Yöntem makalesi

Otizm Spektrum Bozukluğunun Drosophila Modelinde Davranışsal Değerlendirme Paradigmaları

3.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66649

⸱

6 Eylül 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioscience and Biotechnology, Indian Institute of Technology Kharagpur

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Otizm Spektrum Bozukluğu (OSB), bozulmuş sosyal ve iletişimsel davranış ve tekrarlayan davranışların ortaya çıkması ile ilişkilidir. Drosophila modelinde ASD genleri ve davranışsal eksiklikler arasındaki ilişkiyi incelemek için, bu yazıda sosyal boşluk, saldırganlık, kur yapma, tımar etme ve alışkanlık davranışını test etmek için beş davranışsal paradigma açıklanmaktadır.

Özet

Otizm Spektrum Bozukluğu (OSB), sosyal etkileşim ve iletişim yeteneğindeki eksiklikler, gelişmiş kısıtlı veya tekrarlayan davranışlar ve ayrıca bazı durumlarda öğrenme güçlüğü ve motor eksiklik dahil olmak üzere yaygın davranışsal semptomlara sahip heterojen bir nörogelişimsel bozukluk grubunu kapsar. Drosophila , çok sayıda insan hastalığını modellemek için benzersiz bir model organizma olarak hizmet etmiştir. ASD'de birçok gen rol oynadığından, meyve sinekleri, bozuklukla ilgili olduğu varsayılan genleri test etmenin güçlü ve etkili bir yolu olarak ortaya çıkmıştır. ASD'de çeşitli fonksiyonel rollere sahip yüzlerce gen yer aldığından, ASD'nin tek bir genetik sinek modeli mümkün değildir; bunun yerine, bireysel genetik mutantlar, gen yıkımları veya ASD ile ilişkili genlerin sinek homologlarının aşırı ekspresyona dayalı çalışmaları, bu gen ürünlerinin altında yatan moleküler yollar hakkında fikir edinmenin yaygın yoludur. Drosophila'da , belirli davranışsal bileşenlerdeki eksikliklerin kolayca okunmasını sağlayan bir dizi davranışsal teknik mevcuttur. Sineklerde sosyal alan tahlili ve saldırganlık ve kur yapma tahlillerinin, sosyal etkileşim veya iletişimdeki kusurları değerlendirmede yararlı olduğu gösterilmiştir. Sineklerde tımar davranışı, tekrarlayan davranışların mükemmel bir okumasıdır. Alışma testi, bazı ASD hastalarında etkilendiği tespit edilen alışkanlık öğrenme yeteneğini tahmin etmek için sineklerde kullanılır. Bu davranışsal paradigmaların bir kombinasyonu, sineklerde insan ASD benzeri hastalık durumunun kapsamlı bir değerlendirmesini yapmak için kullanılabilir. Fmr1 mutant sinekleri, insanlarda Frajilite-X sendromunu özetleyen ve sinek nöronlarında POGZ-homolog sıra yıkımını kullanarak, sosyal boşluk, saldırganlık, kur yapma davranışı, tımar davranışı ve alışkanlıkta ölçülebilir eksiklikler gösterdik. Bu davranışsal paradigmalar, sinek modellerinde ASD ve diğer nörogelişimsel bozukluklar üzerine araştırmalar için yaygın kullanımlarını kolaylaştıracağı varsayımıyla burada en basit ve anlaşılır biçimleriyle gösterilmiştir.

Giriş

Otizm Spektrum Bozukluğu (ASD), heterojen bir nörolojik bozukluk grubunu kapsar. Sosyal iletişim ve sosyal etkileşimde çok bağlamlı ve kalıcı eksiklikler ve sınırlı, tekrarlayan davranış ve aktivite kalıplarının ve ilgi alanlarının varlığı ile karakterize bir dizi karmaşık nöro-gelişimsel bozukluğu içerir1. Dünya Sağlık Örgütü'ne (WHO) göre, dünya çapında her 100 çocuktan 1'ine erkek-kadın oranı 4.2 olan ASD teşhisi konmaktadır2. Hastalık yaşamın ikinci veya üçüncü yılında belirginleşir. OSB'li çocuklar sosyal-duygusal karşılıklılık, sözsüz iletişim ve ilişki becerilerine ilgi eksikliği gösterirler. Kalıplaşmış motor hareket, esnek olmayan ve ritüelleştirilmiş rutin takip ve kısıtlı ilgi alanlarına yoğun odaklanma gibi tekrarlayan davranışlar sergilerler. Otizmli çocuklar dokunma, koku, ses ve tat almaya karşı yüksek derecede tepki gösterirken, ağrı ve sıcaklık tepkisi nispeten düşüktür1. Bu bozukluğun penetransı, ASD'den muzdarip farklı hastalar arasında da farklıdır ve bu nedenle değişkenlik artar.

OSB'nin mevcut klinik tanısı, OSB'nin tüm formlarını kapsayan doğrulayıcı biyobelirteç tabanlı veya ortak bir genetik test olmadığı için bireylerin davranışsal değerlendirmesine dayanmaktadır3. Genetik ve nörofizyolojik temellerin deşifre edilmesi, tedavi stratejilerinin hedeflenmesinde yardımcı olacaktır. Son on yılda, geniş bir araştırma grubu, OSB hastalarında silinmiş veya mutasyona uğramış veya ekspresyon seviyeleri değiştirilmiş yüzlerce genin tanımlanmasıyla sonuçlanmıştır. Devam eden araştırmalar, bu aday genlerin katkısının fare veya meyve sineği gibi model organizmalar kullanılarak doğrulanmasını vurgulamaktadır, burada bu genler nakavt edilir veya yere serilir, ardından ASD benzeri davranışsal eksiklikler için testler yapılır ve anormalliklere neden olan altta yatan genetik ve moleküler yolakların aydınlatılması. İnsan kromozomal lokusları 16p11.2'deki Kopya Sayısı Varyasyonlarını (CNV'ler) özetleyen bir fare modeli, ASD davranış kusurlarınınbazılarını gösterir 4,5,6. Teratojenik bir ilaç valproik aside (VPA) doğum öncesi maruz kalma, insan ASD7,8'e benzeyen özellikleri gösteren başka bir fare modelidir. Ek olarak, genetik sendromla ilişkili otizm sergileyen bir dizi fare modeli vardır, örneğin, Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c'deki mutasyonların neden olduğu tek gen sendromik modeller ve Cntnap2, Shank, Neurexin veya Neuroligin genleri gibi genlerdeki mutasyonların neden olduğu tek genli sendromik olmayan modeller5.

Meyve sineği (Drosophila melanogaster), ASD de dahil olmak üzere çok sayıda insan hastalığının9 hücresel, moleküler ve genetik temellerini incelemek için öne çıkan bir başka model organizmadır. Drosophila ve insanlar, moleküler, hücresel ve sinaptik seviyelerde yüksek oranda korunmuş biyolojik süreçleri paylaşırlar. Meyve sinekleri, ASD'lere bağlı genleri karakterize etmek ve sinaptogenez, sinaptik fonksiyon ve plastisite, nöral devre montajı ve olgunlaşmadaki kesin rollerini deşifre etmek için ASD çalışmalarında 10,11,12 başarıyla kullanılmıştır; ASD ile ilişkili genlerin sinek homologlarının sosyal ve/veya tekrarlayan davranışların düzenlenmesinde rolleri olduğu bulunmuştur 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Meyve sineği ayrıca ASD genlerinin ve varyantlarınıntaranması için bir model olarak çalışmıştır 15,22,23. Sineklerde ASD araştırmalarındaki en büyük zorluk, diğer hastalık modellerinden farklı olarak, tek bir ASD sinek modelinin olmamasıdır. Mutasyonların etkisini veya belirli bir ASD geninin yıkılmasını anlamak için, bir araştırmacının davranışsal fenotiplerin ASD hastalarının semptomlarını yeterince taklit edip etmediğini doğrulaması ve daha sonra fenotiplerin moleküler veya fizyolojik temellerini anlamaya doğru ilerlemesi gerekir.

Bu nedenle, ASD benzeri fenotiplerin tespiti, sinek modelinde ASD araştırması için hayati önem taşır. Yıllar boyunca, sosyal davranış / etkileşim, iletişim, tekrarlayan davranışlar ve uyaranlara yanıt verme gibi anormallikleri tespit etmemizi sağlayan bir avuç davranışsal teknik ortaya çıkmıştır. Ek olarak, bu davranışsal tekniklerin yükseltme, tahlillerin otomasyonu, okumalar, niceleme ve karşılaştırma yöntemleri gibi belirli gereksinimlere uyacak şekilde farklı laboratuvarlarda çeşitli modifikasyonları ve yükseltmeleri yapılmıştır. Bu video makalesinde, ASD benzeri davranışsal sonuçları en kolay şekilde tespit etmek için kombinasyon halinde kullanılabilecek beş davranışsal paradigmanın en temel versiyonları gösterilmektedir.

