Yöntem makalesi

Yetişkin Zebra Balıklarında Optimize Edilmiş İntravenöz Enjeksiyon

2.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67463

⸱

20 Aralık 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, School of Clinical Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2ZeBlast Technology Limited, Hong Kong Science Park, 3Centre for Oncology and Immunology, Hong Kong Science Park

Bu makalede

Özet

Burada, yetişkin zebra balıklarına hücrelerin veya farmakolojik ajanların intravenöz enjeksiyonu için optimize edilmiş ve etkili bir protokol sunuyoruz, bu da hücre aşılamasının artmasına ve tedavi edilen zebra balığının hayatta kalma oranlarının artmasına neden oluyor.

Özet

İntravenöz (IV) enjeksiyon, memeli araştırma modellerinde maddelerin sistemik olarak verilmesini sağlamak için en etkili ve yaygın olarak kullanılan yöntem olarak yaygın olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, yetişkin zebra balıklarında ilaç dağıtımı, kök hücre nakli ve rejeneratif ve kanser çalışmaları için uygulanması, küçük vücut boyutları ve karmaşık kan damarlarının yarattığı zorluklar nedeniyle sınırlı kalmıştır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, geçmişte yetişkin zebra balıklarında kök hücre nakli için intrakardiyak ve retro-orbital (RO) enjeksiyon gibi alternatif enjeksiyon teknikleri araştırılmıştır. Bununla birlikte, bu tekniklerin, titiz enjeksiyon tekniklerine duyulan ihtiyaç veya artan mortalite riski dahil olmak üzere dezavantajları vardır.

Bu çalışmada, benzersiz anatomileriyle ilgili zorlukları ele alan, yetişkin zebra balıklarına özel olarak uyarlanmış rafine ve optimize edilmiş bir IV enjeksiyon prosedürü geliştirdik. Bu tekniğin etkinliğini göstermek için, Tg (mpo: EGFP) balıklarından tüm böbrek iliği hücrelerinin ve FITC-dekstran boyasının yetişkin Casper balıklarına başarılı IV enjeksiyonları gerçekleştirdik. Enjekte edilen hücrelerin ve boyaların bir floresan mikroskobu kullanılarak daha sonra görselleştirilmesi, zebra balığı içinde başarılı bir şekilde verildiklerini ve aşılandıklarını doğruladı. Ayrıca, intrakardiyak ve RO enjeksiyonları ile karşılaştırıldığında, IV enjeksiyonunun tedavi edilen zebra balıklarında hayatta kalma oranlarının ve aşılama verimliliğinin artmasına neden olduğunu gösterdik. Bu yaklaşım, maddelerin hassas bir şekilde verilmesini ve lokalizasyonunu sağlar ve yetişkin zebra balığı kullanılarak büyük ölçekli ilaç ve kimyasal tarama için büyük bir potansiyele sahiptir. Ek olarak, enjekte edilen hücreleri ve boyaları görsel olarak izleme yeteneği, bunların aşılanması, göçü ve konakçı dokularla etkileşimleri hakkında paha biçilmez bilgiler sağlayarak, zebra balığı modellerinde terapötik etkilerin ve biyolojik süreçlerin daha kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Giriş

Zebra balığı (Danio rerio), insan genlerinin %70'inden fazlasının zebra balığı muadillerine sahip olmasıyla, öncelikle insanlara olan genetik benzerliği nedeniyle biyomedikal araştırmalarda değerli bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır 1,2. Bu genetik benzerlik, zebra balığının kompakt boyutu, hızlı gelişim döngüsü ve kapsamlı genetik manipülasyon kapasitesi ile birleştiğinde, onu bilimsel keşif için güçlü bir araç haline getiriyor. Bu özellikler, hücre nakli, ilaç dağıtımı ve hücre izlemeyi içeren deneyler için özellikle avantajlıdır. Ayrıca, şeffaf larvaların ve Casper zebra balığı gibi spesifik pigmentasyon mutantlarının optik berraklığı, nakledilen hücrelerin veya maddelerin hassas bir şekilde görselleştirilmesine olanak tanıyarak geleneksel hayvan modellerine daha verimli ve uygun maliyetli bir alternatif sunar.

