Method Article

Murin Dalak Dokusu Oluşumunu Araştırmak için Bazal Membran Matris Kapsüllü Hücre Agregasyonu

DOI:

10.3791/66682

⸱

June 28th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clem Jones Centre for Regenerative Medicine, Faculty of Health Sciences and Medicine, Bond University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, yarı katı bir bazal membran matrisi içinde dalak hücrelerini toplamak ve kapsüllemek için bir protokolü açıklamaktadır. Bazal membran matris yapıları, organoid gelişimini incelemek için veya in vivo transplantasyon ve doku rejenerasyon çalışmaları için üç boyutlu kültürde kullanılabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dalak, kan yoluyla bulaşan bağışıklık tepkilerinde önemli bir rol oynayan bir bağışıklık organıdır. Bu dokunun anatomik veya fonksiyonel kaybı, ciddi kan enfeksiyonlarına ve sepsise yatkınlığı artırır. Dalak dilimlerinin ototransplantasyonu, kaybedilen dokuyu değiştirmek ve bağışıklık fonksiyonunu eski haline getirmek için klinik olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, sağlam ve immünolojik olarak fonksiyonel dalak dokusu rejenerasyonunu yönlendiren mekanizma tam olarak aydınlatılamamıştır. Burada, dalak dokusu oluşumu için hücresel gereksinimleri araştırmak amacıyla dalak hücrelerini yarı katı bir matriks içinde toplamak ve kapsüllemek için bir yöntem geliştirmeyi amaçlıyoruz. Bazal membran matris kapsüllenmiş hücre yapıları, hem üç boyutlu organoidlerin in vitro doku kültürüne hem de doğrudan in vivo doku oluşumunu değerlendirmek için böbrek kapsülü altına transplantasyona uygundur. Agregasyon ve kapsülleme için giriş hücrelerini manipüle ederek, hayvan nakli modelleri altında dalak dokusu rejenerasyonu için greft kaynaklı PDGFRβ+MAdCAM-1- neonatal stromal hücrelerin gerekli olduğunu gösterdik.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dalağın travmatik rüptürü ve vücutta çok sayıda dalak nodülünün ortaya çıkması, dalak dokusunun rejeneratif kapasite barındırdığının ilk göstergelerinden biriydi 1,2. Dalak ototransplantasyonları daha sonra acil splenektomi gerektiren hastalarda dalak dokusunu korumak için kliniğe tanıtıldı3. Yine de, onlarca yıldır klinik uygulamanın bir parçası olmasına rağmen, dalağın nasıl yenilendiği hakkında çok az şey bilinmektedir. Hayvan nakli modelleri, dalak rejenerasyonu ve bağışıklık fonksiyonunun çoklu parametreleri hakkında fikir vermiştir 4,5. Özellikle, greft hazırlama yönteminde yapılan deneysel modifikasyonlar, doku rejenerasyonunun hücresel ve moleküler düzeyde daha ayrıntılı olarak incelenmesine izin vermiştir.

Tüm dalak dilimlerini içeren transplantasyonlar, yeni bir dalak yapısı yeniden inşa edilmeden önce bir kitle nekrozu evresine girer6. Greft nekrozunun ilk aşaması, nakledilen dokunun büyük kısmının büyük ölçüde kırmızı ve beyaz kan hücrelerinden oluştuğunu ve dalak rejenerasyonu için gereksiz olduğunu düşündürmektedir. Bu, fare böbrek kapsülü altına nakledilmeden önce hematopoietik hücrelerin dalak greftlerinden çıkarılmasıyla deneysel olarak araştırıldı. Burada, stromal ve endotel hücrelerini içeren dalağın lökosit olmayan/eritrosit olmayan fraksiyonunun, de novo doku oluşumunu indüklemek için yeterli olduğu gösterilmiştir7. Dalak stromal dokusu, hücresel greft bileşimini manipüle etmek için hücre sıralama teknolojilerinin kullanılmasını sağlayan tek hücreli bir süspansiyona daha fazla işlenebilir. Aday hücre tiplerini seçici olarak çıkararak, greft gelişimi için vazgeçilmez olan iki CD45-TER-119-stromal hücre popülasyonu tanımlandı: endotel benzeri bir CD31 + CD105 + MAdCAM-1 + hücre popülasyonu ve daha geniş bir şekilde tanımlanmış bir PDGFRβ + mezenkimal hücre popülasyonu8.

