlu mikroplaka okuyucu
Zombie Aqua Tamir Edilebilir Canlılık kiti	Biolegend	423102	Floresan Canlılık Boya