Biyo-Hibrit Sivrisinek Stinger Tabanlı Atomik Kuvvet Mikroskobu Probunun Geliştirilmesi

Dünya Sağlık Örgütü (WHO), vektör kaynaklı hastalıkların (VBD'ler) tüm bulaşıcı hastalıkların %17'sinden fazlasını oluşturduğunu ve dünya çapında yılda 7.000.000'den fazla ölüme neden olduğunu bildirmiştir. Örneğin, dünyanın en ölümcül hayvanı olan sivrisinekler, kanla beslenen eklembacaklılar yoluyla dang humması, sıtma ve Zika gibi çok sayıda patojeni yayarak her yıl 700 milyon enfeksiyona neden olur¹. Sivrisineklerin ısırma mekanizmalarını araştırmak için penetrasyon davranışlarını taklit etmek ve penetrasyonu önlemedeki etkinliklerini kanıtlamak için potansiyel engellerin incelenmesi de dahil olmak üzere, VBD'leri önlemek için etkili önlemlerin geliştirilmesine yönelik araştırmalar çok önemlidir. Önemli zorluklardan biri, bu tür araştırmaları gerçekleştirmek için uygun yaklaşımlar geliştirmektir. Literatürde, bir sivrisinek iğnesinin geometrisine benzeyen mikro ölçekli iğnelerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere çabalar sarf edilmiştir; bununla birlikte, bu mikro iğneleri yapmak için kullanılan malzemelerin çoğu (yani, viskoelastik malzemeler², silikon (Si), cam, seramik³, vb.), sivrisinek hortumunun biyolojik malzemesinden farklı mekanik özelliklere sahiptir. Mühendislik malzemeleri kırılgan olabilir ve kırılmaya ve burkulmaya^eğilimli olabilir ^3,4, oysa sivrisineğin hortumu kırılmaya veya burkulmaya daha iyi dayanabilir⁴. Mühendislik malzemeleri yerine bir sivrisineğin labrumunu kullanan biyo-hibrit bir proba sahip olmanın yararı, sivrisineklerin delici mekanizmasının daha doğru bir temsili olabilmesidir. Ayrıca, mühendislik ürünü mikro iğneler kullanılarak özelleştirilmiş kurulumlarla kolayca elde edilemeyen⁵ kuvvetinin doğru ölçümü gibi nicel çalışmaları gerçekleştirmek için özel aletler mikro iğnelerle entegre edilmelidir.

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tabanlı yaklaşım, bir numunenin yüzeyine dikkatlice yerleştirilmiş ultra ince uçlu bir konsol kullanarak çalışması açısından umut vericidir. Uç, bir numune⁶ ile etkileşimleri nedeniyle değişen çekici veya itici kuvvetlere maruz kalarak bir yüzeyi tarayabilir veya bir yüzeye doğru / içine bastırılabilir. Bu etkileşimler, konsolun üst kısmından bir lazer ışınının bir fotodetektöre⁶ yansımasıyla izlenen konsolun sapmasına yol açar. Sistemin hareketine karşı olağanüstü hassasiyeti, AFM'nin pikometre doğruluğu ile morfolojik haritalama, pikonewtonlardan mikronewtonlara kadar değişen kuvvet ölçümleri ve kapsamlı multifizik araştırmaları dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çok çeşitli ölçümler yapmasını sağlar⁷. Örneğin, bir numunenin uygulanan kuvvete tepkisini hassas bir şekilde değerlendirmek ve ayrıca uygun analitik modellerle birleştirilerek bir numunenin sertliğini, elastikiyetini ve diğer mekanik özelliklerini ölçmek için AFM girintileri yapılabilir⁸. AFM'nin probu en yaygın olarak silikon (Si) veya silisyum nitrürden (Si₃N₄) ^yapılır.8 20-300 μm⁹ uzunluğunda ve birkaç ila onlarca nanometre¹⁰ mertebesinde bir uç yarıçapı. Nanometre ölçeği uç yarıçapı, yüksek çözünürlüklü görüntüleme gibi uygulamalar için ideal olabilir; Bununla birlikte, sertlik, yarıçap, şekil ve en boy oranı açısından penetrasyon davranışlarını taklit etmeye çalışan çalışmalar için biyolojik iğnelerin özelliklerine sahip değildir. Örneğin, bir sivrisineğin mikroiğne yapısı, ~60¹¹ (uzunluk ~ 1,5 mm ila 2 mm; çap ~ 30 μm^{) en} boy oranına sahip fasiküldür12. Konvansiyonel bir AFM probunun bir labrum gibi biyolojik bir iğneye benzediği varsayılabilirken, farklı malzeme özellikleri ve boyutları, bir ısırma sırasındaki gerçek durumu yansıtmayacaktır.

