Yöntem makalesi

Bir Glioblastoma Multiforme Hayvan Modelinde Bir Oligonükleotid Yükünün Nanopartikül Teslimi

2.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66986

⸱

27 Eylül 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University, 3Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 5Henry Ford Health, 6Transcode Therapeutics Inc.

Bu makalede

Özet

Kan-beyin bariyeri, tedavisi olmayan bir hastalık olan glioblastoma için tedavilerin uygulanmasında önemli bir engeldir. Burada, boyut nedeniyle bu fizyolojik bariyeri atlayabilen ve tümör içinde birikebilen in vivo görüntü kılavuzluğunda demir oksit terapötik nano bir platform sunuyoruz.

Özet

Glioblastoma multiforme (GBM), tedavisi olmayan primer beyin malignitesinin en yaygın ve agresif formudur. Kan-beyin bariyeri, tedavilerin GBM'ye uygulanmasında önemli bir engeldir. Burada bildirilen, boyut ve tümör bölgesinde birikme nedeniyle bu fizyolojik engeli atlayabilen ve yükünü iletebilen, görüntü kılavuzlu, demir oksit bazlı bir terapötik dağıtım nano platformudur. Bu 25 nm nano platform, Cy5.5 floresan boya ile etiketlenmiş ve faydalı yük olarak antisens oligonükleotid içeren çapraz bağlı dekstran kaplı demir oksit nanopartiküllerinden oluşur. Manyetik demir oksit çekirdek, nanopartiküllerin in vivo manyetik rezonans görüntüleme yoluyla izlenmesini sağlarken, Cy5.5 boyası optik görüntüleme ile izlemeye izin verir. Bu rapor, intravenöz enjeksiyonu takiben ortotopik olarak implante edilen glioblastoma tümörlerinde bu nanopartikül platformunun (MN-anti-miR10b olarak adlandırılır) birikiminin izlenmesini detaylandırır. Ek olarak, RNA terapötiklerinin kliniğe çevrilmesini engelleyen bir sorun olan RNA oligonükleotidlerinin in vivo iletimi hakkında bilgi sağlar.

Giriş

Glioblastoma multiforme (GBM), neredeyse tedavisi olmayan en yüksek astrositom derecesidir. Yılda yaklaşık 15.000 kişiye glioblastoma teşhisi konmaktadır, bu da yaklaşık 15 aylık kasvetli bir medyan sağkalım ve 5 yıllık sağkalım oranı %5'tir1. Son yıllarda, terapötik seçenekleri ilerletmek için çok sayıda çabaya rağmen prognozda marjinal bir iyileşme olmuştur. GBM için mevcut bakım standardı, mümkün olduğunda maksimal cerrahi rezeksiyonu, ardından radyoterapi ve kemoterapiyi içerir2. Tercih edilen kemoterapi olan temozolomid (TMZ), kayda değer klinik etkinlik gösterdiği keşfedilen glioblastoma için en son tedaviydi; bununla birlikte, GBM tümörlerinin en az %50'si TMZ direnci gösterir3. Bu titiz terapötik rejime rağmen, gelişmiş glioblastoma tedavisi için hala önemli bir klinik ihtiyaç vardır.

GBM ve diğer beyinle ilgili hastalıklar için terapötiklerin geliştirilmesi, kan-beyin bariyerinin (BBB) seçici doğası nedeniyle önemli ölçüde engellenmektedir. BBB, dolaşım sistemi ile beyin arasında yarı geçirgen zarı oluşturan, moleküllerin ve hücrelerin beyne serbest geçişini kısıtlayan, endotel hücreleri, perisitler ve astrosit ayak uçlarından oluşan fizyolojik bir bariyerdir4. Normal fizyolojide koruyucu ve beyin homeostazı için kritik öneme sahip olan BBB, birçok terapötiğin beyne ulaşmasını engelleyerek GBM tedavisini zorlaştırır. Terapötiklerin GBM'ye verilmesini geliştirme çabaları, nanopartikül bazlı dağıtım araçlarının geliştirilmesine, odaklanmış ultrason ilaç dağıtımının geliştirilmesine ve reseptör aracılı ilaç dağıtımınayol açmıştır 5,6.

Nanopartiküller, kanserler de dahil olmak üzere sayısız hastalık için terapötik geliştirmek için umut verici bir ortam olarak ortaya çıkmıştır. Nanopartiküllerin GBM'de görüntüleme ve terapötik amaçlar için uygulanması, çeşitli nanopartikül yapıları 7,8 kullanılarak denenmiştir. Teslimatın in vivo görüntülenmesi ile birlikte ilaçların GBM'ye verilmesine odaklanan önerilen yaklaşım, bir demir oksit çekirdeğinden oluşan ve stabilite için dekstran ile kaplanmış manyetik nanopartikülleri (MN) kullanır. Bu nanopartiküllerin manyetik özellikleri, manyetik rezonans (MR) görüntüleme ile tespit edilmelerini sağlarken, aminlenmiş dekstran kaplamaya basit konjugasyon kimyası, RNA molekülleri, ek hedefleme kısımları veya görüntüleme kısımları (Cy5.5 yakın kızılötesi optik boya gibi) gibi terapötik kısımların konjugasyonuna izin verir9,10. Görüntüleme yeteneklerine ek olarak, nano platform, oligonükleotidi endojen nükleazlardan koruyarak ve terapötik uygulamayı iyileştirerek RNA terapötiklerinin yarı ömrünü uzatabilir. Burada, terapötik oligonükleotidlerin (MN-anti-miR10b olarak adlandırılır) GBM'ye in vivo olarak verilmesi için bu nano platformun in vivo görüntüleme ile izlenmesi sunulmaktadır. Daha önce, bu nano platformun birikme kabiliyeti, in vitro GBM hücrelerinde gösterilmiş ve tümör hücrelerinin canlılığında önemli bir kayba neden olmuştur11. Terapötik in vivo çalışmalar yapmadan önce, bu nano platformun hayvan modellerinde GBM tümörlerine in vivo olarak verildiğini göstermek gerekir. Bunu başarmak için, ortotopik GBM hayvan modelleri üretildi ve yapının intravenöz uygulaması yapıldı ve ardından in vivo görüntüleme yapıldı. Burada, in vivo görüntüleme ve ex vivo mikroskopi ile doğrulanan tümör bölgesinde birikimi gösteren bu çalışmaların protokolleri özetlenmiştir.