Saldırganlık, hayatta kalma ve üremeyi etkileyen evrimsel olarak korunmuş doğuştan gelen bir davranıştır24. Türdeşlere yönelik saldırgan davranış, 'sosyalleşme motivasyonu'25,26 ve 'iletişim'den27 etkilenir ve her ikisi de OSB'den etkilenen bireylerde tehlikeye girer. Agresif davranış, Drosophila'da iyi tanımlanmıştır ve sağlam saldırganlık testi 28,29,30 ve iyi anlaşılmış bir genetik ve nörobiyolojik temel 31 yoluyla ölçülebilirliği, onu bir sinek modelinde ASD fenotipini değerlendirmek için uygun bir davranışsal paradigma32 haline getirir. Saldırganlık, sosyal bir ortamdan uzakta sosyal izolasyondan etkilenir ve bu da saldırganlığın artmasına yol açar; Aynı şey, erkek sinekler birkaç gün boyunca tecrit altında tutulduğunda da gözlenmiştir33,34. Sineklerde sosyalliği ölçen bir başka davranışsal tahlil, küçük bir sinek grubunda en yakın komşular arasındaki mesafeleri ve sinekler arası mesafeleri ölçen Sosyal Alan Tahlili35'tir ve bu da onu ASD gen ortologlarının sinek 12,21,36,37 ve çevre kaynaklı ASD sinek modellerindeki rollerini test etmek için mükemmel bir şekilde uygun hale getirir 38, 39.

Drosophila kur yapma testi, Otizm ile ilgili genler 18,19,21,40 dahil olmak üzere, devre veya genetik manipülasyon üzerine sosyal ve iletişim becerilerinde değişiklik için sıklıkla kullanılan başka bir davranışsal paradigmadır. Tekrarlayan davranış kalıpları ASD hastalarında yaygındır ve bu, sineklerde tımar davranışı ile özetlenir - temizlik ve diğer amaçlar için gerçekleştirilen bir dizi farklı, kalıplaşmış eylem. Sineklerde(21,41) ASD gen mutasyonlarının etkisinin yanı sıra kimyasallara maruz kalmanın 38,39 test edilmesinde başarıyla kullanılmıştır. Testteki çoklu ilerlemeler ve otomasyon 16,41,42,43'ten önce tanımlanmıştır; Burada, benimsenmesi ve ölçülmesi kolay olan en temel tahlil modelini gösteriyoruz.

OSB'nin bazı hastalarda alışkanlık, öğrenme ve hafıza yeteneğini etkilediğibilinmektedir 44,45,46,47,48,49,50, OSB model organizmaları 51,52 ve ayrıca farklı koku alma davranışlarında eksikliklere neden olur50. Drosophila ışıktan atlama alışkanlığı daha önce ASD genleri23'ü taramak için kullanılmıştır. Alışkanlık, basit bir koku alma alışkanlığı testi yöntemi ile test edilebilir 53,54,55. Koku alma alışkanlığını indükleme yöntemini açıklıyoruz ve sonucu, ASD gen mutantı veya gen yıkımı durumundaki alışkanlık kusurlarını tespit etmek için kullanılabilecek klasik bir Y-labirent bazlı ikili koku seçimi testi56 kullanarak test ediyoruz. Bir mutasyonun (veya gen yıkımının) veya farmakolojik bir tedavinin bir sineğin davranışı üzerindeki etkisinin ASD benzeri bir fenotipe tekabül edip etmediğini değerlendirmek için, burada açıklanan bu 5 testin bir kombinasyonu kullanılabilir.

Protokol

Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Saldırganlık testi

  1. Saldırganlık tahlil arenasının hazırlanması
    1. Standart bir 24 oyuklu plaka alın (Şekil 1A) ve plakanın her bir oyuğunu sinek saldırganlığı için tek bir 'arena' (Şekil 1B) olarak kullanın. Her kuyunun yarısını normal sinek yemi ile doldurun ve gece boyunca kurumasını bekleyin.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, erkek saldırganlığını sağlamak için arenaya bir nokta maya macunu veya kafası kesilmiş bir dişi gibi saldırganlık için bir odak noktası dahil edilebilir.
    2. Yaklaşık üç ila dört kuyu yüzeyini kaplayacak kadar şeffaf plastik / akrilik levha alın. Tek tek sinekleri kuyucuklara sokmak için ~ 2,5 mm çapında küçük bir açıklık oluşturmak için levhayı delin.
  2. Sinek aspiratörünün hazırlanması
    1. 30-50 cm uzunluğunda bir kauçuk/silikon tüp alın (Şekil 1C1).
    2. 200 μL (veya 1.000 μL) pipet ucu alın ve dar uçtan ~ 1 cm kesin. Kesilen ucu kauçuk borunun bir ucuna yerleştirin; Bu uç, ağız tabanlı aspirasyon için kullanılan 'ağız ucu' olacaktır.
    3. Başka bir pipet ucu alın ve bir sineğin içinden geçmesi için yeterli bir açıklık oluşturmak için bu ucun dar ucunu kesin. Bu pipet ucunun tabanını tüpün kuyruk ucuna yerleştirin; bu, sineğin aspire edileceği aspiratörün 'sinek ucu' olacaktır (Şekil 1C2).
    4. Tüpün 'sinek ucuna' bir parça örgü kumaş veya ince bir pamuk tabakası yerleştirin - tüp ile uç arasındaki birleşim noktasına. Pipet ucuna aspire edilen bir sineğin, ağın önünde uçta sıkışıp kaldığından emin olun.
    5. Boru ve pipet uçları arasındaki bağlantıları parafilm kullanarak kapatın.
  3. Tek yuvalı tüplerin ve grup yuvalı şişelerin hazırlanması
    1. Tek yuvalı tüplerin hazırlanması
      1. 2 mL'lik bir mikrofüj tüpüne yaklaşık 500 μL taze hazırlanmış sinek yemi ekleyin (Şekil 1D). Yiyecekleri tüpün alt kısmına çekmek için mini bir santrifüj kullanın.
      2. Kapağı gece boyunca açık tutarak yiyeceği oda sıcaklığında katılaşacak şekilde ayarlayın. Başıboş sineklerin tüplere girmesini önlemek için tüpleri ince bir bez parçasıyla örtün.
      3. Mikrofüj tüplerinin kapaklarını hava sirkülasyonu için iğnelerle delin ve yiyecekler katılaştıktan sonra kapakları kapatın.
    2. Grup konut şişelerinin hazırlanması
      1. Düzenli sinek şişeleri alın ve şişelerin en azını taze hazırlanmış yiyeceklerle doldurun (Şekil 1D).
  4. Deneyden önce sineklerin hazırlanması
    1. İstenilen genotiplerin sinek hatlarını, standart sinek yemi içeren normal cam / plastik şişelerde, 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde 25 ° C'de bir inkübatörde koruyun.
    2. İstenilen genotipin yeni kapatılmış (0 ila 24 saat) sineklerini toplayın ve bir stereomikroskop kullanarak karbondioksit anestezisi altında cinsiyetlerini ayırın.
    3. Erkek sineklerin yarısını ayrı ayrı 'tek yuvalı tüplere' yerleştirin. Erkek sineklerin diğer yarısını 10 kişilik bir grupta tutun ve dişi sinekler düzenli 'grup konut şişelerinde' sosyal bir durum yaratır. Tüm tüpleri ve şişeleri 5 gün boyunca 25 °C'de saklayın.
      NOT: Davranış odasında 24-25 °C sıcaklık ve ~%50 nem sağlayın. Kullanılan sinek suşları şunlardı: w1118 ve FMR trans-heterozigot mutant sinekler (Fmr1Δ50M / Fmr1Δ113M)57. 5 gün boyunca tecrit altında tutulan Fmr1 sinekleri, başka bir erkeğe karşı saldırganlık nöbetlerinde önemli ölçüde azalma görülmüştür (Şekil 1E).
  5. Saldırganlık davranışı deneyinin gerçekleştirilmesi
    1. Saldırganlık deneyini ZT0-ZT3 zaman penceresi sırasında gerçekleştirin, çünkü sinekler günün bu saatinde en yüksek aktiviteyi gösterir.
      NOT: ZT=Standart 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsünde Zeitgeber saati; ZT0= ışıklar yanıyor, yani ışık fazının başlangıcı, ZT3= ışık fazının başlamasından 3 saat sonra vb. ZT12= ışıklar kapalı.
    2. Ağız-aspirasyon yöntemi ile tek veya grup konut odalarından iki erkek sineği kapaktaki delikten saldırganlık alanına aktarın; Sineklerin kaçamamasını sağlamak için deliği hemen uzaklaştırın.
    3. Sineklerin arenada 1-2 dakika alışmasına izin verin. 20 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın. Bir kamera veya cep telefonunu bir stand kullanarak arenanın tam dikey üzerine yerleştirerek sinekleri 20 dakika boyunca videoya kaydedin. Agresif nöbet türlerinin videoda görünür olduğundan emin olun.
      NOT: Arenanın net bir şekilde aydınlatıldığından emin olun ve kapaktan gelen parlama/yansımanın doğrudan kameranın merceğine düşmesini önleyin.
    4. Deneyi, her genotip ve her tür barınma koşulu için 15-20 çift sinek için tekrarlayın.
      NOT: Bilinçsiz önyargı, kontrol ve test sineklerinin yanı sıra birden fazla genotipe ait video dosyalarının çift kör edilmesiyle ortadan kaldırılabilir.
  6. Saldırganlık tahlil verilerinin analiz edilmesi
    1. Video dosyalarını, agresif nöbetlerin görülebilmesi için yeterince büyük ekrana sahip bir bilgisayara aktarın.
    2. Videoyu oynatın ve 20 dakikalık bir zaman diliminde toplam agresif nöbet sayısını sayın:58,59.
    3. Her genotipten ve her bir konut modelinden verileri bir elektronik tabloda derleyin ve düzenleyin ve herhangi bir istatistiksel yazılım kullanarak veri analizi yapın. İki kuyruklu bir t-testi gerçekleştirin ve verileri kutu ve yatay çizgi olarak çizin.

