Acinetobacter baumannii’nin hızlı ve hassas tespitini kolaylaştırmak için, A. baumannii enfeksiyonlarını tanımlamak için LbaCas12a endonükleaz ile birlikte Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu (RPA) kullanan bir protokol sunuyoruz.
Gram negatif bir bakteri olan Acinetobacter baumannii, yüksek ölüm oranlarına sahip ciddi enfeksiyonlara neden olmasıyla ünlüdür. A. baumannii’nin hızlı ve doğru tespiti, hızlı tedavi, etkili enfeksiyon kontrolü ve antibiyotik direncinin azaltılması için çok önemlidir. Bununla birlikte, A. baumannii’nin yerinde hızlı ve kolay tespiti için uygun bir yöntem yoktur. DNA Endonükleaz Hedefli CRISPR Trans Raportör (DETECTR) sistemi, Cas12a’nın hedefe özgü tanıma yeteneklerini Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonunun (RPA) izotermal amplifikasyon verimliliği ile entegre ederek A. baumannii tespitine hızlı, kesin ve hassas bir yaklaşım sunar. Bu protokol, LbaCas12a endonükleaz ile birlikte RPA kullanılarak A. baumannii’nin tespitini detaylandırır. Bu makalede aşağıdaki adımlar açıklanmaktadır: DNA’nın ekstraksiyonu, belirli bir DNA dizisinin seçimi, primer ve CRISPR RNA (crRNA) tasarımı, pozitif rekombinant plazmidin yapımı, Cas12a-RPA testinin kurulumu, RPA amplifikasyon sisteminin optimizasyonu, gerçek zamanlı PCR cihazı gibi bir floresan tespit aracı kullanılarak RPA-CRISPR/Cas12a testinin görselleştirilmesi, ve duyarlılık ve özgüllük değerlendirmesinin değerlendirilmesi.
Klinik mikrobiyolojide, Acinetobacter baumannii enfeksiyonlarının saptanması önemli bir zorluk teşkil etmektedir. Bu gram negatif bakteri, özellikle bağışıklığı baskılanmış hastalarda yüksek ölüm oranlarında bile ciddi klinik semptomlarla enfeksiyonlara neden olabilir1. Patojen enfeksiyonları için geleneksel kültür tabanlı tespit yöntemleri zaman alıcıdır ve duyarlılıktan yoksun olabilir, bu da antibiyotik tedavisini geciktirebilir ve hasta sonuçlarını tehlikeye atabilir. A. baumannii’nin hızlı ve doğru bir şekilde tanımlanması, etkili tedavi ve salgın kontrolü için çok önemlidir. Bu ihtiyacı karşılamak için nükleik asit amplifikasyonunu kullanan moleküler teknikler araştırılmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar genellikle gelişmiş termal döngü ekipmanına ihtiyaç duyar ve iyi eğitimli teknisyenler ve iyi kurulmuş laboratuvarlar tarafından sınırlandırılabilir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, araştırmalar giderek daha fazla izotermal amplifikasyon yöntemlerigeliştirmeye odaklanmaktadır 2,3,4.
Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu (RPA), Piepenburg ve ark. 5 tarafından oluşturulan ve polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) benzer şekilde ancak sıcaklık döngüsüne ihtiyaç duymadan DNA’yı amplifiye etmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem 50 mM Tris (pH 7.5), 100 mM potasyum asetat, 14 mM magnezyum asetat, 2 mM DTT, %5 PEG20000 (yüksek moleküler ağırlıklı polietilen glikol), 200 μM dNTP, 3 mM ATP, 50 mM fosfokreatin, 100 μg/mL kreatin kinaz, 120 μg/mL UvsX, 30 μg/mL UvsY, 900 μg/mL Gp32, 30 μg/mL Bsu LF, 450 nM primerler ve DNA şablonları. Amplifikasyon işlemi, rekombinaz proteini UvsX’in 3 mM ATP varlığında primerlere bağlanması ve %5 PEG20000 bir rekombinaz-primer kompleksi oluşturmasıyla başlar. Bu kompleks daha sonra primerlerin çift sarmallı DNA üzerindeki homolog dizilerle kombinasyonunu kolaylaştırır.
