Yöntem makalesi

Stereotaksik Cihaz Kullanılarak Beyin Tümörleri İçin Ortotopik Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellerinin Oluşturulması

1.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67349

⸱

2 Mayıs 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Cancer Institute Australia, Lowy Cancer Research Centre, UNSW Sydney, 2School of Clinical Medicine, Faculty of Medicine & Health, UNSW Sydney, 3Kid's Cancer Centre, Sydney Children's Hospital

Bu makalede

Özet

Ortotopik pediatrik beyin tümörü modellerinin geliştirilmesi, kanser hücrelerini hassas bir şekilde implante etmek için stereotaksik bir cihaz kullanarak titiz bir hassasiyet gerektirir. Burada sunulan metodoloji, beyin tümörü hücrelerinin hazırlanması, intrakraniyal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi ve beyin tümörü aşılanmasını değerlendirmek için ameliyat sonrası bir izleme sisteminin uygulanmasında yer alan adımları özetlemektedir.

Özet

Merkezi sinir sistemi (MSS) tümörleri için klinik olarak anlamlı ve güvenilir modellerin geliştirilmesi, nöro-onkoloji alanının ilerlemesinde çok önemli olmuştur. En yaygın kullanılan tekniklerden biri, tümör büyümesinin, invazyonunun ve yayılımının kontrollü bir ortamda araştırılmasına izin veren bir yöntem olan ortotopik intrakraniyal enjeksiyondur. Bu teknik, belirli bir hasta bölgesinden alınan tümör hücrelerinin bir hayvandaki ilgili anatomik bölgeye nakledilmesini içerir. Bunu yaparak, bu ortotopik beyin tümörü modelleri, kanserin biyolojik davranışını ve insan hastalarda görülen beyin ortamı ile etkileşimlerini daha doğru bir şekilde kopyaladıkları için benzersiz bir avantaj sunar. Bu, onları, potansiyel tedavileri değerlendirmek için klinik senaryoya yakın bir benzerliğin gerekli olduğu klinik öncesi terapötik testler için özellikle değerli kılar. Bu protokol, diffüz orta hat gliomu (DMG), glioblastoma (GBM), medulloblastom ve ependimoma dahil olmak üzere pediatrik beyin tümörleri için hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri geliştirme deneyimlerini paylaşır. Bu yöntem, farelerde intrakraniyal stereotaksik enjeksiyonların gerçekleştirilmesi prosedürünü tanımlar ve beyin içindeki enjeksiyon bölgesinin doğru hedeflenmesini sağlar. Ek olarak, başarılı tümör aşılama belirtilerini tespit etmek için kullanılan işlem sonrası izleme sistemini açıklıyoruz. Tümör enjeksiyonunu takiben, tümör ilerlemesinin yaygın göstergeleri olan herhangi bir nörolojik bozukluk, davranış değişikliği ve/veya kilo kaybı belirtisi açısından hayvanları gözlemlemek için titiz bir izleme sistemi uygulanır. Bu sistem zamanında müdahaleye izin verir ve tümörün büyüme dinamikleri ile ilgili kritik veriler sağlar. Bu modelleri ve protokolleri geliştirerek, klinik öncesi çalışmaların güvenilirliğini ve translasyon potansiyelini artırmayı ve pediatrik CNS tümörleri için daha etkili tedavilerin geliştirilmesine katkıda bulunmayı amaçlıyoruz.

Giriş

Pediatrik santral sinir sistemi (SSS) tümörleri, çocuklarda en sık görülen solid tümörler olup, primer pediatrik tümörlerin yaklaşık %20-25'ini oluşturur ve insidansı ve tedaviye yanıt açısından erişkin tümörlerinden farklı özelliklere sahiptir 1,2. Glioblastoma (GBM) ve diffüz intrinsik pontin glioma/diffüz orta hat gliomu (DIPG/DMG) gibi yüksek dereceli gliomlar (HGG'ler) özellikle agresiftir, prognozları kötüdür ve tedavi yöntemlerindeki gelişmelere rağmen sağkalım oranları düşük kalmaktadır 3,4,5. Pediatrik SSS tümörlerinin yaklaşık %20'sini oluşturan medulloblastomlar, standart tedavi ile yüksek bir 5 yıllık sağkalım oranına ulaşmıştır, ancak bazı alt tipler, özellikle nüks senaryolarında zorluklar ortaya çıkarmaktadır 6,7. Pediatrik SSS tümörlerinin yaklaşık %10'unu oluşturan ependimomlar, moleküler özelliklere ve tümör lokalizasyonuna bağlı olarak farklı prognozlar sergiler ve nüks önemli klinik zorluklar oluşturur 8,9. Moleküler manzarayı anlamak ve ortotopik beyin tümörü (BT) modelleri geliştirmek, pediatrik hastalar için sonuçları iyileştirmek için etkili tedaviler geliştirmek için umut vaat etmektedir.

Klinik olarak anlamlı BT modellerinin geliştirilmesi, nöro-onkoloji araştırmalarını ve terapötik keşifleri ilerletmek için hayati önem taşır. Stereotaksik bir cihaz kullanılarak yapılan ortotopik enjeksiyonlar, tümör hücrelerinin beyin içine hassas bir şekilde yerleştirilmesine izin verdiği ve beyin tümörlerinin doğal ortamını yakından taklit ettiği için bu yaklaşımda çok önemlidir10. Bu yöntem, tümör modellerinin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini artırarak, tümör biyolojisi ve invazyon ve anjiyogenez gibi temel özelliklerin daha doğru çalışmalarını ve ayrıca terapötik müdahalelerin değerlendirilmesini kolaylaştırır11. Stereotaksik cihazın hücre enjeksiyonlarının tam yerini ve derinliğini kontrol etme yeteneği, tümör hücrelerinin tutarlı bir şekilde amaçlanan beyin bölgelerine yerleştirilmesini sağlar ve böylece deneysel sonuçların geçerliliğini artırır10. Subkutan modeller, terapötik ajanların ilk taraması için daha erişilebilir ve uygun maliyetli bir seçenek sunar. Bu modellerde, tümör hücreleri cilt altına implante edilir, bu da tümör büyümesinin ve tedavi yanıtlarının doğrudan izlenmesini sağlar12. Beynin karmaşık mikro çevresini kopyalama yeteneğinden yoksun olmalarına rağmen, deri altı modeller, yüksek verimli ilaç taraması ve ön etkinlik değerlendirmeleri için oldukça değerli olmaya devam etmektedir12,13.

Çok sayıda çalışma, otopsi veya biyopsi örneklerinden doğrudan doku implantasyonu ve primer beyin tümörü kültürleri dahil olmak üzere beyin tümörü örneklerinden ortotopik hasta kaynaklı ksenogreft modellerinin (PDX'ler) başarılı bir şekilde geliştirildiğini göstermiştir 11,14,15. Bununla birlikte, tümörle ayrışmış doku veya tümör hücrelerinin intrakraniyal enjeksiyonunun her zaman aşılamayı garanti etmediğini ve başarısızlık nedenlerinin tam olarak anlaşılmadığını kabul etmek çok önemlidir15. İlginç bir şekilde, HGG biyopsi örnekleri, diğer beyin tümörü alt tiplerine kıyasla daha yüksek bir başarı oranı sergileme eğilimindedir. Örneğin, He ve ark. HGG ortotopik modelleri için %56'lık bir başarı oranı gösterirken, Brabetz ve ark. tarafından yapılan çalışma, ependimoma ve medulloblastom gibi diğer pediatrik beyin tümörü örnekleri için sırasıyla %43 ve %30 gibi daha düşük aşılama oranları bildirmiştir 11,14,16. Özellikle, beyin tümörü PDX modelleri, 1 ay ile 11 ay arasında değişen çok çeşitli gecikme süreleri gösterir ve daha sonraki aşılamalar klinik öncesi faydanın azaldığını gösterir. Hastalığı moleküler düzeyde özetleme yeteneklerine rağmen, biyopsiler ve yerleşik modeller arasında bazı genomik farklılıklar gözlenmiştir14,16.

