Yöntem makalesi

Küçük hacimli bir odada yüksek çözünürlüklü respirometri

DOI:

10.3791/67442

⸱

25 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oroboros Instruments, 2Department of Pediatrics and Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University and General Hospital in Prague, 3Institute of Pathophysiology, Medical University of Innsbruck, 4Mitochondrial Medicine, Department of Clinical Sciences, Lund University, 5Abliva AB

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri için 0.5 mL odacığın, uygun enstrümantal O2 arka plan düzeltmesi uygulandığında 2.0 mL oda ile tutarlı sonuçlar gösterdiğini gösteriyoruz. Daha az numune gerektirir, bu da sınırlı kullanılabilirlik veya düşük solunum kapasitesi olan çalışmalar için avantajlıdır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Solunum akışlarını araştırmak, metabolik süreçler arasındaki karmaşık etkileşimi anlamak için belirleyicidir. Sınırlı örnek mevcudiyeti ve düşük solunum hızı olan hücre ve dokuların çalışmaları, küçük deney hacimlerinden yararlanabilir. 0.5 mL'lik odanın, Oroboros ile yüksek çözünürlüklü respirometride kullanılan aynı numune konsantrasyonlarında 2.0 mL'lik oda ile tutarlı sonuçlar verip vermediğini inceledik. Arka plan O2 akısı, hava doygunluğunda 0.5 mL'de 2.0 mL'lik odacıklardan 4 kat daha yüksekti, ancak tekrarlanabilirdi ve doğru arka plan düzeltmesine izin verdi. Optimum karıştırma hızı, 0,5 mL'lik haznede dakikada 550 devir (rpm) ile 750 rpm arasındaydı. Canlı hücrelerdeki, geçirgen hücrelerdeki ve izole edilmiş mitokondrilerdeki solunum akışları, 14 ila 20 titrasyonlu Substrat-Birleştirici-İnhibitör Titrasyon protokolleri kullanılarak 0.5 mL ve 2.0 mL odalarda paralel olarak ölçüldü. Farklı oda tiplerindekiO2 akıları, algılama sınırları dahilinde aynıydı. 2,0 mL'lik odadan dört kata yakın daha az numune gerektiren 0,5 mL'lik oda, sınırlı miktarda numune veya düşük solunum kapasiteleri olan çalışmalar için önemli bir avantaj sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal solunum yollarının araştırılması, çeşitli hastalıkların, yaşlanmanın veya strese verilen tepkilerin altında yatan metabolik mekanizmalara ışık tutmak, böylece terapötik müdahaleler için potansiyel hedefler sağlamak ve teşhis yeteneklerini geliştirmek için anahtardır 1,2,3. Yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR), çeşitli numune türleri ve preparatları arasında oksidatif fosforilasyonda (OXPHOS) mitokondriyal yol ve kuplaj kontrolünün ayrıntılı analizine olanak tanır4. Deney odasının hacmi, respirometrik aletlerin temel bir tasarım özelliğidir. Oroboros'ta daha önce kurulan oda hacmi 2.0 mL'dir. Bu hacim, düşük enstrümantal arka plan O2 akısı gerektirecek ve karıştırılan ortamın homojenliğini sağlayacak şekilde optimize edilmiştir. Bunlar, sırasıyla mitokondriyal oksijen kinetiği ve geçirgen kas lifleri için gerekli olan düşük oksijen ve hiperoksik koşullarda solunumun doğru ölçümü için anahtar kalite kriterleri arasındadır 5,6,7,8,9. Ayrıca, birkaç çoklu sensör yerleştirmesi10, 2.0 mL'lik odanın alanını gerektirir (Tablo 1).

Bu çalışmada, HRR için oda hacmini 2.0 mL'den 0.5 mL'ye düşürmenin fizibilitesini inceledik. Daha düşük hücre sayıları veya doku miktarları, doğruluktan ödün vermeden daha küçük bir odada respirometrik deneylerde uygulanabilir mi? Bu sorunun açıklığa kavuşturulması, insan dokusu ve sıvı biyopsilerinin, birincil hücrelerin ve yavaş büyüyen hücre kültürlerinin araştırılması için önemlidir1. Benzer şekilde, kusurlu mitokondri11'de düşük solunum aktivitesine sahip numuneler ve beyindeki yağ asidi oksidasyonu gibi doğal olarak düşük kapasitelere sahip mitokondriyal yollar12 üzerinde yapılan çalışmalarda oda hacminin azaltılması potansiyel olarak avantajlıdır. Bununla birlikte, orantısız olarak artan O2 geri difüzyon artefaktları ve yanlış hacim kalibrasyonu13,14 nedeniyle düşük oda boyutunda çözünürlük azalabilir. Bu nedenle, 2,0 mL'de kalibre edilmiş klasik hacimli hazneye (cV) kıyasla, 0,5 mL'lik minimum deneysel hacimde kalibre edilmiş küçük hacimli hazne (sV) ile Oroboros'un enstrümantal performansını analiz ettik. Özellikle, enstrümantal arka plan O2 akısını ve optimum karıştırma hızını analiz ettik.

OXPHOS analizinde solunum hızlarını ve durumlarını değerlendirmek için substrat birleştirici-inhibitör titrasyonu (SUIT) protokolleri kullanılır. SUIT protokolleri, respirometrik test başına 14 ila 20 titrasyon içeriyordu ve birkaç pmol∙s-1∙mL-1'den yüzlerce pmol∙s-1∙mL-1'e kadar değişensolunum O2 akıları gerektiriyordu. Kuplaj kontrol durumları, sızıntı oranı L'yi, yani adenozin-5'-difosfatı (ADP) adenosin-5'-trifosfata (ATP) fosforile etmek için mevcut olmayan ve proton sızıntısı, proton kayması, katyon döngüsü ve elektron sızıntısından kaynaklanan solunumun dağıtıcı bileşenini içerir. OXPHOS kapasitesi P, O2 tüketimi (oksidasyon) olarak ölçülen elektron transferi, ADP varlığında ATP sentezine (fosforilasyon) bağlandığında mitokondrinin solunumunu açıklar. Ayrılmış durumdaki elektron transfer kapasitesi E, mitokondriyal substratların15 varlığında bir protonoforun titrasyonları ile ölçülür. Rezidüel oksijen tüketimi rox, Kompleks I ve Kompleks III inhibitörleri rotenon ve antimisin A'nın eklenmesinden sonra belirlenir.

Hücrelerin solunumunu ve mitokondriyal preparatları sV ve cV odacıklarında ölçtük. Trombositler, megakaryositlerin anükleat sitoplazmik fragmanlarıdır ve kolayca elde edilebilen bir insan mitokondri kaynağını temsil eder. Bu nedenle, trombositler, sağlam plazma zarlarına sahip canlı hücreler (veya hücre parçacıkları) için bir model olarak uygulandı. Kan hücrelerinin solunumu, sistemik mitokondriyal hastalıkların bir biyobelirteç görevi görür ve metabolik olarak aktif organların 16,17,18,19 biyoenerjetik uygunluğu ile ilişkilidir, ancak bu bulgular genelleştirilemez 20,21,22. İnsan fibroblastları, mitokondriyal disfonksiyonun hücresel bir modeli olarak uygulamaları için seçildi 1,23,24,25. Plazma zarlarının sağlamlığı, hücre canlılığı için gereklidir, ancak seçici geçirgenliği, sitozol ile çevreleyen ortam arasında molekül alışverişine izin verir. Bu nedenle, kimyasal olarak geçirgen plazma zarlarına sahip fibroblastlar, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için kullanılan ve mitokondriyal alt popülasyonları ayırmak için gerekli olan izole mitokondri ile karşılaştırıldığında, geçirgen hücrelerin bir örneği olarak incelenmiştir26,27.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan trombositleri üzerine yapılan çalışma için, sekiz gönüllü, İsveç Etik İnceleme Kurumu (Nr. 2013/181) tarafından onaylanan çalışmaya katılmak için yazılı bilgilendirilmiş onam verdi. Erkek yenidoğanlardan alınan iki insan derisi fibroblast hücre hattı ATCC'den satın alındı ve Çek Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı'nın etik onayına göre kullanıldı (proje: AZV MZ CR NU22-07-00474). Fareleri içeren prosedürler, Avusturya Hayvan Deneyleri Yasası'na ve Deneysel ve Diğer Bilimsel Amaçlarla Kullanılan Omurgalı Hayvanların Korunmasına İlişkin Avrupa Sözleşmesi'ne uygun olarak yürütülmüştür (Tierversuchsgesetz 2012; 2010/63/EU sayılı Direktif; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). Deney hayvanlarının sayısını en aza indirmek için 3R prensibi uygulandı.

1. Hacim kalibrasyonu

  1. Küçük hacimli odaları (sV) veya klasik hacimli odaları (cV) Oroboros'a monte edin (Şekil 1A,B; Tablo 1).
  2. Oroboros'u açın ve DatLab'a bağlanın.
  3. Odaları kurutun.
  4. SV'ye(0.50 mL etkili deneysel hacim artı 0.04 mL kılcal ölü hacim) 0.54 mL H2O veyacV'ye (2.00 mL etkili hacim artı 0.07 mL kılcal ölü hacim) 2.07 mL H 2 O pipetleyin.
    NOT: Cam silindirin üst kısmı ile polioksimetilen (POM) hazne tutucusu arasında sıvı kaybını önlemek için, pipet ucunu cam haznenin duvarına değecek kadar derine sokun.
  5. Karıştırıcıları açın .
  6. Hazneyi kapatmadan önce, kılcal damarlarını kuru tutarken tıpaların O-ringlerini nemlendirin. Hacim kalibrasyon halkalarını gevşetin ve tıpa kılcal damarını sıvı doldurana ve kılcal damarın üst ucundaki yuvada küçük bir damla görünene kadar tıpaları aşağı doğru itin (Tablo 1).
  7. Hacim kalibrasyon halkalarını, kalibre edilen hacim, durdurucuların ardışık yerleştirilmelerinde elde edilecek şekilde konumlarını sabitlemek için sıkın.

