Yöntem makalesi

Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır

DOI:

10.3791/67405

⸱

7 Şubat 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering, Macquarie University, 2Institute for Glyco-core Research (iGCORE), Nagoya University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kanserlerin glikobiyolojisini daha iyi anlamak için gerekli olan karmaşık tümör mikro ortamlarındaki heterojen glikoproteom hakkında kapsamlı bilgiler sunan entegre bir omik teknolojisi olan glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntemini detaylandırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikozilasyon, çok çeşitli tümörjenik süreçleri etkileyen yaygın ve yapısal olarak çeşitli bir protein modifikasyonudur. Kütle spektrometresi güdümlü glikomikler ve glikoproteomikler, sırasıyla serbest bırakılmış glikanları ve bozulmamış glikopeptidleri analiz etmek için güçlü yaklaşımlar olarak ortaya çıkmıştır ve tümör mikroçevresindeki (TME) heterojen glikoproteomun daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Bu protokol, ilk olarak glikan yapılarını ve bunların tümör dokularının, hücre popülasyonlarının veya vücut sıvılarının glisyonundaki kantitatif dağılımını aydınlatmak için gözenekli grafitleştirilmiş karbon-LC-MS/MS bazlı glikomikler kullanan entegre bir omik teknolojisi olan glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntemini detaylandırır. Bu, hasta grupları, hastalık evreleri veya koşulları arasında değişmiş glikosilasyonu tanımlamak için karşılaştırmalı bir glikomik analize izin verir ve daha da önemlisi, bilinen glikan yapılarından oluşan bir kütüphane oluşturarak aynı numunenin/numunelerin aşağı akış glikoproteomik analizini geliştirmeye hizmet eder, böylece veri arama süresini ve glikoprotein yanlış tanımlama oranını azaltır. N-glikoproteom profillemesine odaklanarak, glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntem için numune hazırlama adımları bu protokolde detaylandırılmıştır ve veri toplama ve analizinin temel yönleri tartışılmaktadır. Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomik yöntem, TME'de bulunan glikoproteinler ve bunların glikozilasyon bölgeleri, bölge doluluğu ve bölgeye özgü glikan yapıları hakkında kantitatif bilgi sağlar. Kolorektal kanser hastalarından alınan formalinle sabitlenmiş parafine gömülü tümör dokularından temsili sonuçlar sunulmakta olup, yöntemin hassas ve biyobankalarda yaygın olarak bulunan doku kesitleriyle uyumlu olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, glikomik güdümlü glikoproteomikler, kompleks TME'lerdeki glikoproteomun heterojenliği ve dinamikleri hakkında kapsamlı bir bakış açısı sunar ve kanserlerin glikobiyolojisini daha iyi anlamak için gerekli sağlam biyokimyasal verileri üretir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein glikozilasyonu, filogenetik yaşam ağacı 1,2,3 boyunca türler tarafından üretilen proteinlerin yaygın ve karmaşık bir ko- ve translasyon sonrası modifikasyon türüdür. Proteine bağlı glikanların, hücresel etkileşimlerin ve iletişim olaylarının aracılığı ve düzenlenmesi dahil olmak üzere insan sağlığı için önemli olan çok çeşitli biyolojik süreçleri etkilediği bilinmektedir 4,5. Anormal protein glikozilasyonunun malign transformasyonun, tümör ilerlemesinin ve yayılmasının bir nedeni olduğu düşünülmektedir 6,7,8. Bu, glikanları tümör mikroçevresindeki (TME) önemli tümörjenik süreçlerde ima eder ve glikan bazlı biyobelirteçlerin ve terapötik uygulamaların keşfi için önemli ve büyük ölçüde kullanılmayan bir potansiyel sunar. Bu nedenle glikobiyoloji, kanser araştırmalarında ve yaşam bilimlerinde giderek daha fazla ilgi görmektedir9.

Son on yılda glikoanalitik ve bilişimdeki önemli gelişmelerden güç alan 10,11,12,13,14,15,16,17, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) güdümlü glikomikler ve glikoproteomikler, karmaşık karışımlarından serbest bırakılan glikanların ve bozulmamış glikopeptitlerin sistem genelinde profillenmesi için güçlü araçlar olarak kurulmuştur. çeşitli kanser hastası örnekleri (örneğin, tümör dokuları, hücre popülasyonları, vücut sıvıları) gibi biyolojik numune kökenlerinden doğrudan ekstrakte edilen glikoproteinler3,13,18,19,20.

Glisimik, hücreler, dokular ve hatta tüm organizmalar tarafından dinamik olarak üretilen glikan repertuarının (glycome) yapısı ve miktarı hakkında bilgi sağlar. Öte yandan, glikoproteomik, protein taşıyıcıları ve bunların glikozilasyon bölge(ler)i, bölge doluluk oranları (makro-heterojenlik), bölgeye özgü glikan bileşimleri ve bunların bölge dağılım modeli (mikro-heterojenlik) hakkında sınırlı glikan yapısal bilgisi ile (genellikle glikan bileşimi ile sınırlıdır) nicel bilgi sağlar15,16,21. Bu nedenle, glikomikler ve glikoproteomikler, glikoproteom22'nin biyokimyasal ayrıntılarını araştırmak için tamamlayıcı yaklaşımlardır.

Glikomikler ve glikoproteomikler için sayısız metodolojik tasarım ve analitik strateji geliştirilmiş ve ilgilenilen glikoanalite (örneğin, N- / O- / C-bağlı, glikan / glikopeptid / glikoprotein, etiketli / etiketsiz), numunenin doğasına (örneğin, hücreler, dokular, vücut sıvıları), miktarına (nanogram / mikrogram / miligram protein seviyeleri) ve mevcut analitik cihaza bağlı olarak laboratuvarlar arasında uygulanmıştır23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32. Paralel kullanımlarının bilinen faydalarına rağmen, glikomikler ve glikoproteomikler yaygın olarak birlikte uygulanmaz, daha ziyade analitik uzmanlık ve özel enstrümantasyon için yüksek talepleri nedeniyle glikobiyolojik ve kanser araştırma çalışmalarında bağımsız yaklaşımlar olarak uygulanır.

Bu teknoloji boşluğunu kabul ederek, on yıldan fazla bir süre önce, karmaşık biyolojik örneklerden elde edilen glikomik ve glikoproteomik verileri entegre edebilen glikomik destekli glikoproteomik yöntemi tanıttık33. Kısacası, glikomik destekli (veya bu protokolde olduğu gibi glikomik kılavuzlu) glikoproteomik teknolojisi, N- ve/veya O-glikanları, yerleşik bir gözenekli grafitleştirilmiş karbon (PGC) LC-MS/MS yöntemi34,35 aracılığıyla profillendirir ve daha sonra glikan arama alanının sınırlarını tanımlayarak aynı numune(ler)den elde edilen bozulmamış N- ve/veya O-glikopeptid verilerinin analizi için kullanılır36. PGC-LC-MS/MS, yüksek hassasiyet ve yapısal çözünürlükle glisit hakkında kantitatif bilgi sağladığı, karmaşık karışımlar içinde bile glikanların topolojisi (monosakkarit dizisi ve dallanma modeli) ve glikosidik bağları hakkında bilgi verdiği için özellikle güçlü bir glikomik yöntemdir 35,37,38. Glikoproteomik iş akışı, peptit üretimi, isteğe bağlı peptit etiketleme, çoğullama ve ön fraksiyonlamanın yanı sıra, analitik tanımlaması için kademeli çarpışma enerjisi/daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması (sceHCD, N-glikopeptidler için) ve elektron transferi/yüksek enerjili çarpışma ayrışması (EThcD, O-glikopeptidler için) dahil olmak üzere farklı parçalanma yöntemlerini ideal olarak kullanan ters fazlı LC-MS/MS analizinden önce zenginleştirmeyi içerir. N-glikoproteom analizi için, paralel de-N-glikoproteomikler, protein/peptit arama alanını tanımlayarak ve işgal edilen N-glikosilasyon bölgeleri ve bunların site doluluk oranları hakkında daha fazla ayrıntı sağlayarak bozulmamış N-glikopeptid veri analizine rehberlik edebilirken, modifiye edilmemiş peptitlerin paralel analizi, incelenen koşullar arasındaki herhangi bir protein seviyesi değişikliğini ortaya çıkarır.