PDX modelleri, pediatrik BT'lere karşı yeni terapötik stratejiler arayışında vazgeçilmez araçlar olarak hizmet eder. Modeller, kan-beyin bariyerinin (BBB) varlığına bağlı olarak tümör büyümesi, semptomlar ve ilaç farmakokinetiği açısından insan hastalığını aslına uygun olarak özetlediğinden, ilaç etkinliği çalışmalarını gerçekleştirmek için altın standart olarak kabul edilirler. Araştırmalar, pediatrik beyin sapı gliomu alanında, korunan BBB bütünlüğünün ve ilaç penetrasyonunun eksikliğinin, bu tümörler için terapötik etkinliğin azalmasına yol açan bir özellik olduğunu göstermiştir 17,18,19. Bununla birlikte, epigenetik ve metabolik inhibitörler gibi yeterli ilaç penetrasyonu gösteren seçilmiş tedavilerde etkinlik gözlenebilir17,20.

Bu çalışma, immün sistemi baskılanmış hayvanlarda beyin tümörü hücrelerinin intrakraniyal enjeksiyonlarını gerçekleştirmek için, PDX gelişimi için engraftmanı değerlendirmeyi ve/veya terapötik ilaç etkinliğini değerlendirmeyi amaçlayan bir yöntem sunmaktadır. Etik deneysel son noktaya ulaşılana kadar tümör ilerlemesini izlemek için kapsamlı araçlar da sağlanmaktadır.

Protokol

Aşağıda özetlenen protokol, New South Wales Üniversitesi tarafından belirtilen hayvan bakımı ve kullanımı için etik yönergeleri takip eder ve tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvan refahına öncelik verildi ve intrakraniyal enjeksiyon işlemi sırasında kullanılan hayvanların acısını en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.

1. Nörosfer oluşturan beyin tümörü kültürlerinin genişletilmesi için kültürleme

NOT: Özel gereksinimler, kullanılan beyin kültürlerine bağlı olarak değişebilir. Aşağıdaki adımlar, nörosferler olarak birincil beyin tümörü hücreleri için genel bir kültür protokolünü özetlemektedir. Beyin tümörü kültürleri ticari satıcılardan elde edilebilir veya hasta beyin tümörü biyopsilerinden veya otopsilerinden birincil kültürler olarak oluşturulabilir. Hasta biyopsisi veya otopsi örneklerinden primer kültür oluşturma prosedürü yayınlanmış literatürde özetlenmiştir15,21.

  1. Dondurularak saklanmış stok şişesini, içindekiler çözülene kadar 37 °C'lik bir su banyosuna koyun. Steriliteyi sağlamak için şişenin dış yüzeylerini% 70 etanol ile silin.
  2. Mayoh ve ark.21'de tarif edildiği gibi primer beyin tümörü hücreleri için Neurosphere ortamını hazırlayın. Biyolojik güvenlik kabininde (BSC), çözülmüş hücreleri 5 mL önceden ısıtılmış nörosfer ortamı içeren steril 15 mL konik bir tüpe aktarmak için steril 1 mL'lik bir pipet kullanın.
  3. Hücreleri peletlemek için konik tüpü 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu 10 mL'lik bir pipetle dikkatlice atın.
  4. Hücre peletini 10 mL veya 25 mL nörosfer ortamında yeniden süspanse edin. Kriyoprezervasyondan beklenen hücre sayısına bağlı olarak hücre süspansiyonunu bir T25 veya T75 şişesine yerleştirin. Tipik olarak, yoğunluğu 5x 105 olan başlangıç hücreleri bir T25 şişesine yerleştirilir.
  5. Şişeyi% 5 CO2 ile 37 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. Medyayı haftada 1 veya 2 kez yeni medyayla değiştirin. Alternatif olarak, hücrelerin büyüme hızına bağlı olarak büyüme faktörlerini ve B27'yi gerektiği gibi doldurun.
  6. Nörosferler bir T25 şişesinde oluştuktan sonra, T75 şişelerinde genişletilebilirler. T25 şişesinin içeriğini 10 mL'lik bir pipetle 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Nörosferleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin ve yeterince büyüdüklerinde (yaklaşık 500 μm), çıplak gözle de görülebilirler.
  7. Tüpü 300 x g'da 3-5 dakika santrifüjleyin. Tüpünde yaklaşık 1 mL bırakarak hücre peletinin üzerindeki ortamı aspire edin.
  8. Hücre peletini ayırmak için hücreleri 1 mL'lik bir pipetle 12x-15x yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Nörosferleri tek hücreli bir karışıma ayırmak için bir hücre süzgeci (40 μm) kullanın.
  9. Süzgeci 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine yerleştirin ve süzgecin üzerine 10 mL'lik bir pipetle ayrışmış sferoidler ekleyin. Çoğu tek hücre, ağı tüpe geçirecek ve küme malzemeleri ağ üzerinde kalacaktır.
  10. Hücre sayma odası ile hücreleri sayın. Eşit miktarda hücre süspansiyonunu (ör., 5 μL) Tripan Mavisi (5 μL) ile karıştırarak hücre canlılığını değerlendirin. Ölü hücreler ışık mikroskobu altında mavi görünürken, canlı hücreler lekesiz kalacaktır.
  11. Hücre yoğunluğunu aşağıdaki gibi hesaplayın:
    Hücre konsantrasyonu = Izgara başına ortalama hücre sayısı × Seyreltme Faktörü / Bir ızgaranın hacmi (mL). Standart bir hücre sayma odasından gelen ızgara hacmi 0,0001 mL'dir.
  12. Hücreleri geçmek için, bir T75 şişesinde 25 mL taze, ısıtılmış ortamda 1 x 106 hücreyi yeniden süspanse edin. Hücreler bir T75 şişesine yerleştirildikten sonra, nörosferler büyüyene kadar% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
  13. Beyin tümörü hücrelerini kriyoprezervasyon yapmak için, 1 mL kriyoprezervasyon solüsyonunda 1 x 106 hücreyi yeniden süspanse edin ve gece boyunca kontrollü bir donma kabına koyun ve -80 ° C'de saklayın. Uzun süreli depolama için dondurularak saklanmış stokları -180 °C'lik bir sıvı nitrojen tankına yerleştirin.
    NOT: Kriyoprezervasyon ortamı %90 Fetal Buzağı Serumu ve %10 Dimetil Sülfoksit (DMSO) içerir.

2. İntrakraniyal enjeksiyon için beyin tümörü hücrelerinin hazırlanması

NOT: Aşağıdaki protokol, intrakraniyal enjeksiyon için yerleşik veya kısa süreli kültürlerden kültürlenmiş hücrelerin hazırlanmasını ana hatlarıyla belirtirken, insan beyin tümörlerinden yeni ayrışmış doku da dahil olmak üzere diğer hücre tipleri için de uyarlanabilir22,23.