2. Sosyal alan tahlili

NOT: Burada açıklanan tahlil protokolü, arena ve analiz daha önce60,61 olarak tanımlanmıştır.

  1. Sosyal alan tahlili (SSA) arenasının hazırlanması
    1. Her iki üçgen akrilik ara parçayı (yükseklik = 8,9 cm, taban = 6,7 cm ve kalınlık = 0,3 cm) dikdörtgen bir cam panelin (13,5 cm x 10,4 cm, kalınlık 0,3 cm) üzerine düz bir şekilde yerleştirin. akrilik ara parçaların dik açıları cam panelin köşeleri ile hizalanır (Şekil 2A).
    2. İki dikdörtgen akrilik ara parçayı (6.7 cm x 1.5 cm, kalınlık = 0.3 cm) iki üçgen ara parçanın tabanlarıyla hizalanacak şekilde cam panelin üzerine düz bir şekilde yerleştirin. Bu düzenlemeden sonra, dört akrilik ara parçanın, ara parçalarla örtülmeyen dikdörtgen cam panel üzerinde üçgen bir arenayı (~2.16 cm61 sq.) çevrelediğini onaylayın (Şekil 2A,B). Üçgen ara parçalardan birine bir cetvel çıkartması (Şekil 2C) yerleştirin ve üstten göründüğünden emin olun.
    3. Şimdi akrilik ara parçaların üzerine, alttaki cam bölme ile aynı hizaya gelecek şekilde ikinci bir dikdörtgen cam panel (13,5 cm x 10,4 cm, kalınlık 0,3 cm) yerleştirin; Akrilik ara parçalar, cam boşluğu arasına sıkışacak ve ortada iki cam panel arasında üçgen bir boşluk bırakacaktır. Bölmeleri ve ara parçaları tutmak için dört küçük bağlayıcı klips kullanın.
  2. SSA için sineklerin hazırlanması
    1. İstenilen genotipin yeni kapatılmış (0 ila 24 saat) sineklerini toplayın ve bir stereomikroskop kullanarak soğuk anestezi altında cinsiyetlerini ayırın.
      NOT: Soğuk anestezi cihazını (bir Petri kabı kullanılabilir) -20 °C'lik bir inkübatörde soğutun. Sinekleri boş şişelere koyun, bu şişeleri sinekler hareketsiz hale gelene kadar buza (bir buz kovasına) daldırın, soğuk Petri kabına koyun ve sıralamaya başlayın.
    2. Erkek ve dişi sinekleri 24 saat boyunca gıda şişelerinde 25 ° C'lik bir inkübatörde 12 saat aydınlık / karanlık döngüsüyle saklayın.
      NOT: Burada gösterilen deneyler için kullanılan sinek suşları w1118 ve FMR trans-heterozigot mutant sineklerdi (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. SSA deneyini gerçekleştirme
    1. Saldırganlık testi ile aynı deney koşullarını koruyun (sıcaklık: 24-25 ° C, nem ~% 50) ve deneyi ZT0-ZT3 zaman penceresi sırasında gerçekleştirin.
    2. Sağ alt bağlayıcı klipsi çıkarın ve iki dikdörtgen ara parça arasında bir boşluk (~0.5 cm) oluşacak şekilde dikdörtgen ara parçayı hafifçe dışa doğru kaydırın.
    3. Sinekleri (önceki gün toplanan) yiyecek şişesinden boş bir şişeye aktarın. Dikdörtgen ara parçalar arasında oluşturulan boşluktan nazik bir aspirasyon ile onları sosyal alan alanına (üçgen alan) aktarın. Dikdörtgen ara parçayı ve bağlayıcı klipsi yerlerine geri kaydırarak boşluğu hemen kapatın ve sineklerin kaçması için boşluk kalmadığından emin olun.
    4. Hazneyi dik konumda tutarak, deneyin başlangıcında tüm sineklerin haznenin tabanında olduğundan emin olmak için hazneyi 3x yumuşak bir ped üzerine hafifçe vurun.
    5. SSA odasını dik konuma sıkıştırın ve zamanlayıcıyı başlatın. Sineklerin arenadaki pozisyonlarına yerleştiği ve minimum hareket gösterdiği 20 dakika sonra arenanın net bir fotoğrafını çekin. Parlama ve düzensiz aydınlatmadan kaçının.
    6. Sinekleri döverek ve 2.3.5 ile 2.3.7 arasındaki adımları (dahili kopyalar) tekrarlayarak aynı sinek popülasyonu için deneyi 3 kez tekrarlayın. Aynı genotip/koşula sahip farklı bir sinek popülasyonu ile 3x'i tekrarlayın (bağımsız tekrarlar).
      NOT: Sinekleri hazneden atmak için tahlil haznesini dondurun. Bir grup sinekle bir tur deney yapıldıktan sonra tüm kokuları gidermek için cam ve plastik yüzeyleri etanol ile silin.
  4. Sosyal alan tahlil verilerinin analizi
    1. ImageJ62 yazılımındaki görüntüleri analiz edin ve daha önceaçıklandığı gibi sinekler arası en yakın komşu mesafelerini listeleyin 61.
    2. İstatistiksel yazılım kullanarak istatistiksel analiz yapın ve grafikler çizin.
      NOT: Burada tarif edilen SSA testi için kullanılan sinek suşları w1118 ve Fmr1 trans-heterozigot mutant sineklerdi (Fmr1Δ50M / Fmr1Δ113M)57. Fmr1 sinekleri, en yakın komşulardan önemli ölçüde artan mesafeyi gösterir (Şekil 2D).

3. Kur tahlili

  1. Kur odası
    1. Kur yapma odasının dört parçasını da (Şekil 3A) Şekil 3B'de gösterilen sırayla bir araya getirin. Kapak ve taban parçaları arasına sıkıştırılan merkezi diskin her bir deliği, 'kur yapma odası' olarak çalışacaktır (Şekil 3C).
  2. Premate dişilerin elde edilmesi
    1. Her yiyecek şişesinde ~ 60-100 erkek ve dişi sinek bulunan CS (Kanton S, vahşi tip) sineklerinin birden fazla kültür şişesini başlatın ve bakımını yapın.
    2. Yetişkinler ortaya çıktığında, tüm yetişkin sinekleri atın ve her 2-3 saatte bir bu şişelerden çıkan sinekleri az miktarda maya ezmesi ile takviye edilmiş yeni gıda şişelerine aktarın.
      NOT: Şişelerin aşırı kalabalık olmasını önleyin. Eski sinekleri, larvaları veya pupaları çiftleşme şişesine aktarmamaya dikkat edin.
    3. Tüm dişilerin çiftleştiğinden emin olmak için bu "çiftleşme şişelerini" 4 gün boyunca kuluçkaya yatırın.
  3. Erkekler için tek yuvalı tüplerin hazırlanması
    1. Her 2 mL'lik mikrofüj tüpüne yaklaşık 500 μL sinek yemi ekleyin. Yiyecekleri tüpün alt kısmına çekmek için bir mini santrifüj makinesi kullanın.
    2. Yiyeceklerin gece boyunca katılaşmasına izin verin, mikrofüj tüpünün kapağını kesin, parafilm ile örtün ve parafilmi hava sirkülasyonu için bir iğne ile delin.
  4. Bakire erkeklerin toplanması ve izolasyonu
    1. İstenilen genotiplerden 10-15 erkek ve 20-30 bakire dişi ile ayrı gıda şişelerinde melezler oluşturun.
    2. İstenilen genotiplerin bakire erkeklerini döllerden toplayın ve aspiratör kullanarak tek tek 'tek yuvalı tüplerde' saklayın. Her 5-6 saatte bir (her genotip için 40-50 erkeğe kadar) yeni kapatılmış erkekleri toplamaya devam edin ve bunları ayrı tek yuvalı tüplerde izole edin.
    3. Tüpün kapağını parafilm ile tekrar kapatın.
  5. Kur yapma tahlil deneyinin gerçekleştirilmesi
    1. Test erkeklerinin 5 günlük izolasyonundan sonra, ZT0-ZT3 zaman penceresi sırasında kur yapma testini gerçekleştirin.
    2. Tahlil çalışma alanına odaklanarak video kayıt cihazlarını önceden iyi bir şekilde ayarlayın.
    3. Bir aspiratör yardımıyla, çiftleşme şişelerinden önceden doğmuş bir dişi (6-10 günlük) toplayın ve bir kur yapma odasına yerleştirin.
    4. Aspiratörü kullanarak, tek yuvalı tüpten bir erkek (kontrol/test) sineğini transfer deliğinden tek premated dişiyi içeren kur yapma odasına nazikçe aktarın. Hazneyi kapatmak için kapağı hızlı bir şekilde çevirin.
    5. Sineklerin davranışlarını 15 dakika boyunca videoya kaydedin.
  6. Video veri analizi ve istatistik
    1. Video dosyalarını bir bilgisayara aktarın; Videoyu manuel olarak inceleyerek erkeğin 15 dakika boyunca kur yapmak için geçirdiği süreye dikkat edin.
    2. Her erkek sinek için, erkeğin 15 dakika boyunca dişiye kur yapmak için harcadığı zamanın kesri (veya yüzdesi) olan kur yapma indeksini (CI) hesaplayın.
    3. 15 dakika içinde toplam çiftleşme denemesi sayısını sayın.
    4. Erkeğin ilk mahkeme girişiminden önce gösterdiği gecikme süresini, kur yapma gecikmesi (CL) olarak not edin.
      NOT: İstatistiksel güç elde etmek ve CI sonuçlarının tutarlılığını belirlemek için durum/genotip başına 40-60 erkeğin analiz edilmesi önerilir.

