Yöntem makalesi

Ters Translasyonel Beyin Araştırmaları için İnsan Kanı Kaynaklı Mikroglia Benzeri Hücrelerin Mühendisliği

DOI:

10.3791/66819

⸱

6 Eylül 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuropsychiatry, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 2Department of Functional Anatomy and Neuroscience, Asahikawa Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, beyin iltihabının dolaylı olarak değerlendirilmesini sağlayan insan monosit türevli mikroglia benzeri (iMG) hücrelerin kurulması için yeni bir yaklaşımı tanımlamaktadır. Bu, beynin potansiyel iltihabına ve ilişkili nöropsikiyatrik bozukluklara odaklanan araştırmalar için faydalı olabilecek bir hücresel model sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan modelleri kullanılarak yapılan son araştırmalar, mikroglianın çeşitli nöropsikiyatrik ve fiziksel hastalıklarda önemli immünolojik modülatörler olarak önemini vurgulamıştır. Postmortem beyin analizi ve pozitron emisyon tomografisi görüntüleme, insan hastalarda mikroglial aktivasyonu değerlendiren temsili araştırma yöntemleridir; Bulgular, çeşitli nöropsikiyatrik bozukluklar ve kronik ağrı ile başvuran hastaların beyinlerinde mikroglia aktivasyonunu ortaya koymuştur. Bununla birlikte, yukarıda bahsedilen teknik, mikroglial aktivasyonun sınırlı yönlerinin değerlendirilmesini sadece kolaylaştırır.

Beyin biyopsisi ve indüklenmiş pluripotent kök hücre tekniği yerine, başlangıçta taze türetilmiş insan periferik kan monositlerinden doğrudan indüklenmiş mikroglia benzeri (iMG) hücreleri, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör ve interlökin 34 ile 2 hafta boyunca takviye ederek üretmek için bir teknik geliştirdik. Bu iMG hücreleri, hücresel düzeyde stres stimülasyonunu takiben fagositik kapasite ve sitokin salınımları ile ilgili dinamik morfolojik ve moleküler düzeyde analizler yapmak için kullanılabilir. Son zamanlarda, insan iMG hücreleri ile beyin primer mikroglia arasındaki benzerliği doğrulamak için kapsamlı transkriptom analizi kullanılmıştır.

Hastadan türetilen iMG hücreleri, insan beynindeki mikroglial aktivasyonu tahmin etmek için anahtar vekil belirteçler olarak hizmet edebilir ve Nasu-Hakola hastalığı, fibromiyalji, bipolar bozukluk ve Moyamoya hastalığı olan hastalarda daha önce bilinmeyen dinamik mikroglia patofizyolojisinin ortaya çıkarılmasına yardımcı olmuştur. Bu nedenle, iMG tabanlı teknik, değerli bir ters çeviri aracı olarak hizmet eder ve çeşitli zihinsel ve fiziksel hastalıklarda mikroglianın moleküler patofizyolojisini dinamik olarak aydınlatmak için yeni bilgiler sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, beyin inflamasyonunun çeşitli beyin ve nöropsikiyatrik bozuklukların patofizyolojisinde önemli roller üstlendiği öne sürülmüştür; mikroglia, insan ölüm sonrası beyin analizi ve pozitron emisyon tomografisi (PET) tabanlı biyo-görüntüleme teknikleri 1,2,3,4 ile anahtar immünomodülatör hücreler olarak vurgulanmıştır. Postmortem beyin ve PET görüntüleme analizleri önemli bulgular ortaya koymaktadır; Bununla birlikte, bu yaklaşımlar, beyindeki insan mikrogliasının dinamik moleküler aktivitelerini bir bütün olarak yakalamak açısından verimsizdir. Bu nedenle, insan mikroglial fonksiyonlarının ve işlev bozukluklarının moleküler ve hücresel düzeyde kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için yeni stratejiler gereklidir.

