Yöntem makalesi

Umbilikal Kordon Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerin Yüksek Verim ve Düşük Hasarla İzolasyonu

5.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66835

⸱

5 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3Obstetrical Department, Longgang District Maternity & Child Healthcare Hospital of Shenzhen City, 4Longgang Maternity and Child Institute of Shantou University, Medical College

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, Wharton jölesinin (WJ) bütünlüğünü korumak için benzersiz bir künt diseksiyon prosedürü sunar, bu da daha az hasarlı WJ ve hasat edilen mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) daha fazla miktarda ve canlılığı ile sonuçlanır. Yöntem, konvansiyonel keskin diseksiyon yöntemlerine kıyasla üstün verim ve proliferatif yetenek göstermektedir.

Özet

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), dikkate değer rejeneratif ve immünomodülatör özelliklere sahip multipotent hücrelerin bir popülasyonudur. Göbek kordonundan (UC) elde edilen Wharton jölesi (WJ), olağanüstü bir MSC kaynağı olarak biyomedikal alanda artan bir ilgi görmüştür. Bununla birlikte, sınırlı tedarik ve mevcut yöntemlerde standardizasyon eksikliği gibi zorluklar ortaya çıkmıştır. Bu makale, göbek kordonundan sağlam WJ'yi diseke ederek MSC verimini artırmak için yeni bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, epitel tabakasını çıkarmak için künt diseksiyon kullanır, tüm WJ'nin bütünlüğünü korur ve hasat edilen MSC'lerin miktarının ve canlılığının artmasına neden olur. Bu yaklaşım, geleneksel keskin diseksiyon yöntemlerine kıyasla WJ israfını önemli ölçüde azaltır. WJ-MSC'lerin saflığını sağlamak ve dış hücresel etkiyi en aza indirmek için, UC'yi çevirdikten sonra endotelyumu soymak için iç gerilimi kullanan bir prosedür gerçekleştirildi. Ek olarak, Petri kabı, bağlanmayı ve hücre büyümesini iyileştirmek için eksplant kültürü sırasında kısa bir süre için ters çevrildi. Karşılaştırmalı analiz, önerilen yöntemin üstünlüğünü gösterdi ve geleneksel yöntemlere göre daha iyi uygulanabilirliğe sahip daha yüksek bir WJ ve WJ-MSC verimi gösterdi. Her iki yöntemde de hücre yüzeyi belirteçlerinin benzer morfolojisi ve ekspresyon modeli, çeşitli uygulamalar için karakterizasyonlarını ve saflıklarını doğrular. Bu yöntem, WJ-MSC izolasyonu için yüksek verimli ve yüksek uygulanabilirlik yaklaşımı sağlar ve MSC'lerin klinik uygulaması için büyük bir potansiyel gösterir.

Giriş

Mezenkimal Kök Hücrelerin (MSC'ler) 1991 yılında Wharton jölesinden (WJ) ilk izolasyonundan bu yana, bu multipotent kök hücreler, rejeneratif özellikleri ve çok soylu farklılaşma kapasiteleri nedeniyle araştırmacılardan büyük ilgi görmüştür1. MSC'ler kemik iliği, periferik kan, diş pulpası, yağ dokusu, fetal (insan kürtajı) ve doğumla ilgili dokular dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan izole edilebilir2. Göbek kordonu (ÜK), non-invaziv doğası, bol hücre verimi ve farklılaşma kapasitesi, yüksek oranda proliferasyon, farklılaşma potansiyeli ve bağışıklık modülasyon özellikleri sergilemesi nedeniyle umut verici bir rezervuar olarak ortaya çıkmıştır3. Fetal MSC'ler güçlü gövde ve bağışıklık özellikleri sergiler, bu da onları son yirmi yılda yürütülen klinik çalışmaların ve temel araştırmaların birincil odak noktası haline getirir 2,4,5. UC'den türetilmiş MSC'ler, kemik iliği veya yağ dokusu gibi diğer MSC kaynaklarına kıyasla üstün terapötik potansiyele sahiptir 6,7.

UC, amniyotik epitel, üç damar (iki arter ve bir ven) ve WJ3 olarak bilinen jelatinimsi maddeden oluşur. Şaşırtıcı bir şekilde, UC, yalnızca endotel ve mezotelyumdan oluşan, ancak tunika adventitia'dan oluşmayan basit bir damar sistemi oluşturur; WJ lenf veya sinir içermez8. UC, segmental ayırma için ideal olan benzersiz bir yapı sunar. UC-MSC'ler öncelikle WJ'de bulunur. MSC'ler, amniyon, subamniyon (amniyon ve subamnyon aynı zamanda kordon astar bölgesi olarak da adlandırılır) ve WJ8'in perivasküler alanı dahil olmak üzere WJ'nin farklı bölmelerinden izole edilebilir. WJ'nin her bölgesinin kendi yapısı, immünohistokimyasal özellikleri ve işlevivardır 3,6.

UC'nin WJ'sinden izole edilen MSC'lerin, diğer bölgelerden gelenlere kıyasla üstün klinik faydaya sahip olduğu yaygın olarak kabul edilmektedir3. WJ-MSC'ler, çok hatlı farklılaşma potansiyelleri, immünomodülatör özellikleri, parakrin etkileri, anti-inflamatuar etkileri ve bağışıklık ayrıcalıklı özellikleri nedeniyle çeşitli hastalıkların tedavisi için klinik öncesi ve klinik ortamlarda kapsamlı bir şekilde incelenmiştir 2,3. WJ-MSC'lerin graft-versus-host hastalığı (GvHD), greft reddi, Crohn hastalığı, otoimmün hastalıklar ve kardiyovasküler hastalıklar dahil olmak üzere bir dizi hastalığın tedavisinde umut vaat ettiği kanıtlanmıştır 9,10,11,12,13,14. WJ-MSC'lere yönelik klinik talep artmaya devam ettikçe, göbek kordonlarının arzının yetersizliği şu anda yaygın uygulamalarının önünde bir engel teşkil etmektedir.

WJ-MSC'lerin verimi, hücre ekstraksiyonu için kullanılan yöntemebağlıdır 15. WJ-MSC'ler eksplant kültürü veya enzim sindirimi yoluyla izole edilebilirken, ikinci yöntem, hücre hasarı riskini artırabilecek ve hücre canlılığını azaltabilecek daha uzun bir yayılma süresine sahiptir16. Bununla birlikte, çok sayıda çalışma, eksplant kültür yönteminin hücre verimini ve canlılığını artırdığını ve eksplant dokularından salınan parakrin faktörlerin de hücre proliferasyonunu desteklemeye yardımcı olduğunu göstermiştir17,18.

Bu çalışma, tüm WJ'yi elde etmek için benzersiz bir diseksiyon yaklaşımı uyguladı ve WJ'ye verilen zararı en aza indirirken, gelişmiş proliferatif kapasite, canlılık ve miktara sahip MSC'ler verdi. Bu yenilikçi yöntem, MSC uygulamalarındaki kritik ihtiyaçları ele alarak WJ-MSC'leri izole etmek için kolaylaştırılmış bir strateji sunar.

Protokol

Örnekler, Çin'in Guangdong kentindeki Shenzhen Longgang Bölgesi Doğum ve Çocuk Sağlığı Hastanesi'nden rıza gösteren, sağlıklı bağışçılardan alındı. Çalışma için insan örneklerinin kullanımı, Shenzhen Hastanesi Etik Kurulu, Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi (SZLDH2020LSYM-095) ve Shenzhen Longgang Bölgesi Doğum ve Çocuk Sağlığı Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi (LGFYYXLLS-2020-005) tarafından onaylandı. Tüm deneyler onaylanmış yönergelere göre yapılmıştır. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. İnsan göbek kordonunun toplanması

  1. Kooperatif hastanesinden steril koşullar altında insan göbek kordonu örnekleri alın.
    NOT: 35 yaşın altında, tercihen bir primipara, hepatit, cinsel yolla bulaşan hastalıklar veya genetik bozukluk öyküsü olmayan bir donör seçin. Hepatit B virüsü, hepatit C virüsü ve sitomegalovirüs için başvuru muayene sonuçlarının negatif olması gerekir. Doğum şekli olarak sezaryen doğumu seçin.
  2. Yaklaşık 10-15 cm uzunluğunda düz ve sağlam bir UC parçası seçin.
  3. Her iki ucu da hemostatik forseps ile kapatın ve sezaryen ile tam süreli bir yenidoğanın doğumundan hemen sonra forsepsler arasındaki iç uçta cerrahi düğümlerle bağlayın. ( Şekil 1, adım 1'de gösterildiği gibi toplanan UC).
    NOT: Sezaryen ameliyatı, koleksiyonun steril olmasını sağlar. Daha iyi gerilme mukavemeti için 0 veya 2-0 sütür boyutunda cerrahi düğümler kullanın.
  4. Forseps ve düğümler arasındaki bağlı göbek kordonunu cerrahi makas kullanarak kesin (Şekil 1, adım 1).
  5. Yüzeydeki kirletici kan pıhtılarını gidermek için tuzlu su çözeltisi ile durulayın ve derhal 20 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içeren steril 50 mL plastik tüpe aktarın.
    NOT: Transfer sırasında herhangi bir antibiyotik kullanılmamıştır.
  6. Tüpü kapatın. Polistiren bir kutuda buzun üzerine koyun ve laboratuvara taşımadan önce 4 °C'de saklayın.
    NOT: Kabloyu aldıktan sonra 4 saat içinde inceleyin.

2. Wharton jölesinin göbek kordonundan izolasyonu

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek göbek kordonunu işleyin:
    1. Cerrahi aletler, aseptik olarak paketlenmiş 90 mm'lik tabaklar, 1000 μL pipetler, steril PBS, %75 etanol çözeltisi ve kseno içermeyen insan MSC kültür ortamı içeren sterilize bir tepsi hazırlayın.
      NOT: Dişli forseps ve sivrisinek kelepçeleri, kayan kordonun verimli bir şekilde ele alınmasına izin verir.
    2. Biyogüvenlik kabinine yerleştirmeden önce gerekli öğeleri ve çalışma alanını yüzey dekontamine edin.
      NOT: Çalışmaya başlamadan önce çalışma bölgesi havasının birkaç dakika boşalmasına izin verin.
    3. Tüpün yüzeyini dezenfekte edin ve numuneyi biyogüvenlik kabinindeki bir Petri kabına çıkarın. Numuneyi düğümlü olarak 30 saniye boyunca %75 etanole daldırın ve ardından yeni bir Petri kabında steril PBS ile birkaç kez durulayın.
      NOT: %75 etanole daldırılmadan önce kablo bağlanmalı ve kablonun zarar görmeden tamamen dezenfekte edilmesi için daldırma süresi 30 s ila 1 dakika ile sınırlandırılmalıdır.
    4. Düğümleri kesin ve iki düğüm arasındaki kordonu cerrahi makas ve forseps ile enlemesine yaklaşık 2 cm uzunluğunda kısa parçalar halinde kesin.
      NOT: Kablonun düğümlü uçları atılmalıdır. UC'nin uzunluğu çok uzun veya çok kısa olmamalıdır; Her iki durum da operasyonun zorluğunu artırabilir.
    5. Kordonun diğer ucundan çıkan sıvı tamamen şeffaf hale gelene kadar 1000 μL'lik pipetler kullanarak damarı (daha büyük damar) PBS ile perfüze edin19.
  2. Göbek kordonunu inceleyin.
    1. Önceden kesilmiş parçalardan birini yeni bir Petri kabına aktarın.
      NOT: Kesit8'de iki arter ve bir ven görünür şekilde açığa çıkarılmalıdır (Şekil 2B).
    2. İşlem boyunca kabloyu ıslak tutmak için uygun miktarda PBS ekleyin.
    3. Kordonu forseps ile kavrayın ve sivrisinek kıskaçları yardımıyla ana ekseni boyunca arterleri dışarı çekin.
      NOT: Arter yırtılmışsa, arter duvarı büyük bir esnekliğe sahip olduğundan, kordonun diğer ucundan çekmeye çalışın.
    4. Forsepsin bir bıçağını göbek damarına sokarak ve ardından sıkıca sıkıştırarak kordonu daha kalın tarafı yukarı bakacak şekilde yatay olarak sabitleyin, forsepsin daha kalın tarafa kenetlendiğinden emin olun.
    5. Bir neşter kullanarak forsepsin diğer bıçağının kenarı boyunca amniyotik epitel tabakası üzerinde bir uçtan diğer uca doğrusal bir kesi yapın (Şekil 3).
      NOT: Mümkün olduğunca az WJ keserek Wharton jölesinin bütünlüğünü koruyun.
    6. Kesme boşluğunun bir köşesinden başlayın. Amniyotik epitelin köşesini dişli kelepçelerle kaldırın ve epitelin iç yüzeyi boyunca kornea makasıyla yatay olarak biraz daha kesmeye devam edin.
      1. Wharton'un jölesini ve amniyotik epitelini kelepçelerle ayırın ve yavaş yavaş UC'nin bir ucunun tüm çemberine genişletin. Epitel tabakasını uzunlamasına soyun (Şekil 3).
        NOT: Wharton jölesi, yoğun amniyotik epitel8 ile çevrili bir mukoza bağ dokusudur. Tüm işlem düzgün olmalıdır, ancak soyulma sırasında zorluklarla karşılaşılırsa künt diseksiyon için sivrisinek kelepçeleri kullanılabilir.
    7. Forsepsin her iki bıçağını da damarın içine yerleştirin, WJ'nin bir kısmını sıkıştırın ve ardından göbek damarının epitelini ortaya çıkarmak için ters çevirin (Şekil 3).
    8. İç gerilim damar epiteli ile perivasküler WJ arasında bir ayrım oluşturduğundan, damarın epitelini kolayca soyun (Şekil 3).
  3. Karşılaştırma için geleneksel yöntemi kullanarak UC'yi inceleyin20.
    1. Önceki kordonla neredeyse aynı ağırlıkta önceden kesilmiş başka bir numune seçin ve yeni bir Petri kabına aktarın.
    2. Göbek damarı boyunca makasla uzunlamasına kesin ve damarları ve WJ'yi ortaya çıkarmak için UC'yi yayın.
    3. Göbek damarını ve iki arteri çıkarın ve WJ'yi makas ve neşter ile endotel tabakasından çıkarın.

3. UC-MSC'lerin izolasyonu ve kültürü

  1. Toplanan WJ'yi önceden etiketlenmiş 90 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin ve makas ve forseps ile 1-3 mm'lik parçalar halinde kesin.
  2. Altta kapak olacak şekilde çanağı ters çevirin ve parçalar ile plastik yüzey arasındaki bağlantıyı güçlendirmek için 37 °C'de 30 dakika boyunca %5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
  3. Çanağı ters çevirin ve daha fazla kültür için nazikçe uygun miktarda insan MSC kültür ortamı ekleyin.
    NOT: Parçaların hala takılı olduğundan emin olmak için en düşük hızı kullanın.
  4. İnsan MSC kültür ortamını her 3 günde bir değiştirin. Ortamın üçte ikisini değiştirin ve ilk 7 günde bir her 2 günde bir fibröz hücrelerin büyümesinin görünümünü gözlemleyin, tam ortamı değiştirin ve daha sonra günlük olarak gözlemleyin.
    NOT: İlk 7 gün boyunca Petri kabını hareket ettirmekten kaçının. Fibroblast benzeri hücrelerin belirgin büyümesi yaklaşık 4 gün içinde gözlendi.
  5. Birleşme% 80'e ulaşana kadar alt kültür.
    NOT: Bu adım 7-10 gün sürer.
    1. PBS,% 0.25 tripsin ve kseno içermeyen insan MSC kültür ortamını bir su banyosunda 37 ° C'ye kadar önceden ısıtın.
    2. Süpernatanı pipetlerle aspire ettikten sonra PBS ile durulayın ve hücreler Petri kabına dokunarak yerinden çıkana kadar hücreleri önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin ile ayırın.
    3. Önceden ısıtılmış MSC kültür ortamını 4:1 oranında karıştırarak tripsini inaktive edin, hücre süspansiyonunu toplayın ve 300 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Bu hücreler geçiş 0 (P0) olarak kabul edilir.
    4. Süpernatantı bir pipetle atın, hücreleri insan MSC kültür ortamında yeniden süspanse edin ve çoğaltma için 1x104 hücre /cm2 tohumlama yoğunluğunda yeni Petri kaplarına aşılayın.
  6. Bir hemositometre kullanarak, birinci, ikinci ve üçüncü geçişte amplifikasyondan sonra iki yöntemin toplam hücre sayısını sayın. Birinci, üçüncü ve beşinci pasajlarda mikroskop altında hücre morfolojisini belirleyin.
    NOT: Bu hücrelerin morfolojisi P0 hücrelerine benzer olmalıdır.
  7. Akış sitometrisi ve diğer deneyler için beşinci geçitteki hücreleri kullanın.

4. Akış sitometrisi ile hücre yüzey belirteçlerinin ekspresyonu

  1. Geçiş 5 (P5) hücrelerini% 0.25 tripsin ile ayırın, hücreleri hücre boyama tamponu ile yıkayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Peletleri hücre boyama tamponu ile her biri 100 μL'ye kadar yeniden süspanse edin.
  2. Her tüpü etiketleyin ve Allofikosiyanin (APC), floresein izotiyosiyanat (FITC) veya fikoeritrin (PE) ile konjuge edilmiş uygun miktarlarda antikor ekleyin: CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE üreticinin talimatlarını izleyerek21. Karanlıkta oda sıcaklığında 15-20 dakika inkübe edin.
  3. Lekeli hücreleri 300 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı bir pipetle aspire edin ve hücre boyama tamponu ile bir kez yıkayın.
  4. Hücrelerin santrifüjlenmesini ve yeniden süspansiyonunu 300 μL hücre boyama tamponu ile tekrarlayın.
  5. Hücreleri akış sitometresinden geçirin ve antikor lekeli hücreleri üreticinin talimatlarına göre analiz edin.

5. Hücre sayımı yöntemi ile hücre büyüme eğrisinin belirlenmesi

  1. Bir insan MSC kültür ortamında seyrelterek iki yöntem kullanarak tek hücreli bir P5 hücresi süspansiyonu hazırlayın.
  2. 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 8.000 hücre tohumlayın ve her yöntemden toplam 21 kuyu tohumlanır.
    NOT: Tohumlamadan önce hücreleri pipetlerle üfleyerek ve emerek nazikçe karıştırın.
  3. 24 saatlik tohumlamadan sonra hücreleri üç kuyudan hasat edin. Ortalama değeri hesaplamak için bir hemositometre kullanarak hücre sayımı yapın.
    NOT: Hücre sayımından önce plakayı sallayın. Hücre agregatlarının oluşumunu önlemek için çalkalama süresi uzatılabilir.
  4. Toplam 7 gün boyunca her 24 saatte bir hücre sayımını tekrarlayın. X ekseninde zaman (d) ve Y ekseninde hücre sayısı (x104/mL) kullanarak bir büyüme eğrisi çizin.

Sonuçlar

UC-MSC'lerin toplanması ve kültürlenmesine ilişkin prosedürler ve bunların müteakip analizleri Şekil 1'de özetlenmiştir. UC, benzersiz yöntem kullanılarak düzgün bir şekilde birkaç bölüme ayrıldı; ana prosedürlerin spesifik çalışma şeması Şekil 2'de gösterilmektedir. Eksplant kültürlerinden elde edilen hücrelerin büyümesi rutin olarak izlendi ve kaydedildi. Yapışık iğ şeklindeki hücreler, eksplantların kültürlenmesinden yaklaşık 4 gün sonra gözlemlendi ve giderek bir girdap şekline girdi. Bu hücreler ayrıca P0 olarak tanımlandı ve proliferasyon ve paslaşma sırasında tek tip boyut ve morfolojiyi korurken sonraki geçiş için çoğalmaya devam etti. Konvansiyonel ve güncel yöntemler, hücre büyüklüğü ve morfolojisi açısından ihmal edilebilir farklılıklar göstermiştir (Şekil 3).

Konvansiyonel diseksiyon yöntemi, WJ'nin kan damarlarından ve ÜK'nin iç epitelinden kazınmasını içerir. WJ verimi, ağırlık ayarlaması ile iki yöntem arasında önemli bir farkı temsil etti. WJ verimi, 2 cm'lik kordondaki WJ'nin ağırlık yüzdesi ölçülerek hesaplanabilir (2,4 g ± 0,2 g). Mevcut ve geleneksel yöntemler arasındaki WJ verim oranının karşılaştırılması, yeni yaklaşım kullanılarak WJ veriminde önemli bir artış olduğunu göstermiştir (Şekil 4A). Her iki yöntemle hasat edilen WJ-MSC'lerin toplam miktarını aynı anda UC'nin eşdeğer ağırlığından sayarak yapılan daha ileri analiz, artan geçiş sayıları ile hücre miktarında belirgin bir boşluk gösterdi (Şekil 4B). Büyüme eğrisi, yeni yöntemde MSC'lerin proliferasyon hızının, 2 gün sonra aynı aşılama yoğunluğu altında geleneksel yönteme göre anlamlı derecede yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 4C). Bu deneyler, aynı malzemenin verimli bir şekilde tedarik edilmesini sağlamak için verimli bir yol sağlayan mevcut yöntemin avantajlarını göstermektedir.

Uluslararası Hücre ve Gen Terapisi Derneği (ISCT) kılavuzunun MSC'lerin tanımlanması için minimum kriterlerini takiben, MSC'lerin immünofenotipi CD105, CD44, CD90, CD73'ün pozitif ekspresyonunu gösterirken (% 95'ten fazla), CD45, CD19, CD34, CD11b ve HLA-DR yoktur (% 2'den az)22. WJ'den türetilen MSC'ler kantitatif akış sitometrisi ile araştırıldı (Şekil 5); Her iki yöntemle izole edilen hücreler, yüzey antijenleri CD105, CD44, CD90 ve CD73 için oldukça pozitifti (tümü% 99'un üzerinde), yüzey molekülleri CD45, CD19, CD34, CD11b ve HLA-DR'nin ekspresyonu ile tespit edilebilir seviyelerin altında ifade edildi (veriler gösterilmemiştir). Hücre yüzeyi belirteçlerinin sonuçlarına dayanarak, yapışık hücreler hassas bir şekilde MSC'ler olarak kabul edilebilir ve bunların tanımlanması ve saflığı sağlanabilir.

figure-results-1
Şekil 1: WJ-MSC'lerin göbek kordonundan diseksiyonu ve izolasyonunun şematik gösterimi.

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

Tartışma

MSC'ler, rejeneratif tıp için derin etkileri olan dinamik bir araştırma alanını temsil etmektedir22. Eşsiz özellikleri, onları bilimsel araştırmalar için bir odak noktası haline getirir ve çok çeşitli hastalık ve yaralanmaların tedavisinde devrim yaratma potansiyeline sahiptir7. WJ-MSC'ler, intervasküler ve amniyotik epitel23 arasında yer alan UC içindeki jelatinimsi bağ dokusundan elde edilebilen MSC'lerin farklı bir alt kümesidir. MSC'lerin klinik uygulaması, yeterli hücre sayısına ulaşmada yatmaktadır24. Bununla birlikte, geçiş sayısı arttıkça, hücreler belirli bir derecede yaşlanma fenomeni göstermeye başladı ve MSC'lerin proliferatif kapasitesi P524'ten sonra yavaş yavaş azaldı. Bu nedenle, MSC verimini artırmak için yöntemlerin optimize edilmesi zorunludur.

WJ-MSC'leri izole etmenin en etkili yolu, bütünlüğünü koruyarak tüm WJ'yi incelemektir6. Araştırmalar, göbek kordonu sınır bölgelerinden gelen bu sınır hücrelerinin, intervasküler WJ-MSC'lerden daha yüksek bir göç özelliğine ve daha yüksek bir proliferasyon hızına sahip olduğunu göstermektedir23. Bununla birlikte, WJ'yi diseksiyon için bölgeler ve yöntemler standartlaştırılmamıştır ve WJ-MSC'ler içindeki kök hücre popülasyonlarının, bölümler3 arasında net histolojik sınırların olmaması nedeniyle aynı nitelikleri paylaşıp paylaşmadığı belirsizliğini korumaktadır.

Önceki çalışmalar, göbek kordonunun çeşitli bölmelerinden türetilen WJ-MSC'lerin özelliklerinde önemli farklılıklar olduğunu ve amniyotik yüzeye yakın bulunan hücrelerin gelişmiş proliferatif yetenek sergilediğini göstermiştir3. UC'yi diseksiyon ve WJ-MSC'leri izole etmek için mevcut benzersiz yöntem, hem astar WJ kaybını hem de hücre hasarını azaltmayı amaçlamaktadır, bu da hücre verimini ve canlılığını artırır. Bu protokol, UC'nin neredeyse bozulmamış WJ'ye işlenmesini kolaylaştıran bir yöntemi göstermektedir. Protokolün birincil basamağı, epitel tabakasının soyulması ve künt diseksiyon yoluyla çıkarılmasını içerir. İnovasyon adımı, epitel tabakasını sivrisinek kıskaçları ile uzunlamasına soymaktır. Bu yaklaşım, makas25 ile konvansiyonel keskin diseksiyonun neden olduğu bitişik hücre hasarını azaltmada etkilidir.

Damarın endotelyumu kırılgandır ve kurtulması zordur. Amniyotik epitel göbek damarından çıkarıldıktan sonra, göbek kordonu endotelyumu ortaya çıkarmak için damar boyunca çevrilir. WJ tarafından oluşturulan iç gerilim daha sonra damarın endotelini soymak için kullanılır, böylece sonraki hücre kültürü işlemleri sırasında insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler) girişiminden kaynaklanan etkileşimi en aza indirir.

Eksplant kültür yöntemi, mevcut diğer yöntemlere kıyasla daha yüksek verime sahip olduğu için benimsenmiştir18. Bağlanmamış hücreler, insan MSC kültür ortamının değişimi yoluyla kademeli olarak uzaklaştırılacak ve bu da hücrelerin kaybına neden olacaktır26. Plastiğe yapışmayan eksplantlar, önceki deneyimlerde hücre büyümesini engelleyebilir. İnkübatörün iç ve dış sıcaklıkları arasındaki değişiklikler nedeniyle dokudan çıkan su buharının etkisinin dikkate alınması gerekir. Petri kabının kuru durumunu korumak için, kapak altta olacak şekilde inkübasyon sırasında çanağı 30 dakika boyunca ters çevirmek için yenilikçi bir adım uygulandı. Bir çanağın bu şekilde ters çevrilmesi, doku ile Petri kabının yüzeyi arasındaki temasta su buharının yoğunlaşmasını önledi ve bu da hücre büyümesini iyileştirmek için eksozomların plastik yüzeye daha iyi bağlanmasına izin verdi.

Mevcut yöntem, elde edilen WJ'nin ağırlık yüzdesi ve kültürlenmiş ve pasajlı MSC'lerin miktarı ölçülerek geleneksel diseksiyon yöntemi ile karşılaştırılır; yeni yöntemle önemli ölçüde daha yüksek bir WJ verimi ve daha fazla miktarda hasat edilen MSC gösterildi. Bu bölmelerin her birinden kök hücre popülasyonlarını izole etmek için herhangi bir protokol, diğer bölmelerden hücre kontaminasyonu riski taşısa da, sonuçlar, mezenkimal belirteçlerin yüksek ekspresyonu (tümü% 99'un üzerinde) ve hematopoietik ve endotel belirteçlerinin minimal tespiti (veriler gösterilmemiştir) ile karakterize edilen izole MSC'lerin saflığını göstermiştir. Sonuçlar, WJ-MSC'lerin saf olduğunu ve ISCT yönergeleri21 ile uyumlu olarak çeşitli uygulamalar için uygun olduğunu kanıtladı. Kültürlenmiş MSC'ler kısa bir süre içinde fibroblast benzeri hücreler sergiledi ve hücreler giderek daha fazla girdap şeklinde hücrelere dönüştü ve büyük proliferatif potansiyel ve göç etme özellikleri gösterdi.

Bu çalışmada özetlenen protokol çeşitli eksiklikler sunmaktadır. İlk olarak, amniyotik epitelin ayrılması ile gösterildiği gibi, operatör için gereken yeterlilik yüksektir. Bu, araştırma veya klinik uygulamalarda yaygın olarak benimsenmesini engelleyebilir. İkinci olarak, protokol büyük ölçüde diseksiyon sırasında manuel manipülasyona dayanır ve bu da deneyler veya operatörler arasında tutarsızlığa neden olabilir. Diseksiyon işleminin standardizasyonu, protokolün güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini artıracaktır25. Ayrıca, geleneksel yöntemle başka karşılaştırmaların olmaması cevapsız sorular bırakmaktadır.

Sonuç olarak, mevcut yöntem, sağlam WJ'yi amniyotik epitel ve damarlardan ayırmak için etkili bir yol sağlar ve perivasküler ve subamniyotik Wharton jölesini içeren bir hasatla sonuçlanır. Ters çevrilmiş bir inkübasyon adımının tanıtılması, MSC bağlantısının iyileştirilmesine daha fazla katkıda bulunur. Geleneksel yöntemlerle karşılaştırmalı analiz, önerilen protokolün daha yüksek bir WJ verimi elde etme ve daha iyi çoğalma kabiliyetine sahip daha fazla MSC'nin hasat edilmesi açısından önemli avantajlarını göstermektedir. Bulgular ayrıca, hücre yüzeyi işaretleyici ifadesinin belirgin bir modeli ile gösterildiği gibi, izole edilmiş MSC'lerin saflığını da vurgulamaktadır. Bu yöntem, MSC verimini ve çoğalma kabiliyetini artırabilir ve MSC üretimini artırmak için uygun maliyetli bir yöntem sunar.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82172107), Çin'in Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), Shenzhen Tıbbi Araştırma Fonu (SMRF. D2301015), Shenzhen Belediye Bilim ve Teknoloji İnovasyon Komitesi (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) ve Longgang Bölgesi Ekonomik ve Teknolojik Kalkınma Özel Fonu (LGKCYLWS2022007).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
APC anti-insan CD44 Antikoru Biyoefsane 
24 oyuklu hücre kültürü plakalarıThermo Scientific142475
APC anti-insan CD73 (Ekto-5'-nükleotidaz) Antikoru Biyoefsane 
APC Fare IgG1, & İzotip Ctrl (FC) AntikorBiyoefsanesi 
OtoklavHIRAYAMAHVE-50
Otomatik Hücre SayacıCountstarFL-CD
BAMBANKER Kriyoprezervasyon SolüsyonuWako302-14681
Hücre Boyama TamponuBiolegend 
Santrifüj MakinesiEppendorf5424R
Temiz TezgahŞangay ZhiChengC1112B
CO2 İnkübatörThermo ScientificHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
Elektro-termostatik Şok FırınŞanghay JingHongDHG-9423A
FITC anti-insan CD105 Antikoru Biyoefsane 
FITC anti-insan CD90 (Thy1) Antikoru Biyoefsane 
FITC Fare IgG1, & İzotip Ctrl (FC) AntikorBiyoefsanesi 400110
Akış SitometrisiBeckmanCytoFLEX
hemositometreSuperior Marienfeld640410
Hücre İçi Boyama Geçirgenleştirme Yıkama Tamponu (10 kez;) Biyoefsane 
Ters Biyolojik MikroskopZEISSAxio Vert. A1
Sıvı Azot Depolama TankıThermo ScientificCY50935-70
Normal salin (NS)MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE anti-insan CD11b AntikorBiolegend 
PE anti-insan CD19 Antikoru Biyoefsane 
PE anti-insan CD34 AntikorBiyoefsanesi 
PE anti-insan CD45 AntikorBiyoefsanesi 368510
PE anti-insan HLA-DR Antikoru Biyoefsane 
PE Fare IgG1, κ İzotip Ctrl (FC) AntikorBiyoefsanesi 
PE Fare IgG2a, κ İzotip Ctrl (FC) AntikorBiyoefsanesi 
Hassas Elektronik TeraziSatoriusPRACTUM313-1CN
Kar Tanesi Buz MakinesiZIEGRAZBE 30-10
steril 50 mL plastik tüpGreniner227270
Termostatik Su BanyosuŞangay YiHengHWS12
Tripsin 1:250SolarbioT8150
UltraGRO-GelişmişHelios 
Ultra Saf ve Saf Su Arıtma SistemiMilli-QMilli-Q Referans Kseno
İçermeyen İnsan MSC Kültür OrtamıFUKOKU 
338806344006400122420201323204328108421002393112392506343606307606400114400214HPCFDCGL50T2011301