Zebra balığı, kanser nakli modelleri geliştirmek ve gliom, melanom, pankreas tümörleri ve lösemi gibi ciddi hastalıklar için ilaç taramaları yapmak için yaygın olarak kullanılmaktadır 3,4,5,6,7,8,9,10. Tipik olarak, bu modeller, larvaların olgunlaşmamış bağışıklık sisteminden ve doğal şeffaflığından yararlanmak için larva aşamasında başlatılır, bu da enjeksiyon sürecini basitleştirir ve kısa süreli çalışmaların fizibilitesini artırır. Bununla birlikte, larvaların kullanılması, aşılama ve terapötik müdahalelerin değerlendirilmesi için süreyi sınırlar 7,11. Bu deneysel protokollerin yetişkin zebra balıklarına geçişi, daha karmaşık enjeksiyon prosedürleri, düşük aşılama verimliliği, daha yüksek ölüm oranları ve bireysel tepkilerde artan değişkenlik gibi zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu zorluklar, özellikle uzun gözlem süreleri gerektiren yetişkin zebra balıklarını içeren çalışmalar için, gelişmiş enjeksiyon ve madde verme tekniklerine olan kritik ihtiyacı vurgulamaktadır.

Tarihsel olarak, intrakardiyak12 ve retro-orbital (RO) enjeksiyonlar13, yetişkin zebra balıklarında ilaç dağıtımı ve hücre nakli için birincil yöntemler olmuştur. Maddelerin doğrudan kalbe enjekte edilmesini içeren intrakardiyak enjeksiyon, ilaçların hemen sistemik dolaşımını sağlar, ancak potansiyel kardiyak yaralanma ve yüksek mortalite dahil olmak üzere önemli risklerle ilişkilidir. Öte yandan, materyalleri gözün arkasındaki venöz sinüse ileten RO enjeksiyonu da hızlı sistemik dağılımı teşvik eder, ancak balıklar için stresli olabilir ve uygulamada yüksek hassasiyet gerektirir14. Farelerde ve sıçanlarda sistemik madde dağıtımı için iyi bilinen IV enjeksiyonları, bu modellerde farmakokinetik çalışmalar, ilaç etkinlik değerlendirmeleri ve terapötik müdahaleler için çok önemlidir 15,16,17,18. Son zamanlarda, zebra balığı araştırmalarında, özellikle larva zebra balıklarında doğuştan gelen bağışıklık tepkileri19,20 ve akut böbrek hasarı21 çalışmalarında IV enjeksiyonları önem kazanmıştır. Bununla birlikte, yetişkin zebra balıklarındaki uygulamaları sınırlı kalmaktadır.

Bu çalışmada, hayatta kalma oranlarını, hassasiyeti ve teslimat verimliliğini önemli ölçüde artıran, yetişkin zebra balıkları için özel olarak tasarlanmış bir IV enjeksiyon prosedürü geliştirdik ve optimize ettik. Bu yöntemi görsel olarak gösteriyoruz ve bu rafine tekniği kullanarak ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Tg (mpo: EGFP) balıklarından ve FITC-dekstran boyasından elde edilen tüm böbrek iliği (WKM) hücrelerinin IV enjeksiyonlarını yetişkin Casper balıklarına başarıyla uyguladık ve floresan mikroskobu ile değerlendirilen doğum ve aşılama onayı ile uygulandı. Bulgularımız, rafine IV enjeksiyon tekniğinin geleneksel intrakardiyak ve RO yöntemlerine kıyasla daha verimli ve tutarlı olduğunu göstermektedir. Zebra balığının bilimsel araştırmalarda kullanımı genişlemeye devam ettikçe, bu geliştirilmiş IV enjeksiyon tekniğinin benimsenmesi, hastalık patogenezi anlayışımızı geliştirecek ve yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesini hızlandıracaktır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Hong Kong Üniversitesi'ndeki (HKU) Laboratuvar ve Araştırma Hayvanları Kullanım Komitesi (CULATR) tarafından onaylandı.

