Bir Fare Cerrahi Modelinde Genişletilmiş %78 Hepatektomi

İlk olarak 1931'de tanımlanan fare ve sıçan cerrahi karaciğer rezeksiyonu modelleri, karaciğer rejenerasyonunun moleküler temelini incelemek için kullanılan en yaygın deneysel modellerdir. Ayrıca, uzun süreli karaciğer rezeksiyonu veya suboptimal karaciğer greftlerinin^naklini takiben sonuçları iyileştirmek için stratejileri test etmek ve geliştirmek için translasyonel bilim araştırmalarında da yararlı olabilirler 1,2,3,4. Farelerde kısmi hepatektomiler (PH), toplam karaciğer kütlesinin (TLM) yaklaşık 2/3'ünün (% 66) çıkarılmasını gerektirir ve bu, sağlıklı hayvanlarda yapıldığında istisnai sonuçlara sahiptir⁵. Prosedürün süresi kısadır, fare karaciğeri anatomisindeki çok az değişiklik nedeniyle kolayca tekrarlanabilir ve ameliyat sonrası sağkalım tipik olarak %100'e ^yakındır1.

Sol lob (LL) ve median lobun (ML) rezeksiyonunu kapsayan parsiyel 2/3 hepatektomi, rezidüel lobların lober inflamasyon veya hepatik giriş ve çıkışın kısıtlanması ile nispeten engellenmeden yenilenmesine izin verir. Daha ziyade, PH'ı takiben artan portal venöz akış ve ardından karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri üzerindeki kesme stresi, endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) ekspresyonunun ve ardından nitrik oksit (NO) salınımının sürekli olarak yukarı regülasyonuna neden olur, bu da hepatositlerin proliferasyon ve karaciğer rejenerasyonu için hazırlanmasına katkıda bulunur³. Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı gibi hastalık modellerinde veya spesifik genetik arka planlarda 2/3 PH'dan sonra yaygın olarak incelenen sonuçlar arasında akut karaciğer yetmezliği riski, karaciğer rejeneratif kapasitesinin kalitatif ve kantitatif ölçümleri ve stres veya travmatik yaralanmaya karşı diğer biyolojik yanıtlar yer alır ^1,3.

Bununla birlikte, kanser için uzun süreli karaciğer rezeksiyonu veya marjinal (steatoz veya uzamış iskemik zaman) veya kısmi (bölünmüş veya canlı donör karaciğerden) karaciğer greftlerinin transplantasyonu sonrasında ortaya çıktığı gibi, fonksiyonel veya anatomik boyuta göre küçük sendromu taklit eden bir fare modeli, iyi bilinmeye devam etmektedir. Bu ihtiyacı karşılamak için, minimal (ve fonksiyonel) bir karaciğer kütlesinin korunmasının ötesine geçen daha kapsamlı karaciğer rezeksiyonu modelleri, boyuta göre küçük karaciğer sendromunu ve bu sendromla ilişkili yüksek mortaliteyi modellemek için gereklidir ^6,7.

Fare karaciğer anatomisi minimal varyasyon gösterir. Fare karaciğeri, her biri toplam karaciğer kütlesinin aşağıdaki yüzdesini oluşturan beş lobdan oluşur: sol lob (LL; %34.4 ± %1.9), medyan lob (ML; 26.2 ± %1.9), sağ üst (sağ üst olarak da adlandırılır) lob (RUL; 16.6 ± %1.4), sağ alt (sağ alt olarak da adlandırılır) lob (RLL; %14.7 ± %1.4) ve kaudat lob (CL, %8.1 ± %1.0)^{1, 5}. Her lob, hepatik arterin bir dalı, portal venin bir dalı ve bir safra kanalı⁵ dahil olmak üzere bir portal triad tarafından sağlanır. Tarihsel olarak, LL ve ML'yi rezeke ederek 2/3 PH gerçekleştirmek için çeşitli teknikler tanımlanmıştır. Bunlar şunları içerir: 1) rezeke edilen lobların her birinin tabanında tek bir ligatür en bloktan oluşan klasik teknik; 2) rezeke edilen lobların tabanına uygulanan titanyum klipsler kullanılarak hemostatik klips tekniği; 3) klempin proksimalinde delici dikişler kullanan damar yönelimli parankim koruyucu bir teknik; ve 4) lob rezeksiyonu^1'den önce portal ven ve hepatik arter dallarının bağlandığı damar odaklı bir mikrocerrahi teknik. Her tekniğin göreceli güçlü ve zayıf yönleri olsa da, hiçbiri daha yüksek ölümcüllük vermez ^1,8,9.