Protokol

Hayvan deneklerle ilgili tüm prosedürler Michigan Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Dişi soylu atimik çıplak fareler, 7 haftalıkken Jackson Labs'tan (suş # 007850) satın alındı ve implantasyon ameliyatından önce 1 hafta boyunca alışmalarına izin verildi. Fareler implant sırasında yaklaşık 21-25 g idi. Ateşböceği lusiferazı eksprese eden U251 hücreleri, Dr. Ana deCarvalho12 tarafından üretildi ve sağlandı.

1. Hücre kültürü ve implantasyon için hazırlık

  1. Kültür lusiferaz etiketli, insan glioblastoma hücreleri, Dulbecco'nun D-glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat içeren Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) U251 ve% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile% 5 CO 2ile% 37 ° C'de.
  2. Hücreler %70 birleşmeye ulaştığında, 37 ° C'de 1-2 dakika boyunca% 0.25 tripsin / EDTA ile tripsine edin. Bir T-75 şişesi için 2-4 mL veya bir T-175 şişesi için 4-6 mL kullanın.
  3. Hücreler şişeden ayrıldıktan sonra, reaksiyonu 2: 1 oranında takviye edilmiş DMEM ile söndürün ve hücreleri tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için pipetleyerek nazikçe karıştırın. Hücreleri konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme ile peletleyin.
  4. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin. Ölü hücreleri dışlamak ve toplam canlı hücre sayısını hesaplamak için tripan mavisi boyama kullanarak hücreleri bir hemositometre ile sayın. Hücreleri tekrar peletleyin, yukarıda tarif edildiği gibi.
  5. Hücre peletini PBS'de 1 x 108 hücre / mL konsantrasyona yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu intrakraniyal implantasyon için buz üzerinde saklayın.

2. Serbest el ortotopik tümör implantasyonu

NOT: Bu protokol Irtenkauf ve ark. (Dr. Ana deCarvalho'nun prosedürü; Henry Ford Sağlık Hermelin Beyin Tümörü Merkezi)12. Hem denekler hem de araştırmacılar için güvenliği sağlamak için tüm adımlar bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Serbest el implantasyon yöntemi, intrakraniyal implantasyonun kalitesini korurken daha büyük numune boyutları elde etmek için daha hızlı bir prosedüre izin verir. Alternatif olarak, tümörü aşağıda açıklanan aynı koordinatlarda implante etmek için stereotaksik bir cihaz kullanılabilir.

  1. Çıplak, atimik fareyi tartın ve 28G şırınga ile intraperitoneal enjeksiyon yoluyla anestezik bir ketamin / ksilazin çözeltisi (100 mg / kg / 10 mg / kg) uygulayın. Vücut ısısını korumak için fareyi bir ısıtma yastığının üzerindeki bir kurtarma kafesine yerleştirin. Pedal refleksini kontrol ederek anesteziyi onaylayın.
  2. Oftalmik göz merhemi uygulayın, ketoprofen'i (5 mg / kg) 28G şırınga ile deri altına uygulayın ve tanımlayıcı kulak zımbaları verin.
  3. Başın üst kısmındaki cerrahi bölgeyi %70 etanol ile sterilize edin, ardından betadin fırçalayın ve 3 kez tekrarlayın. Daha sonra başın orta hattının sağına küçük cerrahi makaslarla 5-7 mm'lik bir kesi yapın ve kafatasının kafa ve dikiş hatlarını ortaya çıkarmak için cildi ince forsepslerle geri çekin.
  4. Periosteumu çıkarmak için kafatasını pamuklu çubukla ovalayın ve kemiğe erişim sağlayın. Kemiği kurutmak için yeni bir pamuklu çubuk kullanarak% 3'lük bir hidrojen peroksit çözeltisi uygulayın. Yeni bir pamuklu çubuk kullanarak fazla hidrojen peroksiti ve oluşabilecek köpüğü silin. Kafatasında bregma görünene ve kemik delme için yeterince kuruyana kadar bu adımı 3 kez tekrarlayın. Yeterince kuru bir kafatası, keskin bir şekilde beyazlatılmış dikiş hatlarına ve başlangıç görünümünden itibaren azaltılmış kızarıklığa sahip olacaktır.
  5. Bregma ile ilgili olarak, bir cetvel ile -2,5 mm medial/lateral ve -1 mm ön/arka ölçün ve matkap bölgesini bir işaretleyici ile işaretleyin. İşaretin doğru konumda olduğundan emin olmak için delmeden önce tekrar ölçün.
  6. 0,5 mm'lik matkap çapağı olan bir elektrikli mikro cerrahi matkabı (11.000 RPM) alın ve daha önce işaretlenmiş olan kafatasında dikkatlice bir delik açın. Matkap bölgesinde birikebilecek kan veya sıvıyı yeni bir pamuklu çubukla emdirin.
  7. 3 mm'lik açıkta kalan iğne uzunluğuna kadar bir iğne manşonu ile donatılmış 33G mikrolitrelik bir şırınga hazırlayın. Bir pipetle kısa bir süre yeniden süspanse ettikten sonra önceden hazırlanmış 1 x 108 hücre / mL hücre süspansiyonundan 5 μL çekin ve enjeksiyon solüsyonunda kabarcık olmadığından emin olun. İğnenin ve iğne manşonunun dışında kalan fazla hücre süspansiyonunu %70 izopropanol mendille dikkatlice silin.
  8. İğne manşonu, iğnenin daha fazla yerleştirilmesini durdurana kadar iğneyi matkap bölgesine dikey olarak sokun. Enjekte edilen hücrelerin birikmesi için alan yaratmak için iğneyi yaklaşık 0,5 mm dikkatlice geri çekin.
  9. Hücre süspansiyonunu 1 dakikalık bir süre boyunca yavaşça enjekte edin. Tam hacim enjekte edildikten sonra, enjeksiyon çözeltisinin akışını azaltmak için iğneyi bir dakika daha derinlikte tutun. Ardından iğneyi dikkatlice geri çekin.
  10. Temiz bir pamuklu çubukla, enjeksiyon bölgesinde biriken sıvıyı silin ve ardından deliği kapatmak için kemik mumu uygulayın.
  11. Kesiği bir veteriner bağı ile kapatın ve kurumasını bekleyin. Temiz bir pamuklu çubukla, analjezik olarak topikal lidokain uygulayın.
  12. Tamamen iyileşene ve yürüyene kadar fareyi izleyin. Ağrı yönetimi için implantasyondan sonraki 2 gün boyunca deri altından ketoprofen (5 mg / kg) uygulayın.