2. Oroboros genel ayarı

  1. DatLab yazılımını başlatın.
  2. Deney sıcaklığını (37 °C) ve karıştırma dönüş hızını Hazne sV'de 550 rpm'ye (9.2 Hz veya sn başına devir) veya cV Haznesinde 750 rpm'ye (12.5 Hz) ayarlayın. EnstrümantalO 2 arka plan testlerinde 80 sn (40 veri noktası) veya respirometri için 40 sn (20 veri noktası) üzerinde yumuşatma ile veri örnekleme aralığını 2 sn olarak ayarlayın.
    NOT: Manyetik karıştırma çubukları (poliviniliden diflorür [PVDF] ile kaplanmış AlNiCo; Tablo 1) haznedeki karıştırıcı seviyesinde 3.5 mT alan kuvvetine sahip darbeli dönen bir manyetik alan ile çalkalanır.
  3. MiR28'te veya sonraki deneylerde kullanılan aynı inkübasyon ortamında hava kalibrasyonu 05 gerçekleştirin.
  4. Deneylere başlamadan hemen önce ara sıra sıfır oksijen kalibrasyonu yapın, ancak asla hemen yapmayın.
    1. O2-Sıfır Tozunu 50 mM fosfat tamponunda (pH 8.0)SV veya CV odaları için sırasıyla 2.5 mM veya 10 mM'lik bir konsantrasyona çözerek taze bir Na-ditiyonit stok çözeltisi hazırlayın.
    2. O2 konsantrasyonunda 0 μM14,28 ham sinyali R0 veya sıfır akımı [μA] elde etmek için fazla Na-ditiyonit titre edin.

3. Enstrümantal O2 arka plan testi

  1. Oda sV
    1. Hava kalibrasyonundan sonra hazneyi kapatın. O2 konsantrasyonu hava doygunluğundan yaklaşık 150 μM'ye düşene kadar oksijen sinyalini yaklaşık 60 dakika izleyin. 'O2 eğim negatif' grafiğinde J°1 ila J°4 arasında dört işaret ayarlayın.
      NOT: Bir deneye başlamadan önce bu enstrümantal O2 arka plan testini her gün gerçekleştirin.
    2. İSTEĞE BAĞLI: Bir Hamilton şırınga ile, 100 μM'lik birO2 konsantrasyonuna ulaşmak için adım 2.4.1'e göre hazırlanan Na-ditiyoniti titre edin (Şekil 1C).
      NOT: Başka bir protokolde, Na-ditiyonit, titrasyon enjeksiyonlu mikro pompa (TIP2k; Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2), enstrümantal arka plan O2 akısını belirlemek için standart bir yöntemle karşılaştırma için28.
  2. Oda cV
    1. Hava kalibrasyonundan sonra, hazneyi kapatın, O2 eğiminin stabilizasyonunu bekleyin ve 'O1 eğimi neg.'28 grafiğine J°28 işaretini ayarlayın. Bir Hamilton şırınga ile, adım 2.4.1'e göre hazırlanan Na-ditiyoniti titre edin. Odanın V oksijen rejimine uymasıiçin 0,7 μL'lik adımlarla ve O2 konsantrasyonunu 150 μM'ye düşürün.
    2. O2 konsantrasyonunu 100 μM'ye düşürmek için başka bir Na-ditiyonit titrasyon adımı (yaklaşık 7 μL) ekleyin (Şekil 1D).
  3. Enstrümantal O2 arka plan veri analizi
    1. DatLab28'de enstrümantal O2 arka plan eğimini hesaplayın. Üst menüden Flux/Slope'u seçin.
    2. O2 arka plan düzeltme penceresini açın. O2 arka planının kaynağı olarak Aktif Dosya'yı seçin ve doğrusal regresyonun hesaplanması için kullanılacak J° işaretlerini seçin. O2 arka plan düzeltmesini uygulayın.

figure-protocol-1
Şekil 1: Küçük hacimli (sV) ve klasik hacimli (cV) odalar ve enstrümantal O2 arka plan testi. (A) Oda sV. (B) Oda cV. (C) Eğim negatif ve J°1 işaretlerinin temsili izleri, sV (0,5 mL; yeşil) ve cV (2,0 mL; mavi). (D) Karşılık gelen oksijen konsantrasyonu ve R1 işaretleri. Üç manuel Na-ditiyonit titrasyonu (yaklaşık 0,7 μL, 10 mM stok; cV) ve sV ve cV odasında sırasıyla 2,5 mM ve 10 mM stokun son 7,0 μL titrasyonu. Titrasyonların neden olduğu ani yükselmeler ortadan kaldırıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Oroboros odalarına numune eklenmesi

NOT: Numune, odaya iki yöntemle eklenebilir: kısmi hacim replasmanı (bu çalışmada trombositler ve fibroblastlar) veya tam hacim replasmanı (bu çalışmada izole mitokondri).

  1. Kısmi hacim değişimi
    1. Tam olarak yerleştirilmiş durdurucuyu çıkarın. MiR05'ten bir hacim V pipetleyin ve atın. Vçıkışı, trombositler için 60-70 μL ve fibroblastlar için 80-150 μL'dir ve stok hücre süspansiyonundaki hücre konsantrasyonlarına göre hesaplanır.
    2. Vçıkışına eşdeğer olarak, aynı hacimde VJ.i stok hücre süspansiyonunu (bilinen hücre konsantrasyonu ile) hazneye pipetleyin (Şekil 2).
    3. Etkili deney hacmi V'den (0.54 mL ve 2.07 mL) daha büyük olan gerçek hacim V'deki (0.5 mL ve 2.0 mL) deneysel hücre konsantrasyonunu hesaplayın.
      NOT: Stok hücre süspansiyonunun ve deneysel hücre konsantrasyonunun konsantrasyonları, küçük bir titrasyon hatasıyla uyumlu VJ.i = Vout hacimleri elde etmek için planlanmalıdır. Trombositlerle yapılan deneylerde, 0.05 mL'lik bir kılcal ölü hacme sahip Chamber sV için bir prototip durdurucu kullanıldı.
  2. Komple hacim değişimi
    1. Tüm ortamı odadan sifonlayın vesırasıyla SV veya CV odalarındaki deneysel numune konsantrasyonunda en az 0.54 mL veya 2.07 mL izole mitokondri stok çözeltisi ile değiştirin.
    2. Hazneyi kapatın ve fazla mitokondriyal stok çözeltisini durdurucu hazneden sifonlayın.
      NOT: Tam hacim değişimi, bir Hamilton şırınga ile durdurucu kılcal damar yoluyla kapalı odaya titre edilmesiyle oluşabilecek mitokondriyal konsantrasyondaki herhangi bir değişkenliği içermez. İkinci yöntem, konsantre stok süspansiyonlarında (örneğin, izole edilmiş mitokondri) hazırlanan küçük çaplı numunelere uygulanabilir; bununla birlikte, kırılgan hücreleri, Hamilton şırıngasının 51 mm uzunluğundaki iğnesine (0,41 mm iç çap) uygulanan kesme kuvvetleri tarafından plazma zarlarının potansiyel hasarına maruz bırakır. Bu, durdurucunun çıkarılması ve numunenin kısmi veya tam hacim değişimi ile hazneye pipetlenmesiyle önlenir. Üç tip mitokondriyal preparat incelenmiştir. Numune hazırlıkları Ek Dosya 1 1,26,29,30'da açıklanmıştır.
  3. Canlı hücreler: insan trombositleri
    1. Trombosit içeren kriyoviyalleri 37 °C'de bir su banyosuna yerleştirin ve içeriği çok az buz kalana kadar çözün.
    2. Kriyoviyalleri açın ve 1 mL önceden ısıtılmış ortamı (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C) yavaşça damlalar halinde ekleyin.
    3. Trombositleri nazikçe karıştırın ve toplam hacmi 10 mL önceden ısıtılmış ortam (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C) olan 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Açılır bir rotor (hızlanma 6, fren 2) kullanarak oda sıcaklığında (RT) 1000 g'da 10 dakika santrifüjleyin.
    4. Trombositleri 0.25 mL DPBS + 10 mM EGTA (RT) içinde yeniden süspanse edin ve bunları 157 · arasında değişen bir başlangıç deneysel hücre konsantrasyonuna kısmi hacim replasmanı ile odalara ekleyin. 106 ila 210 · 106 x·mL-1 0.5 mL haznede ve 164 · 106 ila 220 · 106 x·mL-1 2.0 mL haznede (x temel ünitesi ile ilgili ayrıntılar için bkz.31).
      NOT: Bir Oroboros, sırasıyla A ve B konumlarında sV ve cV odası ile donatılmıştı ve sırasıyla B ve A konumlarında sV ve cV odası ile donatılmış başka bir Oroboros ile paralel olarak kullanılıyordu.
  4. Geçirgen hücreler: insan fibroblastları
    1. Hücreleri, 0.75 · 'lik bir nominal hücre konsantrasyonuna kısmi hacim değişimi ile Oroboros odalarına ekleyin Her iki oda tipinde 106 x·mL-1 ve gerçek konsantrasyonu hesaplayın (adım 4.1.3).
      NOT: Farklı Oroboros cihazları paralel olarak kullanıldı ve her biri sV veya cV odaları ile donatıldı.
  5. İzole mitokondri: fare kalbi
    1. 5985 μL mitokondriyal solunum ortamına (MiR05) 15 μL mitokondriyal süspansiyon ekleyin, bu da 0.013-0.026 mg∙mL-1 arasında değişen bir stok mitokondriyal protein konsantrasyonu ile sonuçlanır.
    2. Mitokondriyal süspansiyonu, tam hacim değişimi ile Oroboros odalarına ekleyin.
      NOT: Bir Oroboros, sırasıyla A ve B konumlarında sV ve cV odası ile donatılmıştı ve sırasıyla B ve A konumlarında sV ve cV odaları ile donatılmış başka bir Oroboros ile paralel olarak kullanılıyordu.