Böceklerin veya iğneli diğer hayvanların biyolojik ısırıklarını taklit eden penetrasyon davranışlarının nicel araştırmalarını mümkün kılmak için, burada, ucu biyolojik bir iğne olan biyo-hibrit AFM konsolları üretmek için bir süreç geliştirilmiştir. Bir vaka çalışması olarak, bir sivrisinek labrumunun ucu takılı bir AFM konsolu başarıyla gösterildi. Bir sivrisineğin kurbanın derisini delmek için kullandığı tipik yerleştirme kuvvetleri^12,13 hakkındaki literatürdeki mevcut bilgilerden yararlanan bu biyo-hibrit AFM konsolu, normal bir AFM altında sivrisinek ısırıklarının neredeyse gerçek taklidine potansiyel olarak izin verebilir. Biyo-hibrit AFM konsollarını imal etmek için mikro biyolojik iğnelerden yararlanma protokolü, çeşitli ısırma mekanizmalarının kantitatif araştırmaları için diğer keskin stinger bazlı biyohibrit AFM konsollarının geliştirilmesine de uygulanabilir.

Terminoloji
Bir hortumun şeması ve ilgilenilen bileşenleri Şekil 1'de gösterilmiştir ve tanımları şöyledir: (1) Hortum: Bir sivrisineğin ağzından çıkan ve sivrisineğin kendi kendini beslemesine izin veren, fasikül (çekirdek) ve labiumdan (kabuk) oluşan bir çekirdek-kabuk yapısına sahip bir vücut parçası, (2) Labium: bir hortumun koyu ve künt dış örtüsü², (3) Fasikül: iki maksilla, iki mandibula, bir hipofarenks ve bir labrum² dahil olmak üzere labiumun içinde bulunan bir grup ince iğne, (4) Hipofarenks: konakçının kan dolaşımına tükürük salgılamaktan sorumludur², (5) Maksilla: beslenme mekanizmasına yardımcı tırtıklı üye², (5) Mandibulalar: maksillaya benzer şekilde, sivrisineğe beslenme mekanizmasında yardımcı olurlar ve keskin bir uca sahiptirler², (6) Labrum: maksilla, mandibula ve hipofarenksten çok daha büyük olan bir kurbanın derisine nüfuz etmek için ana üye. Ayrıca deri altındaki kan damarlarını ve iç kanalları bulmasını sağlayan duyusal yapılara sahiptir², (7) Manipülatör: XYZ yönlerinde harekete izin veren, konumlandırma için üç serbestlik derecesine ve mikron ölçeğinde doğruluğa sahip bir düzenek, (8) Kelepçe düzeneği: deney sırasında uçsuz AFM konsolunu sıkıştırmak için kullanılan manipülatöre monte edilmiş özel yapım 2 parçalı bir kelepçe.