UvsY’nin yardımıyla, rekombinaz UvsX, astar ve şablon ipliği arasındaki alışverişi kolaylaştırır ve hedef DNA’nın bir zincirinin yer değiştirmesine neden olur. Gp32, tek sarmallı DNA yapısının korunmasına yardımcı olur. Son olarak, rekombinaz ayrışır ve DNA ipliklerinin yerini alabilen bir DNA polimeraz (Bsu LF), primerin 3′ ucuna bağlanır ve onu deoksiribonükleosit trifosfatların (dNTP’ler) varlığında uzatır. Bu işlem döngüsel olarak tekrarlanır ve üstel amplifikasyon sağlanır. Tüm amplifikasyon işlemleri 20-40 dakika içinde ve 37 °C ile 42 °C arasındaki nispeten sabit sıcaklıklarda tamamlanabilir. Bu sıcaklık aralığı, RPA’nın minimalist bir ortamda yürütülmesine izin veren fizyolojik sıcaklıklarla yaklaşık olarak aynıdır ve RPA’yı DNA tespiti ve analizi için çok yönlü ve verimli bir araç haline getirir.
Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) ve CRISPR ile ilişkili protein (CRISPR-Cas) sistemi, bakteri ve arkelerde Sınıf I ve Sınıf II sistemleri kapsayan adaptif bir bağışıklık mekanizması olarak işlev görür. Sınıf II, CRISPR RNA (crRNA) tarafından yönlendirilen hedef DNA veya RNA’yı tanımlayan ve parçalayan Cas12 (a, b, f), Cas13 (a, b) ve Cas14 gibi proteinleri içerir6,7,8 . LbaCas12a (veya Cpf1), crRNA güdümlü bir DNA endonükleazdır. crRNA, Cas proteinleri ile kompleks oluşturduğu CRISPR-Cas sistemi içinde yol gösterici bir RNA görevi görür. Hedef DNA ile eşleşmek için aralayıcı bölgesini kullanır ve protein kompleksini hedef dizilere etkili bir şekilde yönlendirir. 5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3′ dizisi, tüm LbaCas12a crRNA’larında sabit bir element olan korunmuş crRNA tekrarı olarak hizmet eder. Bu tekrarı takiben, amaçlanan DNA hedefine göre farklılık gösteren hedefe özgü bir segment gelir. Bu hedefleme dizisinin uzunluğu 18 ila 24 nükleotid arasında değişir.
PAM (Protospacer-Bitişik Motif) dizisi (V, A, C veya G olabilen TTTV), DNA hedefinin tamamlayıcı olmayan zincirinin 5′ ucunda bulunur. Cas12a, PAM dizisinde hedef çift sarmallı DNA’yı keser. Daha sonra, aktive edilmiş Cas proteinleri, tek sarmallı DNA’nın (ssDNA) spesifik olmayan trans-bölünmesini gerçekleştirir9,10,11,12. Bu nedenle, bir florofor ve söndürücü ile etiketlenmiş ssDNA, bölünmeye uğrar ve bu da teminat bölünmesini takiben bir floresan sinyalinin yayılmasına neden olur 8,13. Floresan yoğunluğu, hassas nükleik asit tespiti için bir floresan okuyucu kullanılarak ölçülebilir14. Özellikle, Cas12a, Protospacer-Bitişik Motifin (PAM) tanınmasına bağlı olarak hedef dizilerin bağlanması ve bölünmesi ile DNA analizi için yaygın olarak kullanılırken, Cas13a böyle bir gereklilikten bağımsız olarak çalışır.
CRISPR-Cas sistemleri 15,16,17, tek bir reaksiyonda bölünmeyi kolaylaştırır 18,19,20,21. Yukarıdaki ikisini birleştirmek, nükleik asit tespiti için A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Hedeflenen A. baumannii’nin Etkin Tespiti) olarak bilinen sağlam bir araç oluşturabilir 22,23,24. Bu protokol, A. baumannii’nin 16s rDNA geni içindeki bir crRNA kılavuzlu diziyi spesifik olarak hedeflemek ve parçalamak için Cas12a’nın DNaz aktivitesi ile birlikte RPA’nın kullanımını gösterir, böylece patojenin hassas ve hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar.
