Yöntem makalesi

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67374

⸱

24 Ocak 2025

 , 
1Institute for Medical Microbiology, Virology and Hygiene, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Bu makalede

Özet

Burada, birincil insan monositinden türetilmiş makrofajların üç boyutlu (3D) bir kollajen I matrisinde bir tümör sferoidi ile etkileşimini araştırmak için bir protokol sunuyoruz ve mikroçevrenin çözünür ve fiziksel özelliklerinin hücre istilası üzerindeki etkisini karşılaştırma imkanı sunuyoruz.

Özet

Bağışıklık ve kanser hücrelerinin etkileşimi ve bunların metastaz üzerindeki etkileri, kanser araştırmalarının önemli bir yönünü temsil eder. Şimdiye kadar, in vivo durumun in vitro yaklaşımına izin veren sadece birkaç protokol mevcuttur. Burada, üç boyutlu (3D) kollajen I matrisine gömülü H1299 küçük hücreli dışı akciğer karsinomu hücrelerinin tümör sferoidlerini kullanarak, insan makrofajlarının kanser hücrelerinin invazivliği üzerindeki etkisini gözlemlemek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz. Bu birlikte yetiştirme kurulumuyla, makrofajlardaki düzenleyici faktörlerin küçük enterferans yapan RNA (siRNA) bazlı tükenmesinin, kontrollere kıyasla tümör sferoidinden kanser hücrelerinin 3D istilası üzerindeki etkisini test ettik. Bu yöntem, sferoid alan veya istilacı kanser hücrelerinin sayısı gibi farklı parametrelerin belirlenmesine ve böylece kanser hücresi invazyonundaki farklılıkların tespit edilmesine olanak tanır. Bu makalede, ilgili kurulumu sunuyoruz, sonraki analizleri ve bu yöntemin avantajlarını ve potansiyel tuzaklarını tartışıyoruz.

Giriş

Makrofajlar, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir parçasıdır ve enfeksiyonlar veya yaralanmalardan sonra hücre kalıntılarının temizlenmesi gibi birçok patolojik durumda ilk savunma hattını temsil eder1. Son on yıllarda, bağışıklık hücrelerinin kanserin ilerlemesi üzerindeki etkisi birçok çalışmanın bir yönü olmuştur. Buna göre, makrofajların primer tümörlerle ilişkilendirilerek ve tümörle ilişkili makrofajlar (TAM'ler) haline gelerek metastazı kolaylaştırabileceği gösterilmiştir2. Makrofajlar, kanser hücrelerine maruz kaldıklarında ifade profillerini değiştirebilir ve bu da metastazın bağışıklık sisteminden kaçışını kolaylaştırır3. Ek olarak, kanser hücrelerinin primer tümörden kaçmak için makrofajlar tarafından oluşturulan hücre dışı matriksteki (ECM) kusurları kullanabildiği ve davranışlarının hücre dışı veziküller (EV'ler) dahil olmak üzere salgılanan faktörlerin alımıyla da manipüle edildiği gösterilmiştir4,5. Fiziksel ve kimyasal yönlerin bu etkileşimi, bağışıklık hücrelerinin tümör yayılımı ve çevresindeki mikro çevre üzerindeki etkisini karakterize etmek için yeni yöntemlerin geliştirilmesini gerektirir.

Metastaz bağlamında immün hücre davranışını incelemek için farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir in vivo6. Bununla birlikte, hayvanlar da dahil olmak üzere tüm deneyler için olduğu gibi, hayvanlar üzerinde test yapılması için bir lisansa ve bir hayvan tesisine ihtiyaç vardır; Bu yaklaşımlar zaten çok fazla geliştirme ve hazırlık gerektiriyor. Ayrıca, çoğu mikroskobik kurulum için tüm örneklere erişilemediğinden, özellikle canlı hücre görüntüleme ile ilgili olarak analiz genellikle karmaşıktır. Bilim ve toplum, kurban edilen hayvanların sayısını azaltmak için hayvansız araştırmaları hedeflediğinden, hipotezleri ilk olarak nitelikli in vitro koşullarda test etmek için yeni yöntemlerin geliştirilmesi de gerekli ve zamanında.

