Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Gynura bicolor DC'nin Kimyasal Bileşenlerini İncelemek için Yüksek Çözünürlüklü Tandem Kütle Spektrometresi

1.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66612

⸱

2 Şubat 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Clinical Research Center for Dermatology, Chongqing Key Laboratory of Integrative Dermatology Research, Key Laboratory of External Therapies of Traditional Chinese Medicine in Eczema, Department of Dermatology, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine, 2General Surgery, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Geleneksel Çin tıbbı araştırmalarında yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi analizini ve moleküler yerleştirmeyi entegre eden genel bir protokolü açıklıyoruz.

Özet

İstenilen kimyasal bileşenlerin ayrılması ve analizi, geleneksel Çin tıbbının (TCM) temel araştırması için önemli konulardır. Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi dört kutuplu uçuş süresi tandem kütle spektrometresi (UPLC-Q-TOF-MS/MS), TCM bileşenlerinin tanımlanması için yavaş yavaş lider bir teknoloji haline gelmiştir. Gynura iki renkli DC. Çin'de ilaç ve gıda için kullanılan çok yıllık sapsız bir bitki olan (BFH), ısıyı temizlemek, akciğeri nemlendirmek, öksürüğü hafifletmek, stazı dağıtmak ve şişliği gidermek gibi tıbbi etkilere sahiptir. Polifenoller ve flavonoidler, BFH'deki karmaşık bileşiklerin tanımlanmasını engelleyen çok sayıda izomer içerir. Bu makale, solvent ekstraksiyonu ve UPLC-Q-TOF-MS aracılığıyla entegre verilere dayalı olarak BFH'nin kimyasal bileşenlerini incelemek için sistematik bir protokol sunmaktadır.

Burada açıklanan yöntem, numune ön işlemi, MS kalibrasyonu, MS elde etme, veri işleme ve sonuçların analizi için sistematik protokolleri içerir. Numune ön işlemi, toplama, temizleme, kurutma, kırma ve ekstraksiyonu içerir. MS kalibrasyonu, çok noktalı ve tek noktalı düzeltmeden oluşur. Veri işleme, veri içe aktarma, yöntem oluşturma, analiz işleme ve sonuç sunumunu içerir. Gynura bicolor DC'deki fenolik asitlerin, esterlerin ve glikozitlerin tipik parçalanma modelinin temsili sonuçları bu yazıda sunulmuştur. Ek olarak, organik çözücü seçimi, ekstraksiyon, veri entegrasyonu, çarpışma enerjisi seçimi ve yöntem iyileştirme ayrıntılı olarak tartışılmaktadır. Bu evrensel protokol, TCM'deki karmaşık bileşikleri tanımlamak için yaygın olarak kullanılabilir.

Giriş

Geleneksel Çin tıbbı (TCM), Çin'de binlerce yıldır klinik olarak uygulanmaktadır ve Çin halkının sağlığının korunmasında hayati bir rol oynamaktadır1. TCM'nin bileşimi çeşitli ve karmaşıktır ve TCM, kimyasal bileşim2'ye odaklanan birçok kalitatif çalışmada geniş çapta rapor edilmiştir. TCM'deki kimyasal bileşenler kabaca alkaloidler, organik asitler, fenilpropanoidler, kumarinler, lignanlar, kinonlar, flavonoidler, terpenoidler, triterpenoid saponinler, steroid saponinler, kardiyak glikozitler ve tanenler gibi aşağıdaki kategorilere ayrılabilir3. TCM'deki çok sayıda bilinmeyen bileşen ve ayırt edilemeyen izomerler göz önüne alındığında, istenen kimyasal bileşenlerin ayrılması ve analizi, TCM4'ün temel araştırması için önemli konulardır.

Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi dört kutuplu uçuş süresi kütle spektrometresi (UPLC-Q-TOF-MS), geleneksel Çin tıbbındaki (TCM) maddeleri analiz etmek için uygulanmıştırve bunlar ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi 5,6 ile ayrılabilir. MS'in yüksek çözünürlüğü, 5 ppm'den daha az hatayla veritabanı analizi için kullanılan kapsamlı iyon bilgisi sağlayabilir7. Çarpışma enerjisini açtıktan sonra, ikincil MS modu, yoğunluğu ve sayısı8 enerjisinin büyüklüğünden etkilenen ikincil parça iyonları elde edebilir.

