Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kimerik Antijen Reseptörü T Hücrelerinde İn Vitro Genom Çapında CRISPR Nakavt Taraması Gerçekleştirme

1.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67338

⸱

31 Ocak 2025

 ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, 3Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Mayo Clinic, 4Center for Regenerative Biotherapeutics, Mayo Clinic, 5Division of Hematology, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

Bu makalede

Özet

Makale, sağlıklı donör kimerik antijen reseptörü T hücrelerinde genom çapında bir CRISPR nakavt ekranını tamamlamak için tükenme için bir in vitro modelin uygulanması için bir protokolü açıklamaktadır.

Özet

Kimerik antijen reseptörü T (CART) hücre tedavisi, kanser tedavisinde devrim yaratan yenilikçi bir hedefe yönelik immünoterapi şeklidir. Bununla birlikte, kalıcı yanıt sınırlı kalmaktadır. Son çalışmalar, preinfüzyon CART hücre ürünlerinin epigenetik manzarasının tedaviye yanıtı etkileyebileceğini göstermiştir ve gen düzenlemesi bir çözüm olarak önerilmiştir. Bununla birlikte, optimal gen düzenleme stratejisini belirlemek için daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir. Genom çapında CRISPR ekranları, hem direnç mekanizmalarını araştırmak hem de gen düzenleme stratejilerini optimize etmek için popüler araçlar haline geldi. Yine de birincil hücrelere uygulanmaları birçok zorluk ortaya çıkarmaktadır. Burada, sağlıklı donörlerden alınan CART hücrelerinde genom çapında bir CRISPR nakavt ekranını tamamlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Bir kavram kanıtı modeli olarak, CD19 antijenini hedefleyen CART hücrelerinde tükenme gelişimini araştırmak için bu yöntemi tasarladık. Bununla birlikte, bu yaklaşımın farklı CAR yapılarında ve tümör modellerinde tedaviye karşı çeşitli direnç mekanizmalarını ele almak için kullanılabileceğine inanıyoruz.

Giriş

Kimerik antijen reseptörü T (CART) hücre tedavisi, B hücreli malignitelerin tedavisinde etkileyici bir başarı göstermiştir; Bununla birlikte, dayanıklı yanıt %30-40 ile sınırlıdır1,2,3,4,5. Araştırmacılar, CAR tasarımının optimizasyonu, gen düzenleme ve kombinasyon tedavileri dahil olmak üzere CART hücre tedavisine direnç mekanizmalarını ele almak için çeşitli yaklaşımlar geliştirmiş ve test etmiş olsalar da, direncin gelişimi büyük ölçüde bilinmemektedir. Son zamanlarda, preinfüzyon CART hücre ürünlerinin başlangıç gen ekspresyon profilinin, CART tedavisinin 6,7,8,9 hem toksisitesinin hem de etkinliğinin önemli bir belirleyicisi olduğuna dair artan kanıtlar olmuştur. Bu nedenle, CART hücre üretimi sırasında gen düzenleme, CART hücre tedavisinin başarısını artırmak için popüler bir yaklaşım haline gelmiştir.

Örneğin, laboratuvarımız daha önce gen granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktörü (GM-CSF) devre dışı bırakmak için kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) Cas9 teknolojisinin kullanılmasının CART hücre aktivitesini iyileştirdiğini ve CART ile ilişkili toksisite belirtilerini azalttığını göstermiştir 10,11,12. Ek olarak, CRISPR ile tasarlanmış hücre tedavisi klinik çalışmalarda test edilmiş ve etkinlik ve güvenlik göstermiştir13. Birlikte, bu, CRISPR teknolojisi ile gen düzenlemenin yalnızca CART hücre biyolojisi anlayışımızı geliştirmekle kalmayıp, aynı zamanda çevrilebilir CART hücre ürünleri de üretebileceğini göstermektedir.

Genom çapında CRISPR nakavt ekranları, terapötiklere direnç mekanizmalarını anlamak için kanser biyolojisi araştırmalarında giderek daha popüler araçlar haline geldi. Bu teknikte, hücre başına bir gRNA'nın girişini teşvik etmek için on binlerce kılavuz RNA (gRNA) hücre havuzlarına verilir14. Daha sonra hücreler, temel genleri hedefleyen gRNA'larla dönüştürülen hücrelerin öldüğü ve inhibitör genleri hedefleyen gRNA'larla dönüştürülen hücrelerin hayatta kaldığı ve çoğaldığı basınca neden olan koşullara tabi tutulur. Yeni nesil dizileme kullanarak, gRNA temsilinin CRISPR ekranı14 boyunca nasıl değiştiğini belirleyebiliriz.