2014 yılında, 2016'da insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) türevi mikroglia benzeri hücrelerin ilk yayınlanmasından önce, doğrudan indüklenmiş mikroglia benzeri (iMG) hücreler 5,6 üretmek için orijinal olarak yeni bir teknik tasarladık7. Sadece 2 haftada, sitokinleri, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktörü (GM-CSF) ve interlökin 34'ü (IL-34) optimize ederek insan periferik kan monositlerini başarıyla iMG hücrelerine dönüştürdük. Bu tekniği geliştirdiğimizde, iPS hücrelerinden veya fibroblastlardan nöronal hücreleri indüklemenin yenilikçi yeniden programlama yöntemi dünyada hakim olmaya yeni başlıyordu 8,9,10,11. Bununla birlikte, o zamanlar, iPS'den türetilmiş mikroglial hücreleri indüklemek için bir yöntem henüz rapor edilmemişti ve insan somatik hücre türevli bir mikroglial modelin oluşturulması arzu ediliyordu. Makrofaj koloni uyarıcı faktör olan GM-CSF ve IL-34 gibi sitokinlerin mikroglia 12,13,14,15'in gelişimi ve bakımı için gerekli olduğu bildirildiğinden, bu sitokinlerin bir kombinasyonunun kan monositlerinden bir mikroglial hücresel model oluşturmak için doğrudan uygulanabileceğini varsaydık. Son olarak, GM-CSF ve IL-345'i birleştirerek monositlerden türetilen bir mikroglia modeli geliştirmeyi başardık. Ek olarak, bu sitokin kombinasyonlarının bazıları, iPS hücrelerinden 7,16 mikroglia'yı indüklemek için de kullanılır ve mikroglial özelliklerin elde edilmesinde önemli bir faktör olduğu varsayılmaktadır.

iPSC yöntemlerinin aksine, iMG hücreleri herhangi bir genetik modifikasyon gerektirmez ve basit kimyasal indüksiyonla çok kısa sürede üretilebilir, bu da daha düşük zaman ve finansal maliyetlerle sonuçlanır. Ayrıca, iMG hücreleri genetik yeniden programlama gerektirmez, bu nedenle iMG hücrelerinin sadece özellikleri değil, aynı zamanda insan mikroglia durumlarını da değerlendirmek için güçlü vekil hücreler olduğuna inanıyoruz. 2014 yılında iMG tekniği ile ilgili ilk makalede, iMG hücrelerinin, monositlerden ve makrofajlardan farklı olabilen bir insan mikroglia fenotipi sergilediğini doğruladık. Örneğin, iMG hücreleri, monositlere ve transmembran protein 119 (TMEM 119) ve purinerjik reseptör P2RY12 5,17 dahil olmak üzere monositlere ve tipik mikroglia belirteçlerine göre CX3C kemokin reseptörü 1 (CX3CR1) ve CC kemokin reseptörü tip 2'nin (CCR2) aşırı ekspresyon oranını sergiledi. Son zamanlarda, periferik kan kaynaklı iMG hücrelerinin, beyin ameliyatı geçiren aynı hastada iyi bilinen mikroglial belirteçlerin gen ekspresyon profilinde beyin mikrogliasına benzediğini doğruladık18. IMG hücreleri, fagositoz ve sitokin üretimi gibi moleküler düzeyde dinamik fonksiyonlar için analiz edilebilir ve ölüm sonrası beyin araştırmalarının ve PET çalışmalarının dezavantajlarını telafi etmesi beklenir.

Nasu-Hakola hastalığı5, fibromiyalji19, bipolar bozukluk20,21 veya Moyamoya hastalığı22 tanısı alan hastalarda mikrogliayı içeren daha önce bilinmeyen dinamik patofizyolojik mekanizmalar keşfettik. Ayrıca, orijinal metodolojimize dayanarak, çeşitli laboratuvarlar iMG hücrelerini (bazı laboratuvarlar bu hücrelere alternatif isimler belirlemiştir) çok önemli bir ters çeviri araştırma aracı olarak kullanmıştır 23,24,25,26,27. Sellgren ve ark. önerilerimize uygun olarak iMG hücrelerini başarıyla ürettiler ve bu hücrelerin insan beyni mikroglia23'e çok benzediğini ortaya çıkaran bir mikroarray analizi yaptılar. Son zamanlarda, RNA dizilimi18 kullanarak insan iMG hücreleri ile beyin birincil mikroglia arasındaki benzerliği doğruladık.

Bu çalışma, nöropsikiyatrik hastalıklara odaklanan ters translasyonel araştırmaları kolaylaştırmak için insan periferik kanından iMG hücreleri üretme metodolojisini belgelemeyi amaçladı. Bu teknik, gen transfer aparatı veya yetkin personeli olmayan yetersiz donanımlı laboratuvarlarda bile, kısa sürede zahmetsizce mikroglial hücresel modeller üretebilen makul bir analitik araç olarak potansiyel sunar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma protokolü, Kyushu Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylandı ve Helsinki Bildirgesi'nin tüm hükümlerine uydu. Sağlıklı gönüllüler ve hastalar da dahil olmak üzere tüm katılımcılardan kanlarını analiz etmek ve verilerini yayınlamak için yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Malzemeler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir ve çözeltilerin bileşimleri Tablo 1'de detaylandırılmıştır.

