Yöntem makalesi

Kemirgen Modellerinde Oral Gavaja Alternatif Bir Yöntem Olarak Mikropipet Kılavuzluğunda İlaç Uygulamasının Kullanımı

3.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66836

⸱

26 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Molecular and Comparative Pathobiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, 4Department of Urology, Johns Hopkins University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Burada, mikropipet kılavuzluğunda ilaç uygulamasını (MDA), araştırma hayvanını minimum stres ve rahatsızlıkla tedavileri kolayca yutmaya teşvik eden oral gavaja alternatif bir yöntem olarak tanımlıyoruz.

Özet

Bir şırıngaya bağlı bir kanül kullanılarak yapılan oral gavaj (OG), araştırma hayvanlarının midesine bileşiklerin hassas dozunu sağlamak için kullanılan en yaygın yöntemlerden biridir. Ne yazık ki, bu yöntem hem operatör hem de araştırma hayvanı için zorluklarla birlikte gelir. Çalışmalar, OG'nin özofajit, yemek borusu perforasyonu ve yanlışlıkla trakeal ilaç uygulaması gibi komplikasyonlara yol açabileceğini göstermiştir. Ek olarak, OG, artmış plazma ve fekal kortikosteron seviyeleri (stres nedeniyle), değişmiş kan basıncı ve artmış kalp atış hızı ile ilişkilidir, bu da çalışma sonuçlarını olumsuz yönde etkileyebilir veya önyargılı olabilir. Mikropipet kılavuzluğunda ilaç uygulaması (MDA) olarak adlandırılan daha önce geliştirilmiş alternatif bir yöntem, hayvanı minimal invaziv bir şekilde tedavileri kolayca tüketmeye teşvik eder. Burada, MDA tekniğinin farklı araçlarda yeniden oluşturulan tedavilerle kullanımına ilişkin örnekler sunuyoruz ve çeşitli tedavilerin birden fazla farklı fare suşuna etkili bir şekilde uygulandığını gösteriyoruz. Ayrıca, MDA'nın ilaç uygulamasının zamanlamasını ve invazivliğini azaltan ve çekirdek bağırsak mikrobiyal türlerinin kantitatif analizi ile değerlendirildiği gibi bağırsak mikrobiyom bileşimini etkilemeyen bir teknik olduğunu gösteriyoruz. Genel olarak, MDA, OG'ye daha az stresli ve etkili bir alternatif sunabilir.

Giriş

Kemirgen modellerine ilaç uygulaması yaygın olarak, çözeltiyi içeren bir şırıngaya bağlı bir kanül kullanılarak doğrudan mideye sıvı bir preparatın uygulanmasından oluşan oral gavaj (OG) yoluyla gerçekleştirilir. Bu teknik, tedavinin hayvana tutarlı ve kesin bir şekilde dozlanmasına neden olur, ancak aynı zamanda birçok dezavantaj da taşır. OG, insan diyeti maruziyetlerini yeterince modellemediği için incelenmiştir 1,2. Ayrıca, OG, üst sindirim sisteminde kasıtsız yaralanmalar (yemek borusu ve mide delinmesi), uygulanan tedavinin aspirasyonu ve solunum yolu lezyonları riskini artırır3. OG ayrıca rahatsızlık4, artmış kan basıncı ve kalp atış hızı5, ayrıca stres 6,7 ve bazen de hayvan tarafından gavaj toleransının azalması nedeniyle ölüm8 ile ilişkilidir. Bu fizyolojik değişiklikler deneysel sonuçlara müdahale edebilir veya karıştırabilir; Bu nedenle, bu yan etkilerden kaçınmak için yeni prosedürler araştırılmıştır. Çalışmalar, jelatinin bir ilaç aracıolarak kullanılması 9, ağızdan çözünen şeritler (ODS)10, sükroz kaplı gavaj iğneleri11, esnek besleme tüpleri, buğday kurabiyeleri12, bal13 ve fıstık ezmesi peletleri14 gibi OG'ye alternatif prosedürler kullanmıştır. Ne yazık ki, OG tekniğinde yapılan bu modifikasyonlarda, suda çözünmeyen ilaçlarla uyumsuzluk, tedavi için daha uzun hazırlık süresi15, ilaç lezzeti ve stabilitesi15 ve hayvanın gıdaya aşina olması dahil olmak üzere sınırlamalar vardır. Ayrıca, hayvanlar ad lib beslediğinde daha az hassas dozlama potansiyeli vardır.