Bununla birlikte, genom çapında gen bozulmaları için gereken ölçek ve seçim süresinin, CART hücreleri gibi birincil hücrelerde gerçekleştirilmesi zor olabilir. Bu nedenle, gruplar terapötik dirençmekanizmalarını daha iyi anlamak için hedefli CRISPR ekranlarını kullanmışlardır 15,16. Hedeflenen ekranların birincil hücrelerde tamamlanması genellikle daha kolaydır, çünkü yeterli kitaplık gösterimi elde etmek için daha az hücre gerektiren daha küçük kitaplıklara sahiptirler. Bu çalışmalar, CART hücre tedavisine direnç mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı geliştirmiş olsa da, hedefe yönelik ekranlar, gen hedeflerinin manuel olarak seçilmesi nedeniyle bir önyargı ortaya koymaktadır. Bu makale, sağlıklı donörlerden alınan CART hücrelerinde in vitro genom çapında bir CRISPR nakavt ekranını tamamlamak için bir yöntemi tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu nedenle, bu yüksek verimli yaklaşım, terapötik yanıtları iyileştirmek için düzenlenebilen temel yolların ve genlerin verimli, tarafsız bir şekilde tanımlanmasına olanak tanır 17,18,19.

Özellikle, bu makalede açıklanan protokol, genom çapında CRISPR nakavt ekranını tükenme için bir in vitro modelle tamamlayarak alanın CART hücre tükenmesi konusundaki anlayışını artırmak için tasarlanmıştır. Tükenme, CART hücre tedavisine yanıt vermemeyle ilişkilendirilen işlevsiz bir CART hücre kaderidir 20,21,22. Bu hücresel kaderin epigenetik olarak düzenlendiği bilinmektedir ve CART hücre proliferasyonunda bir azalma, efektör sitokin üretiminde bir azalma ve inhibitör reseptörlerin ekspresyonunda bir artış ile karakterize edilir23. Önceki literatürde, gen düzenleme, anahtar genleri yukarı veya aşağı regüle ederek tükenme gelişimini önleyebilmiştir 24,25,26. Hem CART hücreleri tükendikçe proliferatif kabiliyetteki azalma hem de gen düzenlemenin oluşumunu önleyebileceğine dair kanıtlar göz önüne alındığında, in vitro genom çapında CRISPR nakavt ekranımızı bu hücresel kader üzerinde modelledik. Bununla birlikte, bu protokol gelecekte CART hücre tedavisine karşı diğer direnç mekanizmalarını araştırmak için değiştirilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Daha da önemlisi, aşağıda özetlenen protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB 18-005745) ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (IBC HIP00000252.43) yönergelerini takip eder ve bunlardan onay almıştır. Lentiviral üretim de dahil olmak üzere tüm hücre kültürü çalışmaları, uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip bir hücre kültürü başlığında gerçekleştirilmelidir. Özellikle, lentiviral çalışma, bertaraf edilmeden önce öğeleri dezenfekte etmek için %2 çamaşır suyu kullanımı da dahil olmak üzere biyogüvenlik seviye 2 (BSL-10) önlemleri altında yapılmalıdır.

1. CRISPR Kütüphanesinin Güçlendirilmesi

  1. CRISPR kitaplığını üreticinin tavsiyelerine göre yükseltin. Kısaca, aşağıdakileri tamamlayarak CRISPR kütüphanesini dört elektroyetkin hücre alikotuna elektrostatik hale getirin:
    1. 1.0 mm'lik bir küvette 25 μL elektroyetkin hücreye 2 μL 50 ng/μL CRISPR kütüphane plazmidi ekleyin.
    2. Aşağıdaki ayarları kullanarak numuneleri elektrostatik hale getirin: 10 μF, 600 Ohm, 1.800 volt ve 3,5 ms ile 4,5 ms arasında bir zaman sabiti.
    3. 975 μL geri kazanım ortamında geri kazanın ve ek 1 mL geri kazanım ortamı içeren bir tüpe aktarın.
    4. Tüm alikotları 250 °C'de 1 saat boyunca 37 RPM'de döndürün.
  2. Dönüşümleri plakalayın:
    1. Elektroporasyonlu hücrelerin tüm alikotlarını bir araya getirin ve iyice karıştırın.
    2. 400 μL dönüşüm karışımını 100 μg / mL karbenisilin ile önceden ısıtılmış 10 cm Luria suyu (LB) plakalarına yayarak tüm elektroporasyonlu hücreleri plakalayın. Plakayı 14 saat boyunca 32 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin.
  3. Kolonileri hasat edin:
    1. Her plakaya 1 mL LB ortamı + 100 μg/mL karbenisilin pipetleyin. Kolonileri her plakadan kazıyın ve 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın.
    2. Yıkamak ve tam iyileşme sağlamak için her plakaya 1 mL LB ortamı + 100 μg/mL karbenisilin daha ekleyin.
    3. Bir maksi hazırlık kitinin talimatlarını izleyerek bir maksi hazırlık yapın.
    4. Elde edilen plazmit DNA'sını bir araya getirin.