  1. Bir biyogüvenlik kabininde, hücreleri ve kültür ortamını doku kültürü şişesinden serolojik bir pipet ile 50 mL'lik konik bir tüpe dikkatlice aktarın.
  2. Konik boruyu oda sıcaklığında 5 dakikaya kadar 300 x g'da santrifüjleyin. 25 mL'lik bir pipetle peletin üzerindeki ortamı aspire edin ve tüpte yaklaşık 0,5 mL bırakın.
  3. Hücre peletini ayırmak için hücreleri 1 mL'lik bir pipetle 10 kat yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
  4. İstenen hücre sayısı yeni bir tüpe aktarıldıktan sonra, hücreleri yeniden süspanse ederek ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da peletleyerek PBS ile 2x'i yıkayın.
    NOT: hücre sayısı açıklandığı gibi belirlenebilir. Örneğin, 200.000 hücrelik hücre yoğunluğunda 10 hayvana enjekte edilmesi gerekiyorsa, gereken minimum hücre sayısı 2 x 106'dır.
  5. Son yıkama sırasında, mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarın. Hücre peletini ve 50 μL hücre dışı matris (ECM) hidrojel alikotunu nazikçe buzun üzerine yerleştirin.
    NOT: ECM hidrojel, 4 °C soğutmalı pipetler kullanılarak buz üzerinde 50 μL'lik porsiyonlar halinde önceden alıntılanabilir ve ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklanabilir. ECM hidrojel, sonraki deneysel kullanım için yavaşça çözülmesi için geçici olarak buz üzerinde tutulabilir.
  6. Hücre peletini enjeksiyon için ECM hidrojel ile karıştırın ve intrakraniyal enjeksiyonlara başlamadan önce bu adımı mümkün olan en kısa sürede tamamlamayı hedefleyin. Standart bir prosedür olarak, ECM hidrojel içinde süspanse edilmiş 200.000 hücre içeren 2 μL süspansiyon kullanın.
    NOT: İntrakraniyal enjeksiyonlar 2-3 saatten uzun sürerse, buz üzerinde uzun süreli inkübasyon hücrelerin canlılığını azaltabileceğinden yeni bir hücre stoğu hazırlanmalıdır. İntrakraniyal olarak 1.000.000 hücreye kadar ve 10 μL'ye kadar hacimlerde enjekte etmek mümkündür; bununla birlikte, bu, hücrelerin ECM hidrojel yerine PBS'de yeniden süspanse edilmesini ve çok yavaş bir enjeksiyon hızında eklenmesini gerektirecektir.

3. Stereotaksik ve anestezik ekipmanların kurulması

NOT: Aşağıda listelenen prosedür, stereotaksik ekipmanın üreticisine ve tercih edilen anestezi türüne bağlı olarak biraz değişebilir.

  1. BSC'yi önce yüzeyini polisorbat 20 deterjanla sterilize ederek ve 10 dakika bekleterek başlatın. Daha sonra, yüzeyi% 80 etanol ile silin. BSC davlumbazının içine yerleştirmeden önce, her bir ekipman parçasını %80 etanol ile silin (herhangi bir elektrik girişini ıslatmaktan kaçının).
  2. Taban plakasını Şekil 1'e göre, burun konisi sağ tarafa gelecek şekilde (sağ elini kullananlar için) BSC başlığının içine yerleştirin. XYZ manipülatörlerinin taban plakasına zaten takıldığından ve sabitlendiğinden emin olun.
  3. Dijital ekran konsolunu taban plakasının arkasındaki girişe bağlayın ve güç kablosunu BSC başlığı içinde sağlanan güç kaynağına takın (bkz. Şekil 1). Bu konsol, XYZ manipülatörünün hareketlerinin koordinatlarını kaydeder.
  4. Karbon filtre kutusunu (anestezik çıkış için) ve anestezik girişini çıkarılabilir burunluktaki iki valfe sabitleyin. Burun parçasını montaj bölümüne kaydırın ve vidayı stereotaksik aparata sıkın.
  5. Kulak çubuklarını, montaj bölümünün her iki yanındaki ilgili tutucularına takın ve tutuculara takılı vidaları sıkarak yerlerine sabitleyin. Kulak çubukları gazlı bez veya elektrik bandı ile kapatılabilir.
  6. Cerrahi yatağı cihaza yerleştirin ve yüksekliğini, hayvanı yerinde sabitleyen kulak çubuklarıyla aynı hizaya gelecek şekilde ayarlayın. Hayvanı sıcak tutmak için cerrahi yatağı bir gösterge pedi ile sarın.
  7. Isıtma yastığını güç kaynağına bağlayın ve anestezik prosedür sırasında sıcaklığı korumak için hayvanın altına yerleştirin.
  8. BSC başlığının içine steril pamuk uçlar, 20 μL pipet uçları, göz merhemi, ayrı ayrı paketlenmiş izopropanol mendiller, cerrahi yapıştırıcı ve 20 μL pipet yerleştirin. Bir gazlı bezi %80 etanol ile nemlendirin ve üzerine steril forseps ve bir neşter yerleştirin.
  9. Cam mikroşırıngayı 5 kez soğuk% 80 etanol ve ardından soğuk% 0.9 Tuzlu su çözeltisi içinde yıkayarak temizleyin.
  10. Delme amacıyla, matkap motorunu güç kaynağına bağlayın ve matkabı XYZ manipülatörüne monte edin, sıkıca vidalayarak güvenli bir şekilde oturmasını sağlayın.
  11. Hücre enjeksiyonu amacıyla matkap bileşenini cam mikroşırınga tutucusu ile değiştirin. XYZ manipülatöründeki vidayı gevşeterek ve şırınga tutucusu ile değiştirerek matkabı çıkarın. Cam mikroşırıngayı daha önce delinmiş delikle hizalamadan önce vidanın sıkıldığından emin olun.
  12. Stereotaksik cihazı kullandıktan sonra, tüm bileşenleri sökün ve temiz bir saklama kutusunda veya tozsuz bir dolapta saklamadan önce %80 etanol ile sterilize edin. Tüm kesici aletleri güvenli ve uygun bir şekilde belirlenmiş bir kesici alet kabına atın.

4. İntrakraniyal enjeksiyon

NOT: İntrakraniyal enjeksiyonlar hem erkek hem de dişi farelerde yapılabilir, ancak dişi fareler genellikle tercih edilir, çünkü erkekler arasında saldırganlığın neden olduğu yara komplikasyonlarına daha az eğilimlidirler. Prosedür tipik olarak 7-10 haftalık farelerde gerçekleştirilir ve tümör gelişimi için yeterli zaman sağlar. Tipik olarak, hayvanlar kafes başına 4-6 kişilik gruplar halinde randomize edilir. BALB/c Nude, NOD-SCID ve NSG gibi immün sistemi baskılanmış suşlar, immün yetmezlik durumları tümör aşılamasını ve büyümesini desteklediğinden, hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) gelişimi için yaygın olarak kullanılır24. Bu protokol anestezi indüksiyonu için izofluran kullanımını belirtirken, ketamin ve ksilazin gibi alternatif anestezikler de kullanılabilir25. İzofluran kullanılmazsa, anestezik odayı ve ilgili ekipmanı içeren adımlar prosedürden çıkarılabilir.