Bu protokol için kullanılan sivrisinek türü, enfekte olmamış yetişkin bir dişi Aedes aegypti (A. aegypti), dondurularak alınır ve -20 °C derece dondurucuda saklanır. Tür, BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920 aracılığıyla dağıtılmak üzere NIH/NIAID Filariasis Araştırma Reaktifi Kaynak Merkezi tarafından sağlandı. Çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Labiumun hortumdan çıkarılması

1. Cımbız kullanarak, ölü bir sivrisineği mikroskop altında bir cam slayt üzerine yerleştirin ve hortumun ucunda konik bir uç olduğundan emin olun (Şekil 2A).
2. Sivrisineği cam kaydırak üzerinde tutarken, sivrisineğin başının yanındaki labiumun üzerine nazikçe bir neşter bıçağı yerleştirin (Şekil 2B).
3. Labiumun kalınlığı boyunca sığ bir penetrasyon derinliği ile labiumun tüm üst yarısı boyunca (yaklaşık 80 μm'lik bir kesi) bir kesi yapmaya devam edin. Bıçağa, yalnızca labium'u kesecek, altında bulunan fasikülü kesmeyecek şekilde hafif bir baskı uyguladığınızdan emin olun.
4. Bir cımbızla, sivrisineğin başını sıkıca tutun ve başka bir hassas cımbızla, konik uç ile insizyonun yeri arasındaki herhangi bir pozisyonda labium'u hafifçe sıkıştırın (Şekil 2B).
   1. Labium'u tutan cımbızı konik uç yönünde çekin (Şekil 2C). Labium serbest kalana ve fasikülden tamamen çıkarılana kadar cımbızı çekmeye devam edin.
5. Sivrisineği mikroskobun altına yerleştirin ve labrumun ucunun mevcut olup olmadığını kontrol edin. Bu, fasikül üzerinde konik bir ucun varlığı ile tanımlanabilir (Şekil 2D).

2. Labrumun ucunu diğer fasikül üyelerinden ayırmak

1. Bir dizi hassas cımbızın uçlarını sıkıştırın ve kapatın ve cımbızın ucunu labrumun hemen yanına, ucuna yakın bir yere yerleştirin.
2. Fasikülün uzunluğuna dik yönde labruma hafif bir kuvvet uygulamak için cımbız ucunu kullanın (Şekil 3A).
3. Labrumun diğer fasikül üyelerinden ayrılması sağlanana kadar labrumu cam slayt boyunca itmeye devam edin.
4. Labrum ve diğer fasikül elemanları arasında uygun ayrımın sağlandığını doğrulamak için numuneyi mikroskop altında inceleyin (Şekil 3, solda). Ayırma başarısız olursa, adım 2.1'e geri dönün.

3. Labrumun ucunun kesilmesi

1. Labrum hala cam slayt üzerindeyken, labrumun ucundan yaklaşık ~ 200 μm mesafede labrumun üzerine bir neşter bıçağı yerleştirin (Şekil 4A). Nazikçe yeterli basınç uygulayın ve labrumun ucunu tamamen kesin. Labrum ucu ideal olarak mümkün olduğunca kısa olmalıdır, ancak ~ 200 μm mevcut yaklaşımın üstesinden gelebileceği en iyisidir.
2. Herhangi bir dijital ölçüm yazılımı kullanarak 300 μm'den uzun olmadığından emin olmak için kesilen labrumun uzunluğunu ölçün (Şekil 4B). Bu protokolde ImageJ^{kullanılmıştır 14}.