4. Tımar davranışı tahlili

  1. Tımar davranışı tahlil arenası
    1. Bakım davranışını kaydetmek için arena olarak ~0,4 cm3 hacimli küçük dairesel bir oda kullanın.
      NOT: Bölüm 3'te açıklanan aynı kur yapma arenası, tımar davranışı testi için kullanılabilir.
    2. Bakım davranışı, bacaklar gibi daha ince organların hareketlerinin kaydedilmesini içerdiğinden, yüksek çözünürlüklü veya yüksek kontrastlı video kaydı kullanın. Bu protokolü takip etmek için, 20 cm x 20 cm boyutlarında eşit şekilde aydınlatılmış bir yüzey olarak dağınık cam kaplı bir LED panel kullanın. Işığın alttan hazneden geçmesini sağlamak için kur yapma odasını panelin üstüne yerleştirin.
  2. Deneyden önce sineklerin hazırlanması
    1. Deneysel genotip sineklerini gıda şişelerinde 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü ile 25 ° C'de tutun.
    2. İstenilen genotipin yeni kapatılmış (0 ila 24 saat) sineklerini toplayın ve sosyal alan tahlilinde tarif edildiği gibi bir stereomikroskop kullanarak soğuk anestezi altında cinsiyetlerini ayırın.
    3. Erkek sinekleri 24 saat boyunca tek yuvalı tüplerde (saldırganlık testinde kullanıldığı gibi) izole edin.
      NOT: Burada gösterilen deney için kullanılan sinek suşları şunlardı: W1118 ve FMR trans-heterozigot mutant sinekler (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Tımar davranış testinin yapılması
    1. 24-25 °C sıcaklık ve nem ~% 50 koruyun; deneyi ZT0-ZT3 zaman penceresi16 sırasında gerçekleştirin.
    2. Tek yuvalı bir erkek sineği tek yuvalı bir tüpten bir aspiratör kullanarak tımar alanına aktarın. Sineklerin kaçamamasını sağlamak için kapaktaki deliği hemen kaydırın.
    3. Bakım arenasını dağınık bir LED panele yerleştirin ve sineğin arena içinde 1 dakika boyunca alışmasına izin verin. Kamerayı bir stand üzerine monte edilmiş arenanın üzerine tam olarak dikey olarak yerleştirerek sineği 10 dakika boyunca video kaydedin. Bakım nöbetlerinin türlerinin videoda görünür ve ölçülebilir olduğundan emin olun.
      NOT: Bakım davranışı, başın, gözlerin, antenlerin, hortum göğüslerinin, karının, genital organların ve bacaklarla kanatların ovuşturulmasını içerir (ilk çift: T1, ikinci çift: T2 veya üçüncü çift bacak: T3). Bu çalışmada dikkate alınan tımar davranış parametreleri Andrew ve ark. 41'de tarif edildiği ve Şekil 4'te gösterildiği gibidir.
    4. Her genotip için deneyi tekrarlayın.
    5. Bakım davranış verilerinin analiz edilmesi
      1. Videoları analiz edin ve aşağıdaki dört parametreyi hesaplayın: tımar Endeksi (tımarda geçirilen zamanın yüzdesi); tımar gecikmesi (ilk tımar nöbetine kadar geçen süre); tımar numarası; ve ortalama tımar süresi (toplam bakım süresi/nöbet sayısı).
      2. Bir sinek parametrelerden herhangi birini göstermeyi bıraktığında ve 2 saniye boyunca hareketsiz kaldığında veya nöbeti durdurduğunda ve en az 4 adım yürüdüğünde, tek bir tımar nöbetini bitti olarak işaretleyin.

5. Koku alma alışkanlığı için test

NOT: Şekil 5'te gösterildiği gibi, son montajın Y-labirent tahlilinin54,56 yapıldığı gün yapılması gerekmektedir.

  1. Alışkanlık için sineklerin hazırlanması
    1. Standart 12 saat ışık altında% 25 °C ortam sıcaklığına ve% 70 neme sahip bir inkübatörde tüm deneyler için istenen genotiplerin sineklerini yükseltin: 12 saat karanlık döngü (LD).
    2. 0-12 saat eski, yeni kapatılmış sinekleri toplayın ve ~ 30-40 sineği sıkılmış bir pamuklu tıpa ile taze orta boy bir şişeye aktarın.
    3. Deneyciyi deney altındaki genotipler hakkında kör tutmak için her şişeye kodlar atayın.
  2. Koku alma alışkanlığının indüksiyonu
    1. Parafin sıvısı (hafif) ile seyreltilmiş tercih edilen koku maddesinin 1 mL'sini 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne koyun. Kontrol için, 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpünde sadece 1 mL parafin sıvı ışığı kullanın. Homojen bir karışım sağlamak için tüpün içindekileri 10 dakika boyunca girdaplayın ve ardından eşit şekilde delikli plastik sargı ile örtün.
      NOT: Videoda %20 etil bütirat kullanılacaktır.
    2. Seyreltilmiş koku maddesini içeren tüpleri veya sadece seyreltici sıvıyı sinek içeren ayrı ortam şişelerinde askıya almak için tel kullanın.
    3. Şişeleri pamukla iyice örtün ve ardından kokulu buharın yayılmasını önlemek için kraft kağıtla sarın. Kontrol ve koku içeren şişeleri sırasıyla naif ve kokuya maruz kalmış (alışılmış) olarak etiketleyin. Bu indüksiyon şişelerini yukarıda belirtilen koşullara sahip bir inkübatörde 3 gün boyunca saklayın.
  3. Sineklerin ve Y-labirent aparatının hazırlanması
    1. Sinekleri indüksiyon şişelerinden sadece suya batırılmış filtre kağıdı içeren şişelere aktarın.
    2. Motivasyonu artırmak için deneyden önce oda sıcaklığında yaklaşık 16-18 saat aç bırakın.
    3. Y-labirent aparatının bileşenlerinin temiz ve kokusuz olduğundan emin olun; Dört parçayı dikey bir şekilde birleştirin. Tırmanma odalarını, daha sonra adaptörün üst kısmına bağlanan Y labirentine takın. Y labirentinin alt kısmını, Şekil 5'te gösterildiği gibi altta merkezi gövde görevi gören giriş şişesine sıkıca takın.
    4. Kokusuz silikon tüpler kullanarak her tırmanma odasının sivrilen ucunu koku verici içeren reaktif şişeleriyle (damıtılmış su ile 10-3 seyreltme) bağlayın.
    5. Koku maddesini bir vakum pompası yardımıyla gaz tüplerinden Y'nin iki koluna eşit bir akış hızında (~ 120 mL / dk) pompalayın ve kıvam için 15 dakika doygunluğa bırakın.
  4. Klasik Y-labirent testinin yapılması
    1. Her bir şişenin aç kalan sineklerini nazikçe Y-labirent kurulumunun giriş şişesine sokun.
    2. Kısa bir süre için alışmalarına izin verin; teste başlamak için giriş şişesini Y-labirent adaptörüne bağlayın; ve sineklerin Y-labirent kollarına tırmanmasına ve iki toplama odasında sıkışıp kalmasına izin verin. Her testin süresini 1 dakika olarak ayarlayın.
    3. Tamamlandıktan sonra, sinekleri giriş şişesinin altına geri vurun ve yan önyargıyı önlemek için Y-labirentinin kollarının konumunu değiştirin. Aynı sinek seti için dört okuma yapın.
    4. Süre içinde Y-labirentinin iki kolunun her birine tırmanan sineklerin sayısını kaydedin.
    5. Temsili bir veri seti elde etmek için testi en az 8 parti boyunca tekrarlayın.
  5. Toplanan verilerin analizi ve yorumlanması
    1. Sonuçları, hava kolunu (A) seçen sinek sayısı ile koku kolunu (O) seçen sinek sayısı arasındaki fark ile toplam katılımcı sinek sayısının bir kısmı olarak temsil edilebilen Performans İndeksini (PI) hesaplayarak nicelleştirin.
    2. Naif ve kokuya maruz kalan sineklerin PI'sinin anlamlı olup olmadığını kontrol etmek için istatistiksel testler (eşleştirilmemiş Öğrenci t-testi) kullanın.