Yakın tarihli bir yayın7'de, birincil insan makrofajlarının bir tümör sferoidinden istilacı kanser hücrelerinin istilacılığı üzerindeki etkisini araştırdık. Bu amaçla, kollajen I bazlı bir makrofaj-tümör sferoid ko-invazyon testi oluşturduk. Bu bağlamda, membran tip 1 matriks metalloproteinazın (MT1-MMP) hızlı geri dönüşüm yolaklarının makrofajlardaki rolünü aydınlatmayı amaçladık. MT1-MMP geri dönüşümünün önemli bir itici gücü olarak tanımladığımız süper işlemsel kinesin KIF16B için tükenmiş makrofajları ve bunların katı bir sferoidden H1299-Yeşil Floresan Protein (GFP) hücrelerinin invaziv yetenekleri üzerindeki etkilerini test ettik. KIF16B'den tükenmiş makrofajlar, yüzeylerinde zara bağlı MT1-MMP'nin azalmış seviyelerini gösterirken, H1299 hücrelerinin kendileri tedavi edilmemiştir.

Bildiğimiz kadarıyla, makrofaj-tümör-sferoid ko-invazyonunun tam olarak görüntülenmesine ve analizine izin veren benzer bir yöntem tanımlanmamıştır. Her ne kadar son yayınımız7'de sferoide uzak bireysel olarak göç eden hücrelerin analizine odaklanmış olsak da, tahlil, istilacı ipliklerin sayısı, kanser hücresi-makrofaj etkileşiminde yer alan proteinler, kollajen I bozunma miktarı veya çevresinin uzunluğu gibi diğer küresel özellikler gibi çok sayıda başka araştırmaya izin verir.

Protokol

Bu protokol, donör kan örneklerinden elde edilen primer insan makrofajlarının kullanımını içerir. Hamburg-Eppendorf Üniversitesi Tıp Merkezi'nin etik kurallarına göre, kan örnekleri toplandı ve bağışçılara tazminat ödendi. Numunelerin daha fazla işlenmesi, verilen güvenlik yönergelerine göre gerçekleştirildi (örneğin, test edilmemiş numunelerin işlenmesi). Bu çalışmada birincil insan makrofajları ile yapılan çalışmalar, Almanya'daki Ärztekammer Hamburg tarafından itiraz edilemez olarak değerlendirilmiştir.

1. H1299 tümör sferoidlerinin iskelesiz bir yaklaşımla oluşturulması (3 gün önceden)

  1. Kanser hücrelerini% 5 CO2 in 25 cm2 hücre kültürü şişeleri (Malzeme Tablosuna bakınız) ile 37 ° C'lik bir inkübatörde kanser hücresi ortamı (Dulbecco'nun modifiye edilmiş kartal ortamı [DMEM] +% 1 penisilin-streptomisin [pen-strep] +% 10 fetal sığır serumu [FBS] + 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler + 2 mM L-glutamin)% 80 birleşene kadar yetiştirin.
  2. Hücreleri Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile bir kez yıkayın ve 2 dakika boyunca 1 mL tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (%0.25, fenol-kırmızı) ekleyerek ayırın. 2 mL kanser hücresi ortamı ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun ve dekolmanı ışık mikroskobu altında kontrol edin.
    NOT: Kanser hücrelerinin ayrılması ve kanser hücresi kümelerinin bulunmaması önemlidir.
  3. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir reaksiyon tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 245 x g'da santrifüjleyin. Daha sonra, tripsin çözeltisini pipetleyerek veya bir pompa kullanarak çıkarın, peleti daha sonra 5 mL DPBS ekleyerek yıkayın ve aynı koşullar altında tekrar santrifüjleyin.
  4. Peletleri 5 mL kanser hücresi ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri örneğin bir Neubauer odası ile sayın. 8.000 H1299-GFP hücresini, 25 μL kanser hücresi ortamının son hacminde 96 oyuklu ultra düşük yapışma plakasına ( Malzeme Tablosuna bakınız) aktarın.
  5. Odayı inkübatörde 3 gün boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin. Mikroskop altında sferoidleri homojenlik açısından kontrol edin. Daha fazla deney için daha düşük yoğunluklu sferoidleri veya bağlanmamış bireysel kanser hücrelerini düşünmeyin.