2. CRISPR kütüphanesinde temel gRNA temsilini doğrulamak için yeni nesil dizileme

NOT: Bu CRISPR kütüphanesi için NGS primerleri, önceki bir yayındatasarlanmıştır 27. Her numune için farklı bir ters astar kullanmak, her numuneyi barkodlayacak ve sıralama sırasında numunelerin havuzlanmasına izin verecektir.

  1. Numuneleri aşağıdaki reaksiyon karışımıyla PCR için hazırlayın (toplam hacim = 50 μL): yüksek kaliteli PCR ana karışımı, 2x: 25 μL; havuzlanmış şablon DNA, 0.5 μg: 1 μL; NGS kütüphanesi ileri astar, 10 μM: 1.25 μL; NGS kütüphanesi ters astar, 10 μM: 1.25 μL; DNaz içermeyen su: 21,5 μL.
  2. Aşağıdaki döngü koşullarıyla PCR gerçekleştirin: döngü 1: 98 °C'de 3 dakika denatüre; döngü 2-23: 98 °C'de 10 saniye denatüre etme, 63 °C'de 10 saniye tavlama, 72 °C'de 25 saniye uzatma; döngü 24: 72 °C'de 2 dakika uzatın.
  3. Her numune için PCR reaksiyonlarını bir araya getirerek ve PCR ürününü üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti ile saflaştırarak PCR reaksiyonunu saflaştırın.
  4. %2 (a/h) agaroz jel üzerinde her numune için 3 μg PCR ürünü çalıştırın.
  5. Üreticinin talimatlarına göre bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı jelden çıkararak PCR ürününü (~ 260-270 bp) jelden çıkarın. En az 500 ng DNA hedefleyin.
  6. Ekstrakte edilen numuneleri -20 °C'de saklayın.
  7. Örneklerle yeni nesil dizileme (NGS) gerçekleştirin ve gRNA27 başına 100 okuma hedefleyin.




  6. figure-protocol-1

  7. figure-protocol-2







Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CART hücre aktivitesini tarafsız bir şekilde iyileştirmek için düzenlenebilen genleri ve yolları sorgulamak için, in vitro genom çapında bir CRISPR nakavt ekranı tasarladık (Şekil 1). Bu ekranın iki aşaması vardır: bir CART hücresi üretim aşaması ve seçici bir basınç aşaması. CART hücre üretim aşamasında, en az 110 × 106 T hücresi önce sağlıklı donör PBMC'lerden izole edilir ve CD3 + / CD28 + boncukları ile aktive edilir. Ertesi gün, 1. günde...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Gen düzenleme, hem tedavilere direnç mekanizmalarını anlamada hem de CART hücrelerinin ömrünü ve aktivitesini iyileştirmek için yeni CART hücre tedavileri tasarlamada güçlü bir araç haline gelmiştir 16,17,26. Bazı gen düzenleme stratejileri hem klinik öncesi modellerde hem de klinik çalışmalarda CART hücre aktivitesinde iyileşmeler göstermiş olsa da, gen düzenleme stratejilerini optimize etmek i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