4. Labrumun ucunu tutmak

1. Bir çift hassas cımbızla, labrumun ucunu cam slayt üzerinde bulun ve izole edin. Labrumun ucu dışında cam slayt üzerinde kalan her parçayı atın.
2. Aynı hassas cımbızla, labrumu yavaşça ve hafifçe sıkıştırın, böylece kesilen uç cımbız tarafından serbest kalır ve engellenmez. Ayrıca, labrumun yönünün cımbızın uzunluğunun yönüne paralel olduğundan ve labrumun kesik ucunun cımbızın vücudundan uzağa baktığından emin olun.
3. Numune sıkıca sıkıştıktan sonra, cımbızın uçlarını bir arada tutan sıkıştırma kuvvetini çıkarın. Labrumun ucu cımbızın uçlarından birine yapışacaktır.
4. Mikroskop altında, cımbızın uçlarını inceleyin ve labrumun ucunun cımbızın uçlarından birinde bulunduğundan emin olun (Şekil 5). Labrumun ucu cımbızın üzerinde değilse, adım 4.2'ye geri dönün ve labrumun ucu cımbızda veya cam slaytta değilse, adım 1'e geri dönün.

5. Uçsuz konsol kirişine epoksi uygulanması

1. Yapıştırıcıyı orijinal şişesinden/kabından doğrudan damlatarak yeni bir cam slaytın kenarına bir damla (~ 0.05 mL) epoksi yerleştirin. Epoksi içeren cam slaytı prob istasyonunun altına yerleştirin ve üzerine odaklanın.
2. Ucu olmayan AFM konsolunu cl'ye monte edinamp tabanı (yani daha büyük ucu) sabitleyerek tertibat, konsol ucunu serbest bırakarak ve boşlukta asılı bırakarak. AFM konsolunun alt kısmının aşağı baktığından emin olun.
3. Manipülatörü prob istasyonuna monte edin.
4. Manipülatörün Z eksenini, uçsuz konsolun epoksi içeren cam sürgünün birkaç milimetre üzerinde olduğu bir konuma yükseltin.
5. Manipülatörü, prob istasyonundaki kameranın alan görünümünde uçsuz konsol görünecek şekilde manuel olarak hareket ettirin.
6. Manipülatörü kullanarak, konsolun ucu doğrudan cam sürgünün kenarındaki epoksinin üzerinde durana kadar AFM konsolunu X ve Y yönleri boyunca hareket ettirin.
7. Manipülatörü tekrar kullanarak, uçsuz konsolu cam sürgünün kenarı üzerinden Z yönünde yavaşça indirin.
8. Konsol indirilirken ve cam kızağa yaklaşırken, konsolu epoksiye ilk temas edene kadar çok yavaş indirmeye devam edin. Konsolu daha fazla indirmeyin.
9. Dikkatli bir şekilde, konsolu X veya Y yönünde yavaşça hareket ettirmek için manipülatörü devreye sokun ve konsol cam slayt üzerindeki epoksiden tamamen ayrılana kadar konsolu sürekli olarak seçilen yönde hareket ettirerek konsolu epoksi havuzundan çıkarın. Uçsuz konsol, ucunda prob istasyonunun altında görülebilen minyatür bir epoksi kabarcığa sahip olmalıdır.
10. Manipülatörü kullanarak konsolu Z yönünde kaldırın.

6. Labrumun ucunun uçsuz konsol kirişine yapıştırılması

1. Manipülatörü konsolun uzun ekseni etrafında 90 derece döndürün ve manipülatörü yan tarafındaki prob istasyonuna yerleştirin. Bu konfigürasyonda, AFM konsolunun uzunluğu boyunca kalınlıklar dikey yöndedir.
2. Labrumun ucunu içeren hassas cımbızları, labrumun ucunun tüm uzunluğu bilgisayar monitöründe görünecek şekilde prob istasyonu kamerasının altına yerleştirin.
3. cl'yi tutan manipülatör tertibatınıamp ve uçsuz konsolu prob istasyonu kamerasının altına, uçsuz konsolun tüm uzunluğu bilgisayar monitöründe görünecek şekilde yerleştirin.
4. Prob istasyonu mikroskobunu labrumun ucuna ve uçsuz konsola odaklayın.
5. Manipülatörü dikkatli ve manuel olarak döndürerek konsolu labrumun ucuna dik olarak yönlendirin (Şekil 6A).
6. Manipülatörün serbestlik derecelerini kullanarak, uçsuz konsolu, konsol üzerindeki yapıştırıcı labrum ucunun kesik ucuna temas edecek şekilde XY yönlerinde yavaşça hareket ettirin (Şekil 6B).
7. Konsol ve sivrisinek labrumu arasındaki kesişimi katılaştırarak epoksiyi sertleştirin.
8. Epoksi sertleştikten sonra, manipülatörü XY yönlerinde nazikçe devreye sokun ve konsolu cımbızdan uzaklaştırın, böylece labrumun ucunun artık uçsuz konsol kirişi üzerinde durduğunu doğrulayın (Şekil 6C).