Dalak hücrelerinden greft yapımı, destek materyalleri ve hücre yükleme işlemleri açısından farklılık gösterir. Doku mühendisliği ile tasarlanmış dalaklar daha önce bir poliglikolik asit/poli-L laktik asit polimer iskelesi 5,9 üzerine dalak üniteleri yüklenerek hazırlanmıştı. İlginç bir şekilde, bir kollajen süngeri içine emilen dalak stromal hücreleri aşılamayı başaramazken, bir kollajen tabakası üzerine toplanan ve yüklenen stromal hücreler dalak rejenerasyonunu kolaylaştırdı8. Bir Matrigel matrisi içindeki dalak stromal hücrelerinin yeniden süspansiyonunun, üç boyutlu kültür koşulları altında hücre agregasyonunu indüklediğide gösterilmiştir 10. Bununla birlikte, bu yöntem transplantasyon modellerinde kullanım için test edilmemiştir. Mevcut protokolün genel amacı, dalak stromal hücrelerini doğrudan bazal membran matrisi içinde zorla toplamak ve kapsüllemektir, bu daha sonra üç boyutlu bir in vitro doku kültürü sistemine aktarılabilir veya hayvan modeli transplantasyonları için bir araç olarak kullanılabilir (Ek Şekil 1).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri, Queensland Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi (UQBR/079/19) tarafından onaylanan deneysel protokollere göre yürütülmüştür.

1. Doku toplama ve stromal hücre hazırlama

  1. 0.5-1.5 günlük erkek ve/veya dişi BALB/c yenidoğan donör fareleri, hayvanları kağıt mendilin içine sararak ve >10 dakika boyunca kırılmış buzun altına yerleştirerek hipotermi indüksiyonu ile ötenazi yapın.
    NOT: Bu protokol farklı fare türlerine, yaşlarına ve hayvan sayısına uyarlanabilir.
  2. Steril cerrahi aletler hazırlayın.
  3. Fareyi sağ yanal konuma getirin. Cildi %80 etanol ile sürüntü ve periton duvarını ortaya çıkarmak için Iris cerrahi makasıyla 1 cm'lik bir kesi yapın.
  4. Dalağın üzerinde 0,5 cm'lik ikinci bir kesi yapın ve dokuyu nazikçe yukarı kaldırmak için bir çift ince forseps kullanın. Kan damarlarını kesmek ve dokuyu çıkarmak için bir çift cerrahi makas kullanın. Dokuyu buz gibi soğuk Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içeren bir Petri kabına aktarın. Dalağa bağlı kalan bağ dokusunu çıkarın.
    NOT: Bir stereomikroskop, cerrahi aletleri manipüle etmek için gereken ince motor hareketlerine yardımcı olabilir.
  5. Tüm dokuları ayırmak için, yenidoğan dalaklarını (10 veya daha az havuzlar) ters çevrilmiş 14 mL konik tüp kapağının iç kenarına aktarın. 1 mL'lik bir şırınga pistonunun plastik arka ucunu kullanarak bir baskı hareketiyle dokuları mekanik olarak bozun.
  6. Kapağı 10 mL soğuk PBS içeren 14 mL'lik konik bir tüpün üzerine sıkıca yerleştirin ve sabitleyin. Kapaktan tüpe bozulan tüm dokuları yıkamak için tüpü 5x ters çevirin.
  7. Kalan doku için adım 1.6'yı tekrarlayın.
  8. Dokunun tüpün dibine çökmesini sağlamak için tüpü 1 dakika buz üzerinde bırakın.
  9. Çözeltiyi geri dönüşümlü 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek süpernatanı (hematopoietik hücreler içeren) dikkatlice atın.
  10. 1 mg / mL Kollajenaz IV, 40 μg / mL DNaz I ve% 2 Fetal Sığır Serumu (FBS) içeren taze hazırlanmış 2 mL takviyeli Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (sDMEM) kullanarak süzgeci ters çevirerek ve stromal dokuyu 14 mL konik tüpe geri yıkayarak çözünmeyen stromal fraksiyonu geri kazanın.
    DİKKAT: Kollajenaz IV ve Kollajenaz D tehlikeli maddelerdir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla bir biyogüvenlik kabini içinde taşınmalıdır.
  11. Tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için, havuzlanmış dokuyu (20'ye kadar) sabit rotasyonla 37 ° C'de 10 dakika boyunca enzimatik olarak sindirin.
  12. 1 mg/mL Kollajenaz D, 40 μg/mL DNaz I ve %2 FBS içeren 4 mL taze hazırlanmış sDMEM'i doğrudan stromal doku içeren tüpe ekleyin. Sabit dönüşle 37 °C'de 10 dakika daha inkübe edin.
  13. 8 mL buz gibi PBS ekleyerek sindirimi durdurun. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyerek hücreleri toplayın.
  14. Süpernatanı atın ve 1 mL soğuk PBS'de yeniden süspanse ederek ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyerek hücreleri iki kez yıkayın. Hücreleri buz üzerinde tutun.
    NOT: Hücreler sayılabilir ve istenen konsantrasyona ayarlanabilir. Bu, farklı hücre popülasyonları için optimizasyon gerektirebilir. Bu protokolü kullanarak, donör farelerin yaşına bağlı olarak tipik olarak 0.5 x 106-1 x 106 stromal hücreler / dalak geri kazanılır. Hücreler isteğe bağlı olarak boyanabilir ve hücre kompozisyonunu tanımlamak için bu aşamada FACS sıralanabilir.