1. Enjeksiyon malzemesinin hazırlanması

  1. Hücre süspansiyon ortamını hazırlayın: 0.9x PBS +% 5 fetal sığır serumu (FBS) +% 1 penisilin / streptomisin (Kalem / Strep).
  2. Hamilton şırıngasını ve takılı iğneyi (34 G, 10 mm uzunluk, 10 μL kapasite, Malzeme Tablosuna bakınız) 270-280 nm dalga boyuna sahip UV ışığı altında sterilize edin ve öğeleri 2 saat boyunca maruz bırakın.
  3. Sterilize edilmiş pamuklu çubuklar, köpük pedler ve kağıt mendil hazırlayın.
  4. Trikiyi sterilize edilmiş balık suyuyla 0.2 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyrelterek anestezi karışımını hazırlayın.
  5. Casper balıklarında WKM hücrelerinin nakli için, transplantasyondan 2 gün önce, her biri 12.5 Gy'lik iki seansa bölünmüş, aynı gün dozlar arasında 7-8 saatlik bir aralıkla verilen 25 Gy'lik bir subletal ışınlama dozu uygulayın. Işınlama işlemi için, 5-10 yetişkin balığı balık suyu içeren 100 mm'lik bir Petri kabına koyun ve bir gama ışınlayıcıya maruz bırakın.
    NOT: Casper balıklarını 30 gün boyunca izlenen 35 Gy'ye kadar çeşitli ışınlama seviyelerine maruz bıraktıktan sonra hayatta kalma analizine dayalı olarak dozun öldürücü olmadığı belirlenmiştir (Şekil 1A). Tam maruz kalma süresi, ışınlayıcının ayarlarına göre kalibre edilmelidir. Sadece ilaç verilmesini içeren işlemler için ışınlamaya gerek yoktur.
  6. Enfeksiyonları önlemek ve enjeksiyon sonrası balıklar için güvenli bir iyileşme ortamı sağlamak için tedavi edilmiş balıkları barındırmaya yönelik balık suyunu sterilize etmek için bir laboratuvar otoklav buhar sterilizatörü kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Sterilizasyon işlemi, kullanılan özel otoklav ünitesine göre uyarlanmıştır ve balık suyunu hazırlamak için üreticinin sıvı çözeltileri otoklavlama yönergelerine bağlı kalıyoruz.
  7. İğne yıkama tamponu hazırlayın: 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde birkaç tüp% 75 etanol ve ultra saf su.
  8. FITC-Dekstran'i (Molekül Ağırlığı: 10.000) önceden hazırlanmış hücre süspansiyon ortamında (% 5 FBS ve% 1 Pen / Strep ile 0.9x PBS) çözerek transplantasyon tamponu hazırlayın. Konsantrasyonu 100 μg/mL'ye ayarlayın.
    NOT: Bu tampon, balık başına 2 μL planlanan hacimle enjeksiyonlar için kullanılacaktır.

2. Transplantasyon için tüm böbrek iliğinin hazırlanması

  1. Gerekli sayıda Tg (mpo: EGFP) balığı 0.4 mg / mL trikat çözeltisine batırarak ötenazi yapın ve operküler hareketin kesilmesini takiben en az 10 dakika boyunca çözelti içinde kalmalarını sağlayın.
  2. Böbrek iliğini (KM) daha önce tarif edildiği gibi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü içinde hücre süspansiyon ortamına izole etmek ve aktarmak için Tg (mpo: EGFP) balığını inceleyin22.
  3. Süspansiyonu 40 μm'lik bir naylon hücre süzgecinden pipetleyerek ve filtreleyerek KM hücrelerini ayırın.
  4. Süspansiyonu 500 × g'da 8 dakika santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı atın ve peleti 500 μL hücre süspansiyon ortamında yeniden süspanse edin.
  6. Hücre süspansiyonunun 10 μL'lik bir alikotu olan otomatik bir sayaç kullanarak hücreleri sayın.
  7. 500 × g'da tekrar 8 dakika santrifüjleyin.
  8. Transplantasyon tamponunu kullanarak hücre konsantrasyonunu 150.000 hücre / μL'ye ayarlayın.