Bu çalışmada, farelerde uzamış %78 PH için yeni bir yöntem sunuyoruz. Bu modelde, LL, ML ve RUL dahil olmak üzere beş karaciğer lobundan üçü, bir ligatür tekniği kullanılarak ayrı ayrı çıkarılır (Şekil 1). Bu işlem toplam karaciğer kitlesinin yaklaşık %78'inin (± %5.2) rezeksiyonu ile sonuçlanır. Klasik PH tekniğinde olduğu gibi "en blok" yerine LL ve ML'yi ayrı ayrı çıkarmayı tercih etmemiz, bu iki lobun en blok rezeksiyonu ile ilişkili komplikasyonları en aza indirir, örneğin suprahepatik vena kava darlığı ve tek ligatür vena kavaya çok yakın uygulandığında kalan lobların nekroz riskinin artması 1^, 10,11,12,13,14. Bu, RUL'u kaldırmak için bu prosedürün son adımına geçmeden önce çok önemlidir. 8-12 haftalık, vahşi tip C57BL/6 farelerde yapılan bu kapsamlı hepatektomi, fulminan karaciğer yetmezliğine neden olan başarısız karaciğer rejenerasyonu nedeniyle ameliyattan sonraki 1 hafta içinde %50 ölümcüllüğe neden olur^15,16. Uzatılmış %78'lik hepatektomiyi takiben artan ölümcüllüğün bu fare modeli, boyuta göre küçük sendromun patofizyolojisini uygun şekilde özetler ve sonuçları iyileştirmek için yeni stratejilerin geliştirilmesini ve test edilmesini sağlar.

Bu prosedür protokolünde açıklanan yöntemler, Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi'ndeki (BIDMC) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler IACUC ve BIDMC hayvan araştırma tesisi yönergelerine uygun olarak ve bunlara uygun olarak tamamlanmıştır.

1. Fare ameliyat öncesi hazırlık

1. Fare karnını göğüs kafesinin ortasından suprapubik bölgeye kadar makasla tıraş edin.
2. % 100 oksijende% 1-4 izofluran ile genel anesteziyi indükleyin. Anestezi uygulandığında, fareyi altında bir ısıtma yastığı bulunan cerrahi alana sırtüstü yatırın. Bir kesi yapmadan önce, pedal refleksinin olmadığından emin olmak için ayak parmağınızı sıkıca sıkıştırın (varsa, hayvan yanıt verecektir). Genel anestezi durumuna ulaşmak için anestezi seviyesini gerektiği gibi ayarlayın.
   NOT: Yeterli genel anesteziyi sürdürmek için izofluranı gerektiği gibi titre edin.
3. Postoperatif analjezi için deri altından 1.2 mg / kg buprenorfin uzatılmış salimli (ER) uygulayın. Fareyi ön ayakları ve arka ayakları uzatılmış olarak sırtüstü yerleştirin ve uzuvları bantla sabitleyin; Daha sonra ameliyat için steril bir alan hazırlayın.
   NOT: Solunumun engellenmemesi için sabitlendiğinde ön ayakların gevşediğinden emin olun.
4. Karnı, her bir çubuk arasında 3 kez dönüşümlü olarak ılık steril salin ve betadin çubuklarıyla hazırlayın. Karnı steril bir şekilde örtün.