Gynura iki renkli DC. Tıp ve gıda için yaygın olarak kullanılan çok yıllık sapsız bir bitki olan (BFH) (Şekil 1A), Çin'e özgü nadir ve nesli tükenmekte olan bir bitkidir9. BFH bol miktarda antosiyanin, polifenol, flavonoid ve güçlü antioksidan kapasiteye sahiptir10. BFH, ısıyı temizlemek, kanı soğutmak, akciğeri nemlendirmek, öksürüğü hafifletmek, stazı dağıtmak, şişliği gidermek, yaz sıcağını hafifletmek ve ısıyı ortadan kaldırmak gibi tıbbi etkilere sahiptir. BFH11'in kimyasal bileşimine odaklanan az sayıda çalışma vardır. Polifenoller ve flavonoidler, BFH'deki karmaşık bileşiklerin tanımlanmasını zorlaştıran çok sayıda izomer içerir. Kimyasal bileşenlerin tanımlanması için her türlü TCM'ye uygulanabilecek evrensel bir yöntem geliştirilmelidir. Bu çalışma, solvent ekstraksiyonuna ve UPLC-Q-TOF-MS aracılığıyla entegre verilere dayalı olarak BFH'nin kimyasal bileşenlerini incelemek için sistematik bir protokol raporlamayı amaçlamıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Numune ön işlemi

  1. BFH'nin tüm bitkisini, görünür tortu ve kirlilik kalmayana kadar saf suda yıkayın. Temiz BFH'yi bir tabağa koyun ve ardından fırına koyun (Şekil 1B). Fırını 24 saat boyunca 50 °C'ye ayarlayın.
    NOT: BFH fabrikasının tamamı Çin'in Sichuan Eyaletinde toplandı.
  2. Kurutulmuş BFH'yi yüksek hızlı, çok işlevli bir kırıcıda ezin. Kaba tozu 50 gözenekli bir eleğe aktarın (Şekil 1C). İnce tozu hava geçirmez bir torbada toplayın ve bir kurutma kulesinde saklayın.
  3. Her biri 0,25 g'lık altı BFH örneğini doğru bir şekilde tartın ve bunları altı konik şişeye yerleştirin. Her konik şişeye 30 mL organik çözücü (%50 etanol-su, %70 etanol-su, kloroform, petrol eteri, etil asetat ve n-bütil alkol) ekleyin (Şekil 1D).
  4. Karışımı, 25 ° C'de 30 dakikalık ekstraksiyon için bir ultrason banyosu sonikatörüne aktarın. Numuneyi 5 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin. Bir enjeksiyon şırıngası ve 0.22 μm organik mikro gözenekli membran filtresi hazırlayın. Tüm süpernatanları 2 mL'lik numune şişelerine filtreleyin.

2. MS kalibrasyonu

  1. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak, 500 μL 0.1 M sodyum hidroksit çözeltisini 100 mL'lik bir hacimsel şişeye aktarın ve ardından 450 μL deiyonize veya ultra saf suyu 100 mL hacimsel şişeye aktarın (Şekil 2).
  2. 200 μL'lik bir pipet kullanarak, 100 mL hacimsel şişeye 50 μL formik asit ekleyin. 90:10 2-propanol: su ile toplam 100 mL hacim yapın ve çözeltiyi 5 dakika boyunca sonikleştirin. Şişeyi 90:10 2-propanol: su içinde 0,5 mM sodyum format çözeltisi olarak etiketleyin ve buzdolabında saklayın.
    NOT: Sodyum format çözeltisi oda sıcaklığında 1 hafta içinde sona erer.
  3. UPLC-Q-TOF-MS kontrol yazılımını başlatın ve ardından MS tune penceresini açın. Sample Flow Control (Numune Akış Kontrolü ) panelinde, Infusion Flow Speed (İnfüzyon Akış Hızı ) seçeneğinde 25 μL/dk'yı ayarlayın ve Reservoir (Rezervuar ) seçeneğinde C'yi seçin. Otomatik temizlemenin sona ermesi için yaklaşık 1 dakika bekleyin.
  4. Sodyum format çözeltisi vermeye başlamak için Akış düğmesine tıklayın. Pozitif iyon moduna geçmek için Pozitif düğmesine tıklayın ve hassasiyet moduna geçmek için Hassasiyet düğmesine tıklayın.
    NOT: Gerçek zamanlı spektrum penceresinde sodyum formatın karakteristik tepe noktaları görünene kadar bir sonraki adıma geçin.
  5. UPLC-Q-TOF-MS kontrol yazılımında MS Console penceresini açın. Sol konumda, sırayla SYNAPT XS ve Intellistart seçeneklerini seçin.
  6. işaretle Kalibrasyon Oluşturve Başlat düğmesine tıklayın. İleri düğmesine tıklayın ve açılır menüden Kalibrasyon Profili'ni seçin. İleri düğmesine tıklayın ve Pozitif polaritede Hassasiyet modunu seçin. Sırasıyla İleri, Tune Page, Next ve Start düğmelerine tıklayın.
  7. MS tune penceresine geçin ve negatif iyon moduna geçmek için Negatif düğmesine tıklayın. MS Console penceresine geri dönün.
  8. işaretle Kalibrasyon Oluşturve Başlat düğmesine tıklayın. İleri düğmesine tıklayın ve açılır menüden Kalibrasyon Profili'ni seçin. İleri düğmesine tıklayın ve Negatif polaritede Hassasiyet modunu seçin. Sırasıyla İleri, Tune Page, Next ve Start düğmelerine tıklayın.
  9. LockSpray Akış Kontrol panelinde, 50 μL/dk'lık bir akış hızı ayarlayın ve LE çözeltisinin kütle spektrometresine girmesine izin vermek için Akış düğmesine tıklayın. MS tune penceresine geçin, LockSpray Source Setup'ı işaretleyin ve kalibrasyona başlamak için Başlat düğmesine tıklayın.