Scarborough ve ark.7 daha önce farelerde mikropipet kılavuzluğunda ilaç uygulaması (MDA) olarak adlandırdıkları alternatif bir oral tedavi yöntemi geliştirdiler. Bu uygulama yöntemi, farmakolojik maddeler için bir araç olarak tatlandırılmış yoğunlaştırılmış bir süt çözeltisine dayanır ve çalışma hayvanlarını, çözeltiyi tek kanallı bir pipet ve pipet ucu ile dağıtarak hazırlanan aracı ve/veya ilaç çözeltilerini kolayca tüketmeye motive eder. Bu tekniği uygulamak için, kemirgenler, işlem sürelerini kısaltmak ve çalışma hayvanının pipet ucundan4 içmeye aşina olmasını sağlamak için bir eğitim seansına (en az 2 gün) tabi tutulur. Scarborough ve ark.7 ve Schalbetter ve ark.16 tarafından yapılan ilk doğrulama çalışmaları, MDA prosedürünün geleneksel oral gavaj yöntemlerine göre uygulanması kolay, uygun maliyetli, minimal invaziv ve hayvanlar için daha az stresli olduğunu göstermektedir. Scarborough ve ark. nörogelişimsel bozukluklarınmaternal immün aktivasyonunun (MIA) bir fare modelinde MDA tekniğinin kullanımını tanıttı 7. Bu çalışma, MDA kullanılarak antipsikotik ilaç risperidon ile tedavi edilen farelerin farmakokinetik profillerinin OG kullanımı ile karşılaştırılabilir olduğunu göstermiştir. Ayrıca, MDA, farelerde kortikosteron (bir stres hormonu) seviyelerinde bir artışa neden olmadı ve MDA tekniği kullanılarak risperidon ile kronik tedavi, MIA'nın neden olduğu sosyal etkileşim eksikliklerinde ve amfetamin aşırı duyarlılığında doza bağlı bir azalmaya yol açtı7. Ek çalışmalar, hem fare17 hem de sıçan18 modellerinde MDA'nın OG'ye karşı etkinliğini araştırmıştır. MDA ayrıca intraperitoneal enjeksiyon ile karşılaştırılmıştır ve farelere klozapin-N-oksitverilmesinde etkili olduğu gösterilmiştir 16. MDA'nın hayvan stresini ve terapötik etkinliği azaltmadaki bildirilen başarısı nedeniyle, şimdi ek murin modelleri kullanarak MDA tekniğini etkili bir ilaç verme yöntemi olarak daha fazla araştırmayı amaçlıyoruz. Burada, bağışıklığı yetkinliğe sahip FVB/NJ ve C57BL/6J suşları ve bağışıklığı baskılanmış NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) suşu dahil olmak üzere farklı fare suşlarını canlı bakteriler, suda çözünmeyen çözeltilerde (mısır yağı) verilen deneysel bileşikler ve araç kontrolleri dahil olmak üzere farklı oral tedavilerle tedavi etmek için MDA yönteminin uygulanmasını açıklıyoruz. Serum ve dışkıdaki farklı tedavilerin aktivitesini ve varlığını değerlendirdik ve MDA yöntemiyle ilişkili olarak çekirdek bağırsak mikrobiyotasındaki değişiklikleri değerlendirdik.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, kurumsal yönergelere uygun olarak ve Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) onaylı M021M197 ve M023M195 protokolleri kapsamında gerçekleştirilmiştir. Kullanılan fare suşları (erkek fareler, 7 haftalık) Malzeme Tablosunda açıklanmıştır. Erkek farelerin kullanımı, devam eden prostat kanseri çalışmalarında kullanılmalarından kaynaklanıyordu. MDA yönteminin daha önce dişi farelerde de etkili olduğu gösterilmiştir 7,17. Fareler kendi kafeslerine / tedavi gruplarına randomize edildi. Fareler kafeslerde ve belirli bir sırayla tedavi edildi. Tedavileri uygulayan deneyci, tedavi grubuna kör edildi. Bir fareye atanan numara, fareye tedavi edilme sırasına değil, kimliklerine atıfta bulundu. Veriler, çalışmanın zaman çizelgesi boyunca toplandı ve herhangi bir önyargıyı önlemek için sonunda analiz edildi. Deneysel tahliller, tüm veriler toplanana kadar tedavi grubuna kör edildi.

NOT: Bu protokol Scarborough ve ark.7'den değiştirilmiştir.

1. Tedavilerin hazırlanması

  1. 3:10 oranında süt-su kullanarak şekerli yoğunlaştırılmış süt (malzemeler: süt ve şeker) ve moleküler biyoloji sınıfı sudan oluşan bir çözelti hazırlayın. Sütün viskozitesi nedeniyle tatlandırılmış yoğunlaştırılmış sütü 15 mL'lik konik bir tüp kullanarak ölçün.
  2. 50 mL'lik bir konik tüp kullanarak, moleküler biyoloji dereceli suyu şekerli yoğunlaştırılmış sütle karıştırın ve her seferinde 5 mL suyu sütle yavaşça karıştırın.
    NOT: Bu adım, bir biyogüvenlik kabini kullanılarak steril koşullar altında gerçekleştirilir.
  3. Süt çözeltisinin alikotlarını hazırlayın (500 μL alikotlar olarak saklanır) ve alikotları, ilgilenilen muamele ile birleştirilene kadar 4 ° C'de saklayın.
  4. Tatlandırılmış yoğunlaştırılmış süt/su çözeltisi ile birleştirmeden önce, ilgili araçlarda hayvanın vücut ağırlığına göre doğru konsantrasyonda tedavileri yeniden askıya alın.

2. MDA eğitim oturumu

NOT: Bu bölümde fare modelleri açıklanmaktadır; bununla birlikte, MDA tekniği, daha büyük kemirgen modelleri için daha büyük hacimler/pipet uçları ile gerektiği gibi ölçeklendirilebilir.

  1. İSTEĞE BAĞLI: Bir elinizle boynunun tırnağını tutarak çalışma hayvanını nazikçe tutun.
  2. Çalışma hayvanına, tek kanallı bir pipet ve ağza yönlendirilen 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak yalnızca 100 μL şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisi (deneysel tedavi eklenmeden) sunun.
  3. Hayvanın ağzını kaçırmamak için süt/su solüsyonunu yavaşça dağıtın. Hayvanın süt çözeltisini 5-15 s arasında kolayca tükettiğinden emin olun.
    NOT: Bu eğitim, en az 2 ardışık gün (günde bir eğitim seansı) boyunca gerçekleşir ve uygulanan ses seviyesinde herhangi bir değişiklik yapılmaz. MDA eğitim seansları için tırmıklama ile nazik bir kısıtlama gerekliydi. Scarborough ve ark.7 , MDA eğitiminin ilk gününde hayvanın tam olarak kısıtlanmasını ve ardından ikinci gün kuyruktan tutulmasını önermektedir. Kısıtlama yöntemi, daha büyük kemirgen modelleri için farklılık gösterebilir. Buna karşılık, Vanhecke ve ark.17 , eğitim sırasında fareleri sadece kuyruğundan hafifçe tuttu.