3. Nanopartikül platform sentezi

  1. Nanopartikülleri daha önce tarif edildiği gibi Cy5.5 ve oligonükleotid (anti-miR10b) ile sentezleyin ve konjugeedin 11.

4. MN-anti-miR10b uygulaması

NOT: Bu çalışmada, enjeksiyonlar implantasyondan 7 gün sonra başlayarak 6 hafta boyunca haftada bir kez yapılmıştır, ancak aynı protokol çeşitli enjeksiyon frekansları için kullanılabilir.

  1. Fareyi tartın ve fareye uygulanacak MN-anti-miR10b hacmini hesaplayın. MN-anti-miR10b dozları, murin GBM modellerinde 20 mg Fe / kg'da verilir. Örneğin, 20 g'lık bir fare, 80 μL'lik bir 5 mg Fe / mL MN-anti-miR10b dozu alır. Kontrol fareleri, bu dozaj şemasına uygun olarak eşit miktarda PBS alır.
  2. MN-anti-miR10b dozu ile 28G'lik bir şırınga hazırlayın ve enjeksiyon solüsyonunda kabarcık olmadığından emin olun.
  3. Bir indüksiyon kutusunda 1,5 L / dak akış hızı ile fareyi indüksiyon için %2-4 izofluran ve bakım için %1,5-%2 altında uyuşturun. Fareyi bir burun konisine getirin ve anestezi vermeye devam edin. Anestezi derinliğini kontrol edin ve veteriner merhemi uygulayın.
  4. Kuyruğu %70 izopropanol mendille sterilize edin ve fazla alkolün kurumasını bekleyin.
  5. Lateral kaudal damarları kuyruğun üst kısmına yerleştirmek için kuyruğu döndürün. Ardından, damarı hedefleyerek iğneyi kuyruğa sokun ve pistonu geri çekerek bir vakum oluşturun.
  6. İğneyi, kan şırıngaya girene kadar sokun, bu da damara başarılı bir şekilde girildiğini gösterir.
  7. MN-anti-miR10b'yi yavaşça enjekte edin ve teslimat tamamlandıktan sonra iğneyi geri çekin. Kanama durana kadar enjeksiyon bölgesine gazlı bezle baskı uygulayın.
  8. Fareyi burun konisinden çıkarın. Tamamen iyileşene ve yürüyene kadar fareyi izleyin.
    NOT: Nanopartiküllerin bolus uygulaması solunum sıkıntısına neden olabilir. Fareyi dikkatlice izleyin ve solunum sıkıntısı belirtileri varsa hemen hafif göğüs kompresyonları uygulayın.

5. İn vivo biyolüminesans ve floresan görüntüleme

NOT: İn vivo biyolüminesans ve floresan görüntüleme, nanopartikül enjekte edilmeden önce ve 24 saat sonra In Vivo Görüntüleme Sisteminde (IVIS) gerçekleştirilir.