2. Hücre agregalarının matris kapsüllenmesi

  1. Steril P200 pipet uçlarını -20 °C'lik bir dondurucuda önceden soğutun.
  2. Esnek laboratuvar filmini (örneğin Parafilm) 1 cm x 2 cm'lik parçalar halinde kesin ve 10 dakika boyunca %80 etanole, ardından 10 dakika PBS'ye batırarak sterilize edin. Laboratuvar filmi önceden hazırlanabilir ve steril olarak saklanabilir.
  3. 0.5 x 10 6-2.5 x 106 hücrelerini 200 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyerek hazırlayın. Kalan PBS hacminin yaklaşık 20 μL'sini bırakarak süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre peletini buz üzerinde tutun.
    NOT: Kalan PBS, hacmi doğrulamak için hücre peletini bozmadan nazikçe aspire edilebilir.
  4. Bir P20 pipetleyici kullanarak 2 μL buz gibi soğuk bazal membran matrisini önceden soğutulmuş bir P200 pipet ucuna aspire edin.
    NOT: Yüksek konsantrasyonlu bir bazal membran matrisi (örneğin, Corning Matrigel Matrisi Yüksek Konsantrasyon), güçlü bir katılaşmış tıkaç oluşturmaya yardımcı olur.
  5. Pipet ucunu çıkarmak için hafifçe çevirin. Laboratuvar filminin önceden sterilize edilmiş bir şeridini gerin ve filmi delmemeye dikkat ederek pipet ucunun ucuna yerleştirin. Pipet ucunu kapatmak için ucu filme sarmaya devam edin. Filmi yırtmamaya dikkat ederek kapalı ucu dikkatlice doğrudan buzun üzerine yerleştirin.
  6. Kalan PBS'de hücre peletini yeniden süspanse edin ve çözeltiyi bazal membran matrisinin üzerine nazikçe katmanlayın. Yapıyı buz üzerinde tutun.
  7. 1.2 mL'lik bir konik tüpün içine 14 mL'lik bir küme tüpü yerleştirerek bir santrifüj tüpü hazırlayın.
  8. Pipet ucunu iç içe geçmiş tüp konfigürasyonunun içine yerleştirin ve 400 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  9. 14 mL konik tüpü dikey yönde konumlandırın ve bazal membran matrisinin pipet ucunun içinde katılaşmasını sağlamak için 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
    NOT: 14 mL konik boru, aşağı akış uygulaması için gerekli olana kadar buz üzerine yerleştirilebilir.