3. Enjeksiyon prosedürü

  1. Enjeksiyondan önce Hamilton şırıngasını 3-4x'i %75 etanol ile iyice yıkayın. Etanol kalıntısını gidermek için şırıngayı 3-4x ultra saf suyla durulayın.
  2. Zebra balıklarına, tamamen uyuşturulana kadar anestezi karışımına daldırarak anestezi uygulayın, bu da hareketin azalması ve refleks tepkilerinin kaybı ile kanıtlanmıştır. Balıklar sakinleştirildikten sonra, sırt tarafları yukarı bakacak ve başları sola bakacak şekilde konumlandırın (Şekil 1B). Balıkları dikkatlice temiz, nemli kağıt mendil üzerine koyun, bu da onları enjeksiyon için stabilize etmeye yardımcı olacaktır. Balığın kurumasını önlemek için dokunun yeterince nemli olduğundan, ancak kaymaya neden olacak kadar ıslak olmadığından emin olun.
  3. Hamilton şırıngasını sıkıca kavrayın ve çevredeki dokulara verilen zararı en aza indirirken etkili bir şekilde hedeflemek için iğneyi birincil damara (kaudal damar) ~ 45 ° açıyla açın. Capser zebra balığı için, doğru iğne yerleşimi için damarın yarı saydam gövdesinden görülebilen bir bölümünü hedefleyin (Şekil 1B). Pigmentli deriye sahip vahşi tip zebra balığı (Tübingen, TU) için, birincil damarların bulunduğu bölgede, vücut ekseni boyunca ve anüsün arkasında bulunan birincil damarları hedefleyin (Şekil 1B). İğneyi belirlenen kaba nazikçe ve düzgün bir şekilde yerleştirin, stresi en aza indirmek için enjeksiyonu (2 μL) yavaşça uygulayın, maddenin en iyi şekilde alınmasını sağlayın ve enjeksiyondan sonra herhangi bir kanamayı kontrol etmek için bir pamuklu çubukla bölgeye 10 saniye boyunca hafif bir baskı uygulayın.
  4. Enjeksiyonun etkinliğini sağlamak için GFP sinyallerinin varlığını doğrulamak için mikroskop altında gözlemleyin. Hücrelerin veya boyaların damar içinde yeşil sinyaller olarak göründüğünü onaylayın (Şekil 2A).
  5. Enjeksiyondan sonra balığın taze sterilize edilmiş balık suyunda statik bir tanka aktarılana kadar 10 dakika iyileşmesine izin verin.
  6. Farklı reaktiflerin enjeksiyonları arasında iğneyi daha önce tarif edildiği gibi temizleyin.
  7. Hücre topaklanmasını önlemek için, hücreleri yeniden askıya almak için hücre süspansiyonunu her 10 dakikada bir hafifçe vurun.
  8. Tedavi süresi boyunca statik su koşulları altında 4 L'lik bir tankta en fazla 15 nakledilen balık bulundurun. Alternatif olarak, nakledilen balıkları ayrı ayrı 1 L'lik statik tanklarda barındırın. Depoyu bir oksijen pompası ile donatın ve enfeksiyon riskini en aza indirmek için günlük su değişimleri yapın.
  9. Aşılama oranını değerlendirmek için transplantasyondan yaklaşık 14 gün sonra balıklarda akış sitometrisi ile GFP ekspresyonunu izleyin ve değerlendirin. Hayatta kalma oranlarını doğru bir şekilde hesaplamak için balıkların günlük ölüm oranını kaydedin. Aşılama analizi için tek yönlü ANOVA ve sağkalım analizi için Log-rank testi gerçekleştirin.