1. Deneyler için ortam ve tamponların hazırlanması

  1. RPMI-1640'ı %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (56 °C, 30 dakika) ve %1 penisilin-streptomisin ile takviye ederek izolasyon ortamını hazırlayın.
  2. Temel tampon çözeltisini% 0.5 sığır serum albümini (BSA) stok çözeltisi ile destekleyerek izolasyon tamponunu hazırlayın ve filtrasyon (0.22 μm) ile sterilize edin.

2. Mononükleer hücrelerin tam kandan izolasyonu

  1. 15 mL yoğunluk gradyan ortamını 50 mL yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpüne aktarın ve 20 ° C'de 1 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.
    NOT: 50 mL yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpü başına 15 mL kan izole edin. Kan hacmi yüksek olduğunda tüp sayısını artırın.
  2. Heparin tüplerinde toplanan kanı ters çevirerek homojenize edin ve ateşle sterilize edilmiş cımbızla kan alma tüpünün kapağını çıkarın.
  3. Yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpündeki yoğunluk gradyan ortamına eşit hacimde (10-15 mL) kan dağıtın.
  4. Santrifüjün yavaşlama seviyesini 4 seviyeden 1'ine ayarlayın ve oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.
    NOT: Bu yavaşlama hızında, 180 × g (1.000 rpm) dönme hızı 3 dakikada durur.
  5. 50 mL yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpleriyle eşit sayıda 50 mL santrifüj tüpü hazırlayın ve her tüpü 10 mL PBS (-) ile doldurun.
  6. Santrifüjlemeyi takiben plazmanın üst katmanını buffy kaplamanın yaklaşık 1 cm üzerine kadar çıkarın.
    NOT: Tüpe dikey olarak bir aspirasyon pipeti yerleştirin ve sıvı yüzeyinin ortasından dikkatlice aspire edin. Buffy ceketi rahatsız etmemek için aşırı aspire etmeyin.
  7. 50 mL yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpünden kalan tüm süpernatantı 10 mL PBS (-) içeren bir santrifüj tüpüne boşaltın.
  8. Santrifüjün yavaşlama seviyesini 4 seviyenin 3'üne sıfırlayın ve RT'de 10 dakika boyunca 250 × g'da santrifüjleyin. Bu adım sırasında, bir adet 50 mL ve iki adet 15 mL'lik santrifüj tüpü ve bir 100 μm hücre süzgeci hazırlayın.
  9. Santrifüjlemeden sonra, santrifüjün sıcaklığını 4 °C'de ayarlayın. Santrifüj tüpünün dibinde kırmızı bir çevre ile beyaz bir pelet arayın. Süpernatanı aspirasyonla çıkarın ve peleti hafifçe vurarak hafifçe gevşetin.
  10. Yangınla sterilize edilmiş cımbız kullanarak 100 mL'lik konik tüpe 50 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin.
  11. Santrifüjlenmiş tüplerden birine 13 mL izolasyon ortamı ekleyin ve hücreleri düzgün bir şekilde toplamak için iç duvarı yıkayın. Hücre süspansiyonunu alın ve kalan santrifüjlenmiş tüpleri art arda yıkayın. Hücreleri tüm tüplerden topladıktan sonra, hücre süspansiyonunu bir hücre süzgecinden 50 mL'lik konik tüpe süzün.
    NOT: İzolasyon ortamının izolasyon işlemi boyunca soğutulması gerekir (adım 2.11-2.16).
  12. Her tüpü adım 2.11'de açıklandığı gibi 13 mL izolasyon ortamı ile tekrar yıkayın. Toplam 26 mL hücre süspansiyonu toplayın.
  13. Eşit miktarları iki adet 15 mL'lik konik tüpe dağıtın, hücreleri numaralandırın ve adım 2.16 için uygun izolasyon tamponu konsantrasyonunu (107 toplam hücre başına 60 μL tampon) hesaplayın.
    NOT: 15 mL'lik konik boru ile çalışmak daha iyidir çünkü sıvı hacmi küçüktür ve adım 2.16'da pipetleme sırasında sıvı kolayca kabarır.
  14. 250 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  15. Santrifüjleme sırasında, manyetik standı (özellikle kolonla temas eden kısım) %70 etanol ile iyice dezenfekte edin ve kuruması için tezgahın üzerine koyun. İzolasyon tamponunu buz üzerinde tutun.
  16. Süpernatanı aspirasyonla çıkarın (bu aşamada, kırmızı kan hücrelerinin varlığı nedeniyle ~ 1 mm kalınlığında kırmızı topaklar arayın), uygun miktarda izolasyon tamponu ekleyin ve ~ 20x pipetleyerek peleti hafifçe gevşetin.