3. Üç boyutlu organoid kültür

  1. Laboratuvar filmini pipet ucundan dikkatlice çıkarın.
  2. Pipet ucunun daha büyük açıklığından ince bir paslanmaz çelik tel piston sokun.
  3. Matris tapasını uçtan serbest bırakılana kadar, %10 FBS, 1x Glutamax, 1x Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA), 10 μM Kaya İnhibitörü, 10 U/mL Penisilin / Streptomisin ve 50 μM β-merkaptoetanol ile desteklenmiş 2 mL sDMEM içeren işlem görmemiş 6 oyuklu bir doku kültürü plakasının bir oyuğuna boşaltın.
    NOT: Doku kültürü kabı ve ilgili ortam hacmi gerektiği gibi ayarlanabilir.
    DİKKAT: NEAA, Penisilin/Streptomisin ve β-merkaptoetanol tehlikeli maddelerdir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla bir biyogüvenlik kabini içinde taşınmalıdır.
  4. 4-12 hafta boyunca 37 °C, %5CO2 ve %95 nemde kültür organoidleri.
  5. Ortamın yarısını her 5 günde bir değiştirin.
    NOT: Organoidler doku kültürü plakasına bağlanmaya başlarsa, taze bir kuyucuğa aktarın.

4. Böbrek kapsülü nakli

  1. Steril cerrahi aletler hazırlayın.
  2. Bazal membran matris tıkacının subkapsüler böbrek naklini gerçekleştirin:
    1. Kurumsal Hayvan Etiği Yönergelerine uygun olarak 8 haftalık BALB/c dişi alıcı fareyi izofluran ile uyuşturun.
      DİKKAT: İzofluran tehlikeli bir maddedir. Çalışma ortamı içerisine girilmesi engellenen atık gazların temizlenmesi gerekmektedir.
    2. Fareyi sağ yanal konuma getirin.
    3. Ameliyat bölgesindeki saçları tıraş edin ve Kurumsal Yönergelere uyarak cildi dezenfekte edin.
      NOT: Cerrahi bölgenin alternatif iyot bazlı veya klorheksidin bazlı ve alkol bazlı fırçalama ile dairesel hareketlerle üç kez dezenfekte edilmesi önerilir.
    4. Periton duvarını ortaya çıkarmak için omurgaya dik deride 2 cm'lik bir kesi yapın.
      NOT: Cilt kesisi için ince cerrahi makas veya neşter bıçağı kullanılabilir. Kullanıcılar, Kurumsal Hayvan Etiği Yönergelerine veya Standart Çalışma Prosedürlerine uymalıdır.
    5. Böbreğin üzerindeki periton duvarında 0,5 cm'lik daha küçük bir kesi yapın.
      NOT: Nakil sırasında böbreğin dışarıda kalmasını sağlamak için kesi böbrek genişliğine yaklaşmalıdır.
    6. Başparmak ve işaret parmağını kullanarak aşağı doğru basınç uygulayarak böbreği periton açıklığından dışarı çıkarın. Dışsallaştırmaya yardımcı olmak için bir çift halka cımbız kullanılabilir. Pamuklu çubuk kullanarak düzenli olarak steril PBS uygulayarak böbreğin işlem boyunca nemli olduğundan emin olun.
    7. Bir stereomikroskop altında, böbrek kapsülünün perirenal yağını böbreğin bir kutbunda bir çift bükülmüş ultra ince forseps ile sıkıştırın. Böbrek kapsülü zarını ters yönde yukarı doğru nazikçe yırtmak ve küçük bir açıklık oluşturmak için ikinci bir çift bükülmüş ultra ince forseps kullanın.
    8. Bir forsepsin ucunu kapsül zarının altına dikkatlice yerleştirin. Kapsül zarını böbrek parankiminden ayırmak için yavaş bir süpürme hareketi kullanın.
    9. Laboratuvar filmini pipet ucundan çıkararak bazal membran matris tapasını nakil için hazırlayın.
    10. Forsepsin bir ucunu kullanarak böbrek kapsülünü kaldırın ve pipet ucunu böbreğin karşı kutbuna doğru iterek açıklıktan geçirin.
    11. Pipet ucuna bir tel piston yerleştirin ve aynı anda pipet ucunu böbrekten çekerken matris tapasını çıkarın.
    12. Böbreği PBS ile nemlendirin ve yeniden içselleştirin.
    13. Periton duvarını bir adet 5-0 Vicryl sütür ile kapatın ve cildi iki otoklips ile kapatın.
    14. Analjezik uygulayın (0.05-0.1 mg / kg'da Buprenorfin, deri altından veya Kurumsal Hayvan Etik Kurallarına uyarak).
      DİKKAT: Buprenorfin tehlikeli bir maddedir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla kullanılmalıdır.
  3. İzofluran akışını kapatın, ancak farenin bilinç kazanmaya başlayana kadar saf oksijen solumasına izin vermek için oksijen akışını açık tutun.
  4. Fareyi kafesine geri koyun. Kafesi kısmen bir ısıtma yastığının üstüne veya bir ısı lambasının altına yerleştirerek iyileşme sırasında hayvanı sıcak tutun ve fare anesteziden tamamen kurtulana kadar izleyin.
  5. Ameliyat sonrası iyileşmeyi ilk iki hafta boyunca veya Kurumsal Yönergelerin gerektirdiği şekilde izleyin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre agregasyonu, hücreden hücreye teması ve sinyalleşmeyi teşvik etmek için önemlidir. Bazal membran matrisi içindeki hücre agregatlarının kaplanması, in vitro doku organoid oluşumu için hem 3 boyutlu kültürleri destekledi hem de greft nakli için hücrelerin böbrek kapsülüne mekanik olarak verilmesini kolaylaştırdı. Bu yapıları oluşturmak için, bazal membran matrisi ilk önce buz gibi soğuk koşullar altında akışkan bir durumda tutuldu. Hücre agregasyonu daha sonra, konsantre bir hücre süspansiyonunun üzerine katmanlanması ve hücreleri yüksek yoğunluklu matris boyunca itmek için merkezkaç kuvveti kullanılmasıyla elde edildi. Santrifüj hızının (200-2000 x g) optimizasyonu, hücre sayısına da bağlı olan bir orta katman hücre konumlandırması elde etmek için gerekliydi (Şekil 1A). Daha yüksek santrifüj kuvvetleri (>500 x g) hücreleri pipetin en ucuna itti (Şekil 1B) ve esnek laboratuvar filmi kaplamasının çıkarılması sırasında kaybolabilecek daha küçük hücre sayıları (yani <5 x 105) için dikkatli olunması gerekir. Tersine, G kuvvetleri çok düşükse (≤200 x g) hücreler bazal membran matrisinden yeterince geçemeyebilir (Şekil 1C). <1 x 105 veya >2,5 x 106 hücre numaraları için santrifüj hızı daha fazla optimizasyona ihtiyaç duyabilir. Santrifüjlemeyi takiben, hücreler bazal membran matrisinin içine yerleştirildi ve yapı 37 °C'de 15 dakika ısıtıldı. Bu katılaştırma işlemi, matris "tapasının" ince bir tel piston kullanılarak tamamen çıkarılmasını sağladı (Şekil 1D).