figure-protocol-2
Şekil 2: Kısmi hacim değişimi ile hücre süspansiyonunun eklenmesi. (A) 0.5 mL Hazne sV ve (B) 2.0 mL Hazne cV'ye ilave. (1) Enstrümantal arka planO2 akı JO2 ° ölçümü için solunum ortamı V hacimleri ve dolu durdurucu kılcal Vstc ile kapalı oda. (2) Durdurucu çıkarıldı, Vstc hazneye boşaltıldı ve toplam hacim V'= V+Vstc ile sonuçlandı. (3) Ortamın kısmen kaldırılması Vçıkışı = -V J.i. Odada bir hacim V''= V'+Vçıkışı kalır. (4) Respirometrik stok hücre süspansiyonunun V J.i hacmine sahip alt numunenin hazneye pipetlenmesi, toplam hacim V# = V+Vstc seyreltilmiş hücre süspansiyonu ile sonuçlanır. (5) Deneysel bir hacim V'de hacme özgü O2 akısı JV, O2 ölçümü için doldurulmuş durdurucu kılcal (ölü hacim Vstc) kapalı oda. Bu rakam, HRR 2'deki Hücre sayımı ve normalizasyondaki Şekil41A'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. SUIT protokolleri

  1. Ek Tablo 1'de listelenen kimyasalların stok çözeltilerini Hamilton mikroşırıngaları ile odalara titre edin, titrasyon hacimlerini sV ve cV odalarında aynı deneysel konsantrasyonları elde edecek şekilde ayarlayın (Şekil 6, 8, 10'daki şekil açıklamalarına bakınız).
  2. SUIT-003_D018 32,33 protokolünü seçin (bu çalışmadaki trombositler için).
  3. SUIT-001_D004 4,15,34,35 ve SUIT-002_D007 4,15,35,36 protokollerini seçin (bu çalışmadaki fibroblastlar için).
  4. SUIT-002_D005 4,15,35,37 protokolünü seçin (bu çalışmada izole mitokondri için).

6. SUIT veri analizi

  1. DatLab'da, seçilen grafiklerin bölümlerini tanımlamak için işaretleri ayarlayın.
  2. Üst menüden Flux/Slope'u seçin. Akı/Eğim penceresini açın. SUIT protokolündeki her titrasyonda askıda kalan numunelerin seyreltilmesi için titrasyon hacmi düzeltmesini uygulayın.
  3. Üst menüden İşaretler'i seçin. Artık oksijen tüketiminin (rox) çıkarılmasıyla düzeltilen referans değer olarak düzeltilen işaretli veri noktalarının medyanını göstermek için İşaret istatistikleri'ni açın.
  4. Bir elektronik tablo kullanarak ters regresyon analizi25,28 ile sV ve cV odalarında elde edilen eşleştirilmiş sonuçlar arasındaki kesişme ve eğimi hesaplayın.
  5. SV ve cV odalarındaki rox durumundaki (minimum O2 akısı) solunum hızlarını, jamovi 2.3.1338 yazılımını kullanarak eşleştirilmiş bir Öğrenci t-testi ile karşılaştırın.
    NOT: Bir Oroboros cihazındaki iki oda işlevsel olarak bağımsız olduğundan (sıcaklık ve DatLab kayıt aralıkları hariç), her odadaki ölçümler, farklı cihazların kullanılmasına benzer şekilde ayrı ayrı düşünülebilir. Nihai sonuçlar, değişkenlikleri hakkında bilgi içeren birden fazla odanın medyanları veya ortalamaları olarak rapor edilebilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oksijen sensörlerinin (POS) ham sinyalleri R1 [μA]'nın, 'açık' odadaki havanın gaz fazı ile dengede olan sulu fazın hacminden bağımsız olması beklenir. Ek Tablo 2. Bununla birlikte, kapalı odada, enstrümantal arka plan O2hava doygunluğuna yakın akı J°1[pmol∙s-1∙mL-1] ses seviyesine bağlıdır V (Ek Tablo 2). O Ç2Sensörün tüketimi [PMOL∙s-1], sıfır düzeltilmiş ham sinyal R1-R0 [μA], yük numarası 4 e olarak ölçülen elektron akışından tahmin edilebilir-/O2ve Faraday sabiti F = 96 485.33 C∙mol-1. 1 μA, bir elektron akışına eşdeğerdir (-) arasında 10.36 pmol∙s-1. Yük numarasına bölmek bir O ile sonuçlanır2akmak15,39 2.591 pmol∙s-1μA-1. R1-R0'ın kaydedilen medyanı, 0.5 mL ve 2.0 mL odalarda sırasıyla 2.09 μA ve 1.98 μA idi (Ek Tablo 2; R0 = 0.006 ± 0.007 μA sV ve R0 = 0.004 ± c'de 0.003 μAV odalar), teorik olarak O'ya karşılık gelir25.41 pmol∙s tüketim oranları-1ve 5.13 pmol∙s-1. O Ç2Sensörün akışı, hava doygunluğunda beklenen hacme özgü akıya dönüştürülür (J°R1) 5.41 pmol∙s olarak-1/0.5 mL = 10.82 pmol∙s-1∙mL-1ve 5.13 pmol∙s-1/2.0 mL = 2.56 pmol∙s-1∙mL-1S'deV ve cV odası, sırasıyla. 2,0 mL ve 0,5 mL haznede aynı tip polarografik oksijen sensörleri ile hacme özgü arka plan O2akı - R1-R0 akımından hesaplanır (J°R1) - teorik olarak oda hacmine ters orantılı olarak 4 kat artar. J°hava (geri difüzyonun sıfır olduğu hava doygunluğunda; karşılaştırın Masa 2 ve Ek Tablo 3) O için hesaplandı2Deneysel arka plan testinin doğrusal regresyonundan (Şekil 3). J°hava teorik olarak beklenen değerlere yaklaştı J°R1 her iki oda için (Masa 2). bu J°hava / J°R1S'de bu oran 0.85 ± 0.04 ve 0.92 ± 0.12 olarak bulunmuşturV ve cV oda, sırasıyla, bu oranın 0.95 ± 0.12 olduğu 2.0 mL'lik odadaki bağımsız bir 52 ölçüm serisine paralel olarak (Ek Tablo 4). J°hava 0.5 mL'de 2.0 mL'lik odaya göre 3.9 kat daha yüksekti. Ağ O2Geri difüzyon J°50, 50 μM O'da hesaplanmıştır2deneysel arka plan testinin doğrusal regresyonundan, 0.5 mL odasında sadece üç kat daha yüksekti (Masa 2). Enstrümantal arka planın değişkenliği O2akılar, 0.5 ve 0.3 pmol standart sapma (SD) ile iki farklı oda hacminde neredeyse aynıydı-1∙mL-1için J°hava ve 0.9 ve 0.8 pmol-1∙mL-1 için J°50S'deV ve cV oda, sırasıyla (Masa 2). Daha yüksek enstrümantal arka plana rağmen O20.5 mL odadaki eğimler, arka plan O'nun bağımlılığı2akılar üzerinde cO2her iki oda tipinde de yüksek oranda tekrarlanabilirdi (Figür 3D). Bu, kalıntıların düşük değerlerine neden olur <±1 pmol∙s-1∙mL-1her iki oda için (Ek Tablo 5), Oroboros'un tespit sınırına uygun olarak28.

Karıştırma hızının POS'un kalibrasyon ham sinyali R1 üzerindeki etkisini, 350 rpm (5,8 Hz) ile 950 rpm (15,8 Hz) arasında, hazne 'açık' konfigürasyondayken 100 rpm'lik (1,7 Hz) adımlarla ölçtük. Bu konfigürasyonda, ortamda çözünenO2, gaz fazı ile dengededir; bu nedenle, karıştırma hızının bir fonksiyonu olarak ham sinyaldeki (mikroamper [μA]) değişiklikler, cO2'deki gerçek farklılıkları yansıtmaz. Oksijen sensörleri, hazne hacminden bağımsız olarak, 750 rpm'lik varsayılan hızda R1'den küçük bir sapma ile karıştırma hızındaki bir değişikliğe yanıt verdi (Şekil 4). 'Açık' konfigürasyonda, sinyalin stabilizasyonundan sonraki her adım için SD olarak tanımlanan O2 eğiminin gürültüsü, her iki oda tipinde de 850 rpm'de en düşüktü ve karıştırma hızı her iki yönde de bu değerden saptığında arttı (Şekil 5A). 550 rpm'nin altında, O2 eğiminin gürültüsü ±4 pmol∙s-1∙mL-1 eşiğini aştı ve minimum pratik karıştırma hızını tanımladı. Teknik sınırlamalar nedeniyle, üst sınıra ulaşılamadı ve maksimum pratik karıştırma hızı 950 rpm olarak kaldı (Şekil 5A). Bu aralıkta, O2 sinyalinin R1'den sapması %<2.5 idi. Odaların kapatılması, gürültü ve karıştırma hızı arasındaki ilişkiyi değiştirmedi (Şekil 5B). Üstel zaman sabiti τ, 0,5 mL oda için 550 rpm'de 2,53 ±± 0,05 s ve 750 rpm'de 0,05 sn 2,50 idi (Ek Şekil 3).