  1. Mg2 + ve Ca2 + olmadan PBS'de 30 mg / mL konsantrasyonda steril filtrelenmiş D-lusiferin hazırlayın.
  2. IVIS işlem yazılımını açın ve makineyi hazırlamak için başlatmaya başlayın. Sistem başlatılırken, Edinme > Otomatik Kaydet'i seçerek görüntüleri kaydetmek için bir klasör seçin ve kaydedilecek dosyalar için klasörü tanımlayın.
  3. Görüntüleme zaman noktalarında, fareyi tartın ve 150 mg / kg'lık bir dozaj için uygulanacak D-lusiferin hacmini hesaplayın. Çözeltiyi doğrudan ışıktan koruyarak hacimli 28G'lik bir şırınga hazırlayın. Bu çalışma, tohumlamayı doğrulamak için implantasyon ameliyatından 2 gün sonra görüntülemeyi içeriyordu ve haftalık görüntüleme, haftalık tedavilerden hemen önce implanttan sonraki 7. günde başladı.
  4. Bir indüksiyon odasında 1,5 L / dk akış hızı ile fareyi indüksiyon için %2-4 izofluran ve bakım için %1,5-%2 altında anestezi altına uygulayın. Anestezi uygulandıktan sonra, cerrahi bölgenin daha fazla yaralanmasını önlemek için fareyi nazikçe fırçalayın ve D-lusiferin dozunu intraperitoneal olarak enjekte edin. Farenin iyileşmesine izin verin ve biyolüminesans sinyalinin gelişmesine ve stabilize olmasına izin vermek için görüntülemeden önce 10 dakika bekleyin.
  5. Biyolüminesans sinyali gelişirken, IVIS tarayıcısını biyolüminesans görüntüleme için hazırlayın. Siyah düşük floresan matı görüntüleme tablasına yerleştirin ve burun konisi dizisini görüntülenecek konu sayısına göre yapılandırın.
  6. Yazılımda, Imaging Wizard (Görüntüleme Sihirbazı) öğesine tıklayın. Biyolüminesans Görüntüleme'yi ve ardından Filtreyi Aç'ı seçin. Bir sonraki ekranda, Imaging Subject (Görüntüleme Konusu) ve Field of View (Görüş Alanı) öğesini seçin. IVIS artık biyolüminesans görüntüleme için ayarlanmıştır.
  7. Görüntülemeden 3 dakika önce, izofluran / oksijen karışımının kutuyu doldurmasına izin vererek indüksiyon kutusunu astarlamaya başlayın. Görüntülemeden 2 dakika önce, fareleri anestezi için indüksiyon kutusuna yerleştirin.
  8. Anestezi uygulandıktan sonra, fareleri görüntüleme için indüksiyon kutusundan IVIS'e taşıyın ve her birini yüzüstü pozisyonda yatırın. Görüntüleme sırasında% 2 izofluran kullanarak idame anestezisi sağlayın.
  9. Fareler IVIS tarayıcıya yerleştirildikten sonra, Sırayı Al'a tıklayın. Minimum 3.000 sayım sinyal eşiği ile otomatik pozlama ayarlarını kullanarak bir görüntü çekin. Biyolüminesans görüntüleme, lusiferaz işaretli U251 glioblastoma hücrelerinin lokalizasyonunu görselleştirir. Otomatik pozlama, kullanıcı tarafından tanımlanan maksimum 5 dakikalık uzunluğa kadar, görüntüdeki en parlak sinyale göre hesaplanan pozlama uzunluğuna sahip bir görüntü yakalar.
    NOT: Tipik bir fare kafesi, tohumlama genellikle tek tip olduğu için tek bir görüntü gerektirir. Bir veya daha fazla parlak farenin olduğu durumlarda, fareler çıkarılabilir ve loş farelerden gelen sinyalleri daha iyi yakalamak için tekrar bir alım yapılabilir.
  10. Biyolüminesans görüntülemeden sonra, epi-floresan görüntülemeyi hazırlamak ve floresan taramaları yapmak için IVIS ayarlarını değiştirin.
    1. Görüntüleme Sihirbazı'nda, Floresan > Epi-Aydınlatma ile Filtrelenmiş Çift'i seçin. Bir sonraki ekranda, Cy5.5 gibi görüntülenecek probları seçin. Görüntüleme konusunu ve görüş alanını seçin. IVIS tarayıcısı artık önceki ekranda seçilen probların floresan görüntülemesi için ayarlanmıştır.
  11. Minimum 6.000 sayım sinyal eşiği ile otomatik pozlama ayarlarını kullanarak bir görüntü çekin. Cy5.5 floresan görüntüleme, MN-anti-miR10b'nin lokalizasyonunu görselleştirir. Otomatik pozlama, kullanıcı tarafından tanımlanan maksimum 5 dakikalık uzunluğa kadar, görüntüdeki en parlak sinyale göre hesaplanan pozlama uzunluğuna sahip bir görüntü yakalar.
    NOT: Floresan görüntüleme, kontrol PBS enjekte edilen farelerde bile nadiren 1 dakikadan daha uzun sürer. Tedavi edilen fareler arasındaki sinyal sapması küçük olduğu için tek bir görüntü her zaman yeterlidir.
  12. Görüntülemeden sonra fareyi IVIS'ten çıkarın. Anestezi ve ayaktan tamamen iyileşene kadar izleyin.

6. İn vivo manyetik rezonans görüntüleme

NOT: MR görüntüleme, nanopartikül enjeksiyonundan önce ve 24 saat sonra yapılır ve optik ve biyolüminesans görüntülemeye tabi tutulan aynı hayvanlarda yapılabilir.

  1. Denek fareyi, indüksiyon için %2-%4 izofluran ve bakım için %1,5-%2 altında 1,5 L/dk akış hızıyla bir indüksiyon kutusunda uyuşturun. Anestezi uygulandıktan sonra, fareyi yüzüstü solunum izleme balonunun üzerindeki MRI yatağına yerleştirin. Görüntüleme sırasında anestezi sağlamak için burun konisini buruna sıkıca yerleştirin ve oftalmik göz merhemi uygulayın.
  2. Bir ısırma çubuğu ve kulak çubukları kullanarak tarama için kafayı hareketsiz hale getirin ve konumlandırın.
  3. Yağlanmış rektal sıcaklık probunu takın ve solunum ve sıcaklık izlemenin çalıştığından emin olun. Fare yatağındaki mandalları bobin üzerindeki deliklere takarak fare beyin bobinini başın üzerine yerleştirin ve tarama sırasında hareketi azaltmak için bobini yerine bantlayın.
  4. Anestezi altındayken vücut ısısını korumak için farenin üstüne küçük bir ılık su sirkülasyon pedi yerleştirin. Su paraziti nedeniyle görüntünün bozulmasını önlemek için bobin ile ısıtma battaniyesi arasında biraz mesafe bırakmaya dikkat edin.
  5. Fareyi ve görüntüleme yatağını tarama için uygun konuma getirin.
  6. Alım yazılımındaki Wobble kurulum adımını başlatarak MRI bobinlerini ayarlayın ve eşleştirin. MRG'nin servis ucunda, izin ortalandığından (akort) ve mümkün olduğunca derin (eşleşme) olduğundan emin olmak için bobin üzerindeki ayar ve kibrit düğmelerini kullanın.
  7. Üç düzlemli bir lokalizatör taraması edinin ve gerekirse beyni mıknatısın izomerkez noktasına konumlandırmak için görüntüleme yatağını ayarlayın.
  8. Aşağıdaki parametrelerle tümöre enjekte edilen ajanı tespit etmek için 2D T2 ağırlıklı taramalar elde edin: tekrarlama süresi (TR) = 2500 ms, yankı süresi (TE) = 25 ms, görüş alanı (FOV) 20 x 20 mm, 18 koronal dilim, 0,2 mm dilim aralığı, 150 x 150 μm düzlem içi çözünürlük, 0,5 mm dilim kalınlığı.
  9. Mapshim yardımcı programını kullanarak lokalize bir şim hesaplamak için tüm beynin bir B0 haritasını edinin. Ardından, TR = 30 ms, TE = 10 ms, FOV 20 x 15 x 12 mm, çözünürlük 100 μm izotropik olan nanopartikülleri görselleştirmek için 3D T2 ağırlıklı görüntüleri kullanın.
  10. Tümör üzerinde pozisyon taraması için referans olarak 2D T2 ağırlıklı görüntüyü kullanarak daha fazla nanopartikül görüntüleme için T2* haritasını edinin. TR = 800 ms, TE = 3,5 ms kullanın. FOV 20 x 20 mm, 5 koronal dilim, dilim boşluğu yok. Düzlemde çözünürlük: Düzlemde 100 μm. 5 ms yankı zaman aralığı ile 10 pozitif yankı görüntüsü elde edin.
  11. Görüntüleme dizileri boyunca solunumu ve vücut ısısını izleyin ve gerekirse izofluran ve su sıcaklığını ayarlayın.
  12. Görüntülemeden sonra, fareyi MRI tarayıcısından çıkarın ve ısıtılmış bir kurtarma kafesine yerleştirin. Anesteziden ve ayaktan tamamen iyileşene kadar fareyi izleyin.

