Burada, tetrasiklin kontrollü tabanlı indüklenebilir sentetik devrenin tasarlanması, inşası ve teslimi için bir protokol sunulmaktadır. Sentetik devrelerin parazit eliminasyonu ve sitokin ekspresyonu üzerindeki etkisi, sunulan boru hattının kanalize edilmesiyle incelenebilir. Bu protokol, bulaşıcı hastalıklarda sentetik devre tabanlı terapötikler üzerinde çalışan araştırmacılar için geçerlidir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Konakçıya Yönelik Tedavileri İlerletmek için Enfeksiyonda İmmünometabolik Devreler
Bu makalede
Özet
Özet
İmmüno-metabolizma, leishmaniasis'in ilerlemesinde çok önemli bir belirleyicidir. Sentetik biyoloji temelli yaklaşım, leishmaniasis'i tetikleyen konakçı ile ilişkili faktörleri hedef alan terapötik müdahaleye yönelik bir adım olarak büyük ilgi görmüştür. Sentetik biyoloji, biyolojik sistemleri hassas bir şekilde modüle etmek ve hücrelere yeni işlevler kazandırmak için genetik bileşenlerin ortogonal ve modüler bir şekilde mühendisliğini gerektirir. Sunulan çalışmada, indüklenebilir tetrasiklin kontrollü (TetON) bazlı bir sentetik devrenin geliştirilmesi için sistematik bir boru hattının aydınlatılması, hücre içi Leishmania parazitlerinin ortadan kaldırılmasını kolaylaştırmak için terapötik bir ajan olarak süksinat dehidrojenazın verilmesini amaçlamıştır. Ana hatlarıyla belirtilen protokol, sentetik bir devrenin tasarımını ve müteakip doğrulamasını açıklar. Önerilen strateji aynı zamanda sentetik devrelerin plazmit omurgasına bir dağıtım aracı olarak dahil edilmesine odaklanmaktadır. Ek olarak, sentetik devrelerin iletimi için poliks bazlı nano parçacıklar kullanan dağıtım makineleri, hücresel morfolojiden ödün vermeden murin makrofaj hücre hatlarında kullanıldı. Yöntemin standardizasyonu, transfekte edilmiş hücrelerin seçilmesi ve sentetik devre ekspresyonu için optimal indüksiyon konsantrasyonunun belirlenmesi için yapılmıştır. Gözlemler, enfekte hücrelere kıyasla transfekte edilmiş hücrelerde hücre içi parazit yükünde belirgin bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır. Pro-inflamatuar sitokinler, parazit eliminasyonunu teşvik etmek için bir mekanizma olarak sentetik devre transfekte edilmiş ve indüklenmiş hücrelerde enfeksiyon sonrası eksprese edildi. Bu, hastalığın ilerlemesi ile ilişkili konakçı faktörleri hedef alarak leishmaniasis'te güçlü bir yaklaşım olarak sentetik biyoloji temelli yöntemin altını çizmektedir.
Giriş
Bütüncül, bütünleştirici tıbbın ilerlemesi, bağışıklık hücrelerindeki metabolik değişiklikler ile bulaşıcı hastalıklarda bağışıklık hücresi fenotipini modüle etme yetenekleri arasında tanımlanan önemli bir bağlantıdır. İmmüno-metabolizma, insanlarda yaygın bulaşıcı hastalıkların patogenezini aydınlatmak için yeni bakış açıları sunar. Ayrıca, müdahale1 için yeni hedefler belirleyerek aşıların ve ilaçların geliştirilmesi için umut verici teknikler sağlar. Bağışıklık hücrelerinin metabolik olarak yeniden programlanması, leishmaniasis dahil olmak üzere çeşitli bulaşıcı hastalıklarda tanımlanır. Leishmania spp. Leishmania majör (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. RAW264.7 hücrelerinin hücre kültürü
NOT: Deneme için düşük pasaj numaraları kullanın. RAW264.7 hücre hattı, Pune'daki Biyoteknoloji Araştırma İnovasyon Konseyi-Ulusal Hücre Bilimleri Merkezi'nin (BRIC-NCCS) Ulusal Hücre deposundan temin edildi. RAW264.7 hücre hattı bir makrofaj hücre hattı olduğundan, artan geçişlerle farklılaşmaya başlayabilir. Hücreleri canlandırdıktan sonra, 2 geçişten sonra transfeksiyon için hücre hattını kullanın.