3. MS edinimi

  1. Ana arayüze geçin ve sıvı kromatografisi yöntemini açmak için Giriş Dosyası sütununa sağ tıklayın.
  2. Giriş düğmesine tıklayın ve ardından Çalışma süresi ve Gradyan dahil olmak üzere parametreleri ayarlayın. Otomatik Örnekleyici düğmesine tıklayın ve ardından Çalışma süresi, Sütun ve Örnek gibi parametreleri ayarlayın. Kaydet düğmesine tıklayın.
  3. Kütle spektrometresi yöntemini açmak için MS Metodu sütununa sağ tıklayın.
  4. Bilgi düğmesine tıklayın ve ardından Bitiş Zamanı, Polarite, Analiz Modu, Düşük Kütle, Yüksek Kütle ve Rampa Transfer Çarpışma Enerjisi gibi parametreleri ayarlayın. Tıkla OK düğmesine ve ardından İndirim düğmesine basın.
  5. Dosya adı, flakon ve hacim dahil olmak üzere sıra tablosunu doldurun. Kaydet düğmesine tıklayın.
  6. Çalıştırmak istediğiniz örnek için sıra tablosundaki satırı seçin. Çalıştır düğmesine tıklayın ve açılan penceredeki Tamam düğmesine tıklayın.

4. Veri işleme

  1. Veri analizi yazılımını başlatın. Çalışmam sütununda, yeni bir pencere açmak için MassLynx Verilerini İçe Aktar düğmesine tıklayın.
  2. Artı işareti düğmesine tıklayın ve pozitif moddan beş ham dosyanın tümünü kontrol edin. Bir grup adı girin ve veri içe aktarmayı başlatmak için UNIFI Örnek Seti Oluştur düğmesine tıklayın (Şekil 3A).
  3. Pozitif modda Analiz Yöntemi dosyasına çift tıklayın. İşleme etiketine tıklayın ve Kütleye Göre Hedefle düğmesine tıklayın. Hedef eşleşme toleransı ve Parça eşleşme toleransından sonra giriş kutusuna 5 ppm sayısını girin.
  4. Ana Sayfa düğmesine tıklayın ve Ekler düğmesine tıklayın. +H ve +Na satırlarını seçin ve sağ ok şeklindeki düğmeye tıklayın. Kaydet düğmesine tıklayın (Şekil 3B).
  5. Negatif modda Analiz Yöntemi dosyasına çift tıklayın. İşleme etiketine tıklayın ve Kütleye Göre Hedefle düğmesine tıklayın. Hedef eşleşme toleransı ve Parça eşleşme toleransından sonra giriş kutusuna 5 ppm sayısını girin.
  6. Ana Sayfa düğmesine tıklayın ve ardından Ekler düğmesine tıklayın. -H ve +HCOO satırlarını seçin ve sağ ok şeklindeki düğmeye tıklayın. Kaydet düğmesine tıklayın.
  7. Çalışmam sütununda, yeni bir pencere açmak için Analiz düğmesine tıklayın. Yeni içe aktarılan verileri ve yeni oluşturulan yöntemi seçin ve ardından İleri düğmesine tıklayın. Dosya adını girin. Analiz verilerinin saklandığı klasörü seçin ve ardından Bitir düğmesine tıklayın
  8. İşlem düğmesine tıklayın ve sonuçlar görünene kadar birkaç dakika bekleyin (Şekil 3C).
  9. Sonuç tablosunu boş bir forma kopyalayın (Şekil 3D).