7. Ex vivo biyolüminesans ve floresan görüntüleme

  1. İn vivo görüntülemeye benzer şekilde IVIS'te ex vivo biyolüminesans ve floresan görüntüleme gerçekleştirin. IVIS başlatma ve tarama ayarı adımlarını yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
  2. Deneysel son noktada, fareyi tartın ve 150 mg / kg'lık bir dozaj için uygulanacak D-lusiferin hacmini hesaplayın. D-lusiferin dozunu enjekte edin ve daha önce tarif edildiği gibi enjeksiyondan 10 dakika sonra canlı görüntüleme yapın.
  3. Son in vivo biyolüminesans ve floresan görüntülemeden sonra, hala anestezi altındayken fareyi servikal çıkık ile hızlı bir şekilde ötenazi yapın, fareyi disseke edin ve beyin de dahil olmak üzere ana organları bir Petri kabında toplayın.
  4. Eksize edilmiş organları içeren Petri kabını IVIS tarayıcısına yerleştirin ve in vivo görüntüleme ile aynı edinim ayarlarını kullanarak organları hem biyolüminesans hem de floresan modaliteleriyle görüntüleyin.
  5. OCT'de daha fazla analiz için gerekli olan tüm organları, OCT'deki numune ile kriyokalıbı, OCT tamamen beyaza dönene kadar uzun forseps ile sığ bir sıvı nitrojen havuzuna yavaşça indirerek dondurun. OCT'nin kabarcıklanması meydana geleceğinden, sıvı nitrojenin sıvı OCT'ye dokunmasına veya kalıbı çok hızlı bir şekilde indirmesine izin vermeyin. Dondurulmuş numuneleri -80 °C'de saklayın.
  6. Tümörü içeren beyni OCT'de saklayın ve kriyoseksiyon için flaş dondurma yapın. Analiz için ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın.

8. Floresan mikroskobu

  1. Kriyostatı kriyoseksiyon için hazırlayın. Hazne ve numune kafası sıcaklıklarını -15 °C ile -20 °C arasında ayarlayın.
  2. OCT'de donmuş beyni -80 °C'lik depodan çıkarın ve kriyostat odasına yerleştirin. Kesitlere ayırmadan önce numunelerin hazne sıcaklığına (-20 °C) ısınmasına izin verin.
  3. Tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanarak beyni enjeksiyon bölgesinde koronal olarak kesin. Bu genellikle beynin yüzeyinde bir çukur olarak görülür. Beynin kesilecek tarafını konumlandırmak için az miktarda OCT kullanarak numuneyi numune diskine monte edin. Numunenin dengeli bir şekilde monte edilmesini sağlamak için haznenin içindeki soğutulmuş ağırlıkla yeterli basınç uygulayın.
  4. Takılan numuneyi ve numune diskini, kesit almaya hazırlanırken numune kafasına taşıyın. 20 μm'lik kesitler alarak dokuyu istenen derinliğe kadar kesin, dokuyu dokuyla mümkün olduğunca aynı hizada olacak şekilde kesit alacak şekilde numunenin açısını ayarlayın.
  5. İstenen doku derinliğine ulaşıldığında, kriyostatı numunenin 5-7 μm'lik bölümlerini alacak şekilde ayarlayın. Mikroskop lamının yüklü tarafını bölümün üzerine hızlı bir şekilde indirerek bölümleri, fare kimliği, doku kesitli ve slayt numarası gibi tanımlayıcılarla önceden etiketlenmiş cam slaytlara monte edin.
  6. Taze %4 paraformaldehit (PFA) yapın. Dokuyu sabitlemek için slaytı doku ile PFA çözeltisine 15 dakika batırın. Sabitlemeden sonra sürgüyü DPBS 3x ile durulayın.
  7. Cam slayt üzerindeki şimdi sabitlenmiş doku bölümüne, hücre çekirdeklerini boyayan 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren 40 μL'lik bir montaj ortamı damlası ekleyin. Montaj ortamının üzerine dikkatlice 24 mm x 50 mm'lik bir cam lamel yerleştirin ve tüm dokunun montaj ortamıyla kaplandığından emin olun.
  8. DAPI (359 nm'de emisyon (em), 457 nm'de uyarma (ex)) ve Cy5.5 (ex 683 nm, em 703 nm) floresan mikroskobu kullanarak dokuyu görselleştirin.