- 25 cm'lik 2 bir şişede RAW264.7 hücre hattının 5 x10 5 hücresini tohumlayın, 5 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS)....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sentetik devreyi ifade etmek için sentetik devreyi oluşturan genetik parçaların düzenlenmesi (Şekil 1A)'da gösterilmiştir. Karşılık gelen parçalar, Şekil 1B'de gösterilen ortogonal ve modüler bir şekilde pEGFP-N1 vektöründe klonlandı. Sentetik devrenin simülasyonu, hem SDHA'da hem de tetrasiklin baskılayıcısında salınım dinamiklerini ortaya çıkardı. Bu gözlem, periyodik dalga fonksiyonları ile karakterize edilen karşılıklı bir ifade modeli önermektedir. SDHA kon.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Elde edilen sonuçlar, sentetik bir devrenin tasarımı ve uygulanması için kanalize edilen boru hattının verimliliğinin altını çizmektedir. Bu sentetik devrenin inşası, leishmaniasis gibi bulaşıcı hastalıklar için hassas ilaç geliştirmeye yönelik bir adımdı. Genetik parçaların in silico montajı ve deterministik simülasyon yoluyla, TetON sisteminin ayırt edici modülatör etkisi izlendi. Devrenin etkisi, özellikle, TetR ve SDHA/GFP'nin karşılıklı iki durumlu ifadesine yol açmış olabilir. SDHA'nın ekspresyonu periyodi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar, araştırmamızı desteklediği için Pune'daki Biyoteknoloji Araştırma ve Yenilik Konseyi - Ulusal Hücre Bilimi Merkezi (BRIC-NCCS) Direktörüne ve BRIC-NCCS Biyoinformatik Tesisine teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10 & mu; L uçları | Tarson | 521050 | |
| 10X kısıtlama tamponu | BioLabs | R0146S | Kısıtlama sindirimi |
| 1 mL uçlar | Tarson | 521016 | |
| 1 mL tüp | Eppendorf | 30121023 | |
| 200 &; L ipuçları | Tarson | 521010 | |
| 25cm2 şişe | Corning | 430639 | Hücre kültürü için |
| 4 ',6-diamidino-2-fenilindol | ThermoFischer Scientific | D1306 | nükleer boyama |
| 50 mL tüp | Corning | 352070 | |
| 60mm plakalar | Falcon | 353002 | |
| 6X TrackIt Camgöbeği / Turuncu Yükleme tamponu | ThermoFischer Scientific | 10488085 | için numunelerin yüklenmesi |
| ThermoFischer Scientific | 160376 | Konfokal görüntüleme ve transfeksiyon için | |
| 96 kuyulu mikro test plakası düz tabanlı kuyular | AGE için Tarson | 941196 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Agaroz jel elektroforez düzeneği | GeNei | 93 | için AGE |
| Bakteriyel laminer akış | ESCO Lifesciences | 2120765 | Dönüşüm için |
| Kalsiyum klorür | Merck | C4901 | Tampon / Reaktif hazırlama |
| Hücre kültürü laminer hava akışı | ThermoFischer Scientific | 1323TS | Hücre kültürü için |
| Hücre sıyırıcı | Genetix | 90020 | Hücre kültürü için |
| Hücre yayıcı | Fischer | ||
| Santrifüj | 50 | ||
| Santrifüj | RNA izolasyonu için ThermoFischer Scientific | 75004210 | |
| Chlorofrom | Fischer Scientific | 67-66-3 | |
| CO2 inkübatörü ThermoFischer | Scientific | 3110 | Hücre kültürü |
| için Küvet | Eppendorf | 6138000018 | Plazmit konsantrasyonunun tahmini |
| CYTIVA IQ 500 jel görüntüleyici | Cytiva | 29655893 | AGE için DEPC |
| TEDAVI EDİLMİŞ H2O 1000 ML | ThermoFischer Scientific | 750023 | RNA izolasyonu için |
| Doksisiklin | Merck | 33429 | Transfekte edilmiş hücrelerin indüksiyonu için |
| Kuru ısıtma bloğu | Labnet | Restriksiyon enzimlerinin transformasyonu ve inaktivasyonu için | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı | Ulusal hücre bilimi | Hücre kültürü için | |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 1.00983 | Tampon / Reaktif hazırlama |
| Etidyum bromür | Sigma | E7637 | AGE için |
| Etilendiamin tetraasetik asit | Fischer Scientific | 12635 | Tampon / Reaktif hazırlama |
| Evos parlak alan mikroskobu | ThermoFischer Scientific | AMEX1000 | |
| ExPasy | https://web.expasy.org/translate/ | sentetik devrenin inşası için | |
| Fetal Sığır Serumu | Gibco | 16000-044 | Hücre kültürü için |
| FV31S-SW yazılımı | Olypmus | Görüntü elde etme | |
| Geneticin | Gibco | Transfeksiyon için | 1563411 |
| Klonlama için Gibson montaj yöntemi | BIOMATIK | Sentetik devre yapımı | |
| Graphpad prizma | Graphpad | İstatistiksel analiz | |
| Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti | cDNA sentezi için | ThermoFischer Scientific | 4368814 |
| İzopropanol | Fischer Scientific | 13825 | Tampon / Reaktif hazırlama |
| Kanamisin | Sigma | 60615 | Dönüşüm ve koloni seçimi için |
| Luria Bertini suyu | Himedia | M1245 | E.coli |
| Magnezyum klorür | Fischer Scientific | BP214 | Tampon / Reaktif hazırlama |
| Mikro Filtre Dikey Laminer Hava Akışı | Mikrofilt | ||
| MicroAmp Hızlı 8 Tüplü Şerit, | qRT-PCR için | ThermoFischer Scientific | 4358293 |
| MicroAmp Optik 8 Kapaklı Şeritler | qRT-PCR | için ThermoFischer Scientific | 4323032 |
| Mikrodalga fırın | LG | MC-7649DW | AGE |
| Mm00434228_m1 için (IFN-&gama;) | ThermoFischer Scientific | 4331182 | Taqman probları |
| Mm00443258_m1 (TNF) | ThermoFischer Scientific | 4331182 | Taqman probları |
| Mm01321739_m1(TGFB) | ThermoFischer Scientific | 4331182 | Taqman probları |
| Fare ELISA Kiti ELISA Kiti IL-10 | ELISA Fare için ThermoFischer Scientific | BMS614 | |
| ELISA Kiti IL-12 | ThermoFischer Scientific | BMS616 | ELISA |
| Multiskan Sky için + & mu; | ELISA | ThermoFischer Scientific | 51119600DP |
| 96 kuyulu Hücre Kültürü Plaka Karıştırıcı Ayarlanabilir 0-1500 rpm Laboratuvar Çalkalayıcı Karıştırıcı | DIAB | ||
| Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi Sentetik | devre inşası için | https://www.ncbi.nlm.nih.gov | |
| Neubauer odası | Marienfeld superior | 640010 | Hücre sayımı için |
| Havalandırmasız 25cm2 şişe | Corning | 353014 | Paraziti kültürlemek için |
| NotI | BioLabs | R3189M | Kısıtlama enzimi |
| Nükleaz içermeyen su | Biyotasarım | 1QIA | Reaktif hazırlama |
| Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 yazılımı | Olypmus | Görüntü işleme | |
| Olympus FV 3000 | Olympus | Konfokal görüntüleme için | |
| OPTI-MEM ortamı | Gibco | 31985070 | ortamı Transfeksiyon |
| pEGFP-N1 vektörü için sentetik devre ile klonlanmış | Biomatik | ||
| Penisilin | ThermoFischer Bilimsel | 15070063 | Hücre kültürü için |
| Polietilenimin | Transfeksiyon için | MERCK | 764965 |
| Potasyum Asetat | Fischer Bilimsel | YBP364500 | Tampon / Reaktif hazırlama |
| Potasyum Klorür | Fischer Scientific | BP366 | Tampon / Reaktif hazırlama |
| Potasyum Fosfat Monobazik | Sigma | P5655 | Tampon / Reaktif hazırlama |
| Güç kaynağı paketi | BIORAD | 1645070 | AGE için |
| Standart Biyolojik parçaların | Kayıt Defteri https://parts.igem.org/Main_Page | sentetik devre | |
| inşası için RNAiso Plus | Takara | 38220090 | RNA izolasyonu için |
| RNase A | ThermoFischer Bilimsel | 12091021 | Tampon / Reaktif hazırlama |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Ulusal hücre bilimi | Parazit kültürü için | |
| Shaker inkübatörü | REMI | CIS 24 plus | E.coliSodyum klorür kültürlemesi için |
| Qualigens | Q27605 | Tampon / Reaktif hazırlama | |
| Sodyum Dodesil Sülfat | Sigma-Aldrich | L3771 | Tampon / Reaktif hazırlama |
| Sodyum Hidroksit | Fischer Scientific | 15895 | Tampon / Reaktif hazırlama |
| Sodyum Fosfat Dibasic | Sigma | S5136 | Tampon / Reaktif hazırlık |
| Spektrofotometre | Eppendorf | Plazmit konsantrasyonunun tahmini | |
| Spin win | Trason | 1020 | |
| StepOne plus Real Time PCR sistemi | Yaşam teknolojileri | 272006777 | qRT-PCR |
| StepOne yazılım sürümü 2.3 | için Yaşam teknolojileri | qRT-PCR | |
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X) için, AmpErase UNG yok | ThermoFischer Scientific | 4366072 | |
| Tinker hücresi | Sentetik devre yapımı ve simülasyonu | ||
| TrackIt 1 Kb Plus DNA merdiveni | AGE için | ThermoFischer Scientific | 10488085 |
| Tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür | Himedia | MB029 | Tampon / Reaktif hazırlama |
| Tris-asetat-EDTA | SERVA | 42549.1 | Tampon / Reaktif hazırlama |
| Tripan mavisi | Sigma | T8154 | Hücre sayımı için |
| XhoI | BioLabs | R0146S | Kısıtlama enzimi |
Kaynaklar
- Chen, J. Y., Zhou, J. K., Pan, W. Immunometabolism: Towards a better understanding the mechanism of parasitic infection and Immunity. Front Immunol. 12, 661241(2021).
- Ferreira, C., Estaquier, J., Silvestre, R. Immune-metabolic interactions b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