3. MDA yöntemini kullanarak fare tedavileri

  1. Çalışma işlemini şekerli yoğunlaştırılmış süt/su çözeltisi ile birleştirin (aşağıdaki doğrulama deneyleri ile örneklere bakın [bölüm 4 ve bölüm 5]).
  2. İSTEĞE BAĞLI: Bir elinizle boynunun tırnağını tutarak çalışma hayvanını nazikçe tutun.
    NOT: Scarborough ve ark.7 , farelerin artık eğitim süresinin ötesinde kısıtlamaya ihtiyaç duymadığını ve pipet ucundan kolayca içeceklerini bildirmektedir. Buna karşılık, Vanhecke ve ark.17 , hafif tat isteksizliğine sahip olabilecek bazı tedaviler (örneğin, tamoksifen) için, MDA'nın en iyi şekilde, tüm tedaviler sırasında fareleri tırmık yoluyla nazikçe kısıtlayarak gerçekleştirildiğini bildirmektedir. Bu çalışma aynı zamanda hayvanı hafif bir tırnekle sırt üstü yatırmanın tedavi tüketiminin süresini ve etkinliğini artırdığını da belirlemiştir.
  3. Eğitim seansları sırasında yapıldığı gibi, tek kanallı bir pipet ve hayvanın ağzına yönlendirilen 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak 100 μL'lik tedavi uygulayın.
  4. Bir seferde tek bir hayvanı tedavi edin.
  5. Tedaviden sonra her hayvanı kendi kafesine geri koyun.
    NOT: MDA yöntemi kullanılarak yapılan tedaviler günlük veya tekrarlanan bir şekilde verilebilir 7,17.

4. Doğrulama deneyi #1 - MDA kullanarak bağırsak bakterilerinin farelere oral yoldan verilmesi

NOT: Bu bölüm, farelerde bağırsak kolonizasyon çalışmaları için canlı bakterileri ağızdan vermek için MDA yönteminin kullanımını açıklar. Bu temsili pilot deneyde, gram pozitif bakteri Clostridium scindens C57BL / 6J farelerine verilir. Fareler, MDA ile bakteri aşılamasından önce içme suyunda art arda iki gün boyunca antibiyotiklerle (sefoxitin) tedavi edildi.

  1. Bakteri kültürü
    1. Kültür C. scindens, 500 μL bakteriyi 7 mL'lik bir RCB tüpüne aşılamak için donmuş bir gliserol stoğu kullanarak güçlendirilmiş klostridyal et suyunda (RCB) ATCC 35704'ü suuş eder. Gece boyunca 37 °C'de anaerobik olarak büyür.
    2. Yeni bir RCB tüpünü aşılamak için gece boyunca 500 μL bakteri kültürü kullanın ve 24 saat anaerobik olarak inkübe edin. Bu tüpü anaerobik odadan çıkarın ve MDA için bakteri tedavisini hazırlamak için kullanın. Mililitre başına koloni oluşturan birimleri (CFU/mL) hesaplamak için aynı tüpü kullanın.
  2. C. scindens CFU/mL'nin hesaplanması
    1. 7 mL RCB ortamına aşılanmış 3.5 mL kültür kullanarak C. scindens kültürünün 1: 3 oranında bir seyreltmesi oluşturun. -80 °C'de saklanan %20 1 mL gliserol stoğu (1:1) yapmak için bu seyreltmenin bir örneğini kullanın.
    2. Güçlendirilmiş clostridial agar (RCA) plakaları üzerine 1: 3 seyreltmenin 100 μL'si. Daha sonra sonraki seri seyreltmeleri yapmak için ilk seyreltmeyi kullanın ve toplam üç kez daha plakalayın.
    3. RCA plakalarının inkübe edilmesinden sonra, kolonileri sayın ve CFU'yu hesaplayın. Seyreltilmiş ve orijinal numunelerdeki bakteri hücrelerinin konsantrasyonunu hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
      Seyreltilmiş numunedeki CFU (hücreler/mL) = (RCA plakasında sayılan koloni sayısı)/(mL cinsinden RCA plakasına eklenen seyreltilmiş numune miktarı)
      Orijinal numunede CFU (hücreler/mL) = (seyreltilmiş numunede CFU)/(RCA plakasının seyreltilmesi)
  3. MDA için C. scindens tedavisinin hazırlanması
    1. 50 μL'lik bir çözeltiyi birleştirin (bu örnekte 1.265 x 106 CFU/mL) C. scindens + 50 μL şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisi.
      NOT: Spesifik bir CFU'ya ihtiyaç duyulursa, 600 nm'de optik yoğunluk (OD) ölçümleriyle standart bir eğri oluşturmak gibi alternatif bir bakteri hücresi niceleme yöntemi kullanılabilir.
  4. MDA kullanılarak C. scindens ile farelerin oral tedavisi
    1. 1-3. günlerde, fareleri bölüm 2'de (MDA eğitim oturumu) açıklandığı gibi süt çözeltisiyle tanıştırın.
    2. 4. günde, 100 μL C. scindens + süt çözeltisi veya PBS (kontrol) + süt çözeltisi MDA yoluyla C57BL / 6J farelerine uygulayın. Çalışma süresince fareleri bir kez tedavi edin.
  5. Dışkı örneği toplama
    1. Fareyi hafifçe tırnarak tutun ve dışkı topağını boşaltmalarını bekleyin. Dışkı peletlerini doğrudan rektumdan steril bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Numuneleri kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
  6. C. scindens kantitatif PCR (qPCR)
    1. Daha önce yayınlanmış bir protokol19,20 kullanarak fekal DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
    2. Yüksek hassasiyetli algılama için bir DNA florometresi kullanarak DNA konsantrasyonunu belirleyin. DNA örneklerini 10 ng/μL'ye normalleştirin ve kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.
    3. Aşağıdakilerin bolluğunu araştırmak için qPCR kullanın: (i) C. scindens suşu ATCC 35704'ün desA genine karşı korunmuş primerler kullanan C. scindens bakterileri, (ii) daha önce tarif edildiği gibi bakteriyel 16S rRNA geninin V6 hiperdeğişken bölgesine karşı tasarlanmış primerler kullanan toplam bakteri20,21.
      NOT: Kullanılan qPCR koşulları ve primerler Tablo 1'de listelenmiştir. desA + bakterilerinin kopyalarını tahmin etmek için C. scindens suşu ATCC 35704 DNA'sını kullanan standart bir eğri kullanıldı.