  1. İntrakraniyal prosedürden önce hayvanların genel refahını tartın ve izleyin. Hayvanlara her seferinde bir kafes analjezik uygulayın (ör., intrakraniyal enjeksiyona başlamadan önce 1 saate kadar buprenorfin 0.05 mg / kg, intraperitoneal olarak).
  2. Anestezik ekipmanı, aletle birlikte verilen yönergelere göre ayarlayın. Prosedüre başlamadan önce buharlaştırıcının en az yarısının dolu olduğundan emin olun. Oksijen kaynağının açık olduğundan emin olun.
  3. Hayvanların kürkü varsa, intrakraniyal işlemden bir gün önce veya aynı anda çıkarılabilir. Kürkü, elektrikli makas veya tıraş bıçağı ile sırt veya fare kafatasındaki cerrahi bölgeden çıkarın.
  4. Hayvanı anestezik indüksiyon odasına aktarın. Anestezik makinesindeki akış ölçerin 1 L/dk akış hızına ayarlandığından ve oksijen regülatörünün 40-50 psi arasında olduğundan emin olun. Kasların gevşediğini ve reflekslerin olmadığını kontrol ederek orta anestezinin sürdürüldüğünden emin olun.
  5. Hayvanın uyaranlara tepkisini izleyin ve sabit nefes almayı sağlamak için göğüs duvarı hareketini gözlemleyin. İntrakraniyal enjeksiyonlar 10 dakikayı aşarsa, bir rektal prob ve sıcaklık izleme sistemi ile sıcaklığı izleyin ve bir nabız oksimetresi kullanarak nabzı izleyin
  6. Hayvanı stereotaksik cihaza monte edin, ön dişlerin insizyon çubuğuna sabitlendiğinden ve burun konisinin hayvanı yerine sabitlediğinden emin olun.
  7. Farenin kafasını iyotla ıslatılmış bir pamuk ucu ve ardından bir izopropanol mendille dezenfekte edin. Ameliyat sırasında kurumayı önlemek için her iki göze de kornea göz merhemi sürün.
  8. Kesiye beyinciğin tabanından başlayın ve kafatasının üst yönü boyunca yaklaşık 1 cm uzunluğunda küçük bir kesik yaparak kafatası boyunca orta noktaya kadar uzatın.
  9. Kafatasını ortaya çıkarmak için kulaklar arasındaki cildi sıkın ve kulak çubuklarını sıkarak başı sabitleyin. Kafatası yüzeyini temizleyin ve bir pamuklu çubukla kurulayın.
  10. Matkabı stereotaksik çerçeveye sabitleyin ve matkabı kullanarak bregmayı (veya lambdoid yapıyı) bulun.
    NOT: Spesifik stereotaksik koordinatlar, aşılama çalışması için gerekli anatomik bölgeye göre seçilir. Bu kesin koordinatlar, yayınlanmış literatürden elde edilebilir veya Stereotaksik Koordinatlar26 atlasında Fare Beyni gibi kaynaklar kullanılarak belirlenebilir ve başarılı implantasyon için doğru hedefleme sağlanır.
  11. Koordinatlar belirlendikten sonra, Diffüz orta hat gliomunun (DMG) belirlenen bölgesinde kemikte dikkatlice küçük bir çapak deliği oluşturmak için bir matkap kullanın: X = +0.5, Y = -5.5, Z = -3.1 bregmadan; Supratentoriyal beyin tümörü (GBM veya ependimom): X = +1.5, Y = +1, Z = -3 bregmadan; İnfratentoriyal beyin tümörü (Medulloblastom, ependimom): X = +2, Y = - 2, Z = -2 lambdoid yapıdan.
  12. Hava kabarcıklarından kaçınırken hücreleri bir pipetle birkaç kez yeniden süspanse edin. Hücre karışımından 2 μL'yi önceden yıkanmış soğuk cam mikro şırıngaya çekin. Şırıngayı stereotaksik çerçeveye takın ve iğneyi kafatası ucuna ayarlayın.
  13. Hücreleri 30 saniye içinde delinmiş bölgeye enjekte edin ve enjeksiyon sırasında herhangi bir geri akışlı hücre süspansiyonunu kurutun.
    NOT: Hücreler ECM hidrojel içinde süspanse edildiğinden, hücre süspansiyonunun şırıngada katılaşmaması için enjeksiyonun yeterince hızlı gerçekleşmesi gerekir. Farklı aşılama oranlarını değerlendirmek için değişen hücre yoğunlukları kullanılabilir, daha yüksek hücre yoğunlukları genellikle daha hızlı tümör aşılamasına yol açar.
  14. Geri akışı önlemek ve ECM hidrojelin çökmesine izin vermek için şırıngayı 1 dakika yerinde bırakın. Şırıngayı çıkarın ve yarayı bir izopropanol mendille silin. Gerekirse kesiyi kapatmak için cilt yapıştırıcısı veya yara klipsleri kullanın.
  15. İyileşmeye kadar sıcak tutmak için hayvanı bir ısı lambası veya bir ısıtma yastığı ile temiz bir kurtarma kafesine yaslanmış bir pozisyonda yerleştirin. Hayvanı kendi kendine hareket etmeye başlayana kadar sürekli olarak ve daha sonra normal davranış gösterene kadar sık sık izleyin.
  16. Bir hayvanın iyileşme sırasında daha önce kapatılmış bir yaranın yeniden açıldığı tespit edilirse, hayvanı tekrar uyuşturun, kalan yapıştırıcıyı çıkarmak için yarayı bir izopropanol mendille temizleyin ve ardından zımba ile yeniden sabitleyin.

5. Aşılama için cerrahi sonrası izleme

  1. İntrakraniyal enjeksiyonu takiben, fareleri haftada 5 gün (veya gerekirse daha fazla) izlemeye başlayın. İntrakraniyal enjeksiyondan sonraki ilk birkaç hafta boyunca tohumlar veya duygusal yiyecekler gibi bakım sonrası bakım sağlayın. Herhangi bir olası yara açıklığı için hayvanları dikkatlice izleyin.
    NOT: Dişi hayvanların yaraları kesilirse, nadiren saldırganlık gösterdikleri için çöp kutusunda kalırlar. Erkek hayvanlar için, saldırganlığı azaltmaya yardımcı olmak için ekstra zenginleştirme ile birlikte kafeste iki iglo sağlıyoruz. Saldırganlığın meydana geldiği ve yaraların yeniden açılmasına yol açtığı nadir durumlarda, yaralar zımbalarla yeniden sabitlenir ve saldırgan gruptan çıkarılır ve ayrı bir yere yerleştirilir.
  2. Kilo kaybı, aktivite seviyesi, duruş, dehidrasyon belirtileri ve kürk durumu gibi genel sağlık parametrelerini izleme sayfasına kaydedin.
  3. Baş eğme, ataksi ve/veya daire çizme davranışı gibi aralıklı, hafif veya şiddetli nörolojik semptomları izleme sayfasına kaydedin.
  4. Nörolojik semptomları aşağıdaki gibi tanımlayın:
    1. Aşağıdakileri aralıklı semptomlar olarak gözlemleyin ve kategorize edin: Baş Eğme: 5 dakikalık bir inceleme sırasında 1-2 kez gözlendi, genel sağlık tatmin edici. Ataksi: 5 dakikalık bir inceleme sırasında 1-2 kez gözlenir; genel refah tatmin edici. Daire: 5 dakikalık bir inceleme sırasında 1-2 kez gözlemlendi; genel refah tatmin edici. Davranış: Fareler normal davranış gösterir, yiyeceğe/suya ulaşabilir ve tırmanabilir.
    2. Aşağıdakileri hafif semptomlar olarak gözlemleyin ve kategorize edin: Baş Eğme: 5 dakikalık bir inceleme sırasında düzenli olarak görüntülenir, genel sağlık tatmin edicidir. Ataksi: 5 dakikalık bir inceleme sırasında düzenli olarak görüntülenir, genel sağlık tatmin edicidir. Daire: 5 dakikalık bir inceleme sırasında düzenli olarak görüntülenir, genel refah tatmin edicidir. Davranış: Fareler fırfırlı bir tüylere veya kuru bir cilde sahip olabilir, ancak yine de normal davranış sergileyebilir, beslenebilir ve tırmanabilir.
    3. Aşağıdakileri ciddi semptomlar olarak gözlemleyin ve kategorize edin: Baş Eğme: İnceleme sırasında sürekli görüntülenir, yaklaşık 90° eğim, fırfırlı ceket, daha az aktif. Ataksi: Muayene sırasında sürekli görüntülenen, sarhoş hareketler, fırfırlı ceket, daha az aktif. Dairesel: Muayene sırasında sürekli görüntülenir, fırfırlı ceket, daha az aktif. Davranış: Fareler çok kabarık bir tüylere veya kuru bir cilde sahip olabilir. %15'in üzerinde kilo kaybı gösterebilirler. Bu aşamada hayvanlara tohum veya lapa gibi yiyecekler sağlayın.
  5. Fareler, sağlıklarını etkileyen tümör büyümesini gösteren aşağıdaki klinik belirtilerden herhangi birini sergilediklerinde fareler için insancıl son noktayı belirleyin: başlangıç ağırlıklarından %20 veya daha fazla kilo kaybı, şiddetli baş eğme, şiddetli ataksi, şiddetli daire, uyuşukluk veya zor nefes alma. Bu aşamada, CO2 asfiksiasyonu kullanarak fareleri insancıl bir şekilde ötenazi yapın.