2. Donör kan örneklerinden primer insan makrofajlarının hazırlanması

  1. Donör kan örnekleri hemen hücre izolasyonu için kullanılmayacaksa, çalkalanarak 4 °C'de saklayın.
  2. Bir transfüzyon torbasından 20 mL kanı 50 mL'lik bir reaksiyon tüpüne aktarın.
  3. Daha sonra, 50 mL'lik yeni bir tüp hazırlayın ve 15 mL lenfosit ayırma ortamı (LSM) ekleyin.
  4. 20 mL kanı LSM içeren her bir tüpe karıştırmadan dikkatlice ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin.
  5. Bu arada, 50 mL'lik yeni bir tüp hazırlayın ve 10 mL soğuk Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 ortamı ekleyin.
  6. Santrifüjlemeden sonra, kan içeren tüp içindeki yoğun, beyaz fazı ("buffy coat") hazırlanan RPMI içeren tüpe aktarın ve soğuk RPMI ile hacmi 50 mL'ye ekleyin.
  7. Süspansiyonu 450 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  8. Hücreleri 10 mL soğuk RPM'de yeniden süspanse edin.
  9. Karışımı 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'da tekrar santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti 50 mL RPMI'de yeniden süspanse edin.
  10. Numuneyi 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 x g'da tekrar santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletini 1.5 mL soğuk monosit tamponunda (25 mL DPBS'de% 0.5 insan serum albümini + 5 mM EDTA) yeniden süspanse edin.
  11. Hücre süspansiyonunu buzun üzerine koyun, 250 μL anti-CD14 mikro boncuk ekleyin ve buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
  12. Manyetik bir ayırıcı rafa bir filtre ekleyerek bir ayırma sütunu hazırlayın ve dengeleme için 900 μL monosit tamponu ekleyin.
  13. Hücre süspansiyonunu filtrenin üzerine dökün ve yerçekimi ile bir atık tüpüne akmasına izin verin.
  14. Manyetik boncuklara bağlı hücrelerin bulunduğu kolonu 1 mL monosit tamponu ekleyerek yıkayınız.
  15. 20 mL RPMI içeren 50 mL'lik yeni bir tüp hazırlayın ve kolonun altındaki atık tüpü değiştirin.
  16. Kolona 3 mL monosit tamponu ekleyin, manyetik raftan çıkarın ve damgayı takın.
  17. Hücreleri hazırlanan 50 mL'lik tüpe bastırın ve RPMI ile 30 mL hacme kadar doldurun.
  18. Hücreleri ışık mikroskobu altında sayın (örneğin, bir Neubauer sayma odası kullanarak) ve RPMI ekleyerek 2 x 106 hücre / mL'ye hücre sayısını ayarlayın.
  19. 1 mL hücre süspansiyonunu 6 oyuklu bir odanın her bir oyuğuna tohumlayın ve plakayı 37 ° C ve% 5 CO2'de 2-4 saat inkübe edin.
  20. Hücrelerin düzgün bir şekilde yapışıp yapışmadığını kontrol edin ve RPMI'yi 1.5 mL monomedium (% 20 insan serumu + RPMI'de% 1 pen-strep) ile değiştirin.
  21. 24 saatlik inkübasyondan sonra ortamı değiştirin. Bu koşullar altında, monositler 6 gün içinde makrofajlara farklılaşır.

3. Makrofaj hazırlığı

  1. Deney gününde, makrofajları bireysel kültür koşulları için uygun miktarda aktataz ile ayırın. Örneğin, hücreler 6 oyuklu bir tabağa ekilirse 500 μL akutaz kullanın. Hücreleri çözelti içinde yaklaşık 40 dakika inkübe edin, bir kez 2 mL DPBS ile yıkayın ve bir Neubauer odası ile sayın.
  2. Bir sferoid için, istenen sayıda makrofajı 40 μL kollajen I karışımında (2.5 mg / mL sıçan kuyruğu kollajen I) seyreltin ve reaksiyon tüpünü kısaca girdaplayarak karıştırın. Yapılan deneylerde 200.000 hücre/mL, kanser hücrelerinin istilasında saptanabilir bir fark göstermiştir. Kollajen hücre karışımını buz üzerinde tutun, çünkü oda sıcaklığında (RT) hızlı bir şekilde polimerleşmeye başlayacaktır.