5. Doğrulama deneyi #2 - MDA kullanarak farelere deneysel ilaç verilmesi

NOT: Bu bölüm, farelere deneysel bir bileşik vermek için MDA yönteminin kullanımını açıklar. Bu temsili pilot deneyde, soya metaboliti equol (S-equol) NSG ve FVB / NJ farelerine verilir.

  1. S-equol tedavisinin hazırlanması
    NOT: Hem S-equol hem de dimetil sülfoksit (DMSO) aliquoted edilir ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklanır.
    1. S-equol'u mısır yağı (% 90) ile birlikte DMSO'da sulandırın. Aliquoted S-equol'u mısır yağında (220 μL) 480 μL şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisi ile karıştırın. Yağın sütten ayrılmasını önlemek için bu çözeltiyi hayvan odasında birleştirin ve karıştırın.
      NOT: Çözeltinin ayrılması gözlenirse, işlemden önce çözeltiyi karıştırın. Uygulanan S-equol dozu 25 mg / kg / gün'dür. Bu çalışmada kullanılan farelerin hepsi ağırlık olarak benzerdi, bu yüzden aynı dozu aldılar. Tedavinin dozunun, çalışma hayvanı ağırlıklarına bağlı olarak ayarlanması ve çoklu preparatlar haline getirilmesi gerekebilir.
    2. DMSO aracını mısır yağı ile birleştirin (% 90). Aliquoted DMSO'yu mısır yağında (220 μL) 480 μL şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisi ile karıştırın. Yağın sütten ayrılmasını önlemek için bu çözeltiyi hayvan odasında birleştirin ve karıştırın.
      NOT: Çözeltinin ayrılması gözlenirse, işlemden önce çözeltiyi karıştırın.
  2. MDA kullanılarak farelerin S-equol ile oral tedavisi
    1. 1. ve 2. günlerde, fareleri bölüm 2'de (MDA eğitim oturumu) açıklandığı gibi süt çözeltisiyle tanıştırın.
      NOT: Doğrulama deneyi #1 için, Scarborough ve ark. 3 günlük bir alışma süresi öneren Scarborough ve ark. Bu deneyde, daha kısa bir eğitim süresi (2 gün) test edildi ve ilgilenilen tedavilerin uygulanmasını değiştirmediği bulundu.
    2. 3-43. günlerde, fareleri (i) PBS kontrolü, (ii) DMSO aracı veya (iii) S-equol ile tedavi edin, hepsi şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisi ile birleştirilmiştir. Tüm çalışma hayvanlarına tedavilerin homojen bir çözeltisini sağlamak için çözeltinin ana karışımını yapın. Her fareye günde bir kez, haftada 5 gün, toplam 43 gün boyunca toplam 100 μL hacim uygulayın.
  3. Kan alma
    1. Kalp delinmesi yoluyla ötenazi (aşırı dozda karbondioksit) sonrası kan toplayın. Kanı bir mikrotainer serum ayırıcı tüpe aktarın, karıştırın ve daha sonraki işlemlere kadar oda sıcaklığında (RT) saklayın.
    2. 5 dakika boyunca 254 x g'da ayırmayı tamamlamak için kan örneğini santrifüjleyin. Serumu (üst ayırma tabakası) toplayın ve kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.
  4. Tandem kütle spektrometresi (LC/MS/MS) testi ile S-equol sıvı kromatografisi
    1. Bu deney için kullanılan kimyasallar ve reaktifler için Malzeme Tablosu dosyasına bakın.
    2. Kalibrasyon standartları ve kalite kontrolü: DMSO'da 1 mg / mL konsantrasyonlarda S-equol ve dahili standart (rasemik equol-d4) stok çözeltilerini hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.
    3. Farklı konsantrasyonlarda karışık bir çalışma çözeltisi hazırlamak için stok standart çözeltilerini asetonitril:su (50:50) ile seyreltin. 100 ng / mL konsantrasyonda ekstraksiyon çözeltisi olarak etil asetatta iç standardı hazırlayın. Stok ve çalışma solüsyonlarını 4 °C'de saklayın ve günlük, seyreltilmiş veya doğrudan kullanın.
    4. Numune çıkarma
      1. Numuneyi, ekstraksiyon çözeltisi (etil asetat artı dahili standart, bkz. bölüm 5.4.3) ile protein çökeltme ve ardından kuru nitrojen (50 °C) altında süpernatantın santrifüjlenmesi ve buharlaştırılması kullanarak hazırlayın.
      2. Numuneyi 100 μL %50 asetonitril içinde sulandırın ve LC/MS/MS analizi için otomatik numune alma cihazı şişelerine aktarın.
    5. Numune ayırma
      1. C18 sütunu, 2,1x50 mm, 1,7 μm ile ayırma elde edin. Mobil faz A olarak %0.1 formik asit ve asetonitril mobil faz B'de %0.1 formik asit kullanın.
      2. Bir gradyan kullanın ve mobil faz B'yi 0,5 dakika boyunca 0,3 mL/dk akış hızıyla %40'ta tutun. Ardından, akış hızını 1 dakika içinde %100'e yükseltin, orada 2 dakika tutun ve ardından 1 dakika boyunca %40 B'ye dönün.
      3. Negatif modda çalışan elektrosprey iyonizasyonu kullanan bir kütle spektrometrik dedektörü kullanarak kolon çıkış suyunu izleyin. Aşağıdaki çoklu reaksiyon izleme (MRM) geçişlerini izlemek için spektrometreyi programlayın: S-equol için 241 → 119.1 ve dahili standart equol-d245 için 123 → 4.
      4. 5-500 ng/mL kalibrasyon aralıklarını kullanarak 1/x2 ağırlıklandırma fonksiyonuna sahip ikinci dereceden bir denklem kullanarak analizin iç standarda alan oranı zirvesini kullanarak S-equol için kalibrasyon eğrisini hesaplayın.