6. Beyinlerin toplanması

  1. Hayvanın CO2 boğulması veya servikal çıkık ile insanca ötenazi yapıldığından emin olun.
  2. Makas veya neşter kullanarak kafa derisi boyunca 2 cm'lik bir orta hat kesisi yapın. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi dikkatlice ayırın ve soyun.
  3. İnce makas veya neşter kullanarak kafatasının orta hattı boyunca 2 cm'lik dikkatli bir kesi yapın. Başın arkasından buruna doğru çalışarak forseps kullanarak kafatasını nazikçe kaldırın.
  4. Kafatasının kenarları boyunca kesmeye devam edin ve altındaki beyin dokusuna zarar vermediğinizden emin olun. Kafatası tamamen açıldıktan sonra, forseps ve makas kullanarak beyni kraniyal sinirlerden ve kan damarlarından dikkatlice ayırın.
  5. Beyni arkadan başlayarak ve ileri doğru hareket ettirerek kraniyal boşluktan nazikçe kaldırın. Beyni, ani dondurma veya fiksasyon gibi sonraki deneysel prosedürlerin gereksinimlerine bağlı olarak uygun koşullar altında saklayın. Beyinlerin immünohistokimyasal analizi farklı laboratuvarlar arasında farklılık gösterebilir. Proliferatif hücre markörü KI67 için tipik bir iş akışı, yayınlanmış literatürdeaçıklanmıştır 20.

Sonuçlar

Stereotaksik bir cihaz kullanılarak yapılan ortotopik enjeksiyonlar, beyin tümörü modellerinin geliştirilmesi için gerekli hale gelmiştir. Bu teknik, nöro-onkoloji araştırmalarında tutarlı ve güvenilir veriler üretmek için çok önemli olan tümör hücrelerinin kesin ve tekrarlanabilir bir şekilde yerleştirilmesine izin verir. Ortotopik enjeksiyonların başarılı bir şekilde uygulanması, büyük ölçüde, tipik olarak bir stereotaksik çerçeve, hassas hareketler için bir dijital mikromanipülatör, bir enjeksiyon şırıngası ve hayvanı hareketsiz hale getirmek için bir anestezi sistemi içeren stereotaksik ekipmanın doğru kurulumuna dayanır (Şekil 1A,B). Bir cam mikroşırınganın kullanılması, tipik olarak 2-5 μL arasında küçük hacimlerde intrakraniyal enjeksiyonu mümkün kılar. Enjeksiyonu bloke edebilecek biyolojik materyalin birikmesini önlemek için uygun bakım ve sık yıkama şarttır (Şekil 1C).

Farelerde stereotaksik ekipman kullanılarak beyin tümörü hücrelerinin intrakraniyal enjeksiyonu prosedürü birkaç önemli adımı içerir. İlk olarak, fare işlem boyunca hareketsiz ve rahat kalması için uyuşturulur. Hayvanın uyuşturulduğunu gösteren tipik ipuçları, ayak parmağını sıkıştırmaya bağlı hareket ve reflekslerin yanı sıra düzenli bir solunum paterninin varlığını içerir. Daha sonra, fare stereotaksik bir çerçeveye yerleştirilir ve başını sabit bir pozisyonda sabitler (Şekil 2A). Kafatasındaki bregma ve lambda gibi yer işaretleri kullanılarak, enjeksiyon için kesin koordinatlar belirlenir. Saçlı deride küçük bir kesi yapılır ve seçilen koordinatlarda kafatasının içinden bir çapak deliği açılır (Şekil 2B). Stereotaksik kola bağlı bir mikroenjeksiyon iğnesi, tümör hücrelerini istenen beyin bölgesine (korteks, beyincik veya beyin sapı; Şekil 2C). İğne konumunun dikkatli bir şekilde izlenmesi ve ayarlanması, doğru hedefleme sağlar. Enjeksiyondan sonra iğne yavaşça çekilir ve kesi kapatılır (Şekil 2D). Mühürlü yaranın intrakraniyal enjeksiyonu takiben iki hafta içinde iyileşmesi beklenir.

İntrakraniyal enjeksiyonu takiben, hayvanların genel refahı ve genellikle tümör ilerlemesini gösteren nörolojik semptomların gelişimi için dikkatli bir izleme gerekir (Ek Tablo 1). Tipik olarak, hayvanlar enjeksiyondan sonraki 1. hafta boyunca (en yüksek ağırlıklarının 'una kadar) hafif bir kilo kaybı yaşayabilir, bu da tipik olarak enjeksiyon bölgeleri 2. haftanın sonunda tamamen kapatıldığında stabilize olur. Genel olarak, hayvanlar kiloda sabit bir artış sergiler ve tümör ilerlemesi meydana gelene kadar genel sağlığı iyi korurlar. Nörolojik semptomların tezahürü, beyin tümörünün tipi, enjeksiyon bölgesi ve hayvan suşu gibi faktörlere bağlı olarak değişir. Örneğin, kortikal gliomlar veya ependimomlar ilerleyici kilo kaybı ve potansiyel ön beyin büyümesi ile ortaya çıkabilirken, beyin sapı gliomları ve medulloblastomlar, özellikle bağışıklığı baskılanmış hayvanlarda ataksi ve baş eğme gibi semptomlar gösterebilir (Şekil 3A). Ek olarak, beyin sapı tümörleri olan hayvanlarda, özellikle NSG veya NOD/SCID suşlarında daire çizme davranışı gözlenebilir. Nörolojik semptomların ilerlemesi genellikle kademeli kilo kaybı ile aynı zamana denk gelir. Uzun ağızlı su şişeleri sağlamak veya yumuşak yiyecekler (duygusal gıda peletleri) veya tohumlar sunmak gibi uygun bakım sonrası önlemler, hayvanların refahını desteklemek için çok önemlidir. Deneysel son noktaya ve ardından hayvanların insancıl ötenazisine ulaştıktan sonra, enjeksiyon bölgesinde genişleme ve / veya hemorajik alanların varlığı dahil olmak üzere beyindeki potansiyel değişiklikler ortaya çıkabilir (Şekil 3B).

Kaplan-Meier grafikleri, beyin tümörü hayvan modellerinin sağkalım sonuçlarını göstermek için yaygın olarak kullanılır. İntrakraniyal enjeksiyon veya antikanser tedavilerini takiben zaman içinde hayatta kalma olasılığının görsel bir tasvirini sunarlar. Bu grafikler, klinik öncesi araştırma ortamlarında sağkalım verilerini analiz etmek ve sunmak için çok önemli araçlar olarak hizmet eder15,27. Beyincikte farklı hücre yoğunluklarında intrakraniyal medulloblastoma hücre kültürü D425 enjeksiyonları gerçekleştirdik. İntrakraniyal olarak enjekte edilen tüm hayvanlarda tümörler gelişti. Sonuçlarımız, daha yüksek hücre yoğunluklarının, özellikle fare başına 50.000 ve 100.000 hücrenin, fare başına 10.000 hücreden daha hızlı aşılandığını gösterdi (Şekil 4). Ayrıca, bu farklı konumlarda genel sağkalımı ve tümör büyüme paternini ve immünohistokimyasal özellikleri karşılaştırmak için hasta kaynaklı yüksek dereceli glioma (HGG) hücrelerini korteks ve beyin sapına intrakraniyal olarak enjekte ettik. Konumdan bağımsız olarak, tüm hayvanlara intrakraniyal olarak gelişmiş tümörler enjekte edildi. HGG hücrelerinin kültürlenmesi, 1.1 ila 1.10 adımlarında ayrıntılı olarak açıklanan protokol izlenerek gerçekleştirilmiştir. İntrakraniyal enjeksiyon için hücrelerin hazırlanması 2.1 ila 2.6 adımlarında tarif edildiği gibi gerçekleştirilirken, intrakraniyal enjeksiyon prosedürü 4.1 ila 4.1627 adımlarında belirtilen yönteme bağlı kalmıştır. Kortekse enjekte edildiğinde, HGG hücreleri intrakraniyal enjeksiyondan yaklaşık 25 gün sonra medyan sağkalım göstermiştir (Şekil 5A). Hayvanlar, 5.1 ila 5.4 adımlarında belirtildiği gibi izlendi. Bu hayvanlar herhangi bir nörolojik semptom göstermedi, ancak ilerleyici kilo kaybı gösterdi. Hayvanlara, adım 5.5'te belirtilen insancıl son noktaya ulaştıklarında insancıl bir şekilde ötenazi yapıldı. Beyinler, 6.1 ila 6.5 adımlarında ayrıntılı olarak açıklanan protokol izlenerek toplandı ve daha fazla analiz için gönderildi27. İmmünohistokimyasal analiz, artmış vaskülarizasyon kanıtı (Şekil 5B) ve birçok proliferatif Ki67 hücresi (Şekil 5C) ile büyük, yüksek çekirdekli bir tümör kitlesi ortaya çıkardı. Beyin sapına enjekte edildiğinde, HGG hücreleri intrakraniyal enjeksiyondan yaklaşık 26 gün sonra medyan sağkalım göstermiştir (Şekil 5D). İmmünohistokimyasal incelemede 4. ventrikül/üst pons bölgesinde büyük tümör kitlesi ve lateral ventriküle leptomeningeal infiltrasyon izlendi (Şekil 5E). Daha ileri immünohistokimyasal analiz, beyin sapında ve diğer infiltre alanlarda birçok proliferatif hücreyi gösterdi (Şekil 5F). Bu deney, aynı tümör hücrelerinin farklı anatomik bölgelere enjekte edilmesinin, büyüme paterninde bazı farklılıklar gözlenmesine rağmen, tümör büyüme hızını etkilemediğini vurgulamaktadır.