Bu makale, glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntem için ayrıntılı ve takip etmesi kolay bir adım adım protokol sağlar (iş akışına genel bakış için Şekil 1'e bakın). Protokol, numune hazırlama adımlarının ve LC-MS/MS tabanlı glikomikler ve glikoproteomik deneylerin deneysel ayrıntılarını sağlar ve yöntemin kolorektal kanser (CRC) hastalarından rezeke edilen tümörlerin formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) doku kesitlerine uygulanmasını gösteren temsili sonuçlar sunarak, dünyanın dört bir yanındaki kanser biyobankalarında arşivlenen değerli bir numune türünde TME'nin glikobiyolojisi hakkında bilgi sahibi olmalarını sağlar. Glikomik ve glikoproteomik verilerin analizi ve entegrasyonu da kısaca tartışılmaktadır.

figure-introduction-1
Şekil 1: Glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntemine genel bakış. Genel bakış, glikomik (solda) ve glikoproteomik (sağda) iş akışlarındaki ayrıntılı deneysel adımları, elde edilen bilgilere genel bir bakış (kalın) ve iki yaklaşımın gelişmiş veri analizi ve yorumlama yoluyla nasıl entegre edildiğini gösterir. Ekle: (i) glisikmik ve (ii-iii) glikoproteomik iş akışları için kullanılan ev yapımı SPE mikro kolonları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, Macquarie Üniversitesi, Sidney, Avustralya'daki İnsan Araştırmaları Etik Kurulu (Tıp Bilimleri) tarafından onaylanmıştır (Protokol 5201800073).

NOT: Glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntem, düşükten aşırı glikoprotein karmaşıklığına kadar değişen çeşitli biyolojik numunelere uygulanabilir. Etiketsiz glikoproteomik yaklaşımlar için (numune havuzunun gerçekleştirilmediği), peptit popülasyonunun yalnızca %1-10'unu oluşturabilen glikopeptitler için zenginleştirmeden sonra yüksek glikoproteom kapsamını sağlamak için başlangıç materyali olarak karmaşık karışımlardan yaklaşık 100-200 μg toplam protein gereklidir. Alan kısıtlamaları nedeniyle, hücrelerden veya dokulardan ilk protein ekstraksiyonu dışarıda bırakılır ve okuyucular diğer kaynaklara yönlendirilir15. Glisimikler, derin glicome profili oluşturma için analiz başına konservatif olarak ~ 10-20 μg protein tüketir ve protein ekstraktının çoğunu glikoproteomik için bırakır. Aksi belirtilmedikçe, nihai konsantrasyonlardan bahsedilmiştir ve aşağıdaki protokolde sulu çözeltiler yapmak için kimyasallar ultra yüksek dereceli suda çözülmelidir.

1. Protein hazırlama

  1. Yerleşik bir yöntem kullanarak ekstraktların protein konsantrasyonunu belirleyin (örneğin, bikinkoninik asit veya Bradford protein tahlilleri). Protein konsantrasyonunu 50 mM TEAB'de (pH 8.5) 10 μg/μL'ye ayarlayın.
  2. Numuneleri 10 mM DTT ile 56 °C'de 45 dakika inkübe ederek disülfür bağlarını azaltın. Alkilat serbest tiyol grupları, daha sonra numuneleri karanlıkta 20-25 ° C'de 30 dakika boyunca 40 mM IAA ile inkübe ederek gruplandırır. Alkilasyon reaksiyonunu fazla DTT (~ 40 mM) ile söndürün.
  3. Her protein örneğini bölün. Glikomikler için yaklaşık 10-20 μg toplam proteine ve glikoproteomik iş akışı için 100-200 μg toplam proteine izin verin.
    NOT: İlgilenilen protein numunesine (örneklerine) ek olarak, prosedürlerin verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini değerlendirmek ve LC-MS/MS performansını izlemek için bilinen bir model glikoprotein (örneğin, sığır fetuini) veya protein karışımı (örneğin, hücre hattı lizatı, plazma) ekleyin.