3. CD11b mikro boncukları kullanılarak monositlerin izolasyonu

  1. Uygulamadan önce 10 saniye boyunca girdaplı insan FcR bloke edici reaktif. Gerekli miktarda reaktifi (toplam 107 hücre başına 20 μL FcR Bloke Edici Reaktif) ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca bir odada inkübe edin.
  2. Uygulamadan önce CD11b mikro boncuklarını 10 saniye boyunca vorteksleyin. Gerekli miktarda reaktifi (toplam 10 7 hücre başına 20 μLCD11b mikro boncukları) ekleyin ve her 5 dakikada bir elle çalkalarken 4 ° C'lik bir odada 20 dakika inkübe edin.
  3. İnkübasyondan sonra, 10 mL izolasyon tamponu ekleyin, hafif pipetleme ile askıya alın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
  4. Santrifüjleme sırasında, manyetik sütunu manyetik standın üzerine yerleştirin ve 3 mL izolasyon tamponu ile durulayın.
    NOT: Kolonun manyetik kısmına dokunmaktan kaçının ve kolonu doğru şekilde konumlandırın. Kabarcıklar sütuna girerse, bunları bir pipetle çıkarın. İzolasyon tamponunun, izolasyon işlemi boyunca soğutulması zorunludur (adım 3.4-3.9).
  5. Santrifüjleme sonrası süpernatanı aspirasyon ile çıkarın, 1 mL izolasyon tamponu ekleyin, hafifçe pipetleyerek karıştırın ve süspansiyonu kolona uygulayın.
  6. Kolon rezervuarı her boşaldığında 3 mL izolasyon tamponu ekleyerek kolonu 3x yıkayın.
  7. Kolonu manyetik kısma dokunmadan 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin; kolona 5 mL izolasyon tamponu ekleyin ve tüpe yerleştirilmiş bir piston ile sıvıyı kolondan dışarı doğru zorlayın.
  8. Tüpte toplanan hücre süspansiyonunu 300 × g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  9. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri izolasyon ortamında yeniden süspanse edin. Adım 2.13'te sayılan hücre sayısının ~%5-10'u geri kazanılacağından, süspansiyon hacmini hücre sayısına göre ayarlayın.
    NOT: İzolasyon ortamı RT'de kullanılmalı ve 4 °C'den hızlı sıcaklık değişimini önlemek için ısıtılmamalıdır.
  10. Hücreleri numaralandırın ve 500 μL hücre süspansiyonunu 40 × 104 hücre / mL konsantrasyonda 24 oyuklu plakaların her bir oyuğuna alın ve gece boyunca inkübe edin.
    NOT: Hücre süspansiyonları, farklı plakalar için gereken ayarlanmış tohumlama hacmine uygun şekilde pipetlenmelidir. Örneğin, 12 oyuklu bir plakada bir kuyucuk için 1 mL ve 8 oyuklu bir oda slaytında bir kuyucuk için 250 μL.
  11. Son olarak, kontamine ekipmanı, tesis tarafından belirlenen bulaşıcı atıkların işlenmesine ilişkin politikaya uygun olarak atın veya dezenfekte edin.

4. Monositlerden iMG hücrelerinin indüksiyonu

  1. Bazal indüksiyon ortamını %1 antibiyotik-antimikotik solüsyon, 10 ng/mL rekombinant insan GM-CSF ve 100 ng/mL rekombinant insan IL-34 ile destekleyerek indüksiyon ortamını hazırlayın.
  2. İzolasyon ortamını önceki günün tohumlamasından itibaren indüksiyon ortamı ile değiştirin. Plakayı öne doğru eğin ve tükenmiş ortamı bir Pasteur pipeti ile kuyu tabanının ön kenarından hemen aspire edin. Ortamı bir seferde maksimum 1 plaka (= 24 kuyucuk) oranında değiştirin ve hemen 500 μL indüksiyon ortamını nazikçe dahil edin.
    NOT: Bu adımda yapıştırılmış monositler seçilmelidir.
  3. İndüksiyonu tamamlamak için hücreleri 14 gün boyunca inkübe edin.
  4. Ortamı 14 gün sonra tekrar 500 μL indüksiyon ortamıyla değiştirin. Daha sonra, hücrelerin indüksiyon sonrası bakımı için, indüksiyon ortamını her hafta 500 μL taze indüksiyon ortamı ile değiştirin.