Sonuçlar

MN-anti-miR10b, daha önce tarif edildiği gibi sentezlendi ve karakterize edildi11. MN-anti-miR10b'nin transmisyon elektron mikroskobu, nano platformun morfolojisini ve polidispersitesini gösterir (Şekil 1B). Bu nano platformun ortalama büyüklüğü 25.12 ± 0.34 nm olup, zeta potansiyeli 13.18 ± 1.47 mV'dir (Şekil 1C,D). Bu çalışmalarda, çıplak atimik farelere, yukarıda açıklanan protokol izlenerek U251 insan glioblastoma hücreleri orttopik olarak implante edildi. Sistemik intravenöz MN-anti-miR10b enjeksiyonları 20 mg Fe / kg'da yapıldı. Farelere ötenazi yapıldı ve nano ilacın son dozundan 7 gün sonra dokular toplandı. MN-anti-miR10b enjekte edilen farelerdeki Cy5.5 floresan ve biyolüminesans sinyalleri, nanopartiküllerin tümöre verildiğini gösteren net bir ko-lokalizasyon gösterdi (Şekil 2A, B), kontrol fareleri ise floresan sinyali göstermedi. Ex vivo floresan görüntüleme, nanopartiküllerin karaciğer ve böbrekler gibi ana klirens organlarında lokalizasyonunu gösterdi ve bu tip nanopartiküller için beklenen şey budur (Şekil 2C). Ayrı bir çalışmada, farelere yukarıdaki gibi ortotopik olarak GBM hücreleri implante edildi ve in vivo MR görüntülemeye tabi tutuldu. T2 * ağırlıklı görüntüler ve T2 * haritaları, nanopartiküllerin uygulanmasından önce ve tek bir 20 mg Fe / kg dozundan 24 saat sonra elde edildi. T2 ağırlıklı MRG sinyalinde karakteristik bir azalma, bir MRG kontrast maddesi olarak MN-anti-miR10b'nin kan-beyin bariyerini geçme potansiyelini ve tümör bölgesinde birikimini göstermektedir (Şekil 3). İn vivo görüntülemeyi takiben, nanopartiküllerin tümöre iletimini daha fazla doğrulamak için floresan mikroskobu yapıldı. Yukarıda tarif edildiği gibi, dokular kesitlere ayrıldı ve DAPI boyaması ile mikroskopi için hazırlandı. Tümör bölgesinde Cy5.5 floresan sinyali gösterildi ve doğumu doğruladı (Şekil 4).

figure-results-1
Şekil 1. MN-anti-miR10b'nin karakterizasyonu. (A) Bir MN-anti-miR10b'nin şematik yapısı. Nano platform, dekstran ile kaplanmış, bir Cy5.5 optik boya ile etiketlenmiş ve terapötik oligonükleotid (anti-miR10b) ile konjuge edilmiş bir demir oksit çekirdeğinden oluşur. BioRender.com ile oluşturuldu. (B) MN-anti-miR10b'nin transmisyon elektron mikroskobu. (C) Yapının hidrodinamik boyutu 25.12 ± 0.34 nm'dir. (D) MN-anti-miR10b'nin zeta potansiyeli 13.18 ± 1.47 mV'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. GBM modelinde in vivo ve ex vivo çalışmalar.(A) İn vivo biyolüminesans görüntüleme (solda) ve floresan görüntüleme (sağda), tümör bölgesindeki manyetik nanopartikül sinyalinin birlikte lokalizasyonunu gösterir. (B) Eksize edilen beyinlerin ex vivo biyolüminesans ve floresan görüntülemesi, sinyalin birlikte lokalizasyonunu doğrular. (C) Organların biyolojik dağılımı, ana temizleme organlarına birikim gösterir. B: Beyin; H: Kalp; Lu: Akciğerler; Li: Karaciğer; S: dalak; K: Böbrekler; M: Kas; (tüm gruplar için n=6). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. İn vivo GBM modelinde MRG. T2* ağırlıklı (üst sıra) ve T2* haritaları (alt sıra) MN-anti-miR10b'nin enjeksiyonundan önce (solda) ve enjeksiyondan 24 saat sonra (sağda) elde edilen görüntüler. Enjeksiyon sonrası görüntüdeki sinyal yoğunluğundaki azalma, demir oksit birikiminin göstergesidir (n=3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. Tümör dokularının ex vivo floresan mikroskobu. Temsili mikroskobik görüntüler nanopartikül birikimini göstermektedir. Mavi - DAPI, Macenta - Cy5.5. Ölçek Çubuğu = 100 μm; (tüm gruplar için n=6). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

BBB boyunca nanopartiküllerin birikimini doğrulamak için farklı yöntemler arasında birkaç kritik adım, protokolün başarısı için belirleyici olabilir. GBM hücrelerinin ortotopik implantasyonundan başlayarak, kemik kuruduktan sonra kafatasının dikiş çizgilerinin görünür olmasını sağlamak önemlidir; Bu, tümör hücrelerinin doğru yerleştirilmesine yardımcı olur. Kafatasını delmek için, matkap bölgesine hafif bir basınç uygulamak ve kemikte sığ bir izlenim bırakmak için delmeye başlamak en iyisidir. İlk işaretleme yapıldıktan ve doğru konuma getirildikten sonra, minimum matkap kayması ile delmek daha kolaydır. Beyne verilen zararı en aza indirmek için kafatasını kırdıktan sonra delmeyi hemen bırakın. Nanopartiküllerin ve diğer ajanların intravenöz enjeksiyonu sırasında, potansiyel olarak ölümcül venöz hava embolilerini önlemek için enjeksiyon solüsyonunda hava kabarcığı olmadığından emin olmak çok önemlidir. Bu protokolü takiben kuyruk damarına başarılı bir şekilde girişin bazı göstergeleri, şırıngaya kan çekilmesi ve iğnenin ucunun etrafındaki kuyruk damarındaki renk kaybıdır. Eksize edilen dokuların ex vivo biyolüminesans ve floresan görüntülemesi için, biyolüminesans sinyali zamanla bozulmaya başladığından hızlı bir şekilde çalışmak en iyisidir. Biyolüminesans sinyal kinetiği hücre hatları arasında farklılık gösterebilir, bu nedenle belirli modelleri anlamak önemlidir.