A. baumannii-DETECTR yöntemi, geleneksel tespit yöntemlerine göre çeşitli avantajlar sunar25,26. İlk olarak, RPA’nın izotermal özelliği, termal döngüleyiciden bağımsız amplifikasyon mekanizması5 aracılığıyla operasyonel prosedürleri kolaylaştırır ve maliyetleri düşürür. İkinci olarak, Cas12a endonükleaz, crRNA aracılı hedefleme ve Watson-Crick baz eşleşmesi7 yoluyla testin özgüllüğünü arttırır. Son olarak, A. baumannii-DETECTR’in tek tüp yönteminin kullanılması sadece zaman kazandırmakla kalmaz, aynı zamanda amplikon kontaminasyonu riskini de önemli ölçüde azaltır19.
Protokol, DNA ekstraksiyonunun ekstraksiyonu, hedef DNA dizilerinin seçimi, primerlerin ve crRNA’ların tasarımı, pozitif rekombinant plazmitlerin inşası, Cas12a-RPA testinin kurulması, RPA amplifikasyonunun optimize edilmesinin optimizasyonu ve Gerçek zamanlı PCR makinesi gibi floresan algılama cihazları araçları kullanılarak sonuçların görselleştirilmesi, duyarlılık ve özgüllük değerlendirmeleri ile tamamlayın.
A. baumannii-DETECTR yöntemi, zamanında ve etkili tedaviyi, sağlam enfeksiyon kontrolünü ve antibiyotik direncinin yayılmasını kontrol altına alarak hasta sonuçlarını iyileştirmede umut vaat etmektedir. Bu protokol, Cas12a-RPA teknolojisinin uygulanması için kapsamlı bir kılavuz görevi görebilir ve çeşitli sağlık hizmeti ortamlarında faydasını artırabilir. Bununla birlikte, tutarlı ve güvenilir sonuçlar elde etmek için her adımın belirli laboratuvar koşullarına ve numune çeşitliliğine göre optimize edilmesi gerektiğine dikkat etmek çok önemlidir.
1. A. baumannii -DETECTR’ın inşası
NOT: A. baumannii-DETECTR’in yapımı, primer ve crRNA tasarımını, pozitif rekombinant plazmit yapısının inşasını, reaksiyon çözeltilerinin hazırlanmasını, RPA ile izotermal DNA amplifikasyonunu ve RPA-CRISPR/Cas12a testinin görselleştirilmesini içeren dört aşamalı bir süreçtir. DETECTR testinin şeması Şekil 1’de gösterilmiştir.
2. RPA-CRISPR/Cas12a tabanlı tespit platformunun özgüllük değerlendirmesi
NOT: A. baumannii-DETECTR’in özgüllüğünü test etmek için A. baumannii, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Rickettsia mooseri, Enterobacter, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Chlamydia psittaci, Legionella, Cockerella burnetii, Serratia’nın nükleik asitleri ve insan örnekleri DETECTR testine tabi tutulmuştur.
3. RPA-CRISPR/Cas12a tabanlı algılama platformunun duyarlılık değerlendirmesi
4. Numune UV ışığı ve LFS tespiti altındayken yapılan hazırlıklar
A. baumannii enfeksiyonları için geleneksel tanı yöntemleri, onları daha az erişilebilir ve bakım noktası testleri için uygun kılan çeşitli kısıtlamalara sahiptir27. Örneğin, PCR iyi bir duyarlılığa ve özgüllüğe sahiptir, ancak profesyoneller tarafından çalıştırılması gereken özel termal döngü ekipmanı ve karmaşık iş akışları gerektirir. Burada sunulan, RPA ve CRISPR-LbaCas12a genom düzenlemesini A. baumannii-DETECTR testi olarak bilinen yeniden birleştirme ile birleştiren yeni yöntem, verimli genetik manipülasyona izin verir. Acinetobacter baumannii enfeksiyonlarının yanı sıra diğer bakteriyel patojenlerin teşhisi için hızlı, hassas ve spesifik bir tespit yöntemi sağlar. İş akışı Şekil 1’de gösterilmiştir.
Yöntemimiz, mevcut tanı tekniklerinin eksikliklerinin üstesinden gelerek hastanın iyileşmesini kolaylaştırması ve