5. İmmünositokimya

  1. Ortamı, aspirasyon ile adım 3.10'da hücrelerle tohumlanmış 8 oyuklu oda slaytından çıkarın ve PBS (-) ile durulayın.
  2. Hücreleri% 4 paraformaldehit ile RT'de 20 dakika sabitleyin.
  3. Fiksatif reaktifi çıkarın ve hücreleri PBS (-) ile 3 x 5 dakika durulayın.
  4. RT'de %0.1 Triton X-100 içeren PBS (-) ile hücreleri geçirgen hale getirin.
  5. Geçirgen hücreleri RT'de 1 saat boyunca bir bloke edici çözelti (% 3 BSA / PBS (-)) ile inkübe edin.
  6. Hücreleri gece boyunca 4 ° C'de birincil antikorlarla (Malzeme Tablosu) inkübe edin.
    NOT: Tüm antikorlar bloke edici çözelti içinde seyreltilir.
  7. Hücreleri 3 x 5 dakika boyunca PBS (-) ile her biri 5 dakika durulayın.
  8. Durulanmış hücreleri, RT'de (Malzeme Tablosu) 1 saat boyunca uygun floresan etiketli ikincil antikorlarla inkübe edin.
  9. İkincil antikorları çıkarmak için hücreleri PBS (-) ile 3 x 5 dakika durulayın.
  10. Hücreleri, RT'de 5 dakika boyunca PBS (-) ile seyreltilmiş DAPI (1: 10.000) çözeltisi ile inkübe edin.
  11. Hücreleri PBS (-) ile 3 x 5 dakika durulayın.
  12. Montaj ortamını kullanarak kuyuyu monte edin ve hücreleri bir floresan mikroskobu altında görselleştirin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha da önemlisi, morfolojiler ve gen ekspresyonları dahil olmak üzere iMG hücrelerinin karakterlerinde çok fazla kişi düzeyinde ve zamanlama düzeyinde heterojenlik vardır. Bazı bireylerdeki iMG hücreleri çok sayıda dallanma görünümü alırken, diğerlerinde küresel kalırlar (Şekil 1B). iMG özellikleri, tek bir birey içinde bile farklılık gösterebilir ve iMG hücrelerini hastalık durumu biyobelirteçlerini tespit etmek için çok önemli bir araç haline getirir. Tersine, bu tür bireyler arası farklılıkların incelenmesi, teknik hataların azaltılmasını garanti eder. iMG hücreleri, en az 14 gün boyunca GM-CSF ve IL-34 ile indüklenen monositler olarak tanımlanır. Teknik hataları en aza indirmek için, indüksiyon süresinin standartlaştırılması, aynı miktarda reaktif kullanılması ve son kullanma tarihi geçmiş reaktiflerin kullanılmasından kaçınılması önerilir.

İmmün boyamanın doğrulanması ayrıca iMG hücrelerinin P2RY12 ve TMEM119 dahil olmak üzere mikroglial belirteçleri eksprese ettiğini doğrular (Şekil 2). Önceki araştırmalar, iMG hücrelerinin morfolojik ve gen ekspresyon özelliklerinin bipolar bozukluğun patofizyolojisi ile ilişkili olduğunu göstermiştir20,21. En erken dallanmış hücreler, GM-CSF ve IL-34 tedavisinden sonra 3. günde gözlendi ve optimum durumdaki iMG hücreleri, haftada bir kez orta değişim yapıldığında 1 aydan fazla hayatta kalabilir. iMG hücreleri, gen ekspresyon analizi için kullanılabilir. Örneğin, interferon gama veya IL-4 ile yapılan stimülasyonlar altında, iMG hücreleri, M1 ve M2 polarize mikroglia 5,22'nin fonksiyonel değerlendirmesi için kullanılabilen gen ekspresyon modelini değiştirdi. Ayrıca, FITC boncukları amoeboid benzeri morfolojik modifikasyonları tetikler ve TNFa ve diğer genlerin ekspresyonunu yukarı regüle eder5. Ayrıca, fagositoz, boncuklarınfloresan yoğunluğu 5,22 ölçülerek değerlendirilebilir. Ayrıca, iMG hücreleri canlı hücreler olduğundan, gerçek hareketleri ve morfolojik değişimleri hücre resimleri çekilerek (Şekil 3) veya hızlandırılmış fotoğrafçılık (Video 1) ile gözlemlenebilir.