Trombositlere uygulanan SUIT-003_D018 protokolü 14 adede kadar titrasyon adımı içerir. Hücre canlılığının bir indeksi olarak canlı hücrelerin, ce ve plazma zarı geçirgenliğinin birleştirme kontrolünü, ce'yi ve plazma zarı geçirgenliğini incelemek için tasarlanmıştır32. İki tip odacıkta ölçülen oksijen akışı (Şekil 6), tüm solunum durumlarında sıkıca eşleşti (Şekil 7). Fonksiyonel hipoksiyi önlemek veya deneyselO2 konsantrasyonunu tanımlanmış bir aralıkla sınırlamak için aralıklı yeniden oksijenasyonlar gereklidir. Reoksijenasyonlar, Rot'un titrasyonundan sonra haznenin 'açık' konuma açılmasıyla gerçekleştirildi. Hazne kapatıldıktan sonra, O2 akısı 2.0 mL haznede 4 dakika içinde stabilize oldu, ancak stabilizasyondan ve yeni işaretin ayarlanmasından önce 0.5 mL'lik haznede yaklaşık 10 dk gerekliydi (Şekil 6 ve Ek Şekil 4). O2 akıları düşük olduğunda rox durumunda yeniden oksijenasyon, stabilizasyon için gereken süre boyunca O2 konsantrasyonunun düşmesini önler. Rotenon inhibe edilen rox, sV ve cV odasında sırasıyla 98 ± 17 ve 94 ± 17 μM O2'de (ortalama ± SD) 0.6 ± 0.6 ± 0.6 pmol∙s-1∙mL-1 2.9 idi. Rox, sV ve cV odasında sırasıyla 159 ± 8 ±ve 11 μM O2'ye 147 ± 8 ve 147 0.4 pmol∙s-1∙mL-1'den 0.9'a 3.1 ± 0.9 artmıştır. Trombositlerde gözlenen rox'un oksijen bağımlılığı, insan fibroblastları ve umbilikal ven endotel hücreleri üzerindeki sonuçlarla uyumludur40.

Geçirgen fibroblastlarda OXPHOS analizi için, 17 ve 20 titrasyon adımına kadar iki SUIT protokolü kullandık (sırasıyla SUIT-001 ve SUIT-002,35; Şekil 8); bu nedenle, titrasyon hacmi düzeltmesi özellikle önemlidir, çünkü SUIT-002'nin sonunda seyreltme, SV ve CV odasında sırasıyla maksimum ve ,5'e ulaşmıştır. 0.5 mL ve 2.0 mL odacıklarda sırasıyla 0.35 · 106 x ve 1.44 ·10 6 x fibroblast hücre sayıları, 0.75 · 106 x∙mL-1 aynı hücre konsantrasyonu ile sonuçlandı. SUIT-001 ve SUIT-002 kombinasyonu, tümü iki odacıklı tiplerde yakından ilişkili olan 20 solunum durumunu ele aldı (SUIT-001 için r2 = 0.950 ve SUIT-002 için r2 = 0.959). Her iki protokolde de, Kompleks IV nispeten yüksek bir dağılıma sahipti (Şekil 9). SUIT-001'de, rutin durumda (ortalama SD) 18.7 ± 7.0 pmol∙s-1∙mL-1'lik düşük hacme özgü O1 akısından başlayarak (ortalama ± SD) yeniden oksijenasyon gerekli değildi, bu daO2 konsantrasyonunun protokolün CIV bağlantılı bölümüne kadar 56 μM'ye düşmesine izin verdi (Şekil 8A; 8Ama). Bununla birlikte, SUIT-002'de, birleştirici titrasyonlarından önce yeniden oksijenlendirme gerçekleştirildi veO2 konsantrasyonu 100 μM'den 180 μM'ye çıkarıldı (Şekil 8B; 6Gp). Yeniden oksijenasyondan sonra akının stabilizasyonu için gereken uzun süre göz önüne alındığında, birleştirici titrasyonları sırasında yeniden oksijenlendirmeden kaçınılmalıdır.

İzole edilen mitokondriye kısaltılmış bir SUIT protokolü uygulandı (Şekil 10). Mitokondriyal protein konsantrasyonu, respirometrik testten sonra belirlendi, bu da odadaki doğru numune konsantrasyonunun önceden tanımlanmasını imkansız hale getirdi. Hacme özgü solunum akısı, mitokondriyal konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak değişir. Bu nedenle, veriler hacme özgü ve protein kütlesine özgü akı olarak sunuldu (Şekil 11). Her iki gösterim de 0.5 mL ve 2.0 mL odalarda elde edilen ölçümler arasındaki sıkı korelasyonu göstermektedir (Şekil 11).

Kompleks III'ün antimisin A ile inhibisyonundan sonra ölçülen rezidüel oksijen tüketimi rox, çok düşük solunum hızlarında enstrümantal performansın bir indeksi olarak kullanılabilir. Tüm deneysel serilerde, rox 0.5 mL ve 2.0 mL odacıklar arasında karşılaştırılabilirdi (trombositler: t(5) = -0.34, p = 0.74; fibroblast: SUIT-001: t(10) = 20.00, p = 0.06; TAKIM-002: t(10) = 11.00, p = 0.96; İzole mitokondri: t(4) = -1.18, p = 0.27). Verilerin dağılımı, Şekil 12'de gösterildiği gibi, büyük ölçüde ±1 pmol∙s-1∙mL-1 13,28'in araçsal belirsizliğine karşılık geldi. Orijinal dosyalar Zenodo deposunda açık erişim için mevcuttur: 10.5281/zenodo.11634408. 