2. N-glikomik iş akışı

  1. Proteinlerin bir PVDF membranı üzerinde immobilizasyonu
    1. PVDF membran bağlantısını tespit edilecek protein numunesi sayısıyla kesmek için tek delikli bir zımba kullanın.
    2. Eksize edilen zarları etanol veya metanol ile ıslatın, ardından zarları düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın.
    3. Membranlar kurumaya yakın olduğunda, biriken protein numunesinin yüzey alanını en aza indirmek için protein numunelerini nokta başına maksimum 2,5 μL hacimde biriktirin. Gerekirse numuneleri yeniden noktalayın, böylece noktadaki toplam hareketsiz protein miktarı ~ 10-20 μg olur. Bunu yapmak için, lekeleme prosedürünü tekrarlamadan önce lekenin kurumasını bekleyin.
      NOT: Lekelenme sırasında, membranların kurumasını önlemek için membranın etanol veya metanol ile yeniden ıslatılması gerekebilir.
    4. Membranları 20-25 °C'de en az 3 saat, tercihen gece boyunca havayla kurutun. Kurutma sırasında membranların kirlenmesini önleyin.
      NOT: İsteğe bağlı bir kalite kontrol adımı olarak, membranlar üzerinde lekelenen proteinler, daha önce tarif edildiği gibi Direct Blue 71 çözeltisi ile boyanarakgörüntülenebilir 34.
  2. Proteine bağlı N-glikanların salınımı
    1. Benekli zarları içeren her oyuğa metanol içinde 100 μL %1 (a/h) PVP40 ekleyin. Protein örneğinin lekelendiği zarın tarafının, numune hazırlama boyunca yukarı baktığından emin olun.
    2. Plakayı PVP40 solüsyonunda 20-25 °C'de 5 dakika çalkalayın, ardından PVP40 solüsyonunu atın.
      NOT: PVP40 çözeltisi, sonraki adımlarda PNGase F'nin (ve paralel deneylerde bağlantıya özgü bilgi elde etmek için uygulanabilecek herhangi bir ekzoglikozidazın) spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için PVDF membranlarını ve kuyuları bloke eder.
    3. Tıkalı protein lekelerini içeren her kuyuyu 100 μL ultra saf su ile yıkayın ve plakayı 5 dakika çalkalayın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. Her yıkamadan sonra suyun tamamen atıldığından emin olun.
    4. Numune başına 15 μg proteinin biriktiği varsayılarak, her bir kuyucuğa 15 μL PNGase F çözeltisi (0.5 U / μL, 10 U / μL stok çözeltisinden ultra saf su ile seyreltilmiş) ekleyin.
    5. Sonraki inkübasyon adımları sırasında numunenin dehidrasyonunu önlemek için çevredeki boş kuyucuklara su ekleyin ve plakayı dikkatlice kapatmak için şeffaf film kullanın. Plakayı 37 °C'de en az 8 saat inkübe edin.
    6. Kuyucukların yan tarafındaki buharlaşmış damlacıkların plakanın dibinde toplanmasına yardımcı olmak için plakayı 5 dakika boyunca sonikleştirin.
    7. Serbest bırakılan N-glikan örneklerini dikkatlice ayrı mikrosantrifüj tüplerine (1.5 mL) aktarın. Numune kuyucuklarını 2x 20 μL ultra saf su ile yıkayın ve birkaç kez dağıtın ve aspire edin. Her bir kuyucuktan kalan herhangi bir numuneyi, N-glikan numunelerini içeren mikrosantrifüj tüplerine birleştirin.
      NOT: Hidrofilik glikanlar kaplanmış tüplere geri dönüşü olmayan bir şekilde bağlanabileceğinden, N-glisikmik numune hazırlama için düşük bağlayıcı tüpler kullanmaktan kaçının.
    8. 10 μL 100 mM amonyum asetat pH 5.0 ekleyin ve numuneleri 20-25 °C'de 1 saat inkübe edin.
      NOT: Bu adım, salınan N-glikanların indirgeyici ucundaki aminasyonlu N-asetilglukozamin kalıntılarını hidroksilatlar ve sonraki adımda kapsamlı bir azalmaya izin verir. 100 mM amonyum asetatı pH 5.0'a ayarlayın, çünkü ayrılan N-glikanların indirgeyici ucundaki yüksek glikosilamin-hidroksil dönüşüm oranları çözeltinin zayıf asitliğine bağlıdır.
    9. N-glikan örneklerini bir vakum yoğunlaştırıcı sisteminde kurutun.
  3. Serbest kalan N-glikanların azaltılması
    1. Kurutulmuş N-glikan örneklerine 20 μL taze hazırlanmış 1 M NaBH4 in 50 mM KOH ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: NaBH4 kullanıldığı gün KOH'da taze olarak hazırlanmalıdır.
    2. Her tüpün kapaklarını sıkıca kapatın ve numuneleri 50 °C'de 3 saat inkübe edin.
      NOT: N-glikanlar, indirgeyici ucun α- ve β-anomerlerini tek bir alditol formuna dönüştüren ve PGC-LC-MS/MS analizinde tek bir kromatografik zirveye yol açan bir indirgemeye tabi tutulur.
    3. İnkübasyondan sonra, sıvıyı tüplerin dibine getirmek için numune tüplerini bir mikrosantrifüjde döndürün.
    4. Her numuneye 100 μL ultra saf su ekleyin. Alkali N-glikan örneklerini nötralize etmek için 2 μL buzlu asetik asit ekleyin. Numuneleri tüplerin dibine getirmek için numune tüplerini bir mikrosantrifüjde döndürün.
      NOT: Buzlu asetik asit, alkali numuneleri nötralize eder, bu da hidrojen gazı (H2) oluşumuna ve reaksiyon sırasında müteakip köpürmeye yol açar.
  4. PGC-C18-SPE kullanılarak N-glikanların tuzdan arındırılması
    1. Ev yapımı PGC-C18-SPE mikro sütunlarını aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.
      1. Uygun bir şırınga kullanarak C18 disklerini uygun pipet uçlarına (10 μL) takın ve aktarın.
        NOT: Burada ticari C18-SPE mikro kolonlar da kullanılabilir.
      2. %50 (h/h) metanol içinde süspanse edilmiş 10 μL'lik PGC reçine bulamacını C18-SPE mikro kolonlarına pipetleyin. Mikro kolonları, mikrosantrifüj adaptörleri ile donatılmış 2 mL'lik tüplere yerleştirin. ~0,5 cm sütun yüksekliğine sahip PGC-C18-SPE mikro sütunları oluşturmak için tüpleri döndürün (bkz. Şekil 1i). Her numune için bir PGC-C18-SPE mikro kolon hazırlayın.
        NOT: Adaptörlerin kullanılması, mikro sütunların tüpün merkezinde asılı kalmasını sağlar.
      3. Sonraki yıkama ve numune yükleme adımları için, bir tezgah üstü santrifüjü 6.000 rpm'ye (~2.000 x g) ayarlayın ve mobil fazların PGC-C18-SPE mikro kolonlarından geçmesini kolaylaştırmak için 60 saniye döndürün. Her bir PGC-C18-SPE mikro kolonunu ACN'de 50 μL %0,1 (h/h) TFA ile üç kez ve ardından üç kez 50 μL %0,1 (h/h) TFA ile sırayla yıkayın ve şartlandırın.