figure-results-1
Şekil 1: iMG hücrelerinin morfolojisi. (A) Tipik dallanmış iMG, dakika soma cisimleri ve çok sayıda dallanmış teminat sergiledi. (B) Ameboid tipi gibi bazı örneklerin görünüşü değişmiştir. Ölçek çubuğu, 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: iMG hücrelerinin immünositostainingi. iMG hücreleri tipik mikroglial belirteçleri eksprese eder: (A) TMEM 119, (B) P2RY12. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçek çubuğu =10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: iMG hücrelerindeki morfolojik modifikasyonlar. iMG, indüksiyon işlemi sırasında morfolojilerini değiştirir. Hücre çıkıntıları (A) 3. gün civarında ortaya çıkar ve indüksiyon ilerledikçe (B) 7 ve (C) 14. günlerde uzar. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: iMG hücrelerinin hızlandırılmış fotoğrafı. Merkezdeki dallanmış iMG hücresinin, süreçlerini uzatıp daraltırken çevredeki hücrelerle temas kurduğu ortaya çıktı. Ayrıca, hücre hasarlı hücrelerin fagositozunu gerçekleştirdi. Görüntü alma aralıkları 46 sn ve çekim süresi yaklaşık 14 saatti. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Çözümlerin bileşimi Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iMG hücrelerini kullanan analitik teknikler, güçlü ters translasyonel araştırma araçları olarak hizmet edebilir 5,6. Yeterli miktarda insan iMG hücresi üretmek için, deneyciler çalışmalarını belirli konuları dikkate alarak tasarlamalıdır. İnsanlardan alınan kan örnekleri son derece hassastır; Sonuç olarak, elde edilen numuneler, kontaminasyonu önlemek için hızlı işlemeyi ve titiz işlemeyi garanti eder. Spesifik olarak, kan örnekleri alındıktan hemen sonra ayrılmalı ve uzun süre gözetimsiz bırakılmamalıdır. Deneyler, geçerliliklerini doğrulamak için geleneksel olarak kan alımından sonraki 3 saat içinde başlatılır; bununla birlikte, kan örneklerini 4 ° C'de 3 saatten fazla saklamak ve ayırma protokollerine başlamadan önce oda sıcaklığına getirmek mümkündür.

Stabil sonuçlar elde etmek için, kültür ortamı gibi reaktiflerin mührü açıldıktan sonraki bir ay içinde kullanılması ve son kullanma tarihinden sonra atılması önerilir. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanılarak periferik kan mononükleer hücrelerini ayırırken, bazı örneklerde hücre agregasyonu gözlenebilir. Bu gibi durumlarda, agregasyonu önlemek için tam kan örneği PBS (-) ile seyreltilmelidir. Mikrogliaya farklılaşmanın indüksiyonu sırasında, hücrelerin gereksiz yere uyarılmasını önlemek için kültür ortamı 14 gün boyunca değiştirilmez. Farklılaşma indüksiyonunun tamamlanmasından sonra, taze ortam ile ortam replasmanı, zayıflamış hücreleri eski haline getirebilir ve bir süre canlılığı koruyabilir.

Bu çalışmada kurulan iMG tekniği bir sınırlılık arz etmektedir; Deneysel olarak indüklenen "mikroglia benzeri hücreler" karşılaştırılabilir, ancak insan beynindeki gerçek mikroglial hücrelerle tamamen aynı değildir. Ek olarak, önceki araştırmalar, insan monositinden türetilmiş mikroglia benzeri hücrelerin indüksiyonu için metodolojiyi belgelemiştir ve farklı araştırma grupları, orijinal iMG yöntemlerine bağlı olarak kendi farklı protokollerini ve isimlerini önermiştir28. Örneğin, bazı protokoller, iPSC β'den türetilmiş mikroglia kültürlerinde veya Geltrex 24,34 gibi kaplamalarda mikroglia benzeri bir fenotipi teşvik ettiği bildirilen M-CSF 29,30,31,32 veya TGF-33 kullanır; Bu faktörlerin mikroglia benzeri hücreleri indüklemek için etkili olduğu kanıtlanabilir.

Orijinal iMG teknolojisi, insan kanı kullanılarak çeşitli ters translasyonel deneylere olanak tanıyan, yalnızca iki sitokin içeren ve kaplama içermeyen basit ve çoğaltılması kolay protokolü sayesinde avantajlıdır. Tersine, teknolojideki gelişmeler birçok ürünün geliştirilmesini kolaylaştırmıştır. Manyetik ayırma yöntemleri, protokolümüze benzer şekilde kolon tabanlı pozitif seçimin yanı sıra negatif seçim ve kolonsuz yöntemleri içerir. Ayrıca, manyetik ayırma yerine, plastik yapışma kullanılarak alternatif bir ayırma yöntemi düşünülebilir. Sütun tabanlı pozitif seçim saflığı sağlar, ancak teknik zaman alıcıdır ve manyetik boncuklarla stimülasyon hücreleri önemli ölçüde etkiler35. Aksine, negatif seçim ve plastik yapışma hücreler için daha az zararlı olabilir; Bununla birlikte, bu yaklaşımlar daha az saf olabilir35,36. Gelecekte diğer protokollere bağlı olarak daha fazla değişiklik yapılması gerekebilir.