İn vitro dalak organoid oluşumu
Uygun bir doku kültürü kabına püskürtülen bazal membran matriks tıkaçları, standart doku kültürü teknikleri ve koşulları (37 °C, %5 CO2


figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yenidoğan dalak hücrelerinin yarı katı bir ortam içinde toplanması, dalak yapıları oluşturmak için uygun bir yöntemi temsil eder. Üç boyutlu dalak kültürlerini başlatmak için benzer bazal membran matris tabanlı protokoller kullanılmıştır10. Burada, dalak yapılarının in vitro organoid kültür sistemlerine ve in vivo transplantasyon modellerine eşit derecede uygun olduğunu gösteriyoruz. Dikkat çekici bir şekilde, in vitro kültürlenmiş dalak organoidlerinin transplantasyonu henüz test edilmemiştir, ancak tam veya kısmi dalak dokusu rejenerasyonu için kapasitenin belirlenmesi ilgi çekici olacaktır. Bu protokol aynı zamanda önceki dalak nakli çalışmalarında açıklanan hücre agregasyon tekniklerini de mirasalır 8. Bu çalışmalar, hücre agregatlarının bir kollajen tabakası üzerine yüklenmesini ve ardından böbrek kapsülünün altına nakledilmesini içeriyordu. Hücre agregalarının bazal membran matrisi içinde kaplanması, kollajen tabaka tarafı aşağı ve hücre agrega tarafı aşağı transplantasyon ile ilişkili varyasyonun ortadan kaldırıldığı greft oryantasyonu açısından belirgin bir avantaj sunar.