5. Sonuç analizi

  1. Sonuç tablosunda bir bileşik seçin. Karşılık gelen ikincil kütle spektrumu sağ alt köşede görüntülenecektir (Şekil 4A).
  2. Tablo şeklindeki düğmeye tıklayın ve ikincil parça iyonlarının tablosunu görüntülemek için Yüksek Enerji Parçaları seçeneğini seçin (Şekil 4B).
  3. Tabloda ikincil bir parça iyonu seçin. Fareyi ikincil kütle spektrumuna karşılık gelen iyon tepesinin üzerine getirin ve ilgili yapısal kırılma ekranda görüntülenecektir (Şekil 4C).
    NOT: Yazılım tarafından verilen çatlamanın makul olup olmadığını manuel olarak değerlendirin ve izomerleri ikincil parça iyonlarına göre ayırt edin.
  4. Parçalanma desenini çizim yazılımında manuel olarak çizin.
    NOT: Parçalanma modellerinin örnekleri, temsili sonuçlar bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

BFH'nin kimyasal bileşim tanımlaması, temsili sonuçları göstermek için bir model olarak kullanıldı. Solvent ekstrakte edilmiş Gynura bicolor DC'nin baz tepe kromatogramları. Ek Dosya 1-Ek Şekil S1-S6'da gösterilmiştir ve gözlemlenen tutma süresi (RT), bileşen adı, formül, kütle-yük oranı (m/z) ve kütle hatası Tablo S1-S6'da listelenmiştir. ZBTK'da, 35 çeşit bileşiğin tümü, UPLC-TOF-MS'deki ayrılmış piklerden tanımlandı. Ek Dosya 1-Ek Tablo S1'de gösterildiği gibi, asit (kinik as...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Su kaynatma12'nin yanı sıra, organik çözücü ekstraksiyonu, TCM ön işleminin13 başka bir yaygın yöntemidir. Benzer faz çözünmesi ilkesine göre, çeşitli organik çözücülerin14 kombinasyonu ile çok sayıda bileşen ekstrakte edilmiştir. Ultrasonik destekli ekstraksiyon, TCM15'te bileşen elde etmek için kullanılan ana yöntemlerden biridir. Süperkritik karbondioksit ekstraksiyonu, lignanlar

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82104881), TCM Bağışıklık Hastalıklarının Tedavisi Kalıtım ve İnovasyon Ekibi, Chongqing Tıbbi Bilimsel Araştırma Projesi (Chongqing Sağlık Komisyonu ve Bilim ve Teknoloji Bürosu'nun ortak projesi) (2022DBXM007), Chongqing Bilimsel Araştırma Enstitüsü'nün performans teşviki ve rehberliği için özel bir proje (cstc2022jxjl120005), Chongqing Doktora Sonrası Bilim Vakfı için özel bir proje (2022CQBSHTB3035), Yong ve Orta Yaşlılar için Chongqing Kıdemli Tıbbi Yetenekler Programı, Chongqing Bilimsel Kurumları Programı (bağımsız araştırma projesi No.2022GDRC015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
kloroformSinopharm Chemical ReagentCo., LtdCAS 67-66-3
etanolChuandongChemicalCAS 64-17-5
etil asetatChuandongChemicalCAS 141-78-6
sıvı kromatografSularıACQUITY Sınıf 1 artı
MassLynxWatersV4.2MS kontrol yazılımı
n-bütil alkolChuandongChemicalCAS 71-36-3
petrol eteriChuandongChemicalCAS 8032-32-4
Dört kutuplu uçuş süresi kütle spektrometresiSularSYNAPT XS
UNIFISularıVeri analiz yazılımı