figure-results-1
Şekil 3: SV (0.5 mL; yeşil ve siyah) ve cV odası (2.0 mL; mavi) için enstrümantal arka plan O2 akısı. O2 konsantrasyonu hava doygunluğundan (yaklaşık 180 μM) yaklaşık 50 μM ile yaklaşık 50 μM arasında değişir. Açık semboller: Na-ditiyonit olmadan elde edilenO2 konsantrasyonları. Katı semboller: Na-ditiyonitin manuel titrasyonları ile kontrol edilenO2 konsantrasyonları. Siyah daireler: 0.5 mL haznede (N = 8) TIP2k kullanılarak Na-ditiyonit titrasyonları ile kontrol edilen O2 konsantrasyonları. Enstrümantal arka plan testlerinden elde edilen sonuçlar, canlı hücreler (ce) kullanılmadan önce (A) Seri 1'den (sV: N = 2; cV: N = 2) toplandı; (B) Seri 2 (sV: N = 38; cV: N = 50) geçirgen hücreleri (pce) kullanmadan önce; (C) İzole mitokondri (imt) kullanmadan önce Seri 3 (sV: N = 10; cV: N = 10). (D) A-C panellerinden üst üste binen veriler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 4: 0.5 mL haznede (yeşil) ve 2.0 mL haznede (mavi) hava doygunluğunda ('açık' hazne) karıştırma dönüş hızının POS sinyali üzerindeki etkisi. 750 rpm'de R0 düzeltmeli hava kalibrasyon sinyalleri R1-R0 [μA] (sV: N = 4; cV: N = 4) göre yanıt [%]. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 5: Karıştırma dönüş hızının bir fonksiyonu olarak O2 eğiminin gürültüsü. (A) 'açık' odada standart sapma olarak ifade edilen gürültü; (B) kapalı oda (0.5 mL, yeşil; 2.0 mL, mavi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 6: 0.5 mL'lik odada kriyoprezervasyonlu insan trombositlerinin O2 tüketimi. Hücre başına O2 konsantrasyonu [μM] (mavi çizgiler) ve O2 akışının [amol∙s-1∙x-1] temsili izleri, O2 akısı [pmol∙s-1∙mL-1] 157∙106 x∙mL-1 hücre konsantrasyonuna bölünmesiyle hesaplanır (kırmızı çizgiler, enstrümantal arka plan O2 akısı için düzeltilmiştir; titrasyonların neden olduğu ani yükselmeler elimine edildi). O2 konsantrasyonu, aralıklı reoksijenasyonlarla (hava, 'açık' oda, mavi gölge) 50 μM'nin üzerinde tutuldu. Solunum durumlarının sırası (titrasyonlar ve hızlar; protokol SUIT-003_D018): ce1, canlı hücrelerin rutin solunum R. ce1P, dış substrat olarak piruvat 5 mM. ce2Omy10 (panel A), 5 nM'lik adımlarla Omy titrasyonları; sızıntı solunumu L. ce3U0.3 (panel A) ve ce3U0.1 (panel B), sırasıyla 0.3 ve 0.1 μM'lik optimum CCCP konsantrasyonuna kadar birleştirici titrasyonları; ET kapasitesi E. ce3Glc, glikoz 11 mM; E, birleştirici tarafından aşamalı olarak inhibe edilir. ce4Rot, rotenon 0.5 μM CI'yi inhibe eder; Artık oksijen tüketimi ROX. ce5S, süksinat 10 mM; plazma zarı geçirgen hücrelerde E'yi uyarır. 1Dig15 (panel A) ve 1Dig10 (panel B), tam plazma membran geçirgenliği için sırasıyla 15 ve 10 μg·mL-1'lik optimum konsantrasyonlara 5 μg·mL-1'lik adımlarla digitonin titrasyonları; süksinat yolu ET kapasitesi SE. 1c, sitokrom c 10 μM; Mitokondriyal dış zar bütünlüğünün testi. 2Ama, antimisin A 2.5 μM CIII'yi inhibe eder; rox'u seçin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 7: 0.5 mL ve 2.0 mL odasında ölçülen dondurularak saklanmış insan trombositlerinin solunumunun korelasyonu. Rox düzeltmeli O2 akışı, SUIT-003_D018 protokolünde değerlendirildi (Şekil 6); N = 6 olur. (A) oligomisin Omy ile; (B) Omy olmadan. Ters çevrilmiş en küçük kareler regresyonunun ortalama eğimleri figure-results-6 ve kesişimleri figure-results-7 ve tüm verilerden hesaplanan r2 belirleme katsayıları. Kesikli siyah çizgiler kimlik çizgilerini temsil eder. Kırmızı çizgiler hesaplanan regresyon çizgilerini temsil eder. Glikoz ilavesinden sonra durumdakiO2 akışları hariç tutulmuştur (bkz. Şekil 6). Oligomisinli ve oligomisinsiz protokoller, veri noktalarının örtüşmesini önlemek için A ve B panellerinde ayrılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: 0.5 mL'lik odacıkta O2 fibroblast tüketimi. Hücre başına cO2 (mavi çizgiler [μM]) ve O2 akışının temsili izleri, O2 akısı [pmol∙s-1∙mL-1] hücre konsantrasyonuna (0.75 · 106 x∙mL-1) bölünerek hesaplanır, enstrümantal arka plan O2 akısı için düzeltildi (kırmızı çizgiler, titrasyonların neden olduğu ani yükselmeler ortadan kaldırıldı). O2 konsantrasyonu, aralıklı reoksijenasyonlarla (hava, 'açık' oda, mavi gölge) 50 μM'nin üzerinde tutuldu. Solunum durumlarının sırası (titrasyonlar ve hızlar). (A) Protokol SUIT-001_D004: ce1, rutin solunum R. + Dig, digitonin 10 μg·mL-1 (ce ila pce), rezidüel endojen solunum ren. 1PM, piruvat 5 mM ve malat 2 mM; N-yolu sızıntı solunumuNL. 2 boyutlu, ADP 2,5 mM; N-yolu OXPHOS kapasitesi NP. 2c, sitokrom c 10 μM; Mitokondriyal dış zar bütünlüğünün testi. 3U1.5, optimum CCCP konsantrasyonu 1.5 μM'ye kadar birleştirici titrasyonları; NADH bağlantılı ET kapasitesi NE. 4G, glutamat 10 mM; N(PGM)E'dir. 5S, süksinat 10 mM; NS yolu ET kapasitesi NSE. 6Rot, rotenon 0.5 μM; süksinat yolu ET kapasitesi SE. 7Gp, gliserofosfat 10 mM; SGpE. 8Ama, antimisin A 2.5 μM; rox'u seçin. 9AsTm, askorbat 2 mM ve TMPD 0.5 mM; CIV stimülasyonu için substratlar; Oksijen4 tükenmeden redoks dengesine izin vermek için oda 20 dakika açık tutuldu; Odayı kapattıktan sonraO2 ölçek dışı akı (205 amol·s-1·x-1). 10Azd, azid 100 mM; Oksijene bağlı kimyasal arka plan akısı CHB. (B) SUIT-002_D007 Protokolü: ce1, R. +Kaz, ren. +D, ren'i uyarır. +M.1, malat 0.1 mM ve 1Oct, oktanoilkarnitin 0.5 mM; F-yolu OXPHOS kapasitesi FP = J (1Oct) -J (+M.1). 1c. 2M2, analorrotik N-yolunu destekleyen malat 2 mM; F(N)P olur. 3P ve 4G, FNP'ye aşamalı aktivasyon. 5S, FNSP. 6Gp, FNSGpS. 7U1.5, FNSGpE. 8Rot, SGpE. 9Ama, rox. 10AsTm O2 ölçek dışı akı 207 amol·s-1·x-1. 11Azd, chb. Genel olarak, Kompleks IV aktivitesi, yakındaneşleşen O2 konsantrasyonlarında J (AsTm) -J (Azd) oranlarının farkıdır. Daha fazla ayrıntı için Şekil 6'ya bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9: 0.5 mL ve 2.0 mL odacıkta geçirgen fibroblastların solunumunun korelasyonu. Rox düzeltmeli O2 akışı (A) SUIT-001_D004 ve (B) SUIT-002_D007 (N = 6). Ters çevrilmiş en küçük kareler regresyonu ve belirleme katsayısı r2'nin ortalama eğimi figure-results-10 ve kesişimi figure-results-11 tüm verilerden hesaplanmıştır. Kesikli siyah çizgi, kimlik çizgisini temsil eder. Kırmızı çizgiler hesaplanan regresyon çizgilerini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-12
Şekil 10: 0.5 mL (yeşil) ve 2.0 mL (mavi) odalarda izole fare kalbi mitokondrilerinin O2 tüketimi. Mitokondriyal protein konsantrasyonu 0.023 mg∙mL-1'de (A) kütleyeözgü O2 akısının temsili izleri (enstrümantal arka planO2 akısı için düzeltildi, titrasyonların neden olduğu ani yükselmeler elimine edildi) ve (B)O2 konsantrasyonu [μM]. SUIT-002_D005 protokolünü takiben solunum durumlarının sırası (titrasyonlar ve hızlar): imt, rezidüel endojen solunum ren. +D, ADP 2,5 mM; Ren'i uyarır. +M.1, malat 0.1 mM ve 1Oct, oktanoilkarnitin 0.5 mM; F-yolu OXPHOS kapasitesi FP = J (1Oct) -J (+M.1). 1c, sitokrom c 10 μM; Mitokondriyal dış zar bütünlüğünün testi. 2M2, anaplerotik N-yolunu destekleyen yüksek malat 2 mM; F(N)P olur. 3P, piruvat 5 mM; FNS. 4G, glutamat 10 mM; FNS. 5S, süksinat 10 mM; FNSP. 6Gp, gliserofosfat 10 mM; FNSGpS. 7U0.5, optimum CCCP konsantrasyonu 0.5 μM'ye kadar birleştirici titrasyonları; FNSGpE. 8Rot, rotenon 0.5 μM CI'yi inhibe eder; SGpE. 9Ama, antimisin A 2.5 μM CIII'yi inhibe eder; Artık oksijen tüketimi ROX. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-13
Şekil 11: 0.5 mL ve 2.0 mL odalarda ölçülen izole fare kardiyak mitokondrilerinin solunum korelasyonu. Şekil 10'da gösterilen protokoldekiO2 akısı (N = 4). (A) Hacme özgü O2 akısı. (B) Rox ile düzeltilmişO2 akısı, mitokondriyal protein konsantrasyonuna bölünür (0.013 - 0.026 mg∙mL-1). Ters çevrilmiş en küçük kareler regresyonu ve belirleme katsayısı r2'nin ortalama eğimi figure-results-14 ve kesişimi figure-results-15 tüm verilerden hesaplanmıştır. Kesikli siyah çizgiler kimlik çizgisini temsil eder. Kırmızı çizgiler hesaplanan regresyon çizgisini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-16
Şekil 12: 0.5 mL ve 2.0 mL odacıklarda artık oksijen tüketimi rox . Canlı hücreler (ce, kareler), geçirgen hücreler (pce, daireler) ve izole mitokondri (imt, üçgenler) ile yapılan deneylerden birleştirilen antimisin A ilavesinden sonra ölçülen hacim başına akı. Ters çevrilmiş en küçük kareler regresyonunun ortalama eğimi figure-results-17 ve kesişimi figure-results-18. Kesikli çizgi: kimlik çizgisi. Kırmızı çizgi: hesaplanan regresyon çizgisi. Gölge: enstrümantal çözünürlük aralığı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ModülsVcV
Deney odası hacmi V0,5 mL2.0 mL
Cam silindirin iç çapı12,0 mm kalınlığındadır16,0 mm
Cam silindirin dış çapı24,0 mm kalınlığındadır24,0 mm kalınlığındadır
Cam duvar kalınlığı6,0 mm genişliğindedir.4,0 mm kalınlığındadır
PVDF kaplı karıştırma çubuğu11,5 x 6,2 mm15,0 x 6,0 mm
Durdurucu kılcal çapı1,00 mm1,30 Milimetre
Stoper kılcal kesit alanı0,79 mm21,33 mm2
Stoper kılcal uzunluğu50,64 Milimetre48,86 Milimetre
Durdurucu kılcal hacim39,8 μL64,9 μL
Durdurucu kılcal ölü hacim Vstc küçük bir damladahil a0,04 mL0,07 mL
Hacim kalibrasyonu için Hacim V'0.54 mL2,07 mL

birDamla, cV Odası için 5 μL'ye ve V Odası için 0 μL'ye yakınolmalıdır.
Tablo 1: Polieter eter keton (PEEK) tıpalı küçük hacimli (SV) ve klasik hacimli (CV) modüllerin boyutları.

J°hava / [pmol∙s-1∙mL-1]J°50 / [pmol∙s-1∙mL-1]
Deney odası hacmi V0,5 mL2.0 mL0,5 mL2.0 mL
Demek9.222.37-3.17-1.17
Medyan9.252.36-3.08-1.04
Standart sapma0.490.340.930.83
Asgari8.201.79-5.11-3.72
Maksimum10.413.42-0.820.67

Tablo 2: J ° hava doygunluğuna göre tahmin edilmiştir ve J ° 50 50 μM O2 konsantrasyonunda hesaplanmıştır. Seri 2 (pce) ve 3'te (imt) ve TIP2k titrasyonlarından önce (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2.0 mL: N = 60).