Bazal membran matris yapılarını hazırlama metodolojisi nispeten basittir. Yüksek konsantrasyonlu bazal membran matrisinin kullanılması, matris birkaç gün içinde dağılmadan önce hücrelerin başlangıçta toplu bir durumda desteklenmesini sağlar. Deneyimlerimize göre, bir PBS süspansiyonlu hücre çözeltisinin dikkatli bir şekilde katmanlanmasını (Adım 2.6) ve santrifüjlenmesini (Adım 2.8) takiben bazal membran matrisinin minimum düzeyde karıştırılması ve seyreltilmesi söz konusudur. Çoğu optimizasyon, hücre peletini matris tapası içinde konumlandırmaya odaklanır (Şekil 1). Bu, santrifüjleme hızı, süresi, bazal membran matris hacmi bileşimi, PBS askılı hücre çözeltisi hacmi ve pipet ucu boyutu gibi çeşitli değişkenler test edilerek ele alınabilir. Hücre sayısı ve özellikleri (boyut, yoğunluk) da ayarları etkileyebilir ve her hücre hazırlığı ayrı ayrı optimize edilmelidir.

Vurgulanması gereken birkaç sınırlama vardır. Bazal membran matrisi sıcaklığa duyarlı bir ürün olabilir ve reaktifleri soğuk tutmak için hızlı çalışmaya özen gösterilmelidir. Bu, erken matris katılaşmasını önler ve hücrelerin uygun şekilde kapsüllenmesini sağlar. İlgili tüm malzemeler soğuk bir ortamda saklanırken, hazırlanırken veya muhafaza edilirken, manuel kullanım adımları (örneğin, pipet ucunun çıkarılması, esnek laboratuvar filmiyle kapatılması [Adım 2.5]) kullanıcıdan değişken bir şekilde harici ısı verebilir, matris viskozitesini değiştirebilir ve santrifüjleme sırasında hücre göç özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, deneyler içinde ve arasında tekrarlanabilirliğin tutarlı bir şekilde elde edilmesi zor olabilir.

İkinci sınırlama, kullanıcı deneyimi ve yeterliliği gerekliliğidir. Bazı manuel tekniklerin verimli ve başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi için uzun süreli eğitim gerekebilir. Örneğin, pipet ucunun laboratuvar filmi ile kapatılması (Adım 2.5) başlangıçta düşük başarı oranlarına neden olabilir, ancak bu kaçınılmaz olarak pratikle düzelecektir. Hayvan mikro cerrahi teknikleri ile yeterlilik de tekrarlama yoluyla elde edilir. Transplantasyonlar için, özellikle pipet ucunu böbrek kapsülünün altına sokarken (Adım 4.2.10), tıpayı çıkarmak için tel pistonu yerleştirirken (Adım 4.2.11) ve ucu böbrekten çekerken dikkatli olunmalıdır. Pipet ucu aynı anda geri çekilirken fişin nazikçe ve sabit bir şekilde çıkarılması önemlidir. Aşırı hareket, böbrek kapsülünün delinmesine veya parankimin hasar görmesine neden olarak aşırı kanamaya neden olabilir.