Sonuçlar

Yetişkin Casper balıklarında farklı enjeksiyon yöntemlerinin etkinliğini ve hassasiyetini değerlendirmek için intrakardiyak, RO ve IV teknikleri kullanılarak karşılaştırmalı bir analiz yapılmıştır (Şekil 2A). Tg (mpo: EGFP) balıklarından değişen miktarlarda WKM hücreleri enjekte edildi, her biri 1 × 105 ve 3 × 105 hücre konsantrasyonlarında FITC-dekstran boya ile karıştırıldı. Her yöntemin başarısı, enjeksiyon sonrası GFP sinyal varlığının anında mikroskobik değerlendirmesi ile belirlendi. Sonuçlar, yöntemler arasında teslimat başarısında önemli farklılıklar olduğunu ortaya koydu. IV enjeksiyon yöntemi, 43 balığın 41'inde tespit edilen GFP sinyalleri ile en yüksek etkinliği göstermiştir. Buna karşılık, RO yöntemi sınırlı başarı gösterdi ve 37 balıktan sadece 3'ünde başarılı enjeksiyonlar gözlendi. İntrakardiyak yöntemle 40 balıktan 11'inde başarılı bir şekilde doğum yapılmıştır (Şekil 2A). Nakledilen balığın hayatta kalması da izlendi. RO ve intrakardiyak yöntemlerle enjekte edilen balıklar, intravenöz olarak enjekte edilenlere kıyasla önemli ölçüde daha düşük sağkalım oranlarına sahipti (Şekil 2B). Özellikle, enjekte edilen hücre sayısı, IV enjekte edilen balıklar arasındaki hayatta kalma oranlarını etkiledi ve alıcılar daha iyi sağkalım gösteren 3 × 105 hücre aldı. Bu bulgular, IV enjeksiyon yönteminin yetişkin zebra balıklarına hücre ve madde vermedeki üstün etkinliğini ve güvenilirliğini vurgulamaktadır.

Alıcı Casper balığındaki WKM hücrelerinin aşılama verimliliği, nakledilen hücrelerden gelen GFP sinyalinin izlenmesiyle kapsamlı bir şekilde değerlendirildi. IV enjeksiyonları alan balıklarda, GFP sinyalleri transplantasyondan sonraki üçüncü gün kadar erken bir tarihte tespit edilebildi (Şekil 2C), bu da hızlı ve etkili bir aşılama sürecini gösteriyor. Buna karşılık, RO ve intrakardiyak enjeksiyonlar uygulanan balıklar, daha yavaş bir aşılama oranına işaret eden gecikmiş bir GFP sinyali ortaya çıkma gösterdi. Transplantasyondan sonraki 17. günde, nakledilen hücreler ağırlıklı olarak böbrek iliğini yeniden doldurmuştu ve en belirgin GFP sinyalleri IV enjekte edilen balıklarda gözlendi (Şekil 2C). Alıcılardan alınan KM'nin akış sitometrik analizi, IV enjeksiyon yönteminin etkinliğini daha da vurguladı. Başlangıçta intravenöz olarak 3 × 105 hücre enjekte edilen alıcılarda, KM'deki hücrelerin yaklaşık% 18'i GFP pozitifti, bu oran herhangi bir transplantasyon geçirmemiş donör Tg (mpo: EGFP) balığının böbrek iliğinde bulunana benzer bir orandı (Şekil 2D, E). Buna karşılık, intrakardiyak enjeksiyon yaklaşık% 5 GFP pozitif hücrelerle sonuçlanırken, RO yöntemi alıcıların böbrek iliğinde sadece% 2 GFP pozitif hücreler verdi. Ek olarak, aşılama oranı, enjekte edilen hücre sayısı ile pozitif korelasyon gösterdi ve bu da daha yüksek hücre dozlarının daha fazla aşılamaya yol açtığını gösterdi. Bu sonuçlar, hücre engraftasyonunu ve ardından böbrek iliğinin yeniden popülasyonunu kolaylaştırmada IV enjeksiyon tekniğinin sağlamlığını doğrulamaktadır.