Ek Dosya 1: Numune hazırlıkları. İnsan trombositleri, insan fibroblastı ve mitokondri fare kalplerinden izole edilmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1:TIP2k kullanılarak enstrümantal O 2 arka plan testi. 0,5 mL'lik haznede Na-ditiyoniti (2,5 mM) titre etmek için TIP2k kullanılarak gerçekleştirilen testin temsili izleri. Orta: MiR05, sıcaklık: 37 °C, karıştırma hızı: 750 rpm. Titrasyonların neden olduğu ani yükselmeler ortadan kaldırıldı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: O2 konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak enstrümantal arka plan O 2 akı J ° 1. S V Odası (0.5 mL; yeşil, N = 48) ve CV Odası (2.0 mL; mavi, N = 60) Seri 2 (pce, daireler) ve 3'te (imt, üçgenler) ve 0.5 mL odacıkta TIP2k titrasyonlarından önce (siyah daireler, N = 8). Kırmızı çizgiler: medyan ± SD. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Karıştırma dönüş hızının bir fonksiyonu olarak üstel zaman sabiti τ . 37 °C'de 0,5 mL oda için bireysel τ değerleri (N = 2). 0,5 mL haznede τ , 550 rpm'de 0,05 sn ± 2,53 s, 750 rpm'de 0,05 sn ± 2,50 ve 850 rpm'de 0,04 sn ± 2,47 idi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: 2.0 mL'lik odada dondurularak saklanmış insan trombositlerinin O2 tüketimi. Oligomisin titrasyonları (Omy) dahil olmak üzere SUIT-003_D018 protokolünün temsili izi. Akı [pmol∙s-1∙mL-1], enstrümantal arka planO2 akısı için düzeltildi ve hücre konsantrasyonuna bölündü (164∙106 x∙mL-1). Titrasyonların neden olduğu ani yükselmeler ortadan kaldırıldı. cO2 , aralıklı reoksijenasyonlarla (hava, 'açık' oda, mavi gölge) 60 μM'nin üzerinde tutuldu. Solunum durumlarının sırası (titrasyonlar ve hızlar): ce1, canlı hücrelerin rutin solunum R . ce1P, dış substrat olarak piruvat. ce2Omy10, 5 nM'lik adımlarla Omy titrasyonları; sızıntı solunumu L. ce3U2.0, 2 μM'lik optimum konsantrasyonlara kadar birleştirici titrasyonları; ET kapasitesi E. ce3Glc, glikoz 11 mM; E , birleştirici tarafından aşamalı olarak inhibe edilir. ce4Rot, rotenon 0.5 μM CI'yi inhibe eder; Artık oksijen tüketimi ROX. ce5S, süksinat 10 mM; plazma zarı geçirgen hücrelerde E'yi uyarır. 1Dig20, tam plazma membran geçirgenliği için 20 μg·mL-1'lik optimum konsantrasyonlara kadar digitonin titrasyonları; süksinat yolu ET kapasitesi SE. 1c, sitokrom c 10 μM; Mitokondriyal dış zar bütünlüğünün testi. 2Ama, antimisin A 2.5 μM CIII'yi inhibe eder; rox'u seçin. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Substrat-inhibitör-birleştirici-titrasyon (SUIT) protokollerinde kullanılan kimyasallar. SV ve cV odaları için kısaltmalar ve stok çözelti konsantrasyonları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: 0.5 mL ve 2.0 mL odalarda R1-R0 ve J ° 1'in karşılaştırılması. Seri 2 (pce) ve 3'te (imt) ve TIP2k titrasyonlarından önce (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2.0 mL: N = 60). Verilerin ortalaması, deniz seviyesinde elde edilen Seri 1 (ce) verileri hariç, ortalama 94.9 kPa (Innsbruck, Avusturya) barometrik basınçta gerçekleştirilen deneysel Seri 2 (pce) ve 3'ten (imt) alınmıştır. 0.5 mL ve 2.0 mL odacıklarda aynı tip ancak farklı bireysel POS'lar kullanıldı. Bu nedenle, SV ve CV odalarını karşılaştırırken sensörler arasındaki değişkenlik dikkate alınmalıdır. 2.0 mL oda için deneysel olarak elde edilen J°1 = 2.26 ± 0.41 pmol∙s-1∙mL-1, hesaplanan değere yakın bir şekilde karşılık gelirken, 0.5 mL oda için deneysel J°1 = 8.48 ± 0.53 pmol∙s-1∙mL-1 beklenenden düşüktü. Bu, aşağıdaki gözlemlerle açıklandı. Odayı kapattıktan sonra, 0,5 mL'lik odadaki daha yüksek arka planO2 akısı, karşılaştırılabilir zaman aralıklarında ayarlanan J°1 işaretlerinde O2 konsantrasyonlarını düşürür (Şekil 1). J ° 1'deki oksijen konsantrasyonu, 0.5 mL ve 2.0 mL odasında hava doygunluğunun sırasıyla ortalama %4.06 ve %1.72 altındaydı (Ek Şekil 2, Ek Tablo 2). Daha düşük cO2'de, sensör tarafından azalan O2 tüketimi ve bir miktar O2 geri difüzyonu, deneysel olarak belirlenen J ° 1'i azaltır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 3: Kalibrasyon (R1) ve J°1'in elde edildiği oksijen konsantrasyonu [μM] ve bunların % farkı. Seri 2 (pce) ve 3'te (imt) ve TIP2k titrasyonlarından önce (0,5 mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2.0 mL: N = 60). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 4: 2.0 mL odasında ölçülen ve beklenen J ° 1. O2k serisi A (titanyum tıpalar13 ile), V = 2.0 mL (37 °C,O2 çözünürlük faktörü 0.92 ile NaCl çözeltisi; N = 52). nO2/Qe = 106/(96485.33·4) = 2.591 pmol∙μC-1 = 2.591 pmol∙s-1∙μA-1. O2 geri difüzyonunun cO 2,1'de ihmal edilebilir olduğu varsayımına dayanarak, bu sadece cO2,1 ~ cO2 * 'de geçerlidir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 5: Her bir enstrümantal O 2 arka plan testi için hesaplanan doğrusal regresyon kalıntıları (mutlak değerler [pmol O 2s-1∙mL-1]). Seri 2 (pce) ve 3'te (imt) ve TIP2k titrasyonlarından önce enstrümantal arka plan testlerinin bir araya getirilen verileri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Respirometri için mevcut numune miktarı, örneğin biyopsiler, birincil hücreler veya düşük hücre sayımlarına sahip yavaş büyüyen hücre kültürleri üzerinde yapılan çalışmalardasıklıkla sınırlıdır 1. Ayrıca, mitokondriyal yaralanmalar11 veya yağ asidi oksidasyonu12 gibi düşük kapasiteli mitokondriyal yolların araştırılması nedeniyle solunum aktiviteleri baskılanır. Bu durumlarda, düşük bir respirometrik oda hacmi,O2 akısının çözünürlüğü için avantajlar sunar. Bununla birlikte, enstrümantal arka planO2 akıları, daha düşük oda hacimlerinde artar ve güvenilir bir şekilde ölçülmediğinde veO2 konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak uygun şekilde düzeltilmediğinde hatalara neden olur. Enstrümantal O2 arka plan testlerinin ve arka plan düzeltmelerinin tekrarlanabilirliği, düşük oda hacimleri için özellikle önemlidir. Teorik (J ° R1) ve deneysel (J ° hava) O2 akısının neredeyse aynı değerleri, POS'un katot reaksiyonunda 4 e- / O2 ile polarografik ölçümün doğruluğu için kanıt sağlar. J ° R1 ve J ° air arasındaki fark, SV ve CV odasında sırasıyla 1.64 ± 0.43 ve 0.22 ± 0.31 pmol∙s-1∙mL-1 idi, bu da ölçümlerde 2.0 mL odasının (±1 pmol∙s-1∙mL-1) algılama sınırı içinde kalan bir kesinliği gösterir.28. 2.0 mL ve 0.5 mL odacıkta aynı tip polarografik oksijen sensörleri ile, hacme özgü arka plan O2 akısı, oda hacmine ters orantılı olarak 4 kat arttı ve değişkenlik iki oda hacminde neredeyse aynıydı, SD ile J ° hava için 0.5 ve 0.3 pmol∙s-1∙mL-1 ve sV ve cV'de J ° 50 için 0.9 ve 0.8 pmol∙s-1∙mL-1 oda, sırasıyla, (Tablo 2). Küçük hacimli haznenin tasarlandığı minimum solunum aktivitelerinde, küçük arka plan etkileri bile önemli hale gelir (Ek Tablo 3; Ek Şekil 2). Bu nedenle, uygun düzeltmeyi28 uygulamak için enstrümantal arka plan O2 akısının (Şekil 1) rutin değerlendirmesi gereklidir.