Fabrikasyon biyo-hibrit AFM probunun taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri Şekil 7'de bulunabilir. Labrumun ucu, uçsuz konsol kirişine başarıyla yapıştırıldı. Sivrisinek iğnelerinin doğal eğriliği ve sunulan protokolün manuel olarak çalıştırılması nedeniyle, konsola mükemmel şekilde dik bir iğne ucu olan bir konsol elde etmek son derece zordur. Stinger ile konsola dik hayali bir merkez çizgisi arasındaki merkez dışı açı genellikle ~10 derecedir. Bir AFM konsoluna15 bir prob monte ederken yaygın bir sorun gibi görünse de, kuvvet/stres analizi yapılırken istenmeyen eğim hesaba katılmalıdır. Gelecekteki çalışmaların üretim protokolünü geliştirmeye odaklanması ve biyo-hibrit probu kullanarak çalışmalar yapması ilginç olacaktır. Bu, bir böceğin iğnesini kullanarak biyo-hibrit bir AFM probu yapmaya yönelik ilk girişimdir.

Resim 1: Bir sivrisinek hortumunun şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bir sivrisinek hortumunun labiumunun çıkarılması. (A) Sağlam konik ucun varlığını gösteren tam hortumlu bir sivrisinek. (B) Labium çıkarma işlemi sırasında labium kesisinin yeri ve labium üzerine cımbız yerleştirilmesi. (C) Labiumun çıkarılması sırasında cımbızın çekme yönü. (D) Labium çıkarıldıktan sonra sağlam bir ucu olan son disseke edilmiş fasikül, konik labrum ucu hala mevcut ve sağlam. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Labrumun istenmeyen fasikül elemanlarından ayrılması. (A) Hortum fasikül elemanlarını ayırmak için bir teknik olarak cımbızın yerleştirilme yeri ve cımbız itme yönü. (B) Labrumu diğer fasikül üyelerinden ayırmak için manipüle edildikten sonra hortum. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: AFM konsoluna montaj için istenen labrum ucunun izolasyonu. (A) Labrumun ucunun çıkarılması için labrum insizyonunun yeri. Ölçek çubuğu: 200 μm. (B) Labrumun ucu, labrumun gövdesinden kesildikten sonra yaklaşık 200-300 μm uzunluğundadır. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Yapıştırma işleminden önce labrum ucunu bir cımbıza monte etme. Labrum ucu, cımbızın uçlarından birine yapıştı, labrumun kesilmemiş ucu serbest ve cımbızın vücudundan uzağa bakıyordu. Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Labrumun ucunu uçsuz konsola monte etme sırası. (A) Uçsuz konsolu labruma göre dik bir konumda yönlendirmek. (B) Uçsuz konsolun labrum ile birleştirilmesi ve iki bileşen arasındaki eklemi katılaştırmak için kullanılan epoksi yapıştırıcının sertleştirilmesi. (C) Labrumun cımbız tarafından desteklenmediği nihai kürlenmiş biyo-hibrit AFM probu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Biyo-hibrit AFM probunun SEM görüntüleri. (A) Labrumun ucunun ve uçsuz konsolun genel görünümü. Ölçek çubuğu: 200 μm. (B) Labrumun ucunun büyütülmüş bir görünümü. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.