Sonuçlar

Saldırganlık testi
Bir sinek ASD modeli olarak, Fmr1 mutant sineklerikullanılmıştır 63,64. w1118 erkek kontrol olarak ve Fmr1 trans-heterozigot Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 erkek sinek deneysel sinek olarak kullanıldı; Erişkin erkekler 5 gün boyunca izolasyon tüplerinde barındırıldı. Homotipik erkekler (aynı genotip, aynı barınma koşulları) saldırganlık alanına sokuldu ve davranışları 20 dakika boyunca kaydedildi. Her genotip için 20 dakika içinde toplam agresif nöbet sayısı sayıldı. 20 dakika boyunca agresif nöbetlerin sayısının, mutant erkeklerde kontrol erkeklerine göre önemli ölçüde azaldığı bulunmuştur (Şekil 1E). Fmr1 sineklerindeki bu azalan saldırganlık, başka bir sinekle sosyal etkileşime olan ilginin azalmasından kaynaklanıyor olabilir. Buna karşılık, grup / sosyal olarak barındırılan Fmr1 mutant erkek sinekleri, sosyal olarak barındırılan w 1118 sineklerinkiyle karşılaştırılabilir saldırganlık sayıları gösterir (veriler gösterilmemiştir), bu da muhtemelen sosyal davranışın indüksiyonunda sosyal çevrenin olumlu bir rolünü gösterir.

Sosyal Alan tahlili
Sosyal alan testi w1118 ve ASD model (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M) sineklerde gerçekleştirilmiştir. Her sinek için en yakın komşuya olan mesafe hesaplanmış ve her genotip için 10 biyolojik replikasyon gerçekleştirilmiştir. Mutant sinekler, kontrol muadillerine göre önemli ölçüde daha yüksek en yakın komşu mesafeleri gösterir (Şekil 2D), bu da diğer sineklerden daha fazla uzaklaşma tercihini gösterir.

Kur yapma tahlili
Tek evli erkek sineklerin kur yapma testi, iki ayrı ASD model sineğin doğuştan gelen kur yapma davranışını ölçmek için yapıldı. İlk olarak, Fmr1 transheterozigot sineklerinin kur yapma davranışı w1118'inkiyle karşılaştırıldı; Fmr1 sinekleri, önemli ölçüde daha düşük bir kur yapma indeksinin yanı sıra çiftleşme girişimlerinin sayısında azalma gösterdi (Şekil 3E1). İkinci bir deneyde, insan POGZ geninin (oldukça yaygın bir ASD risk geni20) bir Drosophila ortoloğu olan row, MB247-GAL4 sürücü hattını kullanarak mantar vücut nöronlarındaki sıraya karşı kısa bir saç tokası mikroRNA'sını eksprese ederek yere serildi. Bu sıra devirme ASD model sinekleri, doğuştan gelen kur yapma modelindeki herhangi bir kusur için test edildi; Kur yapma indeksi ve çiftleşme girişimi sayısı 15 dakikalık videolardan hesaplandı. Sıra devrilen sinekler, önemli ölçüde azalmış bir kur yapma indeksinin yanı sıra çiftleşme girişimi sayılarını gösterdi (Şekil 3E2), bu da dişilere karşı kusurlu iletişimlerini gösteriyor.

Bakım davranışı
Tımar davranışı, Drosophila 16,42,43'te tekrarlayan davranış için bir okuma olarak kullanılır. Tımar davranışı Fmr1 transheterozigot sineklerinde ölçüldü ve w1118 ile karşılaştırıldı. Fmr1 sineklerinde ilk tımar gecikmesi önemli ölçüde azalırken, Fmr1 sineklerinde ortalama tımar süresi ve tımar indeksi önemli ölçüde artmıştır (Şekil 4C), bu da OSB model sineklerinde gelişmiş tımar (veya tekrarlayan) davranışı olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, mutant sineklerdeki toplam tımar nöbeti sayısının, kontrol sineklerine kıyasla önemli ölçüde değişmediği bulundu.

Koku Alma Alışkanlığı testi
Alışkanlığın çok sayıda otistik bireyde kusurlu olduğu bulunmuştur ve Drosophila23'te bunun için bir test olarak kullanılabilir. Burada, LN1-GAL4 tarafından yönlendirilen koku alma lokal internöronlarında sırayı yıkarak koku alma alışkanlığı ASD modelinde test edildi. Bu deneylerde, bu sineklerde alışkanlık uyandırmak için caydırıcı bir koku verici olan etil bütirat kullanılmıştır. Sonuçlar, 3 günlük bir koku maruziyetinden sonra sıra devirme sineklerinin alışılmadığını göstermektedir ( Şekil 5E'deki grafikteki son iki çubuk, naif ve alışılmış sinekler arasında anlamlı bir fark göstermemektedir), 3 gün boyunca etil bütirata maruz kaldıktan sonra tipik alışkanlık gösteren vahşi tip sineklere kıyasla (maruz kalan sinekler, saf sineklere kıyasla performans indeksinde önemli bir düşüş göstermektedir). Bu, sıra devirme sineklerinin 3 gün boyunca etil bütirata maruz kaldıktan sonra alışmadığını ve itici koku verici tarafından itildiğini gösterir, bu da bu ASD sineklerinin alışkanlık eksikliği olduğunu kanıtlar.