        NOT: PGC-SPE mikro kolonları saatler önceden hazırlanabilir, ancak kullanımdan önce oda sıcaklığında sulu olarak saklanmalıdır.
    2. N-glikan örneklerini 40 μL'ye kadar bir yükleme hacminde PGC-C18-SPE mikro kolonlarına uygulayın ve her eklemeden sonra 60 saniye boyunca 6.000 rpm'de (~2.000 x g) döndürün. N-glikan numunesinin tamamı mikro kolona uygulanana kadar yükleme adımını tekrarlayın.
      NOT: Akış fraksiyonlarının glikan içermemesi gerekirken, PGC-C18-SPE mikro kolonlarında eksik tutma durumunda glikomik veriler başarıyla elde edilene kadar bu fraksiyonların saklanmasını öneririz.
    3. PGC-C18-SPE mikro kolonları 20 μL ultra saf suyla yıkayın. N-glikan elüsyonuna hazırlık olarak PGC-C18-SPE mikro kolonlarını yeni 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
    4. Her bir PGC-C18-SPE mikro kolonuna %50 (her ikisi de v/h) ACN'de 40 μL %0.1 TFA ekleyerek N-glikanları elute edin, ardından döndürün. Bu prosedürü tekrarlayın ve elüatı birleştirin.
      NOT: Çözeltinin tamamen döndürüldüğünden emin olmak için her dönüşten sonra mikro sütunları izlemek önemlidir, çünkü bu verimli elüsyonu kolaylaştıracaktır.
    5. Tuzdan arındırılmış N-glikanları bir vakum yoğunlaştırıcı sisteminde kurutun.
  5. PGC-LC-MS/MS alımı
    1. LC çözücülerini aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.
      1. Çözücü A: Ultra saf suda 100 mL 100 mM amonyum bikarbonat (NH4HCO3) stokçözeltisi hazırlayın. Partikülleri gidermek için bir vakum filtreleme ünitesi kullanarak stok çözeltisini 0,2 μm'lik bir naylon filtre diskinden süzün. Daha sonra, 100 mL 100 mMNH4HCO3 stok çözeltisini 900 mL ultra saf suda seyrelterek 1 L 10 mM NH4HCO3 çözeltisi (çözücü A) hazırlayın. Çözeltinin gazını gidermek için çözücü A'yı 15 dakika boyunca sonikleştirin. Solvent A, 20-25 °C'de 1 hafta süreyle saklanabilirken, 100 mM NH4HCO3 stok çözeltisi 4 °C'de 1 ay boyunca saklanabilir.
      2. Çözücü B: 100 mL 100 mM NH4HCO3 stok çözeltisi (bkz. önceki adım 2.5.1.2) ekleyerek ultra saf suda (çözücü B) 1 L 10 mM NH4HCO3'ü hazırlayın (önceki adım 2.5.1.2'ye bakın) 700 mL ACN'ye ve ultra saf su ile toplam 1 L hacme seyreltin. Gazı gidermek için çözücü B'yi 15 dakika boyunca sonikleştirin. Solvent B, 20-25 °C'de 2 hafta saklanabilir.
    2. Tuzdan arındırılmış N-glikanları 10 μL ultra saf suda tekrar süspanse edin ve iyice karıştırın. Numuneleri 5 dakika boyunca 14.000 x g'da döndürün, ardından LC-MS/MS sistemine zarar verebilecek görünür veya görünmez partiküllerin ve kalıntıların aktarılmasını önlemek için yaklaşık 0,5 μL geride bırakarak süpernatanı dikkatlice MS numune şişelerine aktarın.
    3. N-glikanları, bir HPLC sisteminde çözücü A'da %0-70 (h/v) çözücü B'nin 60 dakikalık doğrusal (veya başka bir şekilde uygun) gradyanı kullanarak 50 ° C'ye ısıtılmış bir PGC-LC kılcal kolonuna enjekte edin ve ayırın. HPLC sisteminin kütle spektrometresine bağlı olduğundan ve 20 μL/dk'lık sabit bir akış hızıyla çalıştığından emin olun (akış hızını PGC-LC kolonunun geometrisine uyacak şekilde ayarlayın).
    4. Bir elektrosprey iyon kaynağı ile kurulmuş ve negatif iyon polaritesi modunda çalışan doğrusal bir iyon tuzağı dört kutuplu kütle spektrometresi (veya başka bir uygun düşük veya yüksek çözünürlüklü MS sistemi) kullanarak ayrılmış N-glikanları tespit edin.
    5. MS1 alım tarama aralığını m/z 150-2.000 olarak ayarlayın ve m/z 0,25'de tam genişlikte yarım maksimum (FWHM) yakınlaştırma tarama tepe genişliği m /z 200'de ayarlayın. Kaynak voltajını 3,2 kV'a ayarlayın. MS1 taramaları için, otomatik kazanç kontrolünü (AGC) maksimum biriktirme süresi 50 ms (veya başka bir şekilde uygun ayarlar) ile 5 x 104 iyona ayarlayın.
      NOT: Düşük başlangıç m/z , genellikle N ve O-glicome'a katkıda bulunan mono- ve di-sakkaritlerin tespitini içerecektir.
    6. MS/MS için çözünürlüğü m/z 0.25'de m/z 200 FWHM, AGC'yi 2 x 104 iyon ve maksimum biriktirme süresini 300 ms olarak ayarlayın. Veriye bağlı edinimi (DDA) etkinleştirin ve %33'lük normalleştirilmiş çarpışma enerjisinde (NCE) rezonans aktivasyonu (iyon tuzağı) çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) kullanarak parçalanma için her MS1 tam taramasında en bol bulunan beş öncüyü seçin. Yakından ayrılan izobarik N-glikan izomerlerinin eksik olmasını önlemek için dinamik dışlamanın seçimini kaldırın.
  6. LC-MS/MS glikomik verilerinin veri analizi
    1. Dar LC tepe genişliğini, etkili N-glikan izomer ayrımını, yüksek MS doğruluğunu, çözünürlüğü ve sinyal-gürültüyü ve yüksek CID-MS/MS parçalanma verimliliğini onayladıktan sonra yüksek veri kalitesi sağlamak için uygun yazılımı kullanarak oluşturulan LC-MS/MS ham verilerine göz atın.
    2. Numunedeki N-glikanları monoizotopik öncü kütlelerine, CID-MS/MS parçalanma modellerine ve nispi ve mutlak PGC-LC tutma sürelerine göre manuel olarak tanımlayın.
      NOT: RawMeat v2.1, GlycoMod ve GlycoWorkBench v2.1, açıklandığı gibi tanımlama sürecine yardımcı olabilir26. Gözlemlenen analitler arasındaki bilinen biyosentetik kısıtlamalar ve yapısal ilişkililik de tanımlanan N-glikanlara26 daha fazla güven katabilir. Alternatif olarak, yarı otomatik glikan tanımlaması ve spektral açıklama, ticari yazılım kullanılarak yapılabilir.
    3. Bağıl N-glikan kantitasyonu için, tanımlanan tüm N-glikan izomerlerinin monoizotopik öncüsü m/z'yi içeren bir geçiş listesi oluşturun ve tüm N-glikan öncü iyonlarının ekstrakte edilmiş iyon kromatogramlarına (EIC'ler) dayalı olarak eğri altındaki alan (AUC) değerlerini belirlemek için ticari bir yazılım kullanın26.