Yukarıda bahsedilen bulgular, bu iMG teknolojisinin baskın avantajının kısa süresi, uygun maliyetli metodolojisi ve yüksek verimli çalışmalar için çok sayıda numuneyi işleme yeteneği olduğunu doğrulamaktadır. Bu nedenle, bu teknoloji insan örneklerinden bilgi elde etmek ve daha sonra farklı hayvan modelleri kullanarak daha fazla doğrulama çalışması yapmak için kullanılabilir. Ayrıca, iMG tekniği uygulanarak hücresel ve hayvan modelleri üzerinde yapılan araştırmalardan elde edilen bulgular faydalı olabilir. Bu şekilde, iMG tekniğimiz, başbaşından tezgaha ve tezgahtan başucuna şekilde iki yönlü translasyonel araştırmalara uygulanabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, aşağıdaki Bilimsel Araştırma Hibeleri tarafından kısmen desteklenmiştir: (1) Japonya Bilimi Teşvik Derneği (KAKENHI; JP18H04042, JP19K21591, JP20H01773 ve JP22H00494 TAK'a, JP22H03000 M.O.'ya); (2) Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı (AMED; JP21wm0425010 için TAK, JP22dk0207065 için M.O.) ve (3) Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı CREST (TAK'a JPMJCR22N5). Finansman kuruluşları, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makale hazırlama konularında hiçbir rol üstlenmediler. İngilizce dil düzenlemesi için Editage'a (www.editage.jp) teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.1 Triton X-100Sigma-Aldrich30-5140-5
% 4 paraformaldehitNacalai Tesque09154-14
Antibiyotik-Antimikotik (100x)gibco15240-062"antibiyotik-antimikotik çözelti" olarak tanımlanmıştırautoMACS
Durulama ÇözeltisiMiltenyi Biotec130-091-222"temel tampon çözeltisi" olarak tanımlanan ve "izolasyon tamponu" için kullanılan
CD11b MicroBeadsMiltenyi Biotec130– 049-601
DAPI çözeltisiDOJINDO28718-90-3
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu TuzluNacalai Tesque14249-24"PBS (&eksi;)"
Fetal Sığır SerumubiowestS1760-500
İnsan FcR Bloke Edici ReaktifMiltenyi Biotec130– 059-901
LeucosepGreiner Bio-One227290"yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpü" olarak
tanımlanırMACS LS sütunlarıMiltenyi Biotec130-042-401"manyetik sütun" olarak
tanımlanırMACS BSA Stok ÇözümüMiltenyi Biotec130-091-376"sığır serum albümini (BSA) stok çözeltisi" olarak
tanımlanırMACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303"manyetik stand" olarak tanımlanan
Penisilin-StreptomisinNacalai Tesque26253– 84
ProLong Altın Antifade MountantInvitrogenP10144, "montaj ortamı" olarak
tanımlanırrekombinant insan GM-CSFR& D Systems215-GM
rekombinant insan IL-34R& D Systems5265-IL
RPMI 1640 Orta + GlutaMAX Takviyesi (önceden eklenmiş ortam)Thermo Fisher Scientific61870036"bazal indüksiyon ortamı" olarak
tanımlanırRPMI-1640Nacalai Tesque30264-56
Antikorlar< / güçlü >
anti-P2RY12 antikoruSigma-AldrichHPA014518birincil antikor, tavşan, 1:100
anti-TMEM119 antikoruSigma-AldrichHPA051870birincil antikor, tavşan, 1:100
Keçi anti-tavşan IgG (H+L) çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, Alexa Fluor 568invitrojenA-11011ikincil antikor, tavşan, 1:1000
, , , : ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steiner, J., et al. Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide. J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).
  2. Setiawan, E., et al. Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study. Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).
  3. Holmes, S. E., et al. Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study. Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).
  4. Meyer, J. H., et al. Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets. Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).
  5. Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Sci Rep. 4, 4957(2014).
  6. Method of producing microglial cells. France patent EP. , 3 092 305 B1 (2023).
  7. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  8. Mattis, V. B., Svendsen, C. N. Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology. Lancet Neurol. 10 (4), 383-394 (2011).
  9. Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
  10. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10343-10348 (2011).
  11. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  12. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nat Immunol. 13 (8), 753-760 (2012).