2. Hepatektomi

1. Bir neşter kullanarak ksifoid işleminden suprapubik bölgeye kadar deriden dikey bir orta hat laparotomi kesisi yapın. Daha sonra, periton boşluğuna girmek için linea alba'yı keskin bir makasla kesin ve bu kesiyi cilt kesisinin uzunluğuna kadar uzatın.
   NOT: Altta yatan bağırsağın yaralanmasını önlemek için önce karaciğerin karın duvarına derin olduğu subksifoid bölgede linea alba'yı kesmek daha güvenlidir.
2. Uygun ekartörler kullanarak karın duvarını yanal olarak geri çekin; Daha sonra, ksifoid sürecini bir hemostat ile klempleyin ve karaciğeri ortaya çıkarmak için sternumu üst kısımdan geri çekin.
3. Falsiform ligamenti ortaya çıkarmak için karaciğeri inferiordan geri çekin ve ardından keskin bir makas kullanarak ligamenti karaciğerin uzunluğu boyunca kesin. Hepatogastrik ligament ve intrahepatik lob ligamentlerini ortaya çıkarmak için karaciğeri toraksa doğru üst kısımdan geri çekin ve bu yapıları keskin mikro makas kullanarak kesin.
   NOT: Glisson kapsülü tarafından kapsüllenen karaciğer çok kırılgan olduğundan ve morarması ve yırtılması kolay olduğundan, geri çekme nemli pamuk uçlu aplikatörlerle çok nazikçe yapılmalıdır.
4. Sol lobu orijinal anatomik pozisyonunda tutarken medyan lobu üst tarafa geri çekin. LL'nin üst-medial kısmının etrafına 5-0 ipek bir sütür sarın. Lobun alt yüzeyini ortaya çıkarmak için LL'yi göğüs kafesine doğru üst kısımda yansıtın, lobun tabanındaki dikiş uçlarını bir araya getirin ve dikişi tabandan bağlayın. LL'yi bağlamak için dikişi bağlamadan önce sütürün inferior vena kava (IVC) veya portal vendeki kan akışını engellemediğinden emin olun.
   NOT: Bu sütürü, LL toraksa doğru üst kısımda yansıtılırken bağlamak en iyisidir, böylece portal triad ligasyon sırasında iyi bir şekilde ortaya çıkar. Bu, bitişik yapıları tehlikeye atmadan lobun tabana yakın rezeksiyonunu kolaylaştırır.
5. Keskin bir makas kullanarak LL'yi dikiş bağının hemen distalinde inceleyin ve küçük bir doku manşetinin (~ 2 mm) sütürü rezeke edilen lobun kenarından ayırdığından emin olun. Hemostazı onaylayın.
6. Median lobu toraksa doğru üst kısımda yansıtın, ML'nin tabanına 5-0 ipek sütür yerleştirin ve ML'yi orijinal anatomik konumuna geri getirin. Sütür uçlarını ML'nin üst yönünün tabanına yaklaştırın ve bunları lobun tabanına bağladığınızdan emin olun. Bağlanmış ML'yi rezeke edin ve sütür bağının etrafında küçük bir kalıntı doku manşeti bırakın. Hemostazı onaylayın.
7. Sağ üst ve alt lobları ortaya çıkarmak için karaciğeri sağdan sola doğru hareket ettirin ve bu lobları medial ve inferiora dikkatlice yansıtın. Sütürün RUL tabanını çevrelediğinden emin olmak için RUL'un üst-medial yönü üzerine 5-0'lık bir sütür sarın ve ardından RUL'u toraksa doğru yansıtın. Sütürü RUL'un altına sarın ve uçlarını tabanına yakın bir şekilde bağlayın, ardından sütür bağının etrafında küçük bir kalıntı doku manşeti bırakarak yeniden inceleyin.
   NOT: RUL'un tabanına çok yakın bağlamak, RLL'ye giden kan akışını tehlikeye atabilir, bu da RLL'nin iskemisi ve farenin ameliyat sonrası 24 saat içinde ölümü ile sonuçlanabilir. Buna karşılık, RUL tabanından çok distal bağlanması, karaciğer kütlesinin rezeke edilen miktarını azaltır, böylece postoperatif sağkalım oranlarını beklenenin ötesinde artırır.
8. Kalan karaciğeri dinlenme anatomik pozisyonuna geri getirin ve hemostazı sağlayın. Gerekirse, rezeke edilmiş karaciğer kenarlarında küçük kanama alanlarına gazlı bezle baskı uygulayın.
9. Karın orta hattını (fasya ve kas tabakaları) 5-0 poliglaktin sütür kullanarak kesintisiz bir şekilde kapatın. Cilt kesisini zımba veya 5-0 monofilament dikişlerle kapatın.
10. Anesteziyi bırakın ve fareyi bilincini geri kazanana ve normal şekilde yürüyebilene kadar izleyin.