3. N-glikoproteomik iş akışı

  1. Protein karışımının sindirimi
    1. Her numuneye tripsin (1:50 enzim: protein oranı, a/a) ve/veya tercih edilen diğer proteazları ekleyerek indirgenmiş ve alkillenmiş protein ekstraktının (1. bölümden) 100-200 μg'ını sindirin.
      NOT: Glikomik numune hazırlamanın aksine, maksimum peptit geri kazanımı için glikoproteomik numune hazırlama adımları için mümkünse düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri kullanın.
    2. Numuneleri 37 ° C'de 8-12 saat inkübe edin. PH'ın ~ 8.5 olduğundan emin olun, çünkü hafif alkali bir çözelti tripsin sindirim verimliliğini artırır.
      NOT: Tripsin ve Lys-C gibi öngörülebilir bölünme paternleri üreten ve çoğu N-glikopeptiti tek bir sekonla (glikozilasyon bölgesi) bırakan spesifik proteazlar tercih edilir. Tripsin veya diğer proteazlar tarafından proteinlerin spesifik olmayan bölünmelerini azaltmak için numuneleri aşırı inkübe etmekten kaçının.
    3. % 1 ( h / h) TFA ilavesiyle asitleştirme ile sindirimi durdurun (uzun süreli sindirimin neden olduğu spesifik olmayan bölünmeleri önlemek için).
  2. Oligo R3-C18-SPE kullanılarak peptit tuzdan arındırma
    1. Ev yapımı Oligo R3-C18-SPE mikro sütunlarını aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.
      1. Uygun bir şırınga kullanarak C18 diskleri takın ve 10 μL pipet uçlarına aktarın.
        NOT: Burada ticari C18-SPE mikro kolonlar da kullanılabilir.
      2. Düzgün ACN'de süspanse edilmiş bir Oligo R3 reçinesi bulamacını C18-SPE mikro sütunlarına boşaltın. Mikro kolonların tüpün ortasına asıldığından emin olmak için mikro kolonları mikrosantrifüj adaptörleri ile donatılmış 2 mL'lik tüplere yerleştirin ve ~1 cm kolon yüksekliğine sahip Oligo R3-C18-SPE mikro kolonları oluşturmak için döndürün (bkz. Şekil 1ii). Her numune için bir Oligo R3-C18-SPE mikro sütunu hazırlayın.
    2. Sonraki yıkama ve numune yükleme adımları için, bir tezgah üstü santrifüjü 6.000 rpm'ye (~2.000 x g) ayarlayın ve mobil fazların Oligo R3-C18-SPE mikro kolonlarından geçmesine izin vermek için 60 saniye döndürün. Her bir Oligo R3-C18-SPE mikro kolonunu sırayla 50 μL saf ACN, 3x ve ardından 50 μL %0.1 (h/h) TFA, 3x ile yıkayın ve şartlandırın.
      NOT: Oligo R3-C18-SPE mikro kolonları önceden hazırlanabilir ve kullanımdan önce oda sıcaklığında saatlerce sulu olarak saklanabilir.
    3. Şartlandırılmış Oligo R3-C18-SPE mikro kolonlarını mikrosantrifüj adaptörleri ile birlikte yeni 1.5 mL'lik tüplere yerleştirin. Triptik sindirilmiş peptit karışımlarını Oligo R3-C18-SPE mikro kolonlarına uygulayın ve 60 saniye boyunca 2.000 x g'da döndürün. 50 μL'den büyük numune hacimleri için birden fazla yükleme turu gerekebilir.
    4. Oligo R3-C18-SPE mikro kolonlarını 50 μL% 0.1 (h / v) TFA, 3x ile yıkayın. Tuzdan arındırılmış peptitlerin elüsyonuna hazırlık olarak Oligo R3-C18-SPE mikro kolonlarını yeni 1.5 mL'lik tüplere aktarın.
    5. % 50 (her ikisi de v / v) ACN'de 50 μL% 0.1 TFA uygulayarak tuzdan arındırılmış peptitleri elute edin, ardından her bir Oligo R3-C18-SPE mikro kolonuna% 70 (her iki v / v) ACN'de 50 μL% 0.1 TFA uygulayın. Her adımdan sonra döndürün.
      NOT: Çözeltinin tamamen döndürüldüğünden emin olmak için her dönüşten sonra mikro sütunları izlemek önemlidir, çünkü bu verimli elüsyonu kolaylaştıracaktır.
    6. Tuzdan arındırılmış peptitleri bir vakum yoğunlaştırıcı sisteminde toplayın, birleştirin ve kurutun.
      NOT: Paralel proteomik ve de-N-glikoproteomik yapılıyorsa (Tartışmaya bakınız), tuzdan arındırılmış peptit örneklerini ayırın ve kurutmadan önce ayrı fraksiyonları bir kenara koyun.
  3. Zic-HILIC-C8-SPE kullanılarak N-glikopeptidin zenginleştirilmesi
    1. Ev yapımı ZIC-HILIC-C8-SPE mikro sütunlarını aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.
      1. Uygun bir şırınga kullanarak C8 disklerini 10 μL'lik pipet uçlarına takın ve aktarın.
      2. Metanol içinde süspanse edilmiş bir ZIC-HILIC reçine bulamacını C8-SPE mikro kolonlarına boşaltın. Mikro kolonların tüpün merkezinde asılı kalmasını sağlamak için mikro kolonları mikrosantrifüj adaptörleri ile donatılmış 2 mL'lik tüplere yerleştirin ve ~1 cm kolon yüksekliğine sahip ZIC-HILIC-C8-SPE mikro kolonları oluşturmak için döndürün (bkz. Şekil 1iii). Her numune için bir ZIC-HILIC-C8-SPE mikro sütunu hazırlayın.
    2. Sonraki yıkama ve numune yükleme adımları için, bir tezgah üstü santrifüjü 6.000 rpm'ye (~2.000 x g) ayarlayın ve mobil fazların ZIC-HILIC-C8-SPE mikro kolonlarından geçmesine izin vermek için 60 saniye döndürün. Her bir ZIC-HILIC-C8-SPE mikro kolonunu sırayla 50 μL metanol, 3x ve ardından 50 μL ultra saf su, 3x ve son olarak 50 μL %1 TFA ile %80 (her ikisi de v/h) ACN, 3x'te yıkayın ve şartlandırın.
      NOT: ZIC-HILIC-C8-SPE mikro kolonları saatler önceden hazırlanabilir ancak kullanımdan önce oda sıcaklığında sulu olarak saklanmalıdır.
    3. N-glikopeptid zenginleştirmesi için belirlenmiş kurutulmuş peptit karışımlarını %80 (hem v / h) ACN'de 50 μL% 1 TFA'da yeniden süspanse edin ve iyice karıştırın.
      NOT: Peptitlerin HILIC yükleme çözücüsü içinde yeniden çözülmesi zorsa, peptitler önce %10 (h/h) TFA'da yeniden çözülebilir ve daha sonra HILIC yükleme çözücüsünün konsantrasyonlarına ulaşmak için ACN'de hızlı bir şekilde seyreltilebilir. Hidrolize neden olmamak için numuneyi yüksek TFA konsantrasyonundayken ısıtmaktan kaçının.
    4. Şartlandırılmış ZIC-HILIC-C8-SPE mikro kolonlarını mikrosantrifüj adaptörleriyle birlikte yeni 1,5 mL'lik tüplere yerleştirin. Yeniden süspanse edilmiş peptit karışımlarını ZIC-HILIC-C8-SPE mikro kolonlarına uygulayın ve 60 saniye boyunca 2.000 x g'da döndürün. 50 μL'den büyük numune hacimleri için birden fazla yükleme turu gerekebilir.
    5. Akış fraksiyonlarını toplayın ve fraksiyonları aynı ZIC-HILIC-C8-SPE mikro sütununa yeniden uygulayın. Yeniden uygulamayı 2 kez tekrarlayın ve akış tüplerini koruyun.
    6. ZIC-HILIC-C8-SPE mikro kolonlarını 2x'i %80 (her ikisi de v/h) ACN'de 50 μL %1 TFA ile yıkayın, sıkın ve bu akışı adım 3.3.4'teki akışla birleştirin.
      NOT: Kombine akış fraksiyonu tipik olarak toplam peptit materyalinin ~% 90'ını içerir ve bu nedenle ayrı bir aşağı akış analizi için kullanılabilen (ayrı bir proteomik tip deney yapmak yerine) modifiye edilmemiş peptit fraksiyonunu etkili bir şekilde oluşturur.
    7. ZIC-HILIC-C8-SPE mikro kolonlarını yeni 1,5 mL düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Tutulan N-glikopeptidleri 50 μL %0.1 (h/h) TFA, ardından 50 μL 25 mM amonyum bikarbonat ve ardından 50 μL %50 (h/h) ACN ile sırayla elute edin. Her adımdan sonra 60 saniye boyunca 2.000 x g'da döndürün.