figure-results-1
Şekil 1: Beyin tümörü hücrelerinin intrakraniyal enjeksiyonu için stereotaksik kurulumun temsili görüntüleri. (A) Anestezik aparat tipik olarak BSC başlığının yanına yerleştirilir ve hem indüksiyon odasına hem de stereotaksik aparata anestezinin ikili olarak uygulanmasını gerektirir. (B) Cam mikroşırınga yıkama istasyonu ve stereotaksik tutucu; Şırınga, her intrakraniyal enjeksiyondan sonra tuzlu su, etanol ve ardından su ile yıkamayı gerektirir. (C) BSC başlığının içinde, anestezik odayı, delme makinesini, stereotaksik cihazı, stereotaksik koordinat konsolunu, pamuk uçları, neşter, cımbız, pipet ve uçları gösteren stereotaksik kurulum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Bağışıklığı baskılanmış bir farede gerçekleştirilen intrakraniyal enjeksiyonun temsili görüntüleri. (A) Anestezik bir koni içine yerleştirilmiş anestezi uygulanmış hayvan. (B) Deri kesisi ve ardından kulak çubukları ile cildin her iki tarafa sabitlenmesi. (C) Enjeksiyon için delinmiş deliğin üzerine yerleştirilmiş cam mikroşırınga. (D) Deri, yapıştırıldıktan sonra bir Mohawk stili oluşturur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Beyin tümörü hücrelerinin aşılanmasını takiben gözlenen potansiyel nörolojik semptomlar. (A) Beyin sapına DMG hücrelerinin intrakraniyal enjeksiyonunu takiben baş eğimi sergileyen hayvan. (B) Sağ kortikal hemisferin enjeksiyon tarafı ile genişlemesi tümör oluşumunu ortaya çıkarır. Hayvana ependimoma hücreleri enjekte edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Medulloblastoma kültürü D425'in farklı hücre yoğunluklarında aşılanması. Medulloblastom hücreleri, 2 μL ECM hidrojel, 50.000 hücre ve 100.000 hücre içinde 10.000 hücre yoğunluğunda stereotaksik ekipman kullanılarak intrakraniyal olarak enjekte edildi. Hayvanlar ilerleyici kilo kaybı açısından izlendi ve kaydedilen en yüksek ağırlıklarının altına ulaştıklarında insancıl bir şekilde ötenazi yapıldı. 10.000 hücre enjekte edilen hayvanlar için medyan sağkalım 29 gün iken, 50.000 ve 100.000 hücre daha yüksek hücre yoğunluğu enjekte edilenler için medyan sağkalım sırasıyla 17.5 gün ve 15 gün idi. Bu çalışmada enjekte edilen tüm hayvanlarda başarılı bir şekilde tümör gelişti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Korteks ve beyin sapında intrakraniyal olarak HGG hücreleri enjekte edilen NSG hayvanlarının temsili sağkalım eğrileri ve histolojik analizi. Yaklaşık 100.000 HGG hücresi (pasaj 3), stereotaksik ekipman kullanılarak 2 μL ECM hidrojele enjekte edildi. Hayvanlar ilerleyici kilo kaybı açısından izlendi ve kaydedilen en yüksek ağırlıklarının altına ulaştıklarında insancıl bir şekilde ötenazi yapıldı. Bu beyin tümörü alt tipi için herhangi bir nörolojik semptom gözlenmedi. (A) Kortekse enjekte edilen HGG hücreleri olan hayvanların medyan sağkalımı, enjeksiyondan yaklaşık 25 gün sonradır (N = 2). (B) Korteksin H&E boyaması, kırmızı kan hücrelerinin varlığı ile gösterilen, artmış vaskülarizasyon ile yüksek çekirdekli bir bölgeyi gösterir. (C) Korteksteki tümör aşılı alan, KI67 boyaması ile gösterildiği gibi yüksek düzeyde proliferatif hücreler gösterir. (D) Beyin sapına enjekte edilen HGG hücreleri ile hayvanların medyan sağkalımı, enjeksiyondan yaklaşık 26 gün sonradır (N = 2). Bu çalışmada enjekte edilen tüm hayvanlarda başarılı bir şekilde tümör gelişti. (E) Beyin sapının H&E boyaması, lateral ventriküldeki leptomeninglerde gözlenen tümör infiltrasyonu ile yüksek çekirdekli bir bölgeyi gösterir. (F) Beyin sapındaki tümör aşılı alan, KI67 boyaması ile gösterildiği gibi yüksek düzeyde proliferatif hücreler gösterir. Ana görüntülerdeki siyah ölçek çubuğu 2 mm'yi gösterirken, büyütülmüş eklenen görüntüler 20 μm'yi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Hayvanların post-intrakraniyal enjeksiyonlarının incelenmesi ve antikanser ajanlarla potansiyel tedavi için kullanılan izleme formu. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışmada detaylandırılan intrakraniyal enjeksiyon tekniği, pediatrik beyin tümörleri için ortotopik hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri oluşturmak için sağlam bir yöntem sağlarken, birkaç alanın iyileştirilmesi gerekmektedir. Tekniği geliştirmeye yönelik bir yaklaşım, tümör hücresi hazırlama sürecini optimize etmeyi içerir. Bu, tümör hücrelerinin implantasyonu için kullanılan malzemelerin rafine edilmesini içerir. ECM hidrojeli altın standart olarak kabul edilirken, beyin veya tümörünkine daha çok benzeyen bileşenlerden oluşan hidrojellerin kullanılması ECM, BT hücresi sağkalımını ve aşılanmasını artırabilir. Bu yaklaşım özellikle medulloblastomlar ve ependimomlar gibi daha uzun aşılama sürelerine sahip tümör tiplerine fayda sağlar. Örneğin, kollajenin Grup 3 medulloblastomun büyümesinde kritik bir rol oynadığı gösterilmiştir, oysa laminin SHH tipi medulloblastoma28'i destekler. Ek olarak, ECM'nin sertliği de tümör büyümesini etkileyebilir. Örneğin yüksek dereceli glioblastomlar, normal beyin dokusuna kıyasla çekirdeklerinde daha yüksek sertlik sergiler, bu da tümör büyümesini ve sağkalımını destekleyebilir29. ECM bileşimini ve sertliğini farklı tümör tiplerinin spesifik gereksinimlerine uyacak şekilde uyarlayarak, PDX modellerinin aşılanması ve büyümesi önemli ölçüde iyileştirilebilir.