3. Ameliyat sonrası bakım

1. Uygun iyileşmeyi (yani fare uyanık, uyanık ve kafes içinde yürüyor) ve ağrı kontrolünü sağlamak için fareyi ameliyat sonrası gözlemleyin. İşlemden 6 saat sonrasına kadar fareyi her 2 saatte bir ve daha sonra günlük olarak inceleyin.
   NOT: Ameliyat sonrası farenin kafes içinde daha yavaş hareket etmesi beklenir. Fare, diğer farelerden izole edilmiş bir kafeste iyileşmeli ve ancak tamamen iyileştiğinde diğer farelerin şirketine geri dönmelidir.
2. Fare duyarsız sıvıdan veya ameliyattan kaynaklanan aşırı kan kaybından hipovolemik hale gelirse, ısıtılmış normal salin enjeksiyonları (0.1-1.0 mL, deri altı veya intraperitoneal) uygulayın.

Başarılı bir uzatılmış x hepatektominin, 8-12 haftalık sağlıklı yetişkin farelerde 1 hafta içinde P mortaliteye neden olması beklenmektedir16. Düzgün bir şekilde yapıldığında, minimum kan kaybı beklenir. Devam eden kalıntı kanama manuel basınçla kontrol edilebilir. Ameliyattan sonraki 24 saat içinde perioperatif ölüm genellikle teknik hatalardan kaynaklanır. Teknik arızalar arasında, inatçı intraoperatif kanamaya neden olan büyük kan damarlarının yanlışlıkla yaralanması; sıklıkla rezeke edilen karaciğer kenarlarından rezidüel kanama nedeniyle önemli postoperatif kanama; bitişik portal triadın, portal venin veya IVC'nin yanlışlıkla bağlanması gibi çevredeki yapının yaralanması; lob tabanına çok yakın bir şekilde RUL'un ligasyonuna sekonder RLL iskemisi; ve genel anesteziden kaynaklanan komplikasyonlar. Karaciğer yetmezliği belirtileri arasında ilerleyici uyuşukluk, saç topaklanması, iştahsızlık ve hipoglisemi bulunur ve bunlar genellikle ameliyattan sonraki 24 saat içinde belirginleşir.

Uzun süreli% 78 hepatektomiden sonra beklenen iki sonuç ya sağkalım ya da ölümdür. İlk senaryoda, fare ameliyattan sonra uygun şekilde iyileşir, 72 saat içinde normal aktiviteye devam eder ve 7 günden fazla hayatta kalır. Ameliyat sonrası 9-10 gün sonra yapılan laparotomi, ameliyat öncesi karaciğer kütlesinin tam olarak iyileştiğini gösterir4,16,17,18. İkinci sonuç, ameliyat sonrası 2-7 gün içinde mortalite olacaktır. Fare, ameliyattan sonraki ilk 12 saat içinde ilk iyileşme belirtilerini gösterebilir, ancak fulminan karaciğer yetmezliğinin gelişmesi nedeniyle daha sonra nispeten hızlı bir şekilde kötüleşir16. Fare, ölüme kadar stres, kilo kaybı ve ilerleyici uyuşukluk belirtileri gösterir. Beklenmeyen sonuçlara örnek olarak teknik komplikasyonlardan ölüm veya uzatılmış x hepatektomiden sonra P'nin çok üzerinde veya altında fare sağkalım oranları verilebilir.