Özetle, dalak dokusu oluşumunu anlamaya odaklanarak yarı katı bir matris içindeki hücreleri kapsüllemek için bir süreç burada açıklanmıştır. Bu sistem, çoklu in vitro veya in vivo aşağı akış uygulamaları potansiyeli olan çok çeşitli hücre tiplerine eşit olarak uygulanabilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (#GNT1078247) tarafından desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 Kuyulu Polipropilen 1.2 mL Küme TüpleriCorningCLS440114 ml'lik konik bir tüp içine yerleştirmek için
B-merkaptoetanolGibco21985023Stoku 55 mM, 50 uM'de kullanın
Kollajenaz DRoche11088858001
Kollajenaz IVSigma-AldrichC5138Clostridium histolyticum
Deoksiribonükleaz I'den (DNaz I)Sigma-AldrichD4513Deoksiribonükleaz I, Tip II-S, liyofilize toz, Protein ve ge; %80, ≥ 2.000 ünite / mg protein
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM)Sigma-AldrichD57964500 mg / L Glikoz, L-Glutamin ve Sodyum Bikarbonat, Sodyum Pirüvat içermez, Sıvı. Steril Filtreli.
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (PBS)Sigma-AldrichD8537Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içermeyen, steril filtreli
Eclipse 200 & mu; l Pipet UçlarıLabcon1030-260-000Eğim
Noktası Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco26140-079Lot # 1382243
GlutaMAXGibco35050061Stoku 100X, 1X
MatrigelCorning354263Matrigel matris bazal membranında kullanın Yüksek Konsantrasyon, Lot # 7330186
MEM Esansiyel Olmayan Amino AsitlerGibco11140076Stok 100X, 1X
Penisilin / StreptomisinGibco15140122Stok 10.000 birim / ml Penisilin, 10.000 ug / ml Streptomisin
Geri Dönüşümlü Hücre SüzgeciKÖK HÜCRE Teknolojileri2721670 & mu; m
Halka CımbızNAPOXA-26Yüzük ölçüsü: 3 mm
Kaya İnhibitörü (Y-27632)MedChemExpresHY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R SantrifüjThermofisherHızlanma ve yavaşlama hızları 8
İnce CımbızEMS78340-51Solarak ayarlandıStil 51S. Antimanyetik / anti-asit SA düşük karbonlu östenitik çelik cımbız korozyona dayanıklıdır. Parlama önleyici saten kaplama.
Vicryl 5/0 Sütür Ligapak MakaraEthiconJ283G
Wiretrol II Uzun Telli PistonDrummond5-000-2002-LPaslanmaz Çelik Piston, 25 & 50 & mu; L/WRTL II, Uzun 
Yara Klipsi UygulayıcıMikRon427630
Yara KlipsiMikRon4276319 mm
Sığır pankreasından Ultra

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarcho, S., Andersen, D. Traumatic autotransplantation of splenic tissue. American Journal of Pathology. 15 (5), 527-546 (1939).
  2. Storsteen, K. A., ReMine, W. Rupture of the spleen with splenic implants: splenosis. Annals of Surgery. 137 (4), 551-557 (1953).
  3. Mizrahi, S. Posttraumatic autotransplantation of spleen tissue. Archives of Surgery. 124 (7), 863(1989).
  4. Miko, I., et al. Spleen autotransplantation. Morphological and functional follow-up after spleen autotransplantation in mice: A research summary. Microsurgery. 27 (4), 312-316 (2007).
  5. Grikscheit, T. C., et al. Tissue-engineered spleen protects against overwhelming Pneumococcal sepsis in a rodent model. Journal of Surgical Research. 149 (2), 214-218 (2008).
  6. Pabst, R., Westermann, J., Rothkotter, H. Immunoarchitecture of regenerated splenic and lymph node transplants. International Review of Cytology. 128, 215-260 (1991).
  7. Tan, J. K. H., Watanabe, T. Murine spleen tissue regeneration from neonatal spleen capsule requires lymphotoxin priming of stromal cells. The Journal of Immunology. 193 (3), 1194-1203 (2014).
  8. Tan, J. K. H., Watanabe, T. Stromal cell subsets directing neonatal spleen regeneration. Scientific Reports. 7 (1), 40401(2017).
  9. Gee, K., et al. Spleen organoid units generate functional human and mouse tissue-engineered spleen in a murine model. Tissue Engineering Part A. 26 (7-8), 411-418 (2020).
  10. Ueno, Y., et al. Transcription factor Tlx1 marks a subset of lymphoid tissue organizer-like mesenchymal progenitor cells in the neonatal spleen. Scientific Reports. 9 (1), 20408(2019).
  11. Tourle, K., Rucinski, A., Grainger, A., Limnios, I. J., Gonzalez Ruiz, M., Tan, J. K. H. Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation. , Available from: https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Basement Membrane MatrixCell AggregationSpleen Tissue FormationMurine SpleenOrganoid CultureKidney Capsule TransplantationStromal Cell AggregationMatrigel EncapsulationTissue RegenerationPDGFR Beta Cells

Related Articles