Son zamanlarda yapılan birkaç çalışma, hasta tümör örneği işleme ve PDX modellerinin geliştirilmesi hakkında değerli bilgiler sağlamıştır. Tsoli ve ark. DMG dokusunun doğrudan implantasyonunun tipik olarak primer kültürlerden daha yüksek engraftman oranları ile sonuçlandığını vurgulamıştır15. Smith ve ark. beyin tümörü biyopsilerinin veya otopsi örneklerinin intrakraniyal enjeksiyonu yoluyla 37 PDX modeli oluşturmuş, genel başarı oranının %43 olduğunu, HGG'lerin en yüksek engraftman oranını (%100) gösterdiğini, bunu medulloblastomlar (%45) ve ependimomlar (%25) izlemiştir. Tümör latansı 1 ila 11 ay arasında geniş bir şekilde değişmiştir ve daha agresif tümörler daha hızlı aşılanır11. Buna karşılık, Brabetz ve ark. HGG'ler %31'lik bir engraftman oranı ve medulloblastomlar (%37) ve ependimomlar (%17) için daha düşük oranlar sergileyen %30'luk daha düşük bir genel başarı oranı bildirmiştir16. Bu farklılıklara rağmen, Smith ve ark. ve Brabetz ve ark. tarafından yapılan son iki çalışma, orijinal tümör örnekleri ile kurulan modeller arasında küçük genomik farklılıklar gözlenmesine rağmen, PDX modellerinin genellikle hasta tümörlerini immünohistokimyasal ve moleküler düzeylerde özetlediğini doğruladı. Bu bulgular, temsili PDX modelleri geliştirmedeki zorlukların altını çizmekte ve tümör tipleri arasında aşılama başarısındaki değişkenliği vurgulamaktadır 11,16.

Ortotopik yaklaşımın önemli bir sınırlaması, tümör hücreleri lusiferaz veya Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRI) ile etiketlenmişse, Ksenojen Görüntüleme gibi bir görüntüleme sistemi kullanılmadıkça tümör boyutunun doğru bir şekilde ölçülememesidir. Tümör hücrelerinin lusiferaz ile etiketlenmesi, biyolüminesan görüntülemenin aşılanmayı doğrulamasına ve tümör ilerlemesini non-invaziv olarak izlemesine izin vererek bir çözüm sağlayabilir. Bu yöntem, tedaviye verilen yanıtı dinamik olarak izleme yeteneğini artıracak ve böylece terapötik etkinliğin daha kesin bir değerlendirmesini sunacaktır17,30. Alternatif bir yöntem, MRI teknolojisinin kullanılmasını içerir; Bununla birlikte, tümörlerin saptanabilirliği boyutlarına bağlıdır. Daha büyük tümörler daha kolay tanımlanır, bu genellikle deneysel son noktadadır ve saptama, tümörün alt tipine bağlı olarak da değişebilir, GBM yaygın gliomlardan daha kolay tespit edilir27,31. Özellikle yaygın gliomlar için, sağlam bir kan-beyin bariyerinin (BBB) varlığı, kontrast tutulumu eksikliğine yol açar. Bununla birlikte, GBM'de, sızdıran damar sistemi ve ödem varlığı, tümör dokusu ile çevredeki sağlıklı beyin dokusu arasındaki kontrastı artırabilir ve potansiyel olarak tespit sürecine yardımcı olabilir. Genel olarak, algılamayı iyileştirmek için kontrast maddelere ihtiyaç vardır30,31,32. Difüzyon ağırlıklı görüntüleme (DWI) ve sıvı zayıflatılmış inversiyon geri kazanımı (FLAIR) gibi alternatif görüntüleme teknikleri bazen artmayan tümör bölgelerinin tespitini iyileştirmek için kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin de sınırlamaları vardır ve her zaman tümör sınırlarının kesin bir şekilde tanımlanmasını sağlayamayabilir33. Amid Proton Transfer ağırlıklı (APTw) görüntüleme, protein-su proton değişimini izleyerek yaygın gliomları tespit eden ve tümör derecelendirmesine yardımcı olan non-invaziv bir MRI tekniğidir. Umut verici olsa da, artefaktlara duyarlılık gibi zorluklarla karşı karşıyadır ve henüz küçük hayvan görüntülemesi için uyarlanmamıştır, bu da daha geniş uygulamasını sınırlar34.

İlaç etkinliği çalışmaları için ortotopik BT PDX modellerini kullanırken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önemli husus, kullanılan PDX modellerindeki BBB bütünlüğüdür. BBB'nin geçirgenliği, beyin tümörü tedavisinde ilaç dağıtımını ve etkinliğini önemli ölçüde etkiler. Örneğin, beyin sapı gliomlarında korunan BBB bütünlüğü genellikle zayıf ilaç penetrasyonu ile sonuçlanır ve sistemik tedavilerin etkinliğini sınırlar17. Grup 3 medulloblastomlarda ise MRG görüntülemede BBB bütünlüğünün heterojen olduğu gözlenmiş, hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modellerinde de benzer şekilde kaçak bulunmuştur35. Bu nedenle, her bir PDX modelinde BBB durumunun (sağlam veya sızıntılı olup olmadığı) karakterize edilmesi, uygun terapötik stratejilerin tasarlanması ve ilaç etkinliği çalışmalarının sonuçlarının doğru bir şekilde yorumlanması için gereklidir.

Genel olarak, özetlenen intrakraniyal enjeksiyon prosedürü, BT PDX modellerinin oluşturulması ve terapötik ajanlar için etkinlik çalışmalarının yürütülmesi için sağlam bir yaklaşım sunmaktadır. Devam eden iyileştirmeler, bu modellerin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasıyla birleştiğinde, faydalarını artıracak ve pediatrik BT hastaları için terapötik müdahalelerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, Sidney Çocuk Hastanesi Ağı, Sidney Çocuk Tümör Bankası Ağı ve Sıfır Çocukluk Çağı Kanseri Programı'nın hastalarına, klinisyenlerine ve araştırmacılarına bu metodolojiyi oluşturmak için gerekli örnekleri cömertçe sağladıkları için teşekkür eder. Avustralya Çocuk Kanseri Enstitüsü, Sidney New South Wales Üniversitesi ve Sidney Çocuk Hastanesi Ağı'na bağlıdır. Bu protokol, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (Sinerji Hibesi #2019056, DZ'ye APP2017898 Liderlik Hibesi) ve Kanser Enstitüsü Yeni Güney Galler Programı Hibesi (DZ ve MT'ye TPG2037) hibelerinin yanı sıra Levi's Projesi, Çocuk Kanseri Projesi, Tedavi Şimdi Başlıyor, DIPG İşbirliği, Beyin Kanseri Tedavi Vakfı, Robert Connor Dawes Vakfı ve Benny Wills Vakfı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anestezik ajan (örn. İzofluran)Merck792632
%100 EtanolMerck459844
%70 etanolNANASteril suyla seyrelterek %100 etanolden %70 etanol yapın
%80 etanolNANASteril suyla seyrelterek %100 etanolden %80 etanol yapın
Yapışkan mikroskop slaytlarıMerckZ681156
Analjezik (Buprenorfin 0,3mg/mL)Jurox HakkındaNA
Karbon filtre kutusuVeteriner Ekipmanı931401
Konik tüpler 15 mL (Falcon)Fisher Bilimsel14-959-53A
Konik tüpler 50 mL (Falcon)Fisher Bilimsel14-432-22
DMSO'nunMerck472301
Kulak çubuklarıKopf1921
ECM hidrojeli (Matrigel, Corning)MerckE1270 Serisi
Göz Merhemi (Poly Visc)ChemistDirect 719986
Fetal Buzağı SerumuMerckF0926
cam mikro şırıngaHamilton7002
İzopropanol mendillerMedisaSUL_LWMS-1
KI67 antikoruAbcamAB209897
Mikrosantrifüj tüpleriEppendorf Belediyesi211-2130
Mikromatkap ucu  0,028 inçKopf8170
Mikroenjeksiyon ünitesiKopf5004
PBSMerckP4474
Pipet 10 mLCorningCLS4488
Pipet 1mL Eppendorf Belediyesi3123000063
Pipet 200uLEppendorf Belediyesi3123000055
Pipet 20uLEppendorf Belediyesi3123000098
Pipet 25 mLCorningCLS4489
Pipet ucu 1 mLCorningCLS4868
Pipet ucu 200uLCorningCLS4860
Polisorbat 20 deterjan (F10SC)Sağlık ve HijyenG3070 Serisi
Nabız oksimetresi (MouseSTAT)Kent BilimselDPT2-MSE
Riyot (Povidon-İyot)MerckY0000466
Neşter (tek kullanımlık)MedisaSUL_SCALPEL
Cilt Yapıştırıcısı VetbondMedisa3M_1469SB
Küçük Hayvan stereotaktik enstrümanı dijital ekran konsolu ile Kopf940
Stereotaktik Matkap Kopf1474
Sıcaklık izleme sistemi Harvard Aparatı55-7020
Tripan MavisiMerck93595