Laboratuvarımız bu genişletilmiş x hepatektomiye öncülük etmiş ve 8 haftalık sağlıklı BALB/c farelerinde uzatılmış x hepatektominin P ölümcüllük ile sonuçlandığını gösteren daha önceki bir makalede kullanışlılığını doğrulamıştır, bu da fare karaciğerinin rekombinant adenovirüs16 kullanılarak intravenöz olarak verilen A20'yi (Tümör Nekroz Faktörü İndüklenebilir Protein 3 [TNFAIP3]) eksprese etmek üzere önceden tasarlanmış olması durumunda iptal edilebilir. Longo ve ark. tarafından yapılan bu çalışmada, sağlıklı bir BALB/c faresine, insan A20 (rAd.A20) veya kontrol β-Galaktosidaz (rAd.βGal) eksprese eden rekombinant bir adenovirüs vektörünün uygulanmasından 5 gün sonra yüzde 78 hepatektomi uygulandı. Ek bir tedavi edilmemiş kontrol grubu da dahil edildi. x hepatektomiyi takiben, Longo ve ark. tedavi edilmeyen 12 farenin 6'sının (P) prosedürden sağ çıktığını gözlemledi (Şekil 2)16.

Yeterliliğin iki belirleyicisi şunları içerir: 1) yukarıda listelendiği gibi, başta RLL iskemisi olan ve erken ölüme neden olan teknik komplikasyonların sınırlandırılması ve 2) RUL'un yeterli mobilizasyonunun sağlanması, bu olmadan RUL'un tam boyutunun takdir edilememesi ve dolayısıyla uygun şekilde rezeke edilememesidir. Bu, rezeke edilen karaciğer kütlesi miktarını azaltır ve bu nedenle genel sağkalım oranını beklenen% 50'nin çok üzerine çıkarır. Araştırmacı/yazarın eğitiminin ilk döneminde, 11-21 haftalık 15 sağlıklı erişkin erkek ve dişi CD1 ve C57BL/6 farenin 10'u (g) x hepatektomiyi takiben 1 hafta hayatta kalmıştır (3 teknik ölüm hariç) (Tablo 1)19,20,21. x hepatektomiyi takiben beklenen P sağkalım oranını elde etmek için RUL mobilizasyonunu iyileştirmek ve tahmini yüzde hepatektomi ile ölçülen yeterli bir rezeksiyonu kolaylaştırmak için fare karaciğer anatomisinin takdir edici bir şekilde anlaşılması bağlamında daha fazla eğitim gerekliydi. Teknik yeterliliğin tam olarak sağlandığı hissedildikten sonra, 16 fareden 8'i (% 50; 1 teknik ölüm hariç)% 78 hepatektomiden sonra 1 hafta hayatta kaldı.

Şekil 1: Fare hepatektomi pozisyonu ve karaciğer anatomisi. (Solda) Laparotomi ve genişletilmiş x hepatektomi için fare konumlandırmasının görsel temsili. Fare, orta hat laparotomi insizyonu ile sırtüstü olarak tasvir edilmiştir. (Sağda) Fare karaciğer anatomisi, rezeksiyon bölgelerini tanımlayan renkli çizgilerle aşağıdan gösterilmiştir. Sol lob, median lob ve sağ üst loblar, tabanlarında sütür ligasyonu yapıldıktan sonra sıralı bir şekilde rezeke edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: A20'yi aşırı eksprese etmek için tasarlanmış farelerin uzun süreli (x) hepatektomisini takiben sağkalım avantajı. Kontrol ile tedavi edilmemiş (enfekte olmayan NI), rAd.βGal ve rAd.A20 ile tedavi edilen farelerde% 78 uzamış hepatektomi sonrası sağkalım verileri. Fare karaciğerlerinde A20'nin aşırı ekspresyonu, NI (% 50) ve rAd.βGal kontrolleri (% 13) (n = 12 fare / grup) ile karşılaştırıldığında önemli bir sağkalım avantajı sağlamıştır. Bu rakam Longo ve ark.16'dan alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Uzatılmış x hepatektomi eğitim sonuçları. 11-21 haftalık sağlıklı yetişkin CD1 ve C57BL / 6 farelerde uzatılmış% 78 hepatektomiyi takiben 1 hafta içinde sağkalım sonuçları. Teknik yeterlilik, tahmini yüzde hepatektomi (Ortalama ± SEM) ile hesaplandığı gibi, teknik başarıda gözlemlenebilir iyileşmeler ve sağ üst lobun yeterli rezeksiyonu ile kendi kendine belirlendi.

İfşa edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.