Homojen bir sistemi korumak ve kararlı bir oksijen sinyalini garanti etmek için ortamın yüksek ve sürekli karıştırılması gerekir. 2.0 mL'lik oda için 750 rpm'lik karıştırma hızı belirlenmiştir, ancak 0.5 mL'lik odacıkta optimum hız bilinmemektedir. Cam haznenin ve karıştırma çubuğunun farklı geometrileri (Tablo 2), optimum karıştırma hızının bağımsız bir değerlendirmesini gerektirir. Oksijen sensörleri, 550 rpm ile 950 rpm arasındaki karıştırma hızındaki değişikliklere, oda hacminden bağımsız olarak 750 rpm'de O2 sinyali R1'den küçük bir sapma ile yanıt verdi. Odacık sV için değerlendirilen üstel zaman sabiti τ, aynı karıştırma hızında13 2.0 mL oda için bildirilen τ ile uyumluydu. Bu sonuçlar, karıştırmanın her iki hazne geometrisinde de eşit derecede etkili olduğunu ve 750 rpm'lik (2,0 mL hazne) varsayılan karıştırma hızının 0,5 mL'lik hazneye uygulanabileceğini göstermektedir. Hem 'açık' hem de 'kapalı' oda konfigürasyonlarında, 0,5 mL'lik oda daha yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahipti, bu da 0,5 mL'lik odanın bir avantajı olarak daha yüksek doğruluk olduğunu düşündürüyor (Şekil 5), ancak bireysel POS değişkenliğinin etkisi göz ardı edilemez. Karıştırma hızı 750 rpm'den 550 rpm'ye düşürülürken gürültü artmadığından, 0,5 mL'lik haznede karıştırma hızını 550 rpm'ye düşürmek, sinyal-gürültü oranından ödün vermeden kesme gerilimini en aza indirmek için faydalı olabilir.

Uygun arka plan düzeltmesi uygulandığında üç deneysel modelde 0.5 mL ve 2.0 mL odalarında neredeyse aynı O2 tüketim oranları ölçüldü. Çapı 2 μm olan42 küçük trombositler, canlı ve geçirgen fibroblastlar ve izole mitokondri ile elde edilen sonuçlar, çok çeşitli hücre tiplerinde ve mitokondriyal preparatlarda 0.5 mL ve 2.0 mL odacıklarda tutarlı solunum hızlarının elde edilmesinin beklenebileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, geçirgenleşmiş kas lifleri bu çalışmada test edilmemiştir. Rox'un doğru ölçümü, oksijen seviyelerinin40 kontrolünün ve yüksek enstrümantal çözünürlüğün1 olmasını gerektirir. Hacme özgü O2 rox akısı, algılama sınırı kadar düşük olabilir. Bir deneyde düşük hücre sayıları veya genellikle düşük miktarda numune kullanıldığında yeniden oksijenlendirme gerekli değildir. Bununla birlikte, gerekirse,O2 akısının stabilizasyonu için gereken süre boyuncaO2 konsantrasyonunun hızlı bir şekilde düşmesini önlemek için düşükO2 akısı olan solunum durumlarında reoksijenasyonların yapılması önerilir. Yeniden oksijenasyonlardan sonra O2 akısının stabilizasyonu 0.5 mL odada daha uzun sürer.

Kalite kontrolüne bir katkı olarak, kısmi hacim değişimi sırasında numunenin süspansiyon halinde seyreltilmesine özellikle dikkat edilmelidir. Tam olarak yerleştirilmiş durdurucunun çıkarılmasından sonra, odadaki solunum ortamının toplam hacmi V', deneysel hacim V ve durdurucu kılcal hacim Vstc tarafından verilir (Tablo 2). Bu nedenle, stok hacmi V J.i, V'den daha büyük olan gerçek hacim V' içinde seyreltilir, bu da 0.5 mL ve 2.0 mL odalarda sırasıyla 0.5 / 0.54 = 0.926 ve 2.0 / 2.07 = 0.966'lık bir seyreltme faktörü V / V' ile sonuçlanır (Şekil 2). Trombositlerle yapılan deneylerde, 0.909'luk bir seyreltme faktörüne karşılık gelen 0.05 mL'lik bir kılcal ölü hacme sahip Chamber sV için bir prototip durdurucu kullanıldı.

0.5 mL'de, aynı numune konsantrasyonlarında (hacim başına miktar) 2.0 mL'lik odadan yaklaşık dört kat daha az miktarda canlı hücre, geçirgen hücre ve izole mitokondri gereklidir, bu da hücre sayısı veya protein kütlesi için normalleştirilmiş solunum O2 tüketiminin kantitatif olarak karşılaştırılabilir sonuçlarını verir. Bu, Chamber sV'nin mevcut numune miktarının sınırlı olduğu çalışmalar için değerli bir araç olduğunu göstermektedir. Öte yandan, aynı miktarda numunenin Hazne sV'de uygulanması, hacme özgü O2 akısını arttırır ve böylece solunum aktiviteleri düşük olduğunda ölçümlerin belirsizliğini azaltır.

Bu çalışmadaki oksijen rejimi, 30 μM ileO2 hava doygunluğu aralığı ile sınırlıydı. Bu aralığın ötesindeki oksijen seviyelerinde uygulanabilirlik, doku normoksisi veya hipoksi43'te mitokondriyal fonksiyonu ve hiperoksi9'da geçirgen dokuları araştırmak için daha fazla değerlendirme gerektirir. Oroboros NADH ve Q- Modüllerinin çeşitli çoklu sensör konfigürasyonları; pH, NO ve TPP+-elektrotlar10,44 - OdanınV'sine yerleştirilemez ve 2.0 mL'lik oda gerektirir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EL, Oroboros Instruments'ın bir çalışanıdır. EG, Oroboros Instruments'ın kurucusu ve CEO'sudur.

LFGS, proje süresince Oroboros Instruments tarafından istihdam edildi. EÅF ve EE, Oroboros Instruments ile ticari bir anlaşmaya sahip olan Abliva AB, Lund, İsveç'in çalışanlarıdır.

LR, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İzole mitokondri ile ilgili verileri topladığı için Manuela Passrugger'a, karıştırma dönüş hızının test edilmesinde teknik destek için Patrizia Guerth'e ve karıştırıcı testlerinden elde edilen zaman sabitinin analizi için Mateus Grings'e teşekkür ederiz. Ortağımız WGT Elektronik GmbH & Co KG, Kolsass, Avusturya'ya cam odalarının, tıpaların ve manyetik alan kuvvetinin teknik verileri hakkında bilgi için teşekkür ederiz. Luiza HD Cardoso, Alejandra Romero-Martinez, Ondrej Sobotka, Alba Timon-Gomez ve Jaime Willis'e yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı tarafından 859770 sayılı hibe sözleşmesi kapsamında NextGen-O2k projesi tarafından kısmen finanse edilmiştir. Kısa Vadeli Bilimsel misyonların (LFGS, LR) finansal desteği ile MitoEAGLE CA15203 COST Eylemine Katkı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anaconda3Anaconda Yazılım Dağıtımhttps://www.anaconda.com/yazılım
ADPMerck, Almanya117105
Antibiyotikler-antimikotikler 100xBiosera, FransaXC-A4110DİKKAT H317 Alerjik cilt reaksiyonuna neden olabilir
Antimisin ASigma-Aldrich, ABDA8674DİKKAT H300  Yutulması halinde ölümcül, H400 kısa süreli (akut) su tehlikesi 
AskorbatSigma-Aldrich, ABDA7631
ATPSigma-Aldrich, ABD&nbsp; A 2383
BSA yağ asidi içermeyenSigma-Aldrich, ABDA 6003sığır serum albümini
CaCO3< / sub>Sigma-Aldrich, ABDC 4830
CCCPSigma-Aldrich, ABDC2759karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon DİKKAT H301 + H311 + H331 Yutulduğunda, cilt ile temas ettiğinde veya solunduğunda toksiktir
Kontes Otomatik hücre sayacı Thermo Fisher Scientific, ABDAMQAX100
Sitokrom cSigma-Aldrich, ABDC7752
DatLab Oroboros Instruments, AvusturyaVersiyon 7.4Veri toplama ve analizi için yazılım
DatLab Oroboros Instruments, AvusturyaSürüm 8.1Veri toplama ve analizi için yazılım
DC Protein TestiBio-Rad, ABD5000112Protein tahlil kiti; DİKKAT H314 Ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olur
DigitoninSigma-Aldrich, ABDD5628DİKKAT H301 Yutulması halinde toksiktir
DithiothreitolSigma-Aldrich, ABDD 0632DİKKAT H318 Ciddi göz hasarına neden olur
DMEMPan Biotech, AlmanyaP04-05551Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta
DMSOSigma-Aldrich, ABDD2650dimetilsülfoksit
DPBSLonza Bioscience, İsviçreLONBE17-512FKalsiyum içermeyen Dulbecco' s fosfat tamponlu salin
EGTASigma-Aldrich, ABDE 4378
FBSThermo Fisher Scientific, ABDA5256701fetal sığır serumu
GlukozSigma-Aldrich, ABD&nbsp; G7528
Glutamat Sigma-Aldrich, ABDG1626
GliserofosfatSanta Cruz Biyoteknolojisc-215789
Heraeus Multifuge 3s BüyükThermo Fisher Scientific, ABDHM3Ssantrifüj
Hettich Rotina 380R Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Almanya1701santrifüj
İmidazolHoneywell Fluka, Avusturya56750DİKKAT H302 Yutulması halinde zararlıdır, H314 Ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olur, H360D Doğmamış çocuğa zarar verebilir
jamovi Jamovi projesiSürüm 2.3.13yazılımı
K+-MESSigma-Aldrich, ABDM 8250
Leucosep tüpü ve nbsp;Greiner Bio-One GmbH, AvusturyaZ642843-300EApolietilen bariyerli santrifüj tüpü
Malate Sigma-Aldrich, ABDM1000DİKKAT H319 Ciddi göz tahrişine neden olur.
MannitolSigma-Aldrich, ABDM 4125
MgCl2 Scharlau, İspanyaMA 0036
MiR05-KitOroboros Instruments, Avusturya60101-01mitokondriyal solunum ortamı
Mikser ve nbsp;Swelab Instruments, İsveç440Ssallanan masa
Mr. Frosty Dondurma KabıThermo Fisher Scientific, ABD5100-0001dondurma kabı
OroborosOroboros Instruments, AvusturyaNextGen-O2k ve O2k, ' Oroboros'un
Oroboros Odası cVOroboros Instruments, Avusturya23100-01Klasik Hacim Odası
Oroboros Odası sVOroboros Instruments, Avusturya33100-01Küçük Hacimli Oda
Oroboros TIP2k-ModülüOroboros Instruments, Avusturya11100-03Titrasyon-Enjeksiyon mikro Pompası
O2-Zero TozOroboros Instruments, Avusturya26600-02  Na-ditiyonit DİKKAT H251 Kendiliğinden ısınma: alev alabilir, H302 Yutulması halinde zararlıdır, H319 Ciddi göz tahrişine neden olur
oktanoilkarnitinBiotrend - APExBIO Teknolojisi, AlmanyaB6371
OligomisinSigma-Aldrich, ABDO4876
FosfokreatinSigma-Aldrich, ABDP 7936
PirüvatSigma-Aldrich, ABDP2256DİKKAT H317 Alerjik cilt reaksiyonuna neden olabilir
RotenoneSigma-Aldrich, USAR8875DİKKAT H300 Yutulması halinde öldürücüdür
Cilt fibroblast hücre hatları   ATCC, ABD
Sodyum azidSigma-Aldrich, ABDS2002DİKKAT H300 + H310 + H330 Yutulduğunda, cilt ile temas ettiğinde veya solunduğunda öldürücüdür
Subtilisin ASigma-Aldrich, ABDP 5380DİKKAT H318 - Ciddi göz hasarına yol açar, H334 - Solunması halinde alerji veya astım semptomlarına veya solunum güçlüğüne neden olabilir
SüksinatSigma-Aldrich, ABDS2378
SucroseSigma-Aldrich, ABDS 7903
Swelab Alfa kan hücresi sayacı Boule Diagnostics AB, İsveç1420041
Taurin Sigma-Aldrich, ABDT 0625
Tecan Sonsuz TM F200Tecan, İsviçrespektrofotometre
TMPDSigma-Aldrich, ABDT3134N,N,N',N'-Tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorür DİKKAT H315 Cilt tahrişine neden olur, H319 Ciddi göz tahrişine neden olur
TripsinSigma-Aldrich, ABDT4799DİKKAT H334 Solunması halinde alerji veya astım semptomlarına veya solunum güçlüğüne yol açabilir
VacuetteGreiner Bio-One GmbH, Avusturya15452520