SSK, Novartis'e (Mayo Clinic, Pennsylvania Üniversitesi ve Novartis arasındaki bir anlaşma yoluyla), Humanigen'e (Mayo Clinic aracılığıyla), Mettaforge'a (Mayo Clinic aracılığıyla) ve MustangBio'ya (Mayo Clinic aracılığıyla) ve Chymal therapeutics'e (Mayo Clinic aracılığıyla) lisanslı CAR immünoterapi alanındaki patentlerin mucididir. CS, CMR ve SSK, Immix Biopharma'ya lisanslı patentlerin mucitleridir. SSK, Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Hayvan Sağlığı Laboratuvarları A.Ş. ve Lentigen'den araştırma fonu almaktadır. SSK, Kite/Gilead, Calibr, Luminary Therapeutics, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio ve Novartis ile danışma toplantılarına katılmıştır. SSK, Humanigen ve Carisma ile veri güvenliği ve izleme kurulunda görev almıştır. SSK, Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, BMS, Carisma ve Humanigen için bir danışman ayırdı. CMS ve SSK, bu protokolden kaynaklanan fikri mülkiyetin mucitleridir.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Mayo Clinic Bireyselleştirilmiş Tıp Merkezi (SSK), Mayo Clinic Kapsamlı Kanser Merkezi (SSK), Mayo Clinic Rejeneratif Biterapötikler Merkezi (SSK), Ulusal Sağlık K12CA090628 Enstitüleri (SSK) ve R37CA266344-01 (SSK), Savunma Bakanlığı hibe CA201127 (SSK), Predolin Vakfı (SSK) ve Minnesota Biyoteknoloji ve Tıbbi Genomik Ortaklığı (SSK) tarafından finanse edilmiştir. CMS, Mayo Clinic Biyomedikal Bilimler Enstitüsü tarafından desteklenmektedir. CRISPR ekran şeması (Şekil 1) BioRender.com (Siegler, L. (2022) https://BioRender.com/k71r054) ile oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
293T hücreleriATCCCRL-3216Lentivirüs üretimi için kullanılan hücreler
Biotin ProteinL AntikoruGenScriptM00097CAR tespiti için anti-kappa zincir antikoru
Sığır Serumu AlbüminMillipore SigmaA7906
Karbenisilin disodyum tuzuMillipore SigmaC1389-1GKarbenisilin antibiyotik
CD4 İzolasyonu BoncukMiltenyi Biotec130-045-101 
CD8 İzolasyon BoncuklarıMiltenyi Biotec130-045-201
CTS (Hücre Tedavi Sistemleri) Dynabeads CD3 / CD28Gibco40203D
CytoflexBeckman CoulterNC2279958
DNaz İçermeyen SuİnvitrojeniAM9937
Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)Corning10-017-CV
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu SuyuGibco14190-144
EasySep İnsan T Hücresi İzolasyon KitiSTEMCELL Teknolojileri17951RFNegatif izolasyon kiti
Endura Elektroyetkin Hücreler Biyoaraştırma Teknolojileri60242-1Geri kazanım ortamlı elektroyetkin hücreler
EtanolMillipore SigmaE7023
Fetal sığır serumu (FBS)Corning35-010-CV
GeCKO v2 CRISPR Nakavt Havuzlanmış Kitaplık AAddGene1000000048CRISPR kütüphanesi plazmid
Gen Pulser II Bio-Rad165-2105Elektroporatör
GlikojenMilipore Sigma10901393001
JeKo-1ATCCCRL-3006CD19+ hedef hücreler 
Lipofectamine 3000 Transfeksiyon ReaktifiThermoFisher ScientificL3000075Bir transfeksiyon reaktifi (Lipofectamine 3000 Reaktifi) ve bir nötr ko-lipid reaktifi (p3000) içeren transfeksiyon reaktif kitiCANLI
/ÖLÜ AquaInvitrogenL34966
LenforepKÖK HÜCRE Teknolojileri7851Yoğunluk gradyan ortamı
Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi KitleriThermoFisher Scientific12748412Maxi-hazırlık kiti
NEBNext Yüksek Kaliteli 2X PCR MasterMixNew England BioLabsM0541SYüksek kaliteli PCR mastermix
Opti-MEM I Azaltılmış Serum OrtamıGibco31985-070İndirgenmiş serum ortamı
pCMVR8.74AddGene22036Lentiviral ambalaj plazmidi
Pennisilin-streptomisin-glutamin (100X)Yaşam Teknolojileri10378-016
pMD2.GAddGene12259VSV-G plazmid eksprese eden
Havuzlanmış İnsan AB Serumu Yenilikçi AraştırmaISERABHI
PuromycinMillipore SigmaP8833
QIAquick Jel Ekstraksiyon KitiQiagen28704Gek ekstraksiyon kiti
Qucik-DNA Midiprep Plus KitigDNA'yı izole etmek için kullanılanZymo ResearchD4075
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Otomatik hücre ayırıcı
Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 Orta (RPMI)Gibco21870092
SepMate-50KÖK HÜCRE Teknolojileri85450Yoğunluk gradyan ayırma tüpü
Sodyum AsetatInvitrogenAM9740
Sodyum AzideFisher Scientific71448-16
Streptavidin Antikoru (PE)BioLegend405203İkincil antikor CAR tespiti için kullanılan
T100 Termal DöngüleyiciBio-Rad1861096
Ultrasantrifüj (Optima XPN-80)BeckmanCoulterA99839
Vakum Filtre Sistemleri, 0.22 ve mikro; mThermoFisher Scientific567-0020
Vakum Filtre Sistemleri, 0.45 & mThermoFisher Scientific165-0045
X-VIVO 15 Serumsuz Hematopoetik Hücre OrtamıLonza04-418QHematopoetik hücre ortamı
zarf Kiti