4. Ortak istila testinin kurulması

NOT: Görüntüleme odasının formatına, analizin amacına veya ilgili görüntüleme kurulumuna bağlı olarak, tümör sferoidinin ultra düşük yapışma plakasından aktarılması ve kollajen ve besiyeri değerlerinin uyarlanması gerekebilir. Aşağıdaki adımlar, 15 kuyucuklu μ slaytta bir örnek için kurulumu açıklar.

  1. İlk olarak, 300 μL DPBS ekleyerek sferoidi yıkayın. 1 mL'lik mavi pipet ucunun ucunu kesin ve sferoidi DPBS ile alın. Sferoidin uca yerleşmesinden sonra, tümör sferoidini yüzey gerilimi ile aktarmak için pipeti görüntüleme odasının altına kısa bir süre itin.
    NOT: Değiştirilmemiş uçlardaki sürtünmenin sferoidin bütünlüğünü bozabileceğine dikkat etmek önemlidir.
  2. Sferoid ile aktarılan artık DPBS'yi pipetleme ile mümkün olduğunca çıkarın.
  3. H1299-GFP sferoidini içeren görüntüleme odasına hızlı bir şekilde 40 μL kollajen I/makrofaj karışımı ekleyin (bkz. adım 3.4).
  4. Plakayı bir hücre inkübatörüne aktarın ve kollajen karışımını tamamen polimerize etmek için plakayı nemli koşullar altında 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin.
  5. Polimerizasyondan sonra, her bir oyuğa dikkatlice 25 μL kanser hücresi ortamı ekleyin ve plakayı daha önce açıklanan koşullar altında inkübatörde 3 gün boyunca inkübe edin. Gerekirse, canlı numuneyi istenen zaman noktalarında bir lazer tarama mikroskobu ile görüntüleyin.

5. Ek fiksasyon ve boyama

  1. İmmünofloresan boyama yapmak için, makrofajları ve H1299-GFP sferoidlerini kollajen I matrisi içinde sabitleyin. İlk olarak, süpernatanı matrise dokunmadan bir pompa ile her numuneden dikkatlice çıkarın.
    NOT: Numunenin tahrip olmasını önlemek için, süpernatant bir pompa kullanmadan manuel pipetleme yoluyla da çıkarılabilir.
  2. Her bir oyuğa DPBS'de 50 μL %3.7 formaldehit ekleyin ve numuneleri buz üzerinde 5 dakika inkübe edin. Daha sonra, sabitleyici çözeltiyi çıkarın ve üzerine tekrar 50 μL taze sabitleme çözeltisi ekleyin. Bu adım, kuyu içinde daha homojen bir formaldehit seviyesi elde etmek için önemlidir. Numuneleri gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    NOT: Karıştırdığım kolajen miktarına bağlı olarak, kuluçka süreleri birkaç saate kadar uzayabilir.
  3. Ertesi gün fiksatifi çıkarın ve görüntüleme odasının hacmine bağlı olarak en az iki kez DPBS'yi tekrar tekrar çıkararak numuneleri yıkayın. DPBS'yi pipetleyerek çıkarmadan önce bir çalkalayıcı üzerinde buz üzerinde 5 dakika kısa bir süre inkübe edin. Numuneler artık boyamaya hazırdır.
  4. DPBS'de 1:100 oranında 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 mg / mL, çekirdekleri boyamak için) ve falloidin 568 (F-aktini boyamak için) karışımı ekleyerek numuneleri en az 30 dakika boyunca boyayın ve görüntülemeden önce DPBS ile iki kez yıkayın.

6. Tümör büyümesinin farklı parametrelerinin görüntülenmesi ve analizi

NOT: Aşağıdaki adımlar, sabit canlı hücre görüntüleme örnekleri için gerçekleştirilebilir.