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zdrazilova, L., Hansikova, H., Gnaiger, E. Comparable respiratory activity in attached and suspended human fibroblasts. PLoS ONE. 17 (3), e0264496(2022).
  2. Schöpf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nat Commun. 11 (1), 1487(2020).
  3. Meszaros, A. T., et al. The predictive value of graft viability and bioenergetics testing towards the outcome in liver transplantation. Transplant International. 37, 12380(2024).
  4. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 1782, 31-70 (2018).
  5. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
  6. Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci. 97 (20), 11080-11085 (2000).
  7. Gnaiger, E. Oxygen Conformance of Cellular Respiration. Hypoxia. Advances in Experimental Medicine and Biology. Roach, R. C., Wagner, P. D., Hackett, P. H. , Springer. Springer, Boston, MA. (2003).
  8. Harrison, D. K., Fasching, M., Fontana-Ayoub, M., Gnaiger, E. Cytochrome redox states and respiratory control in mouse and beef heart mitochondria at steady-state levels of hypoxia. J Appl Physiol. 119 (10), 1210-1218 (2015).
  9. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  10. Komlódi, T., Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Moore, A. L., Rich, P. R., Gnaiger, E. Coupling and pathway control of coenzyme Q redox state and respiration in isolated mitochondria. Bioenerg Commun. 2021.3, (2021).
  11. Suomalainen, A., Nunnari, J. Mitochondria at the crossroads of health and disease. Cell. 187 (11), 2601-2627 (2024).
  12. Cardoso, L. H. D., et al. Fatty acid β-oxidation in brain mitochondria: Insights from high-resolution respirometry in mouse, rat and Drosophila brain, ischemia and aging models. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871, 167544(2025).
  13. Gnaiger, E. Bioenergetics at low oxygen: dependence of respiration and phosphorylation on oxygen and adenosine diphosphate supply. Respir Physiol. 128 (3), 277-297 (2001).
  14. Gnaiger, E. Polarographic Oxygen Sensors, the Oxygraph and High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function. Mitochondrial dysfunction in drug-induced toxicity. Dykens, J. A., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 327-352 (2008).
  15. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. An Introduction to OXPHOS analysis. Bioenerg Commun. 2020.2, (2020).
  16. Diaz, E. C., Adams, S. H., Weber, J. L., Cotter, M., Børsheim, E. Elevated LDL-C, high blood pressure, and low peak VO₂ associate with platelet mitochondria function in children-The Arkansas Active Kids Study. Front Mol Biosci. 10, 1136975(2023).
  17. Ehinger, J. K., Morota, S., Hansson, M. J., Paul, G., Elmér, E. Mitochondrial dysfunction in blood cells from amyotrophic lateral sclerosis patients. J Neurol. 262 (6), 1493-1503 (2015).
  18. Heimler, S., et al. Platelet bioenergetics are associated with resting metabolic rate and exercise capacity in older adult women. Bioenerg Commun. 2022.2, (2022).
  19. Palacka, P., et al. Platelet mitochondrial bioenergetics reprogramming in patients with urothelial carcinoma. Int J Mol Sci. 23 (1), 388(2021).
  20. Fischer, C., et al. Mitochondrial respiration in response to iron deficiency anemia: Comparison of peripheral blood mononuclear cells and liver. Metabolites. 12 (3), 270(2022).
  21. JedIicka, J., et al. Impact of aging on mitochondrial respiration in various organs. Physiol Res. 71 (Suppl. 2), S227-S236 (2022).
  22. Westerlund, E., et al. Correlation of mitochondrial respiration in platelets, peripheral blood mononuclear cells and muscle fibers. Heliyon. 10 (5), e26745(2024).
  23. Hütter, E., Renner, K., Pfister, G., Stöckl, P., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Senescence-associated changes in respiration and oxidative phosphorylation in primary human fibroblasts. Biochem J. 380 (3), 919-928 (2004).
  24. Yépez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), e0199938(2018).
  25. Gnaiger, E. Bioenergetic cluster analysis - mitochondrial respiratory control in human fibroblasts. MitoFit Preprints. 2021.8, (2021).
  26. Palmer, J., Tandler, B., Hoppel, C. Biochemical properties of subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria isolated from rat cardiac muscle. J Biol Chem. 252, 8731-8739 (1977).
  27. Lai, N. M., Kummitha, C., Rosca, M. G., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. L. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol. 225 (2), e13182(2019).
  28. Baglivo, E., Cardoso, L. H., Cecatto, C., Gnaiger, E. Statistical analysis of instrumental reproducibility as internal quality control in high-resolution respirometry. Bioenerg Commun. 2022.8, (2022).
  29. Mela, L., Seitz, S. Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue. Methods Enzymol. 55, 39-46 (1979).
  30. Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Gnaiger, E. Magnesium Green for fluorometric measurement of ATP production does not interfere with mitochondrial respiration. Bioenerg Commun. 2021.1, (2021).
  31. Gnaiger, E. The elementary unit — count and numbers in the International System of Units. BEC preprints. , (2025).
  32. Vernerova, A., et al. Mitochondrial respiration of platelets: Comparison of isolation methods. Biomedicines. 9 (12), 1859(2021).
  33. Oroboros Instruments SUIT-003 O2 ce-pce D018. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-003_O2_ce-pce_D018 (2024).
  34. Oroboros Instruments SUIT-001 O2 ce-pce D004. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-001_O2_ce-pce_D004 (2024).
  35. Timón-Gómez, A., et al. Bioenergetic profiles and respiratory control in mitochondrial physiology: Precision analysis of oxidative phosphorylation. Exp Physiol. , 1-33 (2025).
  36. Oroboros Instruments SUIT-002 O2 ce-pce D007. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_ce-pce_D007 (2024).
  37. Oroboros Instruments SUIT-002 O2 mt D005. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_mt_D005 (2024).
  38. The Jamovi Project jamovi (Version 2.3.13). , https://www.jamovi.org/ (2024).
  39. Gnaiger, E. Preface: A biologist´s view. Polarographic Oxygen Sensors. Aquatic and Physiological Applications. Gnaiger, E., Forstner, H. , Berlin, Heidelberg, New York. Springer. V-VII (1983).
  40. Hütter, E., Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption. Mol Biol Rep. 29 (1/2), 83-87 (2002).
  41. Oroboros Instruments Cell count and normalization in HRR. , https://wiki.oroboros.at/index.php/Cell_count_and_normalization_in_HRR (2020).
  42. Williams, O., Sergent, S. R. Histology Platelets. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2022).
  43. Donnelly, C., et al. The ABC of hypoxia - what is the norm. Bioenerg Commun. 2022.12.V2, (2022).
  44. Aguirre, E., Rodríguez-Juárez, F., Bellelli, A., Gnaiger, E., Cadenas, S. Kinetic model of the inhibition of respiration by endogenous nitric oxide in intact cells. Biochim Biophys Acta. 1797 (5), 557-565 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Oksijen Ak s l mMitokondriyal FonksiyonSubstrat Ayr t r c nhibit r TitrasyonuOroboros Respirometri CihazArka Plan Oksijen D zeltmesiCanl H cre Solunumuzole MitokondrilerTrombosit Solunumu

İlgili makaleler