6. MDA tedavisinin çekirdek bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkisinin ölçülmesi

NOT: Bu bölüm, MDA tedavisinden sonra çekirdek bağırsak mikrobiyota düzeylerini ölçmek için qPCR kullanımını açıklamaktadır.

  1. Adım 4.5.1 ve 4.6.1'de açıklandığı gibi dışkı örneği toplama ve DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
  2. Yüksek hassasiyetli algılama için bir DNA florometresi kullanarak DNA konsantrasyonunu belirleyin. DNA örneklerini 10 ng/μL'ye normalleştirin ve kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.
  3. Bağırsak mikrobiyotası üyelerinin bolluğunu araştırmak için qPCR kullanın: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp. ve (v) daha önce tarif edildiği gibi bakteriyel 16S rRNA geninin V6 hiperdeğişken bölgesine karşı tasarlanmış primerler kullanan toplam bakteri 20,21,22.
    NOT: Kullanılan qPCR koşulları ve primerler Tablo 2'de listelenmiştir.

Sonuçlar

MDA, fare modellerinde bakteri suşlarının oral yoldan verilmesinde kullanılabilir. C57BL / 6J fareleri, MDA eğitim seansına başlamadan önce kommensal mikrobiyal toplulukları temizlemek için 2 gün boyunca antibiyotiklerle (içme suyunda sefoxitin) tedavi edildi. Şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisi, tedavi uygulamasından önce 3 gün boyunca günde bir kez ardışık olarak uygulandı. Fareler, MDA tedavisi uygulaması sırasında hafif bir tırtık ile kısa bir süre kısıtlandı. 4. günde, fareler bir kez PBS (negatif kontrol, n = 4) veya daha önce şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisinde yeniden süspanse edilmiş anaerobik bir C. scindens kültürü (desA + bakteri, n = 4) ile muamele edildi. Tüm fareler genellikle tedavileri saniyeler içinde aldı ve tüm dozu (100 μL) içti. Anaerobik bakterilerin iletimini ve varlığını doğrulamak için, antibiyotik tedavisinden sonra toplanan dışkı örneklerini PBS veya C. scindens tedavisinden 24 saat sonra toplanan dışkı örnekleriyle karşılaştırdık (Şekil 1). Fekal DNA izole edildi, nicelendirildi ve C. scindens ATCC 35704 desA genine özgü primerler kullanılarak qPCR gerçekleştirmek için 10 ng/μL'ye normalize edildi (Tablo 1). Antibiyotikle tedavi edilen farelerin çok az veya hiç desA + bakteri içermediğini gözlemledik. Beklendiği gibi, C. scindens ile tedavi edilen farelerde, PBS kontrol grubundakilerden önemli ölçüde farklı olan, önemli ölçüde daha yüksek miktarda desA + bakteri gözlemledik (p = 0.0286, Şekil 1).

MDA yöntemi kullanılarak deneysel bir bileşiğin (S-equol) verilmesi. NSG (n = 15) ve FVB / NJ (n = 18) fareleri, tedavi uygulamasından iki gün önce şekerli yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisi ile eğitime tabi tutuldu. NSG farelerine, equol üreten bağırsak bakterilerini ve dolayısıyla endojen equol üretimini ortadan kaldırmak için antibiyotik tedavisi (içme suyunda sefoksitin) uygulandı. FVB / NJ fareleri, endojen equol üretimini ortadan kaldırmak için soya içermeyen bir diyetle beslendi. Tüm fareler, tedavileri uygulamak için kısa bir süre hafif tırnağa ile kısıtlandı. Kontrol grubuna mısır yağı ile kombinasyon halinde şekerli yoğunlaştırılmış süt/su çözeltisi, DMSO grubuna (S-equol için araç kontrolü) tatlandırılmış yoğunlaştırılmış süt/su çözeltisi ve mısır yağında DMSO ve equol grubuna tatlandırılmış yoğunlaştırılmış süt/su çözeltisi ve mısır yağında equol verildi. Fareler haftada beş gün MDA tekniği ile toplam 43 gün tedavi edildi. Fareler genellikle tedavileri saniyeler içinde aldı ve tüm dozu (100 μL) içti. Genel olarak, tüm fareler belirli bir günde dozun en az yarısını tüketmiştir (belirli bir günde kısmi doz, ancak bir gün önce veya ertesi gün tam doz). Farelerin hiçbiri çalışma süresince tedaviyi tamamen reddetmedi. Fareleri tırmaladıktan sonra sırt üstü yatırmanın tedavi tüketim süresini iyileştirdiğini ve hayvanın tüm dozu almasını sağladığını gözlemledik.

Dolaşımdaki equol seviyeleri etkili MDA ilaç dağıtımını göstermektedir. Çalışma sonunda ötenaziden sonra NSG farelerinden kan örnekleri alındı ve MDA'nın equol dağıtımının çalışma hayvanlarında dolaşımdaki equol seviyelerine yol açtığını doğruladı. LC / MS / MS testini gerçekleştirmek için equol ile tedavi edilen farelerden birinden yeterli kan elde edemedik. Serum equol seviyeleri, Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Analitik Farmakoloji Ortak Kaynağı'nda LC / MS / MS ile ölçüldü. Kontrol ve DMSO (equol aracı) gruplarında dolaşımdaki equol gözlemlemedik, equol ile tedavi edilen farelerde ise saptanabilir dolaşımdaki equol vardı (Şekil 2). Daha da önemlisi, bu deneyde hayvan kurban etme tarihlerinin ve zamanlarının farklı olması nedeniyle equol ile tedavi edilen farelerde dolaşımdaki equol seviyelerinde bir miktar değişiklik bekliyoruz.