      NOT: Elüat tipik olarak toplam peptit malzemesinin ~% 10'unu içerir ve yüksek zenginleştirme verimliliği elde edilirse bunların çoğu N-glikopeptid olmalıdır. Çözeltinin tamamen döndürüldüğünden emin olmak için her dönüşten sonra mikro sütunları izlemek önemlidir, çünkü bu verimli elüsyonu kolaylaştıracaktır.
    8. Zenginleştirilmiş N-glikopeptidleri toplayın, birleştirin ve kurutun ve (gerekirse) modifiye edilmemiş peptit bir vakum yoğunlaştırıcı sistemdeki fraksiyonlardan akar.
  4. Bozulmamış N-glikopeptidlerin ters fazlı LC-MS/MS
    1. LC çözücülerini aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.
      1. Çözücü A: Ultra saf suda 1 L %0,1 (h/h) formik asit hazırlayın. Çözücünün gazını almak için 15 dakika boyunca sonikat. Solvent A, 20-25 °C'de bir ay süreyle saklanabilir.
      2. Çözücü B: %99,9 (her ikisi de h/h) ACN'de 1 L %0,1 formik asit hazırlayın. Gazdan arındırmak için 15 dakika sonikate. Solvent B, 20-25 ° C'de bir ay boyunca saklanabilir.
    2. Kurutulmuş peptit fraksiyonlarını %0.1 (h/h) formik asit içinde yaklaşık 0.2-0.5 μg peptit / μL'lik bir konsantrasyona yeniden süspanse edin ve iyice karıştırın. Numuneleri 5 dakika boyunca 14.000 x g'da döndürün, ardından süpernatanı dikkatlice MS numune şişelerine aktarın ve istenmeyen partiküllerin ve kalıntıların aktarılmasını önlemek için yaklaşık 0,5 μL geride bırakın.
    3. Her numune için, bir C18-LC tuzak kolonuna ~ 0.5-1 μg toplam peptit enjekte edin ve peptitleri, 100 dakika boyunca% 2 -% 30 çözücü B, 18 dakika boyunca% 30 -% 50 B gradyanı ile kütle spektrometresine bağlı bir UPHLC Sistemi kullanarak 250 nL / dk'lık sabit bir akış hızında bir C18-LC analitik kolonunda ayırın, 1 dakika boyunca% 50 -% 95 B ve% 95'te 9 dakika (tüm v / v) B çözücü A'da (veya başka bir şekilde uygun bir kurulum).
    4. Peptitleri, bir nano-elektrosprey iyon kaynağı ile donatılmış ve pozitif iyon polaritesi modunda çalışan nanoLC sistemine bağlı yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresi ile tespit edin.
    5. MS1 için, m/z 350-1.800 alım tarama aralığı, m/z 200'de 60.000-120.000 FWHM'de yüksek çözünürlük ve ~2,5 kV'luk bir kaynak voltajı kullanın. AGC'yi maksimum 3 ms biriktirme süresiyle (veya başka bir şekilde uygun ayarlarla) 10x 6 50 iyona ayarlayın.
    6. MS/MS için, %35'lik sabit NCE ile HCD-MS/MS veya %25, %35 ve %45'lik NCE ile sceHCD kullanan DDA modunu kullanarak parçalanma için her MS1 tam taramasından en bol bulunan 20 öncü iyonu seçin. Daha da önemlisi, her parça spektrumundaki tüm düşük kütleli oksonyum iyonlarını gözlemlemek için düşük m/z değerini 110'a sabitleyin (örneğin, tarama aralığı m/z 110 - 1,800).
    7. Parçalanma için 2'den fazla yük (Z ≥ 2) taşıyan öncüleri seçin. 30,000-45,000 FWHM çözünürlükte, 1 x 105 iyonluk bir AGC ve 1 ms biriktirme süresi ile 5 ms biriktirme süresi ile 90 x 1.0 Th'±lik bir öncü izolasyon penceresi kullanarak (sce)HCD-MS/MS spektrumları elde edin. Belirli bir öncü iyonun tek izolasyonu ve parçalanmasından sonra 30 s'lik dinamik dışlamayı etkinleştirin.
      NOT: ETD mevcutsa, ürüne bağlı iyon tetikleme kullanarak EThcD-MS/MS bozulmamış N-glikopeptid örneklerini de almayı düşünün. Tanısal glikan oksonyum iyonları (örneğin, m/z 138.0545, 204.0867 ve 366.1396) her HCD-MS/MS spektrumu39 içindeki ilk 20 fragman iyonu arasında olduğunda bu adımı gerçekleştirin. 30,000-45,000 FWHM çözünürlükte, 4 x 105 iyonluk bir AGC, 250 ms'lik enjeksiyon süresi, %15'lik HCD NCE ve 1.6 Th'lik bir öncü izolasyon genişliği ile m/z 200'de EThcD-MS/MS parçalarını tespit edin.
  5. LC-MS/MS glikoproteomik verilerinin veri analizi
    1. Çoğu HCD-MS/MS spektrumunun glikan oksonyum iyonları içerdiğini kontrol ederek LC-MS/MS ham verilerinin N-glikopeptidlerle zenginleştirildiğini onaylayın (örneğin, m/z 138.0545, 204.0867 ve 366.1396) ve (etiketleme stratejileri için) düşük kütleli TMT raportör iyonlarının temel ayrımı, MS/MS spektrumlarında yüksek parçalanma verimliliği ve dar LC tepe genişliği ve yüksek MS doğruluğu, çözünürlük ve sinyal-gürültü.
    2. Bir arama motoru kullanarak (birden fazla mevcuttur; aşağıya bakınız), araştırılan numuneyi hedefleyen uygun bir protein / peptit veritabanına (örneğin, bir de-N-glikoproteomik deneyinden elde edilen) veya incelenen tüm UniProtKB insan proteinlerine karşı bozulmamış N-glikopeptidler için MS / MS verilerini arayın. Sekon lokalize Asn ile peptitleri arayarak peptit N-glikosilasyonuna karşı aramayı uyarlayın. Daha da önemlisi, arama alanını numune(ler)de var olduğu bilinen glikanlarla sınırlamak için glikomik bilgili bir N-glikan veritabanı, yani 2. adımda glikomik verilerden tanımlanan glikanları seçin.
      NOT: Önceden tanımlanmış geniş bir N-glikan veri tabanı kullanan paralel aramaların, verilerde ek N-glikan bileşimlerinin varlığını dışladığı düşünülebilir.
    3. Kalan arama değişkenlerini incelenen örneğe, gerçekleştirilen spesifik numune işleme prosedürlerine ve kullanılan MS ayarlarına ve kullanılan enstrümantasyona göre uyarlayın. N-glikoproteomik veri araması için yaygın arama ayarları şunları içerir:
      Öncü ve ürün kütle toleransı: 10 ppm ve 20 ppm
      Proteaz özgüllüğü: Tamamen spesifik ve/veya yarı spesifik (N-düzensiz)
      İzin verilen kaçırılan dekolteler: 2
      Sabit modifikasyonlar: Cys karbamidometilasyon (+57.021 Da)
      Değişken modifikasyonlar: Met oksidasyon (+15.994 Da) (ortak 1)
      Peptit başına izin verilen değişken modifikasyonlar: 1 veya 2
      Glikan modifikasyonları: Glikomik bilgili glikan veritabanı (nadir 1)
      Protein tuzağı ve kirletici veritabanı: Etkin
    4. Tüm aramaları, protein düzeyinde ve peptit düzeyinde %<1 yanlış keşif oranına (FDR) göre filtreleyin. Yalnızca yüksek güvenle tanımlanan N-glikopeptitleri göz önünde bulundurun (ör., 0.001'< PEP 2D skorları) ve tartışıldığı gibi yanlış N-glikopeptid tanımlama oranını daha da azaltmak için filtrelenmiş çıktının manuel açıklama/küratörlüğünü gerçekleştirin 36,40,41.
      NOT: Sialillenmiş ve çoklu fukosile N-glikanlara sahip glikopeptitler ve glikanlara ek olarak diğer değişken modifikasyonları taşıyan glikopeptidler (yani, Met oksidasyonu ve Asn/Gln deamidasyonu) özellikle arama motorları tarafından yanlış yorumlanmaya eğilimlidir41. Raporlamadan önce bu tür adayların doğrulanmasına özellikle dikkat edilmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Evre II'de KRK'den muzdarip bir hastadan alınan bir FFPE doku slaytına uygulanan glikomik kılavuzluğunda glikoproteomik yöntemin temsili sonuçları bu bölümde verilmektedir.