  1. Tümör sferoidinin gözlemlenmesi için, sferoidin kabaca alt üçte birlik kısmının z-yığınının görüntülenmesine izin veren 10x objektif ile donatılmış ters çevrilmiş bir lazer tarama mikroskobu kullanın.
    NOT: Numunenin kalınlığı nedeniyle, 2 fotonlu bir mikroskop da avantajlı olabilir. Tek tek hücrelerin en iyi şekilde tanımlanması için daha yüksek lazer gücü ve maruz kalma süresi gerekebilir.
  2. Satın alma işleminden sonra, ImageJ yazılımı (Fiji) olan Fiji'yi kullanarak yığınları z-projeksiyon ile birleştirin. Ayrıca, bir otomatik eşik (örneğin, Huang otomatik eşiği) uygulayarak H1299-GFP sinyalinin ortaya çıkan kanalını işleyin ve arka plan miktarına ve sinyal yoğunluğuna bağlı olarak görüntünün beneklerini gidererek artık gürültüyü giderin.
  3. Fiji kullanarak küresel parametreleri ölçün.
    1. Alan: Değnek aracıyla küresel boyutu ölçün.
    2. Çevre: Çevre'yi ölçüm ayarlarına dahil edin.
    3. Çap: Feret'in Çapını ölçüm ayarlarına dahil edin.
    4. Dairesellik: Şekil Tanımlayıcılarını ölçüm ayarlarına dahil edin.
  4. Fiji kullanarak bireysel kanser hücresi parametrelerini ölçün.
    1. İstilacı hücrelerin sayısını ölçün.
      1. Değnek aracıyla merkezi küreyi seçin ve sinyali silin. Bu, sferoidin yanı sıra hala sferoide bağlı olan hücrelerin tüm bağlı sinyallerini analizden çıkaracaktır.
      2. Daha sonra, Parçacığı Analiz Et aracını kullanın veya kalan tüm bireysel sinyalleri ölçün.
        NOT: Sonuç, istilacı kanser hücrelerinin sayısı olacaktır. Ek olarak, sonuç aynı zamanda kanser hücrelerinin kapsadığı temsili alanı da gösterebilir ve alanın büyüklüğüne bağlı olarak toplu istila veya tek hücreli istila olarak yorumlanabilir. İstilacı kanser hücrelerinin sayısını daha da doğrulamak için, analiz edilen parçacıkların bir maskesi DAPI kanalının üzerine yerleştirilebilir ve çekirdekler sayılabilir.
  5. Ayrıca, GraphPad Prism veya Microsoft Excel gibi bir istatistiksel program kullanarak sonuçları değerlendirin.
    NOT: Bu protokolün hem sağlam hem de esnek olduğu gösterilmiştir. Laboratuvarımızda, donör değişkenliğini hesaba katmak için her zaman en az 3 donörden alınan birincil insan makrofajları ile 50'den fazla kez kullanılmıştır. Mevcut haliyle, protokolün %90-95 gibi bir başarı oranına yol açtığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, kurulum karmaşık olduğundan, her sferoid için makrofajların etkileşimi bireysel olduğundan, değişen sonuçlar da bir sonuç olabilir. Bu nedenle, deneyin 5 sferoid ile en az 3 kez yapılması istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç elde etmek için önerilmektedir.

Sonuçlar

Şekil 1, bir kollajen I matrisinde inkübasyonun ilgili günlerinde görüntülenen bir H1299-GFP sferoidini göstermektedir. 0. günde çekilen ilgili bir parlak alan görüntüsü, aynı zamanda sferoid ile birlikte kültürlenmiş birincil insan makrofajlarını da göstermektedir. Deneyin 3. gününde kaydedilen temsili görüntü, işlendikten sonra büyütülür. İstilacı hücrelerin sayısı, toplu istila bölgeleri ve küresel çevre dahil olmak üzere analiz edilebilecek farklı parametreler belirtilmiştir. Dahil edilen tablo, bu görüntüden elde edilen sonuçları göstermektedir. Algılanan sinyallerin sayısı görsel izlenimle eşleşir. Merkezi sferoidde herhangi bir bozulma görülmez, bu da sferoid döküntülerinden türetilen hücrelerden ziyade gerçek bireysel kanser hücresi istilasını gösterir. Farklı sferoidlerin ve koşulların sonuçları artık istatistiksel analiz yoluyla karşılaştırılabilir.