figure-results-1
Şekil 1: Saldırganlık arenası ve temsili davranış kalıpları. (A) Sinek girişi için delikli bir kapağı olan 24 oyuklu bir plakada saldırganlık arenası kurulumu. İç: İçinde sinek yemi bulunan tek bir arenanın boyutları. (B) Tek bir izole erkek sinek içeren tek barınaklı bir tüpün ve erkek ve dişi sinekleri içeren bir grup barınak şişesinin fotoğrafı, sosyal bir çevreyi özetliyor. (C) Sineklerin ağız aspirasyonuna dayalı transferi için bir aspiratör. Sinek girişi için tüpün yanlarını (sinek ucu) ve ağza sokulacak tarafı (ağız ucu) (C1) ve monte edilmiş bir sinek aspiratörünü (C2) gösteren bir sinek aspiratörünün montajı için gerekli öğeler. (D) Temsili erkek-erkek saldırgan davranış kalıpları: yaklaşma, kanat tehdidi, eskrim, tutma, akciğer, boks ve mücadele. (E) Fmr1 mutant erkek sinekleri, kontrollere kıyasla diğer erkeklere karşı daha az agresif davranış gösterir. Fmr1 trans-heterozigot sineklere (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M) karşı w1118 (kontrol) sosyal olarak izole edilmiş erkekler için agresif nöbetlerin sayısını gösteren kutu grafiği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Sosyal alan tahlili arena kurulumu. (A) Cam panellerin ve akrilik ara parçaların boyutlarını ve düzenini gösteren diyagram. (B) Akrilik ara parçaların cam parçaları arasına sıkıştırıldığı ve altta sinek girişi için küçük bir boşluk bırakıldığı arena bileşenlerinin son düzenlemesi. Cam parçaları ve ara parçalar arasında oluşturulan üçgen boşluk, sinekler için SSA arenasıdır, burada sinekler sadece iki boyutta hareket edebilir. (C) Odanın içinde sinekler bulunan son SSA arena kurulumunun fotoğrafı. Kısaltma: SSA = sosyal alan dizisi. (D) ASD modeli (Fmr1 transheterozigot) sinekler, w1118'e kıyasla sosyal alan tahlilinde birbirlerinden daha fazla mesafe göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Kur yapma arenası ve temsili davranış kalıpları. (A) bir kur tahlili arenasında disklerin tasarımını ve (B) düzenini gösteren diyagramlar. (C) Son düzenlemeden sonra kur yapma arenasının fotoğrafı. (D) Saf bir erkeğin çiftleşmiş bir dişiye karşı kur yapma davranış kalıplarını gösteren temsili görüntüler: kovalama, yönlendirme, kanat titremesi, yalama, çiftleşme girişimi ve çiftleşme. (E) İki ASD modelinde kur yapma indeksini ve çiftleşme girişimlerinin sayısını gösteren grafikler: (E1) Fmr1 mutant sinekleri, w1118 kontrolüne kıyasla kur yapma indeksinde ve çiftleşme girişiminde önemli bir azalma gösteriyor. (E2) sıra devirme sinekleri, row-shRNA'nın mantar body nöronlarında (MB247-GAL4) eksprese edildiği başka bir ASD modeli olarak kullanıldı; Sıra devrildikten sonra kur yapma davranışında önemli bir azalma gözlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Arena kurulumu ve tımar davranışının temsili davranış kalıpları. (A) Disk veya tekerlek şeklindeki arena ( Şekil 3'te gösterilen aynı kur arenası), alttan eşit aydınlatma için bir difüzöre sahip bir LED panel üzerine kurulmuş ve üstten video çekilmiştir. Bu, tımar sırasında eklerin ince hareketini tanımlamak için gereken daha yüksek bir kontrast sağlar. (B) Yetişkin erkek sineklerde gözlenen tımar davranış kalıplarının fotoğrafları. T1 = 1. çift bacak , T2 = 2. çift bacak , T3 = üçüncü çift bacak. Sezgisel kısaltılmış isimlendirme, B'deki bakım kalıpları için kullanılır: T1-kafa = ilk bacaklarla ovuşturulan baş; T1-T1 = ilk çift bacak birbirine sürtünür, vb. Kısaltma: LED = ışık yayan diyot. (C) Fmr1 trans-heterozigot sineklerde gerçekleştirilen ve w1118 ile karşılaştırılan tımar testi sonuçlarını gösteren grafikler. Fmr1 mutant sinekleri, ilk tımar nöbeti için önemli ölçüde azalmış gecikme gösterdi, bu da kontrole kıyasla tımarın erken başladığını gösteriyor. Ayrıca, Fmr1 mutantlarında ortalama tımar süresi ve tımar indeksi önemli ölçüde artmıştır, bu da ASD model sineklerinde tekrarlayan davranışın arttığının bir göstergesidir. Buna karşılık, mutant sineklerde toplam tımar nöbeti sayısı, kontrole kıyasla önemli ölçüde değişmedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Tahlil sonrası koku alma alışkanlığı ve temsili sonuç için indüksiyon ve tahlil kurulumu. (A) İkili koku seçimi tahlil kurulumunun bileşenleri: (A1) Y-labirenti, (A2) adaptör, (A3) bu ikisinin düzenlenmesi, (A4) Y-labirent kollarının tepesine takmak için bir çift toplama tüpü, (A5) Y-labirentine geçmeden önce havanın kabaracağı koku verici solüsyonu veya suyu tutmak için cam şişe ve cam tüpler. (B) Koku alma alışkanlığının indüksiyonu için sinek gıda şişesi kurulumu; çizgi diyagram (B1), koku içeren mikrofüj tüpünün şişenin ortasında bir bakır tele nasıl asıldığını gösterir; (B2) son olarak, şişenin ağzı pamukla kapatılır ve kahverengi kağıt zarflarla kapatılır. (C) Y labirenti kurulumunun toplam düzenlemesinin fotoğrafı. (D) Bir deneyin bitiminden sonra toplama odalarındaki sineklerin dağılımını gösteren fotoğraflar. (D1) Naif sinekler (sadece kokusuz parafine maruz kalan, kontrol) itici koku vericiye (bu çalışmada alışkanlığın indüksiyonu için kullanılan% 20 etil bütirat) karşı itme gösterir ve Y-labirentinin düzenli hava ile dolu kolunda seçim yaparken, (D2) maruz kalan (alışılmış) sinekler her iki kolda eşit olarak dağılır. Kısaltma: ID = iç çap. (E) Sıra devirme sineklerinin koku alma alışkanlığı tahlil sonuçları alışkanlık kusuru gösterdi. Yabani tip (Kanton S) sinekleri, etil bütirata 3 gün maruz kaldıktan sonra, alışmanın göstergesi olan saf sineklere kıyasla performans endeksinde önemli bir azalma gösterdi. LN1-GAL4 x row-shRNA sineklerinin dölleri 3 gün boyunca maruz kaldığında, performans indeksinin saf sineklerinkinden önemli ölçüde farklı olmadığı bulundu; bu, bu sıra devirme sineklerinin 3 günlük koku verici maddeye maruz kaldıklarında alışılmadıklarını ve insan ASD benzeri bir semptomu özetlediğini göstermektedir. Kısaltmalar: ASD = otizm spektrum bozukluğu; shRNA = kısa saç tokası RNA'sı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Drosophila , sinek ve insan hastalığı genleri arasındaki gen dizilerinin yüksek derecede korunması nedeniyle insan nörolojik bozukluklarında araştırma için iyi bir model organizma olarak kullanılır9. Çok sayıda sağlam davranışsal paradigma, onu insan hastalıklarını özetleyen mutantlarda ortaya çıkan fenotipleri incelemek için çekici bir model haline getirir. Otizm spektrum bozukluğunda (ASD) yüzlerce gen rol oynadığından, herhangi bir model organizmada ortak bir OSB modeli yoktur. Bu nedenle, her mutant için, araştırmacılar önce sinekte ASD benzeri fenotipler oluşturmalıdır. Bu yazıda, bu tür bir değerlendirme için beş sinek davranışsal paradigmasının birlikte kullanılmasını önererek süreci kolaylaştırmaya çalıştık. Bu paradigmalar, insan ASD hastalarının başlıca ve yaygın olarak ortaya çıkan davranışsal eksikliklerini değerlendirmek için sineklerde kullanılır: sosyal ve iletişim eksiklikleri, tekrarlayan davranışların artması ve alışkanlık kusuru. Bir sinek gen mutasyonu bu beş paradigmanın tümünde veya çoğunda kusur gösteriyorsa, ASD benzeri bir senaryonun güçlü bir göstergesi olabilir.

Burada açıklanan davranışsal paradigmaların çoğu, çeşitli araştırma sorularını çözmek için önceki literatürde birçok kez kullanılmıştır. Farklı çalışmalar arasında tekniklerde farklılıklar bulmak nadir değildir. Tekniklerdeki ince ayarlar, araştırma ihtiyacını karşılamak ve çözülmekte olan belirli sorunun talebine uyacak şekilde yapıldı. Örneğin, kur yapma tahlilinde, doğuştan gelen ve öğrenilmiş kur yapma davranışı, olgunlaşmamış bir erkek 65, bakire bir dişi66,67, prematize edilmiş bir dişi 68,69,70, dondurularak öldürülen bir bakire dişi 65 veya hatta kafası kesilmiş bir dişi19 olabilen bir test sineğine doğru ölçülebilir. Bu yazıda açıklanan yöntemde, vahşi tip önceden çiftleşmiş dişiler, bir erkek ASD model sineğin kur yapma modelini kontrol etmek için bir test cihazı olarak kullanılmıştır. Prematizeedilmiş bir dişinin dış alıcılığı, bakire bir sineğinkinden nispeten daha düşüktür71. Sonuç olarak, erkek kur nöbetlerinin sayısı ve süreleri, bir bakireden çok çiftleşmiş bir kadına yöneliktir; Benzer şekilde, çiftleşme gecikmesi de bakire testçi dişilerinkinden daha uzundur, bu durumda erken çiftleşme, kur yapma indeksinin azalmasına yol açarak genotipler arasında etkili karşılaştırma kapsamını azaltır. Bu nedenle, önceden hazırlanmış dişinin test cihazı olarak kullanılması, bir ASD sineğinin vahşi tip bir sineğin kur yapma davranışının daha iyi bir karşılaştırmalı analizini sağlar. Öte yandan, bakire dişilerin kullanımı, çiftleşmiş dişiler kullanıldığında maskelenebilecek ek bilgiler sağlayabilir. Çiftleşmiş dişilerin kullanımı da erkeklerin kur yapma davranışını etkileyebilir ve değiştirebilir. Özetle, araştırmacıların deneysel stratejilerini ve detaylarını belirli bir deneyin gerekliliğine bağlı olarak seçmeleri önerilmektedir.

ASD genlerinin herhangi bir veya tüm sinek homologlarında tekniği uygulamadan önce burada dikkatli olmak gerekir. Tüm bu davranışsal paradigmalar, belirli ve az sayıda nöron tarafından düzenlenir. Belirli bir davranışsal paradigmaya geçmeden önce belirli bir genin ifadesi kurulmalıdır. Örneğin, ASD ile ilişkili bir genin sinek homologu mantar vücut nöronlarında veya glutamaterjik nöronlarda ifade edilmezse, mutantında kur yapma ve tımar etme davranışı etkilenmeyebilir.

Araştırmacıların dikkat etmesi gereken bir diğer nokta da, bir kusurun olmamasının her zaman mutasyonun rolü olmadığı anlamına gelmediğidir. Örneğin, Fmr1 mutantları ile yapılan tımar davranışı deneylerinde, toplam tımar sayısı mutantlarda kontrollere göre önemli ölçüde düşük değildir, oysa tımar indeksi vb. gibi diğer parametreler tımar davranışında bir kusur göstermektedir. Bu, Fmr1 mutantlarında her bir tımar maçının uzamasıyla açıklanabilir, bu da toplam nöbet süresinin çok daha yüksek olmasına rağmen toplam nöbet sayısının düşük bir sayısıyla sonuçlanır. Bu, her davranış modeli için birden fazla parametrenin nicelleştirilmesi ihtiyacını vurgulamaktadır. Ayrıca, ASD teriminin, yüzlerce genden herhangi birindeki varyasyonların neden olduğu geniş bir hastalık yelpazesini kapsadığı ve etkilenen bireyler arasında çeşitli derecelerde penetransa sahip heterojen fenotiplerle sonuçlandığı unutulmamalıdır. Örneğin, bazı hastalarda alışkanlık eksikliği görülürken hepsinde görülmez. Aynı şey hastalığın sinek modellerinde de beklenir.

Saldırgan davranışın analizi için, bu çalışmada farklı türde saldırgan parametreler dikkate alınmıştır: akciğer, kanat tehdidi, boğuşma, vb. (Şekil 1)30. Her maçın ayrı bir maç türü veya toplam maç sayısı olarak tanımlanması ve sayılması gerekir. İlk olarak,59,72'de açıklanan ve Şekil 1'de gösterilen erkek sineklerin saldırganlık kalıpları hakkında bilgi sahibi olmak önemlidir. Agresif maç sayılarını sayarken, tek bir saldırganlık olayının başlangıç ve bitiş noktalarının açıkça tanımlanması gerekir; Tek bir maçta birden fazla saldırganlık modeli türü gösterilebilir ve ardından maçın sonu gelebilir. Bir sinek 2 saniye boyunca agresif davranışlardan veya hareketlerden herhangi birini göstermeyi bıraktığında veya nöbeti durdurup uzaklaşmaya başladığında, bir saldırganlık nöbeti sona ermiş sayılır.