Kaynaklar

  1. Mueller, S., Chang, S. Pediatric brain tumors: current treatment strategies and future therapeutic approaches. Neurotherapeutics. 6 (3), 570-586 (2009).
  2. Packer, R. J. Brain tumors in children. Arch Neurol. 56 (4), 421-425 (1999).
  3. Paugh, B. S., et al. Integrated molecular genetic profiling of pediatric high-grade gliomas reveals key differences with the adult disease. J Clin Oncol. 28 (18), 3061-3068 (2010).
  4. MacDonald, T. J., Aguilera, D., Kramm, C. M. Treatment of high-grade glioma in children and adolescents. Neuro Oncol. 13 (10), 1049-1058 (2011).
  5. Rutka, J. T. Malignant brain tumours in children : Present and future perspectives. J Korean Neurosurg Soc. 61 (3), 402-406 (2018).
  6. Cho, Y. J., et al. Integrative genomic analysis of medulloblastoma identifies a molecular subgroup that drives poor clinical outcome. J Clin Oncol. 29 (11), 1424-1430 (2011).
  7. Thomas, A., Noel, G. Medulloblastoma: optimizing care with a multidisciplinary approach. J Multidiscip Healthc. 12, 335-347 (2019).
  8. Pajtler, K. W., et al. Molecular classification of ependymal tumors across all CNS compartments, histopathological grades, and age groups. Cancer Cell. 27 (5), 728-743 (2015).
  9. Thorp, N., Gandola, L. Management of ependymoma in children, adolescents and young adults. Clin Oncol. 31 (3), 162-170 (2019).
  10. Upton, D. H., Ziegler, D. S., Tsoli, M. Development of orthotopic patient-derived xenograft models of pediatric intracranial tumors. Methods Mol Biol. 2806, 75-90 (2024).
  11. Smith, K. S., et al. Patient-derived orthotopic xenografts of pediatric brain tumors: a St. Jude resource. Acta Neuropathol. 140 (2), 209-225 (2020).
  12. Akter, F., et al. Pre-clinical tumor models of primary brain tumors: Challenges and opportunities. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1875 (1), 188458(2021).
  13. Stribbling, S. M., Ryan, A. J. The cell-line-derived subcutaneous tumor model in preclinical cancer research. Nat Protoc. 17 (9), 2108-2128 (2022).
  14. He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nat Commun. 12 (1), 4089(2021).
  15. Tsoli, M., et al. International experience in the development of patient-derived xenograft models of diffuse intrinsic pontine glioma. J Neurooncol. 141 (2), 253-263 (2019).
  16. Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nat Med. 24 (11), 1752-1761 (2018).
  17. Khan, A., et al. Dual targeting of polyamine synthesis and uptake in diffuse intrinsic pontine gliomas. Nat Commun. 12 (1), 971(2021).
  18. Chen, Y., et al. Preclinical evaluation of protein synthesis inhibitor omacetaxine in pediatric brainstem gliomas. Neurooncol Adv. 6 (1), vdae029(2024).
  19. Ung, C., et al. Doxorubicin-loaded gold nanoarchitectures as a therapeutic strategy against diffuse intrinsic pontine glioma. Cancers (Basel). 13 (6), 1278(2021).
  20. Ehteda, A., et al. Dual targeting of the epigenome via FACT complex and histone deacetylase is a potent treatment strategy for DIPG. Cell Rep. 35 (2), 108994(2021).
  21. Mayoh, C., et al. High-throughput drug screening of primary tumor cells identifies therapeutic strategies for treating children with high-risk cancer. Cancer Res. 83 (16), 2716-2732 (2023).
  22. Lin, G. L., Monje, M. A Protocol for rapid post-mortem cell culture of diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). J Vis Exp. (121), e55360(2017).
  23. Whitehouse, J. P., et al. In vivo loss of tumorigenicity in a patient-derived orthotopic xenograft mouse model of ependymoma. Front Oncol. 13, 1123492(2023).
  24. Hermans, E., Hulleman, E. Patient-derived orthotopic xenograft models of pediatric brain tumors: In a mature phase or still in its infancy. Front Oncol. 9, 1418(2019).
  25. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4 (11), 1670-1680 (2009).
  26. Paxinos, G., Franklin, K. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 5th edn, Academic Press. (2019).
  27. Tsoli, M., et al. Integration of genomics, high throughput drug screening, and personalized xenograft models as a novel precision medicine paradigm for high risk pediatric cancer. Cancer Biol Ther. 19 (12), 1078-1087 (2018).
  28. Yang, H., et al. Roles and interactions of tumor microenvironment components in medulloblastoma with implications for novel therapeutics. Genes Chromosomes Cancer. 63 (4), e23233(2024).
  29. Kondapaneni, R. V., et al. Glioblastoma mechanobiology at multiple length scales. Biomater Adv. 160, 213860(2024).
  30. Mahmoudian, E., Jahani-Asl, A. Establishing brain tumor stem cell culture from patient brain tumors and imaging analysis of patient-derived xenografts. Methods Mol Biol. 2736, 177-192 (2024).
  31. Oudin, A., Moreno-Sanchez, P. M., Baus, V., Niclou, S. P., Golebiewska, A. Magnetic resonance imaging-guided intracranial resection of glioblastoma tumors in patient-derived orthotopic xenografts leads to clinically relevant tumor recurrence. BMC Cancer. 24 (1), 3(2024).
  32. Bauer, S., Wiest, R., Nolte, L. P., Reyes, M. A survey of MRI-based medical image analysis for brain tumor studies. Phys Med Biol. 58 (13), R97-R129 (2013).
  33. Lasocki, A., Gaillard, F. Non-contrast-enhancing tumor: A new frontier in glioblastoma research. AJNR Am J Neuroradiol. 40 (5), 758-765 (2019).
  34. Nichelli, L., Zaiss, M., Casagranda, S. APT weighted imaging in diffuse gliomas. BJR Open. 5 (1), 20230025(2023).
  35. Genovesi, L. A., et al. Patient-derived orthotopic xenograft models of medulloblastoma lack a functional blood-brain barrier. Neuro Oncol. 23 (5), 732-742 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ortotopik Beyin Tümörüİntrakraniyal EnjeksiyonPediyatrik Beyin TümörüDiffüz Medyan GliomKan-Beyin BariyeriTümör TutunmasıNörosfer Kültürüİmmünohistokimyasal Analiz
Stereotaksik Cihaz Kullanılarak Beyin Tümörleri İçin Ortotopik Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellerinin Oluşturulması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.