Nanopartikül lokalizasyonunun tespitine yardımcı olmak için belirli adımlar değiştirilebilir. İn vivo biyolüminesans görüntüleme sırasında, tümör hücresi implantasyonundaki ve tümör büyüme oranlarındaki değişiklikler biyolüminesans sinyalinde farklılıklara yol açabilir. Bazı durumlarda, en yüksek BLI sinyaline sahip fare, taramanın maruz kalma süresini kısaltabilir ve bu da diğer farelerde algılanan sinyalin azalmasına neden olabilir. Bu durumda, BLI ve FLI ko-lokalizasyonu amaçları için farelerin aynı konumda kalması için floresan taramasına devam edilmesi tavsiye edilir. Ardından, ilk BLI taramasında sinyal gösteren fareleri çıkardıktan sonra biyolüminesans için yeniden görüntüleyin. Bu, maruz kalma süresi hesaplamasının bu düşük sinyalli farelere ve nihayetinde tümörün tespitine dayanmasına neden olacaktır. İn vivo floresan görüntüler alırken, vücuttaki nanopartikül lokalizasyonu, kuyruğu siyah kağıtla kaplayarak daha iyi tespit edilebilir, bu da kuyruk damarı enjeksiyonlarından kalan nanopartikül varlığından yüksek bir floresan sinyaline sahip olabilir. Benzer bir akıl yürütme çizgisinde, organların ex vivo floresan taraması sırasında, beynin tek başına görüntülenmesi, nanopartikülün beyin ve tümör bölgesindeki lokalizasyonunu daha iyi gösterebilir, çünkü nanopartikülün retiküloendotelyal sistem organlarında birikmesi sinyal algılamasını gizleyebilir.

Terapötik RNA iletimi için bu yöntemin bir sınırlaması, nanopartiküllerin vücuttaki sistemik dağılımıdır. Diğer tüm sistemik enjeksiyonlarda olduğu gibi, terapötik karaciğer, böbrekler ve dalak gibi organlar tarafından kan dolaşımından uzaklaştırılır ve sonuçta nanopartikülün ilgilenilen bölgeye verilmesinin azalmasına neden olur. Bu sorunu çözmek için, MN-anti-miR10b, vücuttaki dolaşım süresini artırmak için çapraz bağlı bir dekstran kaplama ile sentezlenmiştir13. Nanopartikül yapısını optimize ederek dolaşım süresini ve birikimini artırma çabalarına rağmen, spesifik modele ve hastalık durumuna bağlı olarak tümör bölgesinde önemli birikim için nanopartikülün çoklu enjeksiyonları gerekebilir.

GBM'de terapötik moleküllerin verilmesi, oldukça seçici BBB nedeniyle önemli bir zorluk teşkil etmektedir. Birçok çalışma, boyutları veücretleri 5,6,7 nedeniyle BBB'nin penetrasyonunda sonuçta etkisiz olan nanopartikül bazlı dağıtım araçlarını test etmiştir. Burada açıklanan 25 nm nanopartikül yapısı, MN-anti-miR10b, sistemik olarak enjekte edildiğinde bu fizyolojik bariyeri geçebilir ve tümör bölgesinde birikebilir. Bu nanoparçacık platformu, RNA moleküllerinin GBM'ye iletilmesine aracılık etme potansiyeline sahiptir ve görüntüleme kullanılarak dağıtım aracının birikiminin izlenmesine izin verir. Demir oksit nanopartiküllerinin biyolojik dağılımı, retiküloendotelyal sistem organlarında temizlenme için biriktikleri beklenen bir modeli takip eder. Görüntüleme veya terapötik amaçlar için kullanılan benzer nanopartiküller ile benzer biyodağılım bildirilmiştir. Önemli olarak, bu önceki çalışmalarda, 30 mg Fe / kg 14,15'lik bir dozda bile, ana organlarda ilişkili hedef dışı toksisitelere dair hiçbir belirti yoktu.

Bu nanopartikül platform sisteminin bir avantajı, birikiminin non-invaziv olarak izlenmesine izin veren in vivo görüntüleme yetenekleridir. Dekstran kaplamaya konjuge edilmiş Cy5.5 yakın kızılötesi floresan boya, varlığını tespit etmek için hızlı optik görüntülemeye izin verir. Bu modaliteye ek olarak, MN-anti-miR10b'nin süperparamanyetik demir oksit nanopartikül çekirdeği, yapıyı bir MRI kontrast maddesi olarak uygun hale getirir ve teranostiklerin16 gelişmekte olan bir alanını temsil eder. Demir oksit nanopartikül kontrastı ile birlikte MRG'nin anatomik çözünürlüğü, nanopartiküllerin beyinde nerede biriktiğini kesin olarak gösterebilir. Bu iki modalite birlikte, RNA'nın veya diğer yüklerin BBB boyunca iletimini izlemek için nano platformun klinik öncesi in vivo takibini mümkün kılar.