Bu davranışsal paradigmaların çoğu, birden fazla laboratuvar tarafından tanımlanan çoklu varyasyonlara ve ilerlemelere sahiptir. Belirli değişikliklerin her biri, belirli bir amacın ihtiyaçlarını karşılamak için yaratılmıştır. Benzer şekilde, otomatik ve algoritma tabanlı niceleme veya analiz teknikleri, bu teknikleri manuel hata olasılığından kurtarmıştır. Bu yazıda, en temel teknikler en az materyal gereksinimi ile gösterilmiş, bu tekniklerin en fazla sayıda araştırmacı tarafından kolayca benimsenmesi ve kullanılması umuduyla verilmiştir.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Alışma ve koku seçimi tahlil kurulumu için Mani Ramaswami (NCBS, Bangalore) ve Baskar Bakthavachalu'ya (IIT Mandi), saldırganlık tahlili hakkındaki değerli önerileri için Pavan Agrawal'a (MAHE), kur yapma tahlil odası prototipini ve Fmr1 mutant sinek hatlarını paylaştığı için Amitava Majumdar'a (NCCS, Pune) ve MB247-GAL4 hattını paylaştığı için Gaurav Das'a (NCCS, Pune) son derece müteşekkiriz. Bloomington Drosophila Stok Merkezi'ne (BDSC, Indiana, ABD), Ulusal Genetik Enstitüsü'ne (NIG, Kyoto, Japonya), Banaras Hindu Üniversitesi'ne (BHU, Varanasi, Hindistan) ve Ulusal Biyoloji Bilimi Merkezi'ne (NCBS, Bangalore, Hindistan) Drosophila serileri için teşekkür ederiz. Laboratuvardaki çalışmalar, SERB-DST'DEN (ECR/2017/002963) AD'ye verilen hibeler, AD'ye verilen DBT Ramalingaswami bursu (BT/RLF/Re-entry/11/2016) ve IIT Kharagpur, Hindistan'dan kurumsal destek ile desteklenmiştir. SD ve SM Doktora almak CSIR-Kıdemli Araştırma Bursu'ndan burslar; PM, Hindistan'daki MHRD'den doktora bursu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > Saldırganlık arenası: < / güçlü >
yapılmış standart 24 oyuklu plaka. Tek bir kuyu çapı= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; derinlik = 1 cm
Şeffaf plastik/akrilik levhaAlternatif: bir hücre kültürü plakasının delikli bir kapağı
< güçlü > Sosyal Alan Deneyi: < / güçlü>
Bağlayıcı klipsler19 mm
Özel boyutlardaKalınlık = 5 mm
< güçlü > Kur tahlili: < / güçlü >
dişli
Özelleştirilmiş şekilleresahip Perspex levhalari) Kapak: Periferik bölgede bir yükleme deliği ve merkezde başka bir vida deliği (her biri için ~ 3 mm) bulunan özel yapım yuvarlak şeffaf Perspex disk (2-3 mm kalınlığında, 70 mm çapında); ii) Merkezden eşit uzaklıkta, 15 mm çapında 6-8 delikli ikinci bir şeffaf kalın Perspex disk (3-4 mm kalınlığında, 70 mm çapında); iii) Taban: Yükleme deliği olmadan kapakla aynı
< güçlü > Tımar testi: < / güçlü >
Dağınık cam kaplı LED panel10 < 15 Watt tavana monte edilebilir LED panel
Habituation ve Y-labirent tahlili
tırmanma odalarıx2, Borosilikat cam
Y-labirenti giriş şişesi, ısmarlama, Şekil 5A< / güçlü>
şeffaf reaktif şişelerindeBorosil #1500017
Gaz yıkama tıpasıBorosil #1761021
Cam şişedış çapı= 25 mm x Yükseklik= 85 mm; Borosilikat Cam
Koku Verici (Etil Butirat)Merck #E15701
Parafin mumu (sıvı) ışıkSRL #18211
Makaralı kelepçelerPolymed #14098
Silikon tüplerOD = 0,6 cm, ID = 0,3 cm; akış kontrolü için makaralı kelepçeler
Vakum pompasıHana #HN-648 (Akış yönü olan herhangi bir akvaryum pompası manuel olarak ters çevrilmiş)
Y-labirentBorosilikat cam
Y-şekilli cam tüp (borosilikat cam)Özel yapım, Şekil 5A
Ortak öğeler:
Video oynatma için herhangi bir yazılım (örn. - VLC medya oynatıcı)https://www.videolan.org/vlc/
Video veri analizi
Sinek şişeleriOD= 60 mm x Yükseklik= 140 mm; cam/polipropilen
Sinek şişeleriOD= 25 mm x Yükseklik= 85 mm; Borosilikat Cam
Grafik Pad Prizma yazılımıhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ yazılımıhttps://imagej.net/downloads
Zamanlayıcı
Video kayıt ayarlıKamera veya cep telefonu kamerası çalışacaktır
< güçlü > Sinek Aspiratörü için: < / güçlü >
PamukEmici, otoklavlanmış
ParafilmSigma-aldrich #P7793
Pipet uçları200 ve mikro; L veya 1000 & L, silikon tüpün dış çapına göre karar verin
Silikon / kauçuk tüpuzunluğu = 30-50 cm. Tüp kokusuz
< güçlü olmalıdır> Sinek yeminin bileşimi: < / güçlü >
Malzemeler (1 L gıda için miktar)
Agar (8 g)SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Mısır unu (80 g)Organik, yerel olarak tedarik edilen
D-Glikoz (20 g)SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propiyonik asit (4 g)SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sükroz (40 g)SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Metil para hidroksi benzoat) (1.25 g)SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Maya Tozu (10 g)HIMEDIA # RM027
Bu çalışmada yapılan deneylerde kullanılan sinek çizgileri:
Vahşi tip (Kanton S veya CS)BDSC # 64349
w1118BDSC # 3605
w[1118]; fmr1[δ 50M]/TM6B, Tb[+]BDSC # 6930
w[*]; fmr1[δ 113M]/TM6B, Tb[1]BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, Hindistan)BDSC # 50742
LN1-GAL4NP1227, NP konsorsiyumu, Japonya
row-shRNABDSC # 25971
12 cm x 8 cm x 2 cm şeffaf polistirenden cam levhalar ve akrilik levhalar somun ve cıvata Perspex ile bağlamak için adaptör ölçümler için bilgisayar video kamera