figure-results-1
Şekil 1: Yetişkin zebra balıklarında ışınlama ve intravenöz enjeksiyon sonrası sağkalım sonuçları. (A) Casper balığı 35 Gy'ye kadar ışınlamaya maruz bırakıldı ve 30 gün boyunca sağkalımı izledi, bu da 25 Gy'yi subletal bir dozaj olarak doğruladı (tüm gruplar için n = 10). (B) Hem Casper hem de TU zebra balığı için enjeksiyon bölgelerini gösteren şematik diyagramlar ve başarılı bir şekilde enjekte edilen balık örnekleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Yetişkin zebra balıklarında retro-orbital, intrakardiyak ve intravenöz enjeksiyonların karşılaştırılması. (A) Yetişkin zebra balıklarında RO, intrakardiyak ve IV enjeksiyon yöntemlerinin şematik gösterimleri ve temsili sonuçları. Sağ alt köşedeki sayılar, her bir yöntem için denenen toplam sayıya göre başarılı bir şekilde enjekte edilen veya yanlış enjekte edilen balıkların sayısını gösterir, GFP sinyali enjeksiyondan hemen sonra floresan mikroskop altında doğrulanmıştır. (B) Farklı enjeksiyon yöntemleriyle farklı sayıda donör böbrek iliği hücresi ile nakledildikten sonra alıcıların genel sağkalımı (IV-100K: n = 24; İntrakardiyak-100K: n = 10; RO-100K: n = 12; IV-300K: n = 20; İntrakardiyak-300K: n = 6; RO-300K: n = 8). (C) RO, intrakardiyak ve IV enjeksiyon yöntemleri ile transplantasyon sonrası alıcılarda engraftman etkinliğinin gözlenmesi (D) Transplantasyondan 17 gün sonra alıcıların KM'sindeki GFP pozitif hücreler için temsili akış sitometrisi grafiği. (E) Transplantasyondan 17 gün sonra alıcıların KM'sindeki ve ayrıca ışınlama yapılmayan donör Tg(mpo:EGFP) balıklarının KM'sindeki GFP+ hücrelerinin yüzdesi (IV-100K: n = 30; İntrakardiyak-100K: n = 28; RO-100K: n = 22; IV-300K: n = 22; İntrakardiyak-300K: n = 26; RO-300K: n = 18). Veriler s.e.m. ± ortalamadır. D için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) uygulandı. B için Log-Rank testi yapıldı. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Ölçek çubukları = 1 mm (A, C). Kısaltmalar: RO = retro-orbital; IV = intravenöz; GFP = yeşil floresan proteini; KM = böbrek iliği; SSC-A = yan saçılma-tepe alanı; FITC-A = floresein izotiyosiyanat-tepe alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışmada, hücrelerin veya ilaçların verilmesinin hassasiyetini ve tutarlılığını artırmak için yetişkin zebra balığı için özel olarak hazırlanmış bir IV enjeksiyon protokolü geliştirdik. Bu yöntemin kritik bir unsuru, maddelerin doğru bir şekilde uygulanması için çok önemli olan birincil damarı lokalize etme ve görselleştirme yeteneğidir. Optimum gemi görünürlüğü için yarı saydam Casper zebra balığı türü tavsiye edilirken, protokolümüz, görünürlük ve doğruluk için uygun ayarlamaların yapılması koşuluyla çeşitli yetişkin zebra balığı türleriyle kullanım için uyarlanabilir. Vasküler hasarı en aza indirmek ve etkili madde taşınmasını sağlamak için uygun bir iğne ölçerin seçilmesi çok önemliydi. Ayrıca, temiz ve iyi oksijenli suyun korunması da dahil olmak üzere kapsamlı enjeksiyon sonrası bakıma öncelik verildi. Bu uygulamalar sadece enjeksiyon sürecini kolaylaştırmakla kalmadı, aynı zamanda zebra balığının sağlığını ve hayatta kalmasını önemli ölçüde iyileştirdi, böylece daha güvenilir ve tekrarlanabilir deneysel sonuçlara yol açtı.