Protokol için yeterli protein başlangıç materyali elde etmek için, yayınlanmış bir protokolü takiben aynı FFPE doku bloğundan iki slayttan (z yığınları) protein ekstraktları birleştirildi ve glikoproteomik deneyin duyarlılığını artırmak için bir TMT etiketleme yaklaşımı uygulandı (aşağıdaki isteğe bağlı adımlara bakın)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoldeki kritik adımlar
Bu protokol belgesinde, kompleks TME'deki glikoproteomun heterojenliği ve dinamiklerinin kapsamlı bir görünümünü sağlayan glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntemini adım adım özetledik.

Protokoldeki kritik bir adım, protein karışımını aşırı sindirmeden tam proteolizi sağlamaktır. Proteinlerin spesifik olmayan bölünmeleri, doğal olarak peptit arama alanını arttırır, bu da daha uzun arama sürelerine ve daha yüksek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

THC, Avustralya Hükümeti tarafından finanse edilen bir Uluslararası Araştırma Eğitim Programı Bursu tarafından desteklenmektedir. NB, Macquarie Üniversitesi tarafından finanse edilen Uluslararası Macquarie Üniversitesi Araştırma Mükemmeliyet Bursları tarafından desteklenmektedir. AC, Avustralya Hükümeti tarafından finanse edilen bir Araştırma Eğitim Programı bursu ile desteklenmektedir. RK, Yeni Güney Galler Kanser Enstitüsü (ECF181259) tarafından desteklenmiştir. MTA, Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Bursu'nun (FT210100455) sahibidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kimyasallar< / güçlü >
Amonyum asetat & nbsp;Sigma AldrichA1542Mevcut alternatifler
Amonyum bikarbonat, saflık ve ge; %99.0Sigma AldrichA6141Alternatifler mevcut
Susuz asetonitril (ACN), LC-MS sınıfıSigma Aldrich34851Mevcut alternatifler
Sığır fetuinSigma AldrichF3004Alternatifler mevcut
Dithiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632Mevcut alternatifler
EthanolSigma AldrichE7023Mevcut alternatifler
Formik asit, LC-MS sınıfıSigma Aldrich00940Mevcut alternatifler
Buzlu asetik asitSigma AldrichA6283Mevcut alternatifler
İyodoasetamid (IAA)Sigma AldrichI1149Alternatifler mevcut
MetanolSigma AldrichM1775Alternatifler mevcut
Peptit-N-glikosidaz F (PNGase F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μ L) Escherichia coli'de rekombinant olarak eksprese edilir 
Polivinilpirolidon 40 (PVP)Sigma AldrichPVP40Alternatifler mevcut
Potasyum hidroksit (KOH)Sigma Aldrich484016Mevcut alternatifler
Sıralama dereceli domuz tripsin ve nbsp;PromegaV5113Alternatifler mevcut
Sodyum borhidrür (NaBH4< / sub>)Sigma Aldrich213462Mevcut alternatifler
Trietilamonyum bikarbonat (TEAB), LC-MS sınıfıSigma AldrichT7408Mevcut alternatifler
Trifloroasetik asit (TFA), LC-MS sınıfıSigma AldrichT6508Mevcut alternatifler
Araçlar/Malzemeler
C18 disklerEmpore66883-U
C8 disklerEmpore66882-U
Düz tabanlı polipropilen 96 oyuklu plaka Corning3364
Immobilon-PSQ poliviniliden diflorür (PVDF) membranMillipore IPVH20200Gözenek boyutu: 0.45 μ m 
MikrosantrifüjEppendorf5452000069Mevcut alternatifler
Mikrosantrifüj adaptörleri Nest Group, Inc., MASS18VMiniSpin Sütun Bileziği, Microspin Sütunları
Oligo R3 reçineThermo1133903ile birlikte gelir Parçacık boyutu 30 & mu; m
ParafilmParafilm MPM996
Protein LoBind tüpleri 1.5 mLEppendorf0030108450
Protein LoBind tüpleri 2.0 mLEppendorf0030108442
Güvenli kilitli tüpler 1.5 mLEppendorf0030120086
Güvenli kilitli tüpler 2.0 mLEppendorf0030120094
ÇalkalayıcıEppendorf5382000066Mevcut alternatifler
Tek delikli zımbaSwingline74005
SpeedVac yoğunlaştırıcıMartin ChristRVC 2-25 CDplusAlternatifler mevcuttur
Supelclean ENVI-Carb SPE reçineSupelco57088Parçacık boyutu 120-400 ağ. Reçine kartuşlardan manuel olarak çıkarılabilir ve MilliQ su Şırıngasında %50 (h/h) metanol içinde uzun süreli saklanabilir
Şırınga 5 mLSigma AldrichZ116866Mevcut alternatifler
Sıcaklık kontrollü inkübatörThermolineE7.30Alternatifler mevcut
Ultrasonik banyoUnisonicsFXPAlternatifler mevcut
ZIC-HILIC reçineMerck150455Parçacık/gözenek boyutu, 5 μ m/200 å. Reçine, LC kolonundan manuel olarak ekstrakte edilebilir ve MilliQ suyunda %50 (h/h) metanol içinde uzun süreli olarak saklanabilir
ZipTip C18 katı faz ekstraksiyonu (SPE) mikro kolonları MilliporeZTC18S096Alternatif olarak, ev yapımı C18-SPE mikro kolonları ticari ürünün yerini alabilir
LC-MS/MS Analizi< / güçlü>
1260 Infinity Kılcal HPLC sistemi AgilentAlternatifleri mevcuttur
ReproSil-Pur C18 AQ reçinesi ile önceden paketlenmiş Analitik LC kolonuDr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Almanyar13.aq.s2570Parçacık/gözenek boyutu: 3 μ m/120 Å, uzunluk/iç çap: 25 cm/75 μm. Ticari C18 nano-LC kolonlar da mevcuttur/ 
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC Sistemi TermoAlternatifler mevcuttur
HyperCarb, KAPPA, PGC, kılcal LC kolonu Termo Üretimi DurdurulanParçacık/gözenek boyutu, 3 μ m/250 å; sütun uzunluğu, 30 mm; iç çap, 0.180 mm. Benzer kalitede veriler üreten HyperCarb PGC-LC kolonlarının daha büyük geometrileri ticari olarak temin edilebilir (örneğin, Thermo # 35003-031030). Merck'ten parçacık/gözenek boyutuna sahip SupelTMCarb LC kolonu, 2,7 & m/200 ve farklı kolon uzunlukları ve iç çapları da mevcuttur (örneğin, Merck #59994-U). 
LCMS dereceli asetonitrilLiChrosolv100029Mevcut alternatifler
Doğrusal tuzak dört kutuplu (LTQ) Velos Pro iyon tuzağı kütle spektrometresi (glikomik) TermoAlternatifler mevcuttur
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Kütle Spektrometresi (glikoproteomik)ThermoETD'li veya ETD'siz diğer yüksek çözünürlüklü MS sistemleri (yalnızca O-glikoproteomik için gereklidir) de mevcuttur (örneğin, Q-Exactive HF-X Hibrit Dört Kutuplu-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker veya diğer satıcılardan benzer yüksek performanslı kütle spektrometreleri)
Total Recovery Clear Glass vidalı şişeler 0,9 mLTermoTHC11093563Alternatifler mevcuttur
Toplam Geri Kazanım Şeffaf Cam vidalı şişeler eşleşen kapaklarTermoTHC09150869Alternatifler mevcuttur
ReproSil-Pur C18 AQ reçinesi ile şirket içinde paketlenmiş tuzak LC kolu Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Almanyar15.aq.s0202Parçacık/gözenek boyutu: 5 μ m/120 Å, uzunluk/iç çap: 2 cm/100 μm. Ticari C18 tuzak LC sütunları da mevcuttur. 
Software
ByonicProtein Metrics Incv2.6.46 veya üstüÇoğu MS satıcısından LC-MS/MS ham verilerini kabul eden ticari glikopeptid ve PTM arama motoru
ByosProtein Metrics Incv3.9-7 veya üstüGlikopeptid adaylarının manuel olarak incelenmesi ve glikan MS/MS spektrumlarının otomatik açıklaması için ticari yazılım
GlycoModExpasyAçık erişim yazılımı, glisikik verilerin açıklanmasına yardımcı olur (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1Açık erişim yazılımı, glisikik verilerin açıklanmasına ve glikan karikatürlerinin çizilmesine yardımcı olur
RawMeatVAST Scientificv2.1Açık erişimli yazılım, ham spektral verilerden glikan öncü iyonlarının m/z değerini çıkarır
Ufuk ÇizgisiBrendan X. MacLeanv21.2 veya üstüGlikanların nispi kantitasyonu için açık erişimli yazılım
XcaliburThermov2.2 veya üstüHam LC-MS/MS verilerine göz atmak için
:

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 265-278 (2022).
  2. Tjondro, H. C., Loke, I., Chatterjee, S., Thaysen-Andersen, M. Human protein paucimannosylation: Cues from the eukaryotic kingdoms. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (6), 2068-2100 (2019).
  3. West, C. M., Malzl, D., Hykollari, A., Wilson, I. B. H. Glycomics, glycoproteomics, and glycogenomics: An inter-taxa evolutionary perspective. Mol Cell Proteomics. 20, 100024(2021).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2016).
  5. Reily, C., Stewart, T. J., Renfrow, M. B., Novak, J. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (6), 346-366 (2019).
  6. Leite-Gomes, E., et al. Bringing to light the risk of colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mucosal glycosylation as a key player. Inflamm Bowel Dis. 28 (6), 947-962 (2022).
  7. He, K., et al. Decoding the glycoproteome: A new frontier for biomarker discovery in cancer. J Hematol Oncol. 17 (1), 12(2024).
  8. Mereiter, S., Balmana, M., Campos, D., Gomes, J., Reis, C. A. Glycosylation in the era of cancer-targeted therapy: Where are we heading. Cancer Cell. 36 (1), 6-16 (2019).
  9. Seeberger, P. H., et al. What comes next in glycobiology. Cell. 187 (11), 2628-2632 (2024).
  10. Abrahams, J. L., et al. Recent advances in glycoinformatic platforms for glycomics and glycoproteomics. Curr Opin Struct Biol. 62, 56-69 (2020).
  11. Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Schulz, B. L. Maturing glycoproteomics technologies provide unique structural insights into the N-glycoproteome and its regulation in health and disease. Mol Cell Prot. 15 (6), 1773-1790 (2016).
  12. Gaunitz, S., Nagy, G., Pohl, N. L., Novotny, M. V. Recent advances in the analysis of complex glycoproteins. Anal Chem. 89 (1), 389-413 (2017).
  13. Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Towards structure-focused glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (1), 161-186 (2021).
  14. Hu, H., Khatri, K., Zaia, J. Algorithms and design strategies towards automated glycoproteomics analysis. Mass Spectrom Rev. 36 (4), 475-498 (2017).
  15. Bagdonaite, I., et al. Glycoproteomics. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 48(2022).
  16. Peng, W., et al. MS-based glycomics and glycoproteomics methods enabling isomeric characterization. Mass Spectrom Rev. 42 (2), 577-616 (2023).
  17. Aoki-Kinoshita, K. F., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 705-718 (2022).
  18. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: Growing up fast. Curr Opin Struct Biol. 68, 18-25 (2021).
  19. Thaysen-Andersen, M., Kolarich, D., Packer, N. H. Glycomics & glycoproteomics: From analytics to function. Mol Omics. 17 (1), 8-10 (2021).
  20. Trbojevic-Akmacic, I., et al. High-throughput glycomic methods. Chem Rev. 122 (20), 15865-15913 (2022).
  21. Oliveira, T., Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Kolarich, D. The hitchhiker's guide to glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (4), 1643-1662 (2021).
  22. Rudd, P. M., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 689-704 (2022).
  23. Madunić, K., et al. Colorectal cancer cell lines show striking diversity of their O-glycome reflecting the cellular differentiation phenotype. Cell Mol Life Sci. 78 (1), 337-350 (2021).
  24. Parker, R., et al. Mapping the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-derived peptidome presented by HLA class II on dendritic cells. Cell Rep. 35 (8), 109179(2021).
  25. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  26. Chatterjee, S., et al. Serum N-glycomics stratifies bacteremic patients infected with different pathogens. J Clin Med. 10 (3), 516(2021).
  27. Osimanjiang, W., et al. Analysis of N- and O-linked glycosylation: Differential glycosylation after rat spinal cord injury. J Neurotrauma. 37 (18), 1954-1962 (2020).
  28. Chatterjee, S., et al. Trends in oligomannosylation and α1,2-mannosidase expression in human cancers. Oncotarget. 12 (21), 2188-2205 (2021).
  29. Chang, D., Klein, J. A., Nalehua, M. R., Hackett, W. E., Zaia, J. Data-independent acquisition mass spectrometry for site-specific glycoproteomics characterization of SARS-CoV-2 spike protein. Anal Bioanal Chem. 413 (29), 7305-7318 (2021).
  30. Pan, J., et al. Glycoproteomics-based signatures for tumor subtyping and clinical outcome prediction of high-grade serous ovarian cancer. Nat Commun. 11 (1), 6139(2020).
  31. Venkatakrishnan, V., et al. Glycan analysis of human neutrophil granules implicates a maturation-dependent glycosylation machinery. J Biol Chem. 295 (36), 12648-12660 (2020).
  32. Sethi, M. K., et al. In-depth matrisome and glycoproteomic analysis of human brain glioblastoma versus control tissue. Mol Cell Proteom. 21 (4), 100216(2022).
  33. Parker, B. L., et al. Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity. J Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).
  34. Jensen, P. H., Karlsson, N. G., Kolarich, D., Packer, N. H. Structural analysis of N- and O-glycans released from glycoproteins. Nat Protoc. 7 (7), 1299-1310 (2012).
  35. Hinneburg, H., et al. Post-column make-up flow (pcmf) enhances the performance of capillary-flow PGC-LC-MS/MS-based glycomics. Anal Chem. 91 (7), 4559-4567 (2019).
  36. Chau, T. H., et al. Glycomics-assisted glycoproteomics enables deep and unbiased N-glycoproteome profiling of complex biological specimens. Meth Mol Biol. 2628, 235-263 (2023).
  37. Madunic, K., Wagt, S., Zhang, T., Wuhrer, M., Lageveen-Kammeijer, G. S. M. Dopant-enriched nitrogen gas for enhanced electrospray ionization of released glycans in negative ion mode. Anal Chem. 93 (18), 6919-6923 (2021).
  38. Zhang, T., Wang, W., Wuhrer, M., De Haan, N. Comprehensive O-glycan analysis by porous graphitized carbon nanoliquid chromatography-mass spectrometry. Anal Chem. 96 (22), 8942-8948 (2024).
  39. Wu, S. W., Pu, T. H., Viner, R., Khoo, K. H. Novel LC-MS2 product dependent parallel data acquisition function and data analysis workflow for sequencing and identification of intact glycopeptides. Anal Chem. 86 (2), 5478-5486 (2014).
  40. Kawahara, R., et al. The complexity and dynamics of the tissue glycoproteome associated with prostate cancer progression. Mol Cell Proteom. 20, 100026(2021).
  41. Chau, T. H., Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Critical considerations in N-glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 73, 102272(2023).
  42. Carnielli, C. M., et al. Comprehensive glycoprofiling of oral tumors associates N-glycosylation with lymph node metastasis and patient survival. Mol Cell Proteom. 22 (7), 100586(2023).
  43. Sethi, M. K., et al. In-depth N-glycome profiling of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals cancer-, stage- and EGFR-specific protein N-glycosylation. Glycobiology. 25 (10), 1064-1078 (2015).
  44. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  45. Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wiśniewski, J. R. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).
  46. Tian, Y., Gurley, K., Meany, D. L., Kemp, C. J., Zhang, H. N-linked glycoproteomic analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. J Proteome Res. 8 (4), 1657-1662 (2009).
  47. Cozzolino, F., et al. New label-free methods for protein relative quantification applied to the investigation of an animal model of huntington disease. PLoS One. 15 (9), e0238037(2020).
  48. Sethi, M. K., et al. Quantitative proteomic analysis of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals signature proteins and perturbed pathways involved in CRC progression and metastasis. J Proteomics. 126, 54-67 (2015).
  49. Rosati, D., et al. Differential gene expression analysis pipelines and bioinformatic tools for the identification of specific biomarkers: A review. Comput Struct Biotechnol J. 23, 1154-1168 (2024).
  50. Niu, B., et al. Nonspecific cleavages arising from reconstitution of trypsin under mildly acidic conditions. PLoS One. 15 (7), e0236740(2020).
  51. Delafield, D. G., Li, L. Recent advances in analytical approaches for glycan and glycopeptide quantitation. Mol Cell Proteom. 20, 100054(2021).
  52. Viner, R. I., Snovida, S., Bodnar, E., Perreault, H., Saba, J. A novel workflow for glycopeptide analysis using cellulose-based separation cartridges, TMT-labeling and LTQ Orbitrap ETD. J Biomol Tech. 21 (3 Suppl), S25(2010).
  53. Kawahara, R., et al. Community evaluation of glycoproteomics informatics solutions reveals high-performance search strategies for serum glycopeptide analysis. Nat Meth. 18 (11), 1304-1316 (2021).
  54. Polasky, D. A., Nesvizhskii, A. I. Recent advances in computational algorithms and software for large-scale glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 72, 102238(2023).
  55. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nat Meth. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  56. Goodson, H., et al. Α-mannosylated HLA-II glycopeptide antigens dominate the immunopeptidome of immortalised cells and tumour tissues. Glycobiology. 34 (11), cwae057(2024).
  57. Shajahan, A., Heiss, C., Ishihara, M., Azadi, P. Glycomic and glycoproteomic analysis of glycoproteins-a tutorial. Anal Bioanal Chem. 409 (19), 4483-4505 (2017).
  58. Rosenbalm, K. E., Tiemeyer, M., Wells, L., Aoki, K., Zhao, P. Glycomics-informed glycoproteomic analysis of site-specific glycosylation for SARS-CoV-2 spike protein. STAR Prot. 1 (3), 100214-100214 (2020).
  59. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  60. Chandler, K. B., et al. Multi-isotype glycoproteomic characterization of serum antibody heavy chains reveals isotype- and subclass-specific N-glycosylation profiles. Mol Cell Proteomics. 18 (4), 686-703 (2019).
  61. Haab, B. B., Klamer, Z. Advances in tools to determine the glycan-binding specificities of lectins and antibodies. Mol Cell Proteom. 19 (2), 224-232 (2020).
  62. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. The use of lectin microarray for assessing glycosylation of therapeutic proteins. MAbs. 8 (3), 524-535 (2016).
  63. Goumenou, A., Delaunay, N., Pichon, V. Recent advances in lectin-based affinity sorbents for protein glycosylation studies. Front Mol Biosci. 8, 746822(2021).
  64. Parker, B. L., et al. Terminal galactosylation and sialylation switching on membrane glycoproteins upon TNF-alpha-induced insulin resistance in adipocytes. Mol Cell Proteomics. 15 (1), 141-153 (2016).
  65. Blazev, R., et al. Integrated glycoproteomics identifies a role of N-glycosylation and galectin-1 on myogenesis and muscle development. Mol Cell Proteomics. 20, 100030(2021).
  66. Thaysen-Andersen, M., et al. Human neutrophils secrete bioactive paucimannosidic proteins from azurophilic granules into pathogen-infected sputum. J Biol Chem. 290 (14), 8789-8802 (2015).
  67. Loke, I., Ostergaard, O., Heegaard, N. H. H., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Paucimannose-rich N-glycosylation of spatiotemporally regulated human neutrophil elastase modulates its immune functions. Mol Cell Proteom. 16 (8), 1507-1527 (2017).
  68. Loke, I., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Complementary LC-MS/MS-based N-glycan, N-glycopeptide, and intact N-glycoprotein profiling reveals unconventional ASN71-glycosylation of human neutrophil cathepsin g. Biomolecules. 5 (3), 1832-1854 (2015).
  69. Tjondro, H. C., et al. Hyper-truncated Asn355- and Asn391-glycans modulate the activity of neutrophil granule myeloperoxidase. J Biol Chem. 296, 100144(2021).
  70. Kawahara, R., et al. Glycoproteome remodeling and organelle-specific N-glycosylation accompany neutrophil granulopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (36), e2303867120(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

T m r Mikro evresiK tle SpektrometrisiGlikan Yap larN Glikoproteom ProfillemesiG zenekli Grafitle tirilmi KarbonLC MS MSGlikopeptit Zenginle tirmeB lgeye zg GlikozilasyonKolorektal Kanser Dokusu

İlgili makaleler