Kaynaklar

  1. American Psychiatric Association. American Psychiatric Association DSM-5 Task Force Diagnostic and statistical manual of mental disorders: DSM-5TM, 5th ed. , Am. Psychiatr. Publ. Inc. (2013).
  2. Zeidan, J., et al. Global prevalence of autism: A systematic review update. Autism Res. 15 (5), 778(2022).
  3. Lordan, R., Storni, C., De Benedictis, C. A. Autism spectrum disorders: diagnosis and treatment. Autism Spectr Disord. , Exon Publications. (2021).
  4. Horev, G., et al. Dosage-dependent phenotypes in models of 16p11.2 lesions found in autism. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 17076-17081 (2011).
  5. Bey, A. L., Jiang, Y. Overview of mouse models of autism spectrum disorders. Curr Protoc Pharmacol. 66 (1), 1(2014).
  6. Fetit, R., Price, D. J., Lawrie, S. M., Johnstone, M. Understanding the clinical manifestations of 16p11.2 deletion syndrome: a series of developmental case reports in children. Psychiatr Genet. 30 (5), 136-140 (2020).
  7. Nicolini, C., Fahnestock, M. The valproic acid-induced rodent model of autism. Exp Neurol. 299, 217-227 (2018).
  8. Tartaglione, A. M., Schiavi, S., Calamandrei, G., Trezza, V. Prenatal valproate in rodents as a tool to understand the neural underpinnings of social dysfunctions in autism spectrum disorder. Neuropharmacology. 159, 107477(2019).
  9. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophilamelanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  10. Coll-Tane, M., Krebbers, A., Castells-Nobau, A., Zweier, C., Schenck, A. Intellectual disability and autism spectrum disorders "on the fly": Insights from Drosophila. DMM Dis Model Mech. 12 (5), 1-16 (2019).
  11. Tian, Y., Zhang, Z. C., Han, J. Drosophila studies on autism spectrum disorders. Neurosci Bull. 33 (6), 737-746 (2017).
  12. Ueoka, I., Pham, H. T. N., Matsumoto, K., Yamaguchi, M. Autism spectrum disorder-related syndromes: Modeling with Drosophila and rodents. Int J Mol Sci. 20 (17), 1-24 (2019).
  13. Yost, R. T., et al. Abnormal social interactions in a Drosophila mutant of an autism candidate gene: Neuroligin 3. Int J Mol Sci. 21 (13), 1-20 (2020).
  14. Wise, A., et al. Drosophila mutants of the autism candidate gene neurobeachin (rugose) exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, impaired adult social behavior and activity patterns. J Neurogenet. 29 (2-3), 135-143 (2015).
  15. Koemans, T. S., et al. Functional convergence of histone methyltransferases EHMT1 and KMT2C involved in intellectual disability and autism spectrum disorder. PLoS Genet. 13 (10), e1006864(2017).
  16. Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated levels of the vesicular monoamine transporter and a novel repetitive behavior in the Drosophila model of fragile X syndrome. PLoS One. 6 (11), e27100(2011).
  17. Iyer, J., et al. Pervasive genetic interactions modulate neurodevelopmental defects of the autism-associated 16p11.2 deletion in Drosophilamelanogaster. Nat Commun. 9 (1), 1-19 (2018).
  18. Palacios-Muñoz, A., et al. Mutations in trpγ, the homologue of TRPC6 autism candidate gene, causes autism-like behavioral deficits in Drosophila. Mol Psychiatry. 27 (8), 3328-3342 (2022).
  19. Hahn, N., et al. Monogenic heritable autism gene neuroligin impacts Drosophila social behaviour. Behav Brain Res. 252, 450-457 (2013).
  20. Stessman, H. A. F., et al. Disruption of POGZ is associated with intellectual disability and autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 98 (3), 541-552 (2016).
  21. Hope, K. A., et al. The Drosophila gene sulfateless modulates autism-like behaviors. Front Genet. 10, 574(2019).
  22. Stessman, H. A. F., et al. Targeted sequencing identifies 91 neurodevelopmental-disorder risk genes with autism and developmental-disability biases. Nat Genet. 49 (4), 515-526 (2017).
  23. Fenckova, M., et al. Habituation learning is a widely affected mechanism in Drosophila models of intellectual disability and autism spectrum disorders. Biol Psychiatry. 86 (4), 294-305 (2019).
  24. Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and "loser" effect formation in Drosophilamelanogaster. Learn Mem. 22 (2), 64-68 (2015).
  25. Anderson, D. J. Circuit modules linking internal states and social behaviour in flies and mice. Nat Rev Neurosci. 17 (11), 692-704 (2016).
  26. Flanigan, M. E., Russo, S. J. Recent advances in the study of aggression. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 241-244 (2018).
  27. Sun, Y., et al. Social attraction in Drosophila is regulated by the mushroom body and serotonergic system. Nat Commun. 11 (1), 1-14 (2020).
  28. Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophilamelanogaster. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12342-12347 (2004).
  29. Kravitz, E. A., Fernandez, M. delaP. Aggression in Drosophila. Behav Neurosci. 129 (5), 549-563 (2015).
  30. Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (8), 5664-5668 (2002).
  31. Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly (Austin). 6 (1), 35-48 (2012).
  32. Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J Vis Exp. (2), e155(2007).
  33. Agrawal, P., Kao, D., Chung, P., Looger, L. L. The neuropeptide Drosulfakinin regulates social isolation-induced aggression in Drosophila. J Exp Biol. 223 (2), 207407(2020).
  34. Wang, L., Dankert, H., Perona, P., Anderson, D. J. A common genetic target for environmental and heritable influences on aggressiveness in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5657-5663 (2008).
  35. Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila: Measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11 (2), 243-252 (2012).
  36. Corthals, K., et al. Neuroligins Nlg2 and Nlg4 affect social behavior in Drosophilamelanogaster. Front Psychiatry. 8, 113(2017).
  37. Cao, H., Tang, J., Liu, Q., Huang, J., Xu, R. Autism-like behaviors regulated by the serotonin receptor 5-HT2B in the dorsal fan-shaped body neurons of Drosophilamelanogaster. Eur J Med Res. 27 (1), 1-15 (2022).
  38. Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophilamelanogaster behavior - A new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
  39. Shilpa, O., Anupama, K. P., Antony, A., Gurushankara, H. P. Lead (Pb)-induced oxidative stress mediates sex-specific autistic-like behaviour in Drosophilamelanogaster. Mol Neurobiol. 58 (12), 6378-6393 (2021).
  40. Dockendorff, T. C., et al. Drosophila lacking dfmr1 activity show defects in crcadian output and fail to maintain courtship interest. Neuron. 34 (6), 973-984 (2002).
  41. Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. J Neurogenet. 35 (1), 1-22 (2021).
  42. Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. J Vis Exp. (125), e55231(2017).
  43. Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, e34497(2018).
  44. Webb, S. J., et al. Toddlers with elevated autism symptoms show slowed habituation to faces. Child Neuropsychol. 16 (3), 255-278 (2010).
  45. Kleinhans, N. M., et al. Reduced neural habituation in the amygdala and social impairments in autism spectrum disorders. Am J Psychiatry. 166 (4), 467-475 (2009).
  46. Ethridge, L. E., et al. Reduced habituation of auditory evoked potentials indicate cortical hyper-excitability in Fragile X Syndrome. Transl Psychiatry. 6 (4), e787-e787 (2016).
  47. McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis. Neurosci Biobehav Rev. 80, 286-305 (2017).
  48. Kuiper, M. W. M., Verhoeven, E. W. M., Geurts, H. M. Stop making noise! Auditory sensitivity in adults with an autism spectrum disorder diagnosis: physiological habituation and subjective detection thresholds. J Autism Dev Disord. 49 (5), 2116-2128 (2019).
  49. McDiarmid, T. A., et al. Systematic phenomics analysis of autism-associated genes reveals parallel networks underlying reversible impairments in habituation. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (1), 656-667 (2020).
  50. Lyons-Warren, A. M., Herman, I., Hunt, P. J., Arenkiel, B. A systematic-review of olfactory deficits in neurodevelopmental disorders: From mouse to human. Neurosci Biobehav Rev. 125, 110-121 (2021).
  51. Kepler, L. D., McDiarmid, T. A., Rankin, C. H. Habituation in high-throughput genetic model organisms as a tool to investigate the mechanisms of neurodevelopmental disorders. Neurobiol Learn Mem. 171, 107208(2020).
  52. Huang, T. N., Yen, T. L., Qiu, L. R., Chuang, H. C., Lerch, J. P., Hsueh, Y. P. Haploinsufficiency of autism causative gene Tbr1 impairs olfactory discrimination and neuronal activation of the olfactory system in mice. Mol Autism. 10 (1), 1-16 (2019).
  53. Twick, I., Lee, J. A., Ramaswami, M. Chapter 1 - Olfactory habituation in Drosophila-odor encoding and its plasticity in the antennal lobe. Prog Brain Res. 208, 3-38 (2014).
  54. Das, S., et al. Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (36), E646-E654 (2011).
  55. Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila. J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).
  56. Ayyub, C., Paranjape, J., Rodrigues, V., Siddiqi, O. Genetics of olfactory behavior in Drosophilamelanogaster. J Neurogenet. 6 (4), 243-262 (1990).
  57. Michel, C. I., Kraft, R., Restifo, L. L. Defective neuronal development in the mushroom bodies of Drosophila fragile X mental retardation 1 mutants. J Neurosci. 24 (25), 5798-5809 (2004).
  58. Fernandez, M. P., Trannoy, S., Certel, S. J. Fighting flies: quantifying and analyzing Drosophila aggression. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 107985(2023).
  59. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  60. Simon, A. F., et al. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181 (2), 525-541 (2008).
  61. McNeil, A. R., et al. Conditions affecting social space in Drosophilamelanogaster. J Vis Exp. (105), e53242(2015).
  62. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  63. Drozd, M., Bardoni, B., Capovilla, M. Modeling Fragile X Syndrome in Drosophila. Front Mol Neurosci. 11, 124(2018).
  64. Trajković, J., et al. Drosophilamelanogaster as a model to study Fragile X-associated disorders. Genes (Basel). 14 (1), 87(2022).
  65. Gailey, D. A., Jackson, F. R., Siegel, R. W. Male courtship in Drosophila: the conditioned response to immature males and its genetic control. Genetics. 102 (4), 771-782 (1982).
  66. Cannon, R. J. C. Drosophila courtship behaviour. Courtship and Mate-finding Insects. , 1-13 (2023).
  67. von Philipsborn, A. C., Shohat-Ophir, G., Rezaval, C. Single-pair courtship and competition assays in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (7), 450-459 (2023).
  68. Keleman, K., Krüttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nat Neurosci. 10 (12), 1587-1593 (2007).
  69. Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. J Vis Exp. (124), e55808(2017).
  70. Fitzsimons, H. L., Scott, M. J. Genetic modulation of Rpd3 expression impairs long-term courtship memory in Drosophila. PLoS One. 6 (12), e29171(2011).
  71. Kubli, E. My favorite molecule. The sex-peptide. BioEssays. 14 (11), 779-784 (1992).
  72. Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophilamelanogaster. Nat Protoc. 2 (11), 2712-2718 (2007).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Drosophila Otizm ModeliDavranışsal ParadigmalarSosyal Alan DeneyiAgresyon DeneyiKur DavranışıTemizlenme DavranışıAlışma DeneyiNörogelişimsel BozukluklarGen SusturmaTekrarlayıcı Davranış
Otizm Spektrum Bozukluğunun Drosophila Modelinde Davranışsal Değerlendirme Paradigmaları
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.