Kaynaklar

  1. Lin, P., et al. Qualitative and quantitative analysis of the chemical profile for gualou-xiebai-banxia decoction, a classical traditional chinese medicine formula for the treatment of coronary heart disease, by uplc-q/tof-ms combined with chemometric analysis. J Pharm Biomed Anal. 197, 113950(2021).
  2. Hui, D., et al. Uplc-q-tof/ms-based metabolomic studies on the toxicity mechanisms of traditional chinese medicine chuanwu and the detoxification mechanisms of gancao, baishao, and ganjiang. Chinese J Nat Med. 13 (9), 687-698 (2015).
  3. Newman, D. J. Modern traditional chinese medicine: Identifying, defining and usage of tcm components. Adv Pharmacol. 87, 113-158 (2020).
  4. Liu, S., Yi, L. Z., Liang, Y. Z. Traditional chinese medicine and separation science. J Sep Sci. 31 (11), 2113-2137 (2008).
  5. Yuan, L., et al. Rapid classification and identification of complex chemical compositions in traditional chinese medicine based on uplc-q-tof/ms coupled with data processing techniques using the kudiezi injection as an example. Anal Methods. 7 (12), 5210-5217 (2015).
  6. Wang, F., et al. Hplc coupled with chemical fingerprinting for multi-pattern recognition for identifying the authenticity of clematidis armandii caulis. JoVE. (189), e64690(2022).
  7. Gao, Y., et al. Ultra high-performance liquid chromatography-mass spectrometry and self-established database analysis of chinese herbal medicine components. JoVE. (201), e66091(2023).
  8. Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. JoVE. (193), e65054(2023).
  9. Wang, Y., et al. Comparison of morphological and physiological characteristics in two phenotypes of a rare and endangered plant, begonia fimbristipula hance. Photosynthetica. 54, 381-389 (2016).
  10. Zhang, P., et al. Response of population canopy color gradation skewed distribution parameters of the rgb model to micrometeorology environment in begonia fimbristipula hance. Atmosphere. 13 (6), 890(2022).
  11. Yu, L., Ning, L., Youzhen, D. Studies on microwave extraction of the pigment from begonia fimbristipula hance. Guangdong Trace Elements Science. 11 (10), 60-63 (2004).
  12. Xiao, Q., et al. Novel fusion protein consisting of metallothionein, cellulose binding module, and superfolder gfp for lead removal from the water decoction of traditional chinese medicine. ACS Omega. 5 (6), 2893-2898 (2020).
  13. Huang, H., et al. Using multiple light scattering to examine the stability of phyllanthus emblica l. Extracts obtained with different extraction methods. JoVE. (194), e65130(2023).
  14. Miao, W. G., Tang, C., Ye, Y., Quinn, R. J., Feng, Y. Traditional chinese medicine extraction method by ethanol delivers drug-like molecules. Chin J Nat Med. 17 (9), 713-720 (2019).
  15. Olejar, K. J., et al. Ultrasonic-assisted extraction of cannabidiolic acid from cannabis biomass. JoVE. (183), e63076(2022).
  16. Zhu, H. Y., et al. Sedative and hypnotic effects of supercritical carbon dioxide fluid extraction from schisandra chinensis in mice. J Food Drug Anal. 24 (4), 831-838 (2016).
  17. Lin, X., Wang, Y., Liu, X., Huang, S., Zeng, Q. Ils-based microwave-assisted extraction coupled with aqueous two-phase for the extraction of useful compounds from chinese medicine. Analyst. 137 (17), 4076-4085 (2012).
  18. Wu, T., Lv, H., Wang, F., Wang, Y. Characterization of polyphenols from lycium ruthenicum fruit by uplc-q-tof/mse and their antioxidant activity in caco-2 cells. J Agric Food Chem. 64 (11), 2280-2288 (2016).
  19. Distler, U., et al. Drift time-specific collision energies enable deep-coverage data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 11 (2), 167-170 (2014).
  20. Sawada, Y., et al. Widely targeted metabolomics based on large-scale ms/ms data for elucidating metabolite accumulation patterns in plants. Plant Cell Physiol. 50 (1), 37-47 (2009).
  21. Zhang, X. M., et al. Data-dependent acquisition based high-resolution mass spectrum for trace alternaria mycotoxin analysis and sulfated metabolites identification. Food Chem. 364, 130450(2021).
  22. Downard, K. M. Indirect study of non-covalent protein complexes by maldi mass spectrometry: Origins, advantages, and applications of the "intensity-fading" approach. Mass Spectrom Rev. 35 (5), 559-573 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Ultra-Yüksek Performanslı Sıvı KromatografisiKuadrupol Uçuş SüresiNumune Ön İşlemeSolvent EkstraksiyonuFenolik AsitlerFlavonoid İzomerleriGeleneksel Çin Tıbbı
Gynura bicolor DC'nin Kimyasal Bileşenlerini İncelemek için Yüksek Çözünürlüklü Tandem Kütle Spektrometresi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.