  13. Aloisi, F., De Simone, R., Columba-Cabezas, S., Penna, G., Adorini, L. Functional maturation of adult mouse resting microglia into an APC is promoted by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interaction with Th1 cells. J Immunol. 164 (4), 1705-1712 (2000).
  14. Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6 (10), e26317(2011).
  15. Nandi, S., et al. The CSF-1 receptor ligands IL-34 and CSF-1 exhibit distinct developmental brain expression patterns and regulate neural progenitor cell maintenance and maturation. Dev Biol. 367 (2), 100-113 (2012).
  16. Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Rep. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  17. Yonemoto, K., et al. Heterogeneity and mitochondrial vulnerability configurate the divergent immunoreactivity of human induced microglia-like cells. Clin Immunol. 255, 109756(2023).
  18. Tanaka, S., et al. CD206 expression in induced microglia-like cells from peripheral blood as a surrogate biomarker for the specific immune microenvironment of neurosurgical diseases including glioma. Front Immunol. 12, 2424-2424 (2021).
  19. Ohgidani, M., et al. Fibromyalgia and microglial TNF-alpha: Translational research using human blood induced microglia-like cells. Sci Rep. 7 (1), 11882(2017).
  20. Ohgidani, M., et al. Microglial CD206 gene has potential as a state marker of bipolar disorder. Front Immunol. 7, 676(2016).
  21. Ohgidani, M., et al. A case of bipolar disorder with AIF1 (coding gene of Iba-1) deletion: A pilot in vitro analysis using blood-derived microglia-like cells. Psychiatry Clin Neurosci. 77 (2), 128-130 (2023).
  22. Shirozu, N., et al. Angiogenic and inflammatory responses in human induced microglia-like (iMG) cells from patients with Moyamoya disease. Sci Rep. 13 (1), 14842(2023).
  23. Sellgren, C. M., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Mol Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  24. Sellgren, C. M., et al. Increased synapse elimination by microglia in schizophrenia patient-derived models of synaptic pruning. Nat Neurosci. 22 (3), 374-385 (2019).
  25. Banerjee, A., et al. Validation of induced microglia-like cells (iMG Cells) for future studies of brain diseases. Front Cell Neurosci. 15, 629279(2021).
  26. You, M. J., et al. A molecular characterization and clinical relevance of microglia-like cells derived from patients with panic disorder. Transl Psychiatry. 13 (1), 48(2023).
  27. Rocha, N. P., et al. Microglia activation in basal ganglia is a late event in Huntington disease pathophysiology. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 8 (3), e984(2021).
  28. Sargeant, T. J., Fourrier, C. Human monocyte-derived microglia-like cell models: A review of the benefits, limitations and recommendations. Brain Behav Immun. 107, 98-109 (2023).
  29. Lannes, N., et al. Interactions of human microglia cells with Japanese encephalitis virus. Virol J. 14 (1), 8(2017).
  30. Ryan, K. J., et al. A human microglia-like cellular model for assessing the effects of neurodegenerative disease gene variants. Sci Transl Med. 9 (421), 7635(2017).
  31. Etemad, S., Zamin, R. M., Ruitenberg, M. J., Filgueira, L. A novel in vitro human microglia model: characterization of human monocyte-derived microglia. J Neurosci Methods. 209 (1), 79-89 (2012).
  32. Bortolotti, D., Gentili, V., Rotola, A., Caselli, E., Rizzo, R. HHV-6A infection induces amyloid-beta expression and activation of microglial cells. Alzheimers Res Ther. 11 (1), 104(2019).
  33. Ormel, P. R., et al. A characterization of the molecular phenotype and inflammatory response of schizophrenia patient-derived microglia-like cells. Brain Behav Immun. 90, 196-207 (2020).
  34. Akiyama, H., et al. Expression of HIV-1 intron-containing RNA in microglia induces inflammatory responses. J Virol. 95 (5), e01386-e01420 (2021).
  35. Nielsen, M. C., Andersen, M. N., Moller, H. J. Monocyte isolation techniques significantly impact the phenotype of both isolated monocytes and derived macrophages in vitro. Immunology. 159 (1), 63-74 (2020).
  36. Kelly, A., Grabiec, A. M., Travis, M. A. Culture of human monocyte-derived macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 1-11 (2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

nsan Kan MonositleriTersine eviri Ara t rmasN ropsikiyatrik BozukluklarH cre zolasyonuYo unluk GradyanManyetik H cre Ay r mSitokin Sal n mFagositoz KapasitesiGran losit Makrofaj Fakt r

İlgili makaleler