Kaynaklar

  1. Neelapu, S. S., et al. 5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1). Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).
  2. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  3. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. Lancet Oncol. 20 (1), 31-42 (2019).
  4. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).
  5. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 380 (1), 45-56 (2018).
  6. Bai, Z., et al. Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with all. Sci Adv. 8 (23), eabj2820(2022).
  7. Fraietta, J. A., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nat Med. 24, 563-571 (2018).
  8. Gennert, D. G., et al. Dynamic chromatin regulatory landscape of human CAR T cell exhaustion. Proc Natl Acad Sci USA. 118 (30), e2104758118(2021).
  9. Deng, Q., et al. Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas. Nat Med. 26 (12), 1878-1887 (2020).
  10. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/CAS9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. J Vis Exp. (149), e59629(2019).
  11. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  12. Cox, M. J., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  13. Ottaviano, G., et al. Phase 1 clinical trial of CRISPR-engineered CAR19 universal T cells for treatment of children with refractory B cell leukemia. Sci Transl Med. 14 (668), eabq3010(2022).
  14. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12, 828-863 (2017).
  15. Mccutcheon, S. R., et al. Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens. Nat Genet. 55, 2211-2223 (2023).
  16. Zhu, W., Kelly, C., Dagur, P., Dunbar, C. E., Cordes, S. CRISPR activation screen to optimize chimeric antigen receptor (CAR) T cell immunophenotype. Blood. 142 (Supplement 1), 4820-4820 (2023).
  17. Wang, D., et al. CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies. Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).
  18. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971.e15 (2018).
  19. Belk, J. A., et al. Genome-wide crispr screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence. Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).
  20. Jiang, P., et al. Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction. Leukemia. 36 (11), 2656-2668 (2022).
  21. Rossi, J., et al. Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL. Blood. 132 (8), 804-814 (2018).
  22. Beider, K., et al. Molecular and functional signatures associated with CAR T cell exhaustion and impaired clinical response in patients with B cell malignancies. Cells. 11 (7), 1140(2022).
  23. Wherry, E. J. T. cell exhaustion. Nat Immunol. 12, 492-499 (2011).
  24. Prinzing, B., et al. Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity. Sci Transl Med. 13, eabh0272(2021).
  25. Lynn, R. C., et al. C-jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance. Nature. 576, 293-300 (2019).
  26. Tang, N., et al. TGF-beta inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors. JCI Insight. 5 (4), e133977(2020).
  27. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  28. Li, W., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biol. 16, 281(2015).
  29. Sakemura, R., et al. Targeting cancer-associated fibroblasts in the bone marrow prevents resistance to CART-cell therapy in multiple myeloma. Blood. 139 (26), 3708-3721 (2022).
  30. Stewart, C. M., et al. IL-4 drives exhaustion of CD8+ CART cells. Nat Commun. 15 (1), 7921(2024).
  31. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Babraham Bioinformatics. https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  32. Bbmerge. , https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh (2019).
  33. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed CAS9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
  34. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-CAS9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  35. Dong, M. B., et al. Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells. Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).
  36. Zhou, P., et al. Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer. Nature. 624 (7990), 154-163 (2023).
  37. Sutra Del Galy, A., et al. In vivo genome-wide CRISPR screens identify SOCS1 as intrinsic checkpoint of CD4+ TH1 cell response. Sci Immunol. 6 (66), eabe8219(2021).
  38. Ramos, A., et al. Leukemia-intrinsic determinants of CAR-T response revealed by iterative in vivo genome-wide CRISPR screening. Nat Commun. 14 (1), 8048(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Car T HücreleriGenom Boyunca TaramaKanser İmmünoterapisiGen DüzenlemeT Hücresi TükenmişliğiYeni Nesil DizilemeGenomik DNA İzolasyonuCd19 AntijeniT Hücresi Besiyeri
Kimerik Antijen Reseptörü T Hücrelerinde İn Vitro Genom Çapında CRISPR Nakavt Taraması Gerçekleştirme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.