figure-results-1
Şekil 1: Temsili sonuçlar. (Üst panel) H1299-GFP sferoidi, bir kollajen I matrisinde inkübasyonun 0. gününde, 1. gününde, 2. gününde ve 3. gününde görüntülendi. (Orta sol panel) Birlikte kültürlenmiş birincil insan makrofajlarını gösteren sferoidin parlak alan görüntüsü. (Orta sağ panel) 3. günde elde edilen, işlendikten sonra büyütülen ve analiz edilebilecek farklı parametreleri gösteren temsili bir görüntü (kırmızı küresel çevre; daha iyi görselleştirme için manuel olarak izlenir). (Alt panel) Sağ orta paneldeki görüntüden elde edilen sonuçlar. Not: Kanser hücresi davranışını aydınlatmak için sadece GFP kanalı kaydedildiği için makrofajlar görünmez. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Kanser hücrelerinin istilası, makrofajlar gibi birlikte istila eden bağışıklık hücreleri bağlamında önemli ancak yeterince çalışılmamış bir konu olmaya devam etmektedir. Kolektif ve bireysel kanser hücresi istilası, metastaz sırasında kritik süreçlerdir ve farklı organların istilasının çokluğu nedeniyle kanser hastalarının hayatta kalma oranını düşürdüğü gösterilmiştir 8,9. İn vivo çalışmalar karmaşıktır ve hayvan barınma tesislerine erişimi olan laboratuvarlarla sınırlıdır. Ayrıca, in vivo koşulları kontrol etmek veya bireysel yönleri özel olarak manipüle etmek de zordur. Bu nedenle, araştırmanın ilk satırındaki temel soruları yanıtlamak için daha erişilebilir bir sisteme duyulan ihtiyaç devam etmektedir.

Burada sunulan yöntemle, i) bağışıklık hücresi ve ii) kanser hücresi davranışı, iii) katı bir sferoidin büyümesi ve gelişmesi ve iv) çevredeki tümör mikroçevresindeki (TME) hücrelerin ECM bileşenleri üzerindeki etkisinin daha fazla analiz edilebileceği bir yol geliştirdik. Modifiye edilmiş (örneğin, siRNA tedavisi ile spesifik düzenleyiciler için tükenmiş) makrofajların, katı bir sferoidden bireysel kanser hücrelerinin invazivliği üzerindeki etkisini karşılaştırmak için kullanılabilir. TME'nin veya salgılanan faktörlerin fiziksel olarak yeniden düzenlenmesinin, gözlemlenen kanser hücresi davranışının ana nedenini temsil edip etmediği şu anda belirsizdir ve daha ayrıntılı olarak analiz edilmesi gerekmektedir.

Ek olarak, kanser hücrelerinin kendileri, örneğin siRNA tedavisi veya spesifik düzenleyicilerin nakavt edilmesiyle manipüle edilebilir. Ayrıca, istilacı kanser hücrelerinin daha kesin bir şekilde belirlenmesine izin vermek için tanımlanan hücre profili içindeki sayılan çekirdek sayısı karşılaştırılarak analiz geliştirilebilir.

Bu testi, TME'deki makrofajların tümör hücrelerinin istilası üzerindeki etkisini belirlemek için kullandık. Bununla birlikte, tümör hücrelerinin, muhtemelen ortam içinde salgılanan faktörler yoluyla makrofajların aktivitesini etkileme olasılığının yüksek olduğu da belirtilmelidir. Bu nedenle, ilgili antikorları kullanarak immünofloresan boyama ile değişen polarizasyon durumu (M1'e karşı M2) gibi makrofajlardaki değişiklikleri tanımlamak da değerli bir çaba olacaktır. Geçmişte, tek tabakalar halinde büyüyen hücreler ile 3 boyutlu bir ortamda kültürlenen hücreler arasındaki karşılaştırma, ifade profillerinde önemli farklılıklar göstermiştir10.

Ek olarak, makrofaj alt popülasyonlarının floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ve bunların deneysel prosedüre entegrasyonu öğretici olabilir. Son olarak, makrofajların kanser hücreleri veya tümör küresel yüzeyi ile etkileşime girdiği temas alanlarının daha ayrıntılı görüntülenmesi, 3D invazyon ve etkileşim ile ilgili daha ileri mekanizmaların tanımlanmasına yol açabilir.

Tam olarak kontrol edilemeyen not, kollajen karışımının eklenmesinden sonra sferoidin kuyu merkezine hassas bir şekilde konumlandırılmasıdır. Sferoidin altındaki kollajen miktarının düzenlenmesi özellikle zordur. Burada, sferoidin hassas bir şekilde konumlandırılmasına izin vermek için, örneğin daha yüksek numune sayılarına sahip agaroz kalıplarının üzerine11 başka yöntemler oluşturulmuştur. Bununla birlikte, sitokinlerin salınımı yaygın bir mekanizma olduğundan, bu çok sferoid tahlili içindeki tüm sferoidler salgılanan faktörlere maruz kalır ve tek bir sferoid üzerinde etkili olan bağışıklık hücrelerinin sayısını kontrol etmek zordur.