Bağırsak mikrobiyal toplulukları MDA tedavisinden sonra değişmeden kalır. MDA süt çözeltisinin (equol içeren ve içermeyen) bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkisi FVB / NJ fareleri kullanılarak değerlendirildi. Başlangıçta alınan numunelerin (tedavi yok/MDA yok) ve tedavinin başlamasından 7 gün sonra (eğitim günleri dahil MDA başladıktan 9 gün sonra) alınan numunelerin mikrobiyal bileşimini ölçtük. Daha önce tarif edildiği gibi türe özgü qPCR analizi (Şekil 3) ile değerlendirildiği gibi toplam bakteri yükünde veya çekirdek bağırsak mikrobiyotasının (Akkermansia muciniphila, Bifidobacterium spp., Streptococcus salivarius, Lactobacillus spp.) genel mikrobiyal bileşiminde önemli bir değişiklik gözlemlemedik21,22. Bir kafes, başlangıç ve MDA tedavisi sonrası arasında Lactobacillus'ta önemli bir fark gösterdi; ancak, bu bulgu DMSO araç kontrolünde gözlendi ve tüm kafeslerde tutarlı değildi.

figure-results-1
Şekil 1: MDA, fare bağırsağına dışkı qPCR ile ölçülebilen anaerobik bakteriler verir. C57BL / 6J fareleri, içme suyunda art arda iki gün boyunca antibiyotiklerle tedavi edildi. Fareler daha sonra MDA yöntemi kullanılarak anaerobik bakteri C. scindens ile tedavi edildi. Fekal C. scindens (desA +) bakteri yükü, hem antibiyotik tedavisinden sonra hem de MDA tedavisinden 24 saat sonra (PBS veya C. scindens) desA geni için qPCR ile ölçüldü. (A) Antibiyotik tedavisinden sonra ve MDA tedavisinden 24 saat sonra PBS ve C. scindens ile tedavi edilen fareler arasında C. scindens'e özgü desA gen ölçümü gösterilmiştir.  (B) (A)'da MDA sonrası 24 saat için gösterilen verilerin aynısı bir sütun grafiği olarak gösterilir. İstatistiksel anlamlılık parametrik olmayan Mann-Whitney testi kullanılarak belirlendi. (*) p = 0.0286, hata çubukları = SD. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: MDA tekniği ile equol ile tedavi edilen NSG farelerinde dolaşımdaki equol seviyelerinin analizi. Serum equol seviyeleri, kontrol (n = 5), DMSO (araç, n = 5) ve equol (n = 4) ile tedavi edilen farelerde LC / MS / MS ile ölçüldü. ECOIL ile tedavi edilen farelerin birinden LC / MS / MS gerçekleştirmek için yeterli kan geri kazanılmadı. Bu tedaviler MDA yöntemi kullanılarak uygulandı. Serum equol sadece equol ile tedavi edilen grupta tespit edilebilirdi. Kantitasyon limiti 5 ng/mL

Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: MDA tedavisinden sonra FVB / NJ farelerinde çekirdek bağırsak bakterileri ve toplam bakteri yükü seviyeleri değişmemiştir. MDA yöntemi kullanılarak tedavi uygulamasından önce ve sonra hedeflenen mikrobiyal topluluklar için qPCR Cq değerlerinde önemli bir değişiklik gözlenmemiştir. Lactobacillus sadece kafes 3'te başlangıç ve MDA tedavisi arasında anlamlı bir fark gösterdi (*, p = 0.0321). Bu bulgu kafesler arasında tutarlı değildi. Kafes numaraları C1-C4 olarak işaretlenmiştir. İstatistiksel anlamlılık, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve çoklu karşılaştırmalar (Tukey düzeltmesi) kullanılarak belirlendi. Hata çubukları = SD. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Astar adıAstar dizileriPCR koşulları
DesA_CS_F5'-GGACAGGGTGTCGGCTTTATG-3'93°C 3 dk, 34 döngü (95 °C 30 sn, 54 °C 30 sn)
DesA_CS_R5'-TTACTTCACCTTCGCCAGTTTCTG-3'

Tablo 1: desA+ bakterileri (C. scindens) için primerler ve qPCR koşulları.

Astar adıAstar dizileriPCR koşulları
V6_F
V6_R		5'-CAACGCGWRGAACCTTACC-3'
5'-CRACACGAGCTGACGAC-3'		95 °C, 3 dk
36 döngü
95 °C, 30 sn
53 °C, 30 sn
A.muc_F
A.muc_R		5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3'
5'-CCTTGCGGTTCTTCAGAT-3'		50 °C, 5 dk
95 °C, 10 dk
40 döngü
95 °C, 15 sn
60 °C, 1 dk
Bifido_F
Bifido_R		5'-CGGGTGAGTAATGCGTGACC-3'
5'-TGATAGGACGCACCCCA-3'		95 °C, 3 dk
36 döngü
95 °C, 30 sn
53 °C, 30 sn
S. salivarius_F
S. salivarius_R		5'-CACGCCATGCTGGAAGTG-3'
5'-GCGATGAGCCAAGCTGAAG-3'		95 °C, 10 dk
44 döngü
95 °C, 15 sn
60 °C, 1 dk
Lacto_F
Lacto_R		5'-TGGAAACAGRTGCTAATACCG-3'
5'-GTCCATTGTGGAAGATTCCC-3'		50 °C, 2 dk
95 °C, 10 dk
40 döngü
95 °C, 15 sn
62 °C, 1 dk

Tablo 2: MDA'nın çekirdek bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkisini ölçmek için kullanılan primerler ve qPCR koşulları.