Açıklamalar

Z.M. ve A.M., TransCode Therapeutics, Inc.'in kurucu ortakları ve hissedarlarıdır. Kalan yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışmanın finansmanı kısmen Henry Ford Sağlık Sistemleri Michigan Eyalet Üniversitesi Sağlık Bilimleri İttifakı'ndan ve ADC'ye verilen hibe ile sağlanmıştır. Michigan Eyalet Üniversitesi'nde hayvan çalışmalarını denetlediği ve bu videoyu onayladığı için Dr. Danielle R. Ferguson'a teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Atimik çıplak "J: NU" farelerJackson LaboratuvarıRRID: IMSR_JAX: 007850Bağışıklığı baskılanmış fare modeli
% 0.25 TripsinGibco25200-056
1.7 mL mikrosantrifüj tüpüDOT ScientificRN1700-GMTDoku toplama
10 ve mikro; L, Nöros Şırınga, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4Hamilton65460-06Tümör hücrelerinin intrakraniyal implantasyonu için şırınga
3M Vetbond3M1469SBCerrahi alan kapatma için doku yapıştırıcısı
%4 Paraformaldehit Thermo ScientificJ199943-K2Doku sabitleme solüsyonu
% 70 izopropoyl alkollü mendilKardinalMW-APLTümör implantasyonu ve kuyruk damarı enjeksiyonu için topikal antiseptik mendil
Aperio VersaLeicaLekeli doku kesiti slaytlarının taranması için
Betadine Surgical ScrubPurdue6761815101Tümör implantasyonu
için topikal antiseptikBioSpec 70/30BrukerManyetik rezonans görüntüleme tarayıcı
Kemik MumuMedlineDYNJBW25İmplantasyon bölgesini sızdırmaz hale getirmek için kemik mumu
FSTiçin çapaklar19007-05Tümör implantasyonu için kafatasında delik açmak için kullanılan matkap çapağı
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech0100-20DAPI boyası içeren doku montaj ortamı
Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)Gibco11995-065U251
Ekstra İnce Graefe ForsepsFST11150-10Tümör implantasyonu için sujik alet
Fetal sığır serumuCorning35-010-CVU251 İnce Makas için hücre kültürü ortamı takviyesi
- Keskin 10.5cmFST14060-10Tümör implantasyonu için sujik alet
Glydo (Lidokain)Sagent673-76Cerrahi bölge için topikal analjezik
İdeal Mikro MatkapCellPoint Scientific67-1200ATümör implantasyonu için kafatasında delik açmak için kullanılan matkap
İnsülin şırıngası 1CC 29G X 1/2 "Becton, Dickinson324704 D-Luciferin enjeksiyonu ve kuyruk damarı enjeksiyonu için şırınga nanopartiküller
İzofluranCovetrus11695067772Anethesia
İzofluran buharlaştırıcıSOMNI ScientificVS6002Anethesia cihazı
IVIS SpectrumCT In Vivo Görüntüleme SistemiPerkinElmer/Revvity128201Biyolüminesans ve floresan görüntüleme tarayıcısı
IVISbrite D-Luciferin Potasyum TuzuPerkinElmer/Revvity122799-100MGBiyolüminesans görüntüleme için substrat
Ketaset (Ketamin)Zoetis10004027Tümör implantasyon cerrahisi için anestezik
Ketofen (Ketoprofen)Zoetis10004031Tümör implantasyon cerrahisi için analjezik
Leica CM1950LeicaCM1950OCT gömülü numunelerin kriyoseksiyonu için
PBSGibco14190-144U251
Penisilin-streptomisinGibco15140-122U251
Puralube veteriner merhemiMWI Veteriner27505Tümör implantasyonu sırasında koruma için oftalmik göz merhemi
CetvelFST18000-30İmplanasyon için matkap alanını ölçmek için kullanılır
Tissue-Tek Cryomold  Orta seviye 15 x 15 x 5 mmSakura4566Doku örneklerini toplamak için toplama kalıbı
Doku-Tek O.C.T. BileşiğiSakura4583Doku örneklerini toplamak için dondurma bileşiği
U-251 MG hücre hattı insanMillapore Sigma9063001İnsan glioblastoma hücre hattı
Ksilazin Enjekte Edilebilir Solüsyon, 100 mg / mlCovetrus1XYL006Tümör implantasyon cerrahisi için felçli
U251 için hücre kültürü reaktifi Mikro matkap için hücre kültürü ortamı implantasyonu için hücre kültürü reaktifi ve hücre süspansiyon çözeltisi

Kaynaklar

  1. Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA Cancer J Clin. 70 (4), 299-312 (2020).
  2. Cihoric, N., et al. Current status and perspectives of interventional clinical trials for glioblastoma - analysis of clinicaltrials.Gov. Radiat Oncol. 12 (1), 1(2017).
  3. Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes Dis. 3 (3), 198-210 (2016).
  4. Dong, X. Current strategies for brain drug delivery. Theranostics. 8 (6), 1481-1493 (2018).
  5. Teleanu, D. M., Chircov, C., Grumezescu, A. M., Volceanov, A., Teleanu, R. I. Blood-brain delivery methods using nanotechnology. Pharmaceutics. 10 (4), 268(2018).
  6. Ohta, S., et al. Investigating the optimum size of nanoparticles for their delivery into the brain assisted by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Sci Rep. 10 (1), 18220(2020).
  7. Teplyuk, N. M., et al. Therapeutic potential of targeting microrna-10b in established intracranial glioblastoma: First steps toward the clinic. EMBO Mol Med. 8 (3), 268-287 (2016).
  8. Dube, T., Kumar, N., Bishnoi, M., Panda, J. J. Dual blood-brain barrier-glioma targeting peptide-poly(levodopamine) hybrid nanoplatforms as potential near infrared phototheranostic agents in glioblastoma. Bioconjug Chem. 32 (9), 2014-2031 (2021).
  9. Yoo, B., et al. Design of nanodrugs for mirna targeting in tumor cells. J Biomed Nanotechnol. 10 (6), 1114-1122 (2014).
  10. Medarova, Z., Pham, W., Farrar, C., Petkova, V., Moore, A. In vivo imaging of sirna delivery and silencing in tumors. Nature Medicine. 13 (3), 372-377 (2007).
  11. Chen, M., et al. Co-administration of temozolomide (tmz) and the experimental therapeutic targeting mir-10b, profoundly affects the tumorigenic phenotype of human glioblastoma cells. Front Mol Biosci. 10, 1179343(2023).
  12. Irtenkauf, S. M., et al. Optimization of glioblastoma mouse orthotopic xenograft models for translational research. Compar Med. 67 (4), 300-300 (2017).
  13. Moore, A., Marecos, E., Bogdanov, A., Weissleder, R. Tumoral distribution of iron oxide nanoparticles in a rodent model. Radiology. 214 (2), 568-574 (2000).
  14. Moore, A., Medarova, Z., Potthast, A., Dai, G. In vivo targeting of underglycosylated muc-1 tumor antigen using a multimodal imaging probe. Cancer Res. 64 (5), 1821-1827 (2004).
  15. Yoo, B., et al. Therapy targeted to the metastatic niche is effective in a model of stage iv breast cancer. Sci Rep. 7, 45060(2017).
  16. Dadfar, S. M., et al. Iron oxide nanoparticles: Diagnostic, therapeutic and theranostic applications. Adv Drug Deliv Rev. 138, 302-325 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kan Beyin BariyeriDemir Oksit Nanopartik lleriManyetik Rezonans G r nt lemeFloresans G r nt lemeBiyol minesans G r nt lemeT m r Birikimi
Bir Glioblastoma Multiforme Hayvan Modelinde Bir Oligonükleotid Yükünün Nanopartikül Teslimi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.