Ayrıca, yetişkin zebra balıklarında intrakardiyak, RO ve IV enjeksiyon tekniklerinin karşılaştırmalı bir analizini yaptık ve IV yönteminin hayatta kalma oranlarını artırmada ve hücre aşılamasını teşvik etmede belirgin avantajlarını gösterdik. Geleneksel kullanımlarına rağmen, intrakardiyak enjeksiyonlar yüksek mortalite oranları13 ile bağlantılıdır ve etkili RO enjeksiyonları için gereken hassasiyetin tutarlı bir şekilde elde edilmesi zordur14. IV tekniğinin minimal invaziv doğası, balıklardaki stresi ve fiziksel travmayı önemli ölçüde azaltır ve enjeksiyon sonrası hayatta kalma ve aşılama sonuçlarında önemli ölçüde iyileşmeye yol açar. Ek olarak, IV enjekte edilen balıklarda transplantasyondan sonraki 3. güne kadar GFP sinyallerinin hızlı bir şekilde tespit edilebilirliği, yöntemin etkili hücre aşılamasını kolaylaştırmadaki etkinliğini daha da vurgulamaktadır. Buna karşılık, intrakardiyak enjeksiyonlu balıklarda GFP sinyallerinin daha yavaş ortaya çıkması ve RO enjekte edilen balıklarda sinyallerin neredeyse hiç olmaması, bu alternatif yöntemlerin sınırlamalarının altını çizerek IV yaklaşımını daha etkili bir yaklaşım olarak düşündürmektedir.

IV enjeksiyon yöntemi önemli avantajlar sunarken, yüksek hassasiyet elde etmek için özel ekipman ve eğitim ihtiyacı gibi potansiyel sınırlamaları vardır. Ayrıca, Casper suşunun yarı saydamlığı damar görselleştirmeyi kolaylaştırırken, bu yöntemi daha az yarı saydam suşlara uyarlamak ek görünürlük ve teknolojik geliştirmeler gerektirebilir. Ek olarak, IV enjeksiyonların uzun vadeli etkilerini değerlendirmek ve zebra balıklarında uzun süreler boyunca aşılanmış hücrelerin stabilitesini değerlendirmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır, bu da bu tekniğin sürdürülebilir başarısını ve güvenliğini doğrulamak için çok önemli olacaktır.

IV enjeksiyon tekniğinin, maddeleri kan dolaşımına iletmede ve yetişkin zebra balıklarında yüksek aşılama seviyelerine ulaşmadaki etkinliği, gelecekteki araştırmalar için çeşitli etkilere sahiptir. Bu yöntem, yetişkin zebra balıklarının uzun süreli çalışmalarda daha etkili kullanılmasını sağlayarak larva modelleriyle ilişkili bazı sınırlamaları ele alır. IV yönteminin güvenilirliği, karmaşık hastalıkları incelemek ve ilaç taramaları yapmak için modellerin doğruluğunu arttırır ve potansiyel olarak terapötik stratejilerde önemli ilerlemelere yol açar. Ek olarak, IV enjeksiyonların sağlam aşılama elde etmedeki başarısı, genetik bozuklukların ve bağışıklık tepkilerinin araştırılması için gerekli olan genetik manipülasyon ve transplantasyonda daha fazla araştırma için güçlü bir temel oluşturur. Bu IV enjeksiyon protokolündeki ilerlemeler, zebra balığı araştırmalarına önemli katkılar sağlamaya, biyomedikal araştırmalar için araçları iyileştirmeye ve insan hastalıklarını anlama ve tedavi etmedeki ilerlemeyi hızlandırmaya hazırdır.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Hong Kong Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp Araştırma Merkezi'nden (CCMR) Zebra Balığı Tesisine teşekkür ederiz. Hayvanlara yaptığı yardım için Bayan Jo Yiu Ling Wong'a teşekkür ederiz. Çalışmalar, Temaya Dayalı Araştırma Programı (T12-702/20-N), 08192066 ve 08193106 No'lu Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu Projeleri, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC)/Araştırma Hibeleri Konseyi (RGC) Ortak Araştırma Programı 2021/22 N_HKU745/21, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge programı (2023YFA1800100) ve İnovasyon ve Teknoloji Komisyonu tarafından finanse edilen Health@InnoHK Girişimi kapsamında Onkoloji ve İmmünoloji Merkezi tarafından desteklenmiştir. Hong Kong ÖİB Hükümeti, Çin (A.Y.H.L.).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Otoklavlar Buharlı SterilizatörHIRAYAMA HRG-140
Santrifüj 5424Eppendorf
Kontes 3 Otomatik Hücre SayacıThermofisher
Kontes II FLInvitrogen
Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Trikain)Sigma-aldrichMKCL9483
Falcon 40 & mikro; m Hücreli SüzgeçCORNINGMavisi, Steril, Ayrı Ayrı Paketlenmiş, 50/Kutu
FBS, NitelikliGibco26140079
FITC-Dextran (MW 10000) MedChemExpress60842-46-8
Enjeksiyon iğnesiHamilton ve nbsp;HAMI20743434 G, 10 mm uzunluk
Mikro şırıngaHamilton 7635-01 10 ve mikro; L kapasite, Model 701 RN
Nikon SMZ18
PBS pH 7.4 (1x)Gibco10010023
Penisilin-Streptomisin (5.000 U/mL)Gibco ve ticaret;15070063100x
Pipet UçlarıEppendorf epTIPS
Tek KanallıPipet Eppendorf 05-403-151
UltraPure Distile Suİnvitrojen10977015