Tartışma

OG, daha önce birden fazla çalışmadadeğerlendirildiği gibi kafa karıştırıcı bir değişken oluşturabilen araştırma hayvanlarında önemli bir stres kaynağı olabilir 7,9,11,12,13,14,15,23. OG'nin invazivliği nedeniyle, OG 9,10,12,13,14,15 ile ilişkili zorlukları en aza indirmek için alternatif teknikler kullanılmıştır. Mikropipet kılavuzluğunda ilaç uygulaması (MDA), tek kanallı bir pipet ve ilgilenilen ilacın şekerli yoğunlaştırılmış süt çözeltisi ile bir karışımı kullanılarak daha az invaziv bir şekilde ilaç verilmesine izin veren yeni bir tekniktir7. Bu teknik için kritik bir adım, hayvanın pipet ucunu ve şekerli yoğunlaştırılmış süt aromasını daha iyi tanımasını sağlayan ve genel olarak taşıma sürelerini ve sıkıntıyı kısaltan eğitim seansıdır (en az 2 gün). Bu eğitim seansı aynı zamanda farelerin şekerli yoğunlaştırılmış süt çözeltisine dahil edilen ilaçları diğer tekniklerden çok daha hızlı ve kesin bir dozajla kolayca tüketmelerini sağlar.

Çalışmalarımız, Scarborough ve ark.7'de sunulan tatlandırılmış yoğunlaştırılmış süt / su çözeltisinin hazırlıklarını ve dağıtımını yakından takip etti. Çalışmanın uzunluğu boyunca, fareler dozlamadan önce su veya yiyecekten mahrum bırakılmadı. Kendi barınma kafeslerinde tutuldular ve tedavilerin zamanlaması 1 dakikanın altındaydı. Çalışmalarımızdaki önemli bir fark, muhtemelen kullandığımız albino fare suşlarındaki görme bozukluğu potansiyeli ve ilaç tedavisi ile hafif tat isteksizliği potansiyeli nedeniyle, tüm farelerin eğitim ve tedavi protokolünün bir parçası olarak hafifçe tırnatma ile kısa bir kısıtlama gerektirmesiydi. MDA tedavilerinde yapılan bu değişiklik Vanhecke ve ark.16 tarafından önerilmektedir. Nazik tırmalama, fareleri sırtlarına yerleştirmenin yanı sıra, fareleri süt solüsyonunu hevesle tüketmeye teşvik etti. Eğitim ve tedavi adımlarının bir parçası olarak nazikçe fırçalama ihtiyacının isteğe bağlı olduğu ve çalışmaya bağlı olacağı sonucuna varıyoruz. Tedavilerin uygulanması (uygun olduğu şekilde hayvanın vücut ağırlığına göre düzeltilmiş) standart bir hacimde verildi ve fareler davranışta değişiklik göstermedi. İlk çalışma7'deki diğer küçük değişiklikler, eğitim oturumlarının sayısında ve her oturumda uygulanan hacimlerde bir azalma içeriyordu. Bu çalışmada karşılaştığımız sınırlamalardan bazıları, bazı farelerin eğitimin ilk gününde ve çalışma sırasındaki zaman noktalarında süt çözeltisinin tüm dozunu (100 μL) içmeye karşı direncini içerir. Bu, farelerin kısıtlanırken sırt üstü yatırılmasıyla aşıldı. Bu çalışma, ilacın şekerli yoğunlaştırılmış süt çözeltisi ile etkileşimini, fare cinsiyetleri arasındaki tüketim farklılıklarını (MDA'nın daha önce dişi farelerdede etkili olduğu gösterilmiş olmasına rağmen 7,17) veya kortikosteron seviyeleri gibi stres belirteçlerinin yükselmesini değerlendirmedi 7,11,14, OG ile ilişkili.

Bu çalışmada, MDA tekniğinin deneysel bir tedavinin kesin bir dozunu verme yeteneğine odaklandık ve daha sonra çalışma hayvanlarında ilgilenilen tedavilerin dışkı ve / veya dolaşımdaki seviyelerini değerlendirdik. Aynı şekilde, MDA tedavisinin bağırsak mikrobiyotasını değiştirip değiştirmediğini değerlendirdik ve çalışma hayvanlarının çekirdek dışkı mikrobiyotasında veya toplam dışkı bakteri yükünde çok az değişiklik gözlemledik veya hiç değişiklik gözlemlemedik. Aynı şekilde MDA tedavisine bağlı olarak hayvanlarda herhangi bir yaralanma gözlemlemedik. Sonuç olarak, MDA, kemirgen modellerinde kısa ve uzun süreli tedavi uygulaması için alternatif bir yöntem olarak hizmet edebilir. Genel olarak, MDA, OG ile ilişkili yaralanma riskini azaltarak hayvan refahı üzerinde olumlu bir etkiye sahiptir. MDA, diğer tekniklerin bazı sınırlamalarının üstesinden gelir ve birçok farklı kemirgen modelinde translasyonel araştırmalarda geniş çapta kullanılabileceğini öneriyoruz24.

Açıklamalar

Hiç kimse.

Teşekkürler

Savunma Bakanlığı Prostat Kanseri Araştırma Programı Ödülü W81XWH-20-1-0274 ve Prostat Kanseri Vakfı Yarışma Ödülü 16CHAL13'ten araştırma desteğini kabul etmek isteriz. Johns Hopkins'teki Analitik Farmakoloji Ortak Kaynağı'ndan Dr. Michelle Rudek, Dr. Noushin Rastkari, Dr. Nicole Anders ve Linping Xu'ya equol LC/MS/MS ile ilgili yardımları için teşekkür eder ve teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
200 ve mikro; L pipet uçlarıMettler Toledo17005860
AB SCIEX Üçlü QTRAP 5500 kütle spektrometrik dedektörüSciexN/A
Akkermansia muciniphila suşu muc genomik DNAAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuBAA-835D-5
Amonyum asetatSigma– Aldrich5.43834
C57BL / 6J farelerJackson LaboratuvarlarıSuş # 000664
C. scindens< / em> suşu 35704Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu35704
SefoksitinSagent NDC25021-109-10
Mısır yağıMedChemExpressHY-Y1888
DMSOSigma-AldrichD2650
etanolFisher ScientificAC611050040
Formik asitSigma– Aldrich5.33002
FVB / NJ farelerJackson LaboratuvarlarıSuşu # 001800
GliserolSigma ve ndash; AldrichG5516
HekzanFisher Scientific02-002-996
LC-MS sınıfı suFisher Scientific14-650-357
MetanolFisher Scientific02-003-340
Microtainer serum ayırıcı tüpBecton Dickinson02-675-185
Moleküler biyoloji sınıfı suCorning46-000-CI
NSG fareleriJackson LaboratuvarlarıSuşu # 005557
PBSCorning21-031-CV
Qubit DNA HS kitiInvitrogenQ32851
Rasemik  equol-d4Santa Cruz Biyoteknolojisc-219827
Güçlendirilmiş Clostridial agarAnaerob SistemleriAS-6061
Takviyeli Clostridial et suyuAnaerob SistemleriAS-606
S-equolMedChemExpressHY-100583
Cayman Chemical10010173için S-equol referans standardı
kanal pipetiRainin17008652
Streptococcus tükürük genomik DNAAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuBAA-1024D-5
Şekerli yoğunlaştırılmış sütCalifornia ÇiftlikleriB09TGQ7WV8
VSL # 3VSL # 3B07WX1LVHL
beta; -glukuronidaz Helix pomatiaSigma– AldrichG7017
LC-MS Single ve İkinci El