Bu protokolün temel bir sınırlaması, kanser hücre hatlarının tek tip sferoidler oluşturma yeteneğidir, bu nedenle yalnızca hücre hatlarının bir alt kümesine uygulanabilir. Örneğin, MeWo melanom hücreleri düzensiz, tabaka benzeri 3D yapılar oluşturur, ancak tek tip sferoidler oluşturmazlar.

Ayrıca, ECM materyali, hücre sayısı gibi birçok özelliği değiştirilebildiği veya süpernatana sitokinler gibi spesifik faktörler eklendiği için tahlilin oldukça uyarlanabilir olduğuna dikkat edilmelidir. Bu nedenle, kanser hücresi / bağışıklık hücresi etkileşiminin ilk in vitro çalışmaları için son derece uygun olmalıdır ve şu anda ele alınan spesifik araştırma sorusuna göre uyarlanabilir.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir çıkar bulunmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, mükemmel teknik destek ve hücre kültürü için Andrea Mordhorst'a ve sürekli destek için Martin Aepfelbacher'e teşekkür eder. SL laboratuvarında makrofaj istilası ile ilgili çalışmalar Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC877/B13; LI925/13-1).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 &mikro;-Slayt Anjiyogenez ibidi81506
AccutaseInvitrogen00-4555-56
Alexa Fluor 568 Phalloidin ThermoFisher ScientificA12380
CD14 Mikro BoncuklarMiltenyi Biotec130-050-201
CO2 İnkübatörBağlayıcı
Kollajen I Sıçan Kuyruğu Corning354236
DAPIAppliChem
DMEM (1x) + GlutaMAXGibco31966-021
DPBSAnprotecMS01Y71003
FBSBio& HücreFBS'si. S 0613
Fiji NIHImageJ 2 Sürümü: 2.3.0/1.53s
Formaldehit %37  252549-500mlSigma-Aldrich
H1299-GFP hücre hattı
İnsan serum albüminiSigma-AldrichA5843
Leica TCS SP8 XLeica
l-glutamin ve nbsp;Gibco25030-024
Lenfosit Ayırma Ortamı (LSM) 1077PromoCellC-44010
MS SütunlarıMiltenyi Biotec130-042-201
esansiyel olmayan amino asitler ve nbsp;Sigma-Aldrich11140050
Kalem StrepGibco15140-122
RPMI-1640 Gibco81275-034
TC-Platte 96 Kuyusu, BIOFLOAT, Ar-GeSARSTEDT83,39,25,400
VORTEKS-GEN 2 Bilimsel Endüstriler

Kaynaklar

  1. Lendeckel, U., Venz, S., Wolke, C. Macrophages: shapes and functions. ChemTexts. 8 (2), 12(2022).
  2. Dallavalasa, S., et al. The role of tumor associated macrophages (TAMs) in cancer progression, chemoresistance, angiogenesis and metastasis - Current status. Curr Med Chem. 28 (39), 8203-8236 (2021).
  3. Pan, Y., Yu, Y., Wang, X., Zhang, T. Tumor-associated macrophages in tumor immunity. Front Immunol. 11, 583084(2020).
  4. Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).
  5. Wenzel, E. M., et al. Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding. Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).
  6. Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).
  7. Hey, S., Wiesner, C., Barcelona, B., Linder, S. KIF16B drives MT1-MMP recycling in macrophages and promotes co-invasion of cancer cells. Life Sci Alliance. 6 (11), e202302158(2023).
  8. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).
  9. Shi, X., et al. Mechanism insights and therapeutic intervention of tumor metastasis: latest developments and perspectives. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 192(2024).
  10. Li, G. N., Livi, L. L., Gourd, C. M., Deweerd, E. S., Hoffman-Kim, D. Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices. Tissue Eng. 13 (5), 1035-1047 (2007).
  11. Lin, Y. N., et al. Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture. J Vis Exp. 160, e61392(2020).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tümör Sferoid İnvazyonu3B Kollajen MatrisKanser Hücresi İnvazyonuMakrofaj EksiltmeKüçük İnterferans RNAPrimer İnsan MakrofajlarıLazer Tarama MikroskobuHücre Ko-Kültürü
Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.