Kaynaklar

  1. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  2. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  3. Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 36 (1), 160(2017).
  4. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Dis Model Mech. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  5. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
  6. Etchin, J. P. K. J., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods Cell Biol. 105, 309-337 (2011).
  7. Khan, N., Mahajan, N. K., Sinha, P., Jayandharan, G. R. An efficient method to generate xenograft tumor models of acute myeloid leukemia and hepatocellular carcinoma in adult zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 75, 48-55 (2019).
  8. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
  9. He, B. L., et al. Functions of flt3 in zebrafish hematopoiesis and its relevance to human acute myeloid leukemia. Blood. 123 (16), 2518-2529 (2014).
  10. Wang, D., et al. Transgenic IDH2(R172K) and IDH2(R140Q) zebrafish models recapitulated features of human acute myeloid leukemia. Oncogene. 42 (16), 1331(2023).
  11. Fan, R. Y., et al. Zebrafish xenograft model for studying mechanism and treatment of non-small cell lung cancer brain metastasis. J Exp Clin Cancer Res. 40 (1), 371(2021).
  12. LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J Vis Exp. (2), e159(2007).
  13. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), e1645(2009).
  14. Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660(2017).
  15. Hilligan, K. L., et al. Intravenous administration of BCG protects mice against lethal SARS-CoV-2 challenge. J Exp Med. 219 (2), e20211862(2022).
  16. Moreo, E., et al. Intravenous administration of BCG in mice promotes natural killer and T cell-mediated antitumor immunity in the lung. Nat Commun. 14 (1), 6090(2023).
  17. Wang, Z., et al. Intravenous administration of IL-12 encoding self-replicating RNA-lipid nanoparticle complex leads to safe and effective antitumor responses. Sci Rep. 14 (1), 7366(2024).
  18. Saleem, M., et al. A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents. J Vis Exp. (146), e59295(2019).
  19. Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and Intravenous Microinjections in the Larval Zebrafish to Assess Innate Immune Response. Bio Protoc. 11 (7), e3978(2021).
  20. van Soest, J. J., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunol. 12, 58(2011).
  21. Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J Vis Exp. (42), e2079(2010).
  22. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. (54), e2839(2011).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

B brek li i H creleriH cre EngraftmanRetro Orbital Enjeksiyonntrakardiyak EnjeksiyonAk SitometrisiTransgenik Zebrafishla TaramaFloresan Mikroskopi
Yetişkin Zebra Balıklarında Optimize Edilmiş İntravenöz Enjeksiyon
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.