Kaynaklar

  1. Abbaszadeh, H., et al. Regenerative potential of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: A new horizon of stem cell therapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9230-9240 (2020).
  2. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Curr Res Transl Med. 68 (1), 5-16 (2020).
  3. Kim, D. -W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: Phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  4. Drobiova, H., et al. Wharton's jelly mesenchymal stem cells: A concise review of their secretome and prospective clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1211217(2023).
  5. Joerger-Messerli, M. S., et al. Mesenchymal stem cells from Wharton's jelly and amniotic fluid. Best Pract Res Cl Ob. 31, 30-44 (2016).
  6. Pera, M., Subramanian, A., Fong, C. -Y., Biswas, A., Bongso, A. Comparative characterization of cells from the various compartments of the human umbilical cord shows that the Wharton's jelly compartment provides the best source of clinically utilizable mesenchymal stem cells. Plos One. 10 (6), 0127992(2015).
  7. Petrenko, Y., et al. A comparative analysis of multipotent mesenchymal stromal cells derived from different sources, with a focus on neuroregenerative potential. Sci Rep. 10 (1), 4290(2020).
  8. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise review: Wharton's jelly: The rich, but enigmatic, source of mesenchymal stromal cells. Stem Cells Transl Med. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  9. Pan, Y., Wu, W., Jiang, X., Liu, Y. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cardiovascular and cerebrovascular diseases: From mechanisms to therapy. Biomed Pharmacother. 163, 114817(2023).
  10. Elshaer, S. L., Bahram, S. H., Rajashekar, P., Gangaraju, R., El-Remessy, A. B. Modulation of mesenchymal stem cells for enhanced therapeutic utility in ischemic vascular diseases. Int J Mol Sci. 23 (1), 249(2021).
  11. Wang, R., et al. Stem cell therapy for Crohn's disease: Systematic review and meta-analysis of preclinical and clinical studies. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 463(2021).
  12. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  13. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: Potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  14. Saleh, M., Fotook Kiaei, S. Z., Kavianpour, M. Application of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells in patients with pulmonary fibrosis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 71(2022).
  15. Varaa, N., Azandeh, S., Khodabandeh, Z., Gharravi, A. M. Wharton's jelly mesenchymal stem cell: Various protocols for isolation and differentiation of hepatocyte-like cells; narrative review. Iran J Med Sci. 44 (6), 437-448 (2019).
  16. Hassan, G., Kasem, I., Soukkarieh, C., Aljamali, M. A simple method to isolate and expand human umbilical cord derived mesenchymal stem cells: Using explant method and umbilical cord blood serum. Int J Stem Cells. 10 (2), 184-192 (2017).
  17. Naeem, A., et al. A comparison of isolation and culture protocols for human amniotic mesenchymal stem cells. Cell Cycle. 21 (15), 1543-1556 (2022).
  18. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726(2013).
  19. Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (CFCs). J Vis Exp. (32), e1525(2009).
  20. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. J Vis Exp. (122), e55224(2017).
  21. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2173-2185 (2017).
  23. Sypecka, M., Bzinkowska, A., Sulejczak, D., Dabrowski, F., Sarnowska, A. Evaluation of the optimal manufacturing protocols and therapeutic properties of mesenchymal stem/stromal cells derived from Wharton's jelly. Int J Mol Sci. 24 (1), 652(2022).
  24. Binato, R., et al. Stability of human mesenchymal stem cells during in vitro culture: Considerations for cell therapy. Cell Prolif. 46 (1), 10-22 (2012).
  25. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  26. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Prolif. 50 (2), 12334(2017).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Wharton J lesiK k H cre zolasyonuK nt DiseksiyonH cre Canl lEksplant K lt rH cre Y zey Belirte leriRejeneratif T pOrganoid Transplantasyonu

İlgili makaleler