Kaynaklar

  1. Vandenberg, L. N., Welshons, W. V., Vom Saal, F. S., Toutain, P. -L., Myers, J. P. Should oral gavage be abandoned in toxicity testing of endocrine disruptors. Environ Health. 13 (1), 46(2014).
  2. Craig, M. A., Elliott, J. F. Mice fed radiolabeled protein by gavage show sporadic passage of large quantities of intact material into the blood, an artifact not associated with voluntary feeding. Contemp Top Lab Anim Sci. 38 (5), 18-23 (1999).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Gulin, J. E. N., Bisio, M., García-Bournissen, F. Refining drug administration in a murine model of acute infection with Trypanosoma cruzi. Lab Anim Res. 36, 37(2020).
  5. Bonnichsen, M., Dragsted, N., Hansen, A. K. The welfare impact of gavaging laboratory rats. Anim Welf. 14 (3), 223-227 (2005).
  6. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemp Top Lab Anim Sci. 39 (1), 17-21 (2000).
  7. Scarborough, J., et al. Preclinical validation of the micropipette-guided drug administration (MDA) method in the maternal immune activation model of neurodevelopmental disorders. Brain Behav Immun. 88, 461-470 (2020).
  8. Germann, P. G., Ockert, D. Granulomatous inflammation of the oropharyngeal cavity as a possible cause for unexpected high mortality in a Fischer 344 rat carcinogenicity study. Lab Anim Sci. 44 (4), 338-343 (1994).
  9. Martins, T., et al. Comparison of gelatin flavors for oral dosing of C57BL/6J and FVB/N mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (1), 89-95 (2022).
  10. Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an orally dissolving strip for pharmacological and toxicological studies: A simple and humane alternative to oral gavage for animals. J Vis Exp. (109), e53770(2016).
  11. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49 (3), 329-334 (2010).
  12. Neto, T., Faustino-Rocha, A. I., Gilda Costa, R. M., Medeiros, R., Oliveira, P. A. A quick and low-intensity method for oral administration to large numbers of mice: A possible alternative to oral gavage. Lab Anim. 56 (2), 185-190 (2022).
  13. Küster, T., et al. Voluntary ingestion of antiparasitic drugs emulsified in honey represents an alternative to gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (2), 219-223 (2012).
  14. Gonzales, C., et al. Alternative method of oral administration by peanut butter pellet formulation results in target engagement of BACE1 and attenuation of gavage-induced stress responses in mice. Pharmacol Biochem Behav. 126, 28-35 (2014).
  15. Teixeira-Santos, L., Albino-Teixeira, A., Pinho, D. An alternative method for oral drug administration by voluntary intake in male and female mice. Lab Anim. 55 (1), 76-80 (2021).
  16. Schalbetter, S. M., et al. Oral application of clozapine-N-oxide using the micropipette-guided drug administration (MDA) method in mouse DREADD systems. Lab Anim (NY). 50 (3), 69-75 (2021).
  17. Vanhecke, D., Bugada, V., Buch, T. Refined tamoxifen administration in mice by encouraging voluntary consumption of palatable formulations). bioRxiv. , (2023).
  18. Heraudeau, M., et al. Micropipette-guided drug administration (MDA) as a non-invasive chronic oral administration method in male rats. J Neurosci Methods. 398, 109951(2023).
  19. Sfanos, K. S., et al. Compositional differences in gastrointestinal microbiota in prostate cancer patients treated with androgen axis-targeted therapies. Prostate Cancer Prostatic Dis. 21 (4), 539-548 (2018).
  20. Shrestha, E., et al. Profiling the urinary microbiome in men with positive versus negative biopsies for prostate cancer. J Urol. 199 (1), 161-171 (2018).
  21. Peiffer, L. B., et al. Composition of gastrointestinal microbiota in association with treatment response in individuals with metastatic castrate resistant prostate cancer progressing on enzalutamide and initiating treatment with anti-PD-1 (pembrolizumab). Neoplasia. 32, 100822(2022).
  22. Jones, C. B., Peiffer, L. B., Davis, C. M., Sfanos, K. S. Examining the effects of 4He exposure on the gut-brain axis. Radiat Res. 197 (3), 242-252 (2022).
  23. Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
  24. Miguelena Chamorro, B., Swaminathan, G., Mundt, E., Paul, S. Towards more translatable research: Exploring alternatives to gavage as the oral administration route of vaccines in rodents for improved animal welfare and human relevance. Lab Anim (NY). 52 (9), 195-197 (2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikropipetle la UygulamasFareye la VermeMinimal nvaziv TeknikBa rsak MikrobiyomuProstat Kanseri ModelleriStres Azaltma Y ntemlerila Uygulama Y ntemleriekerli S t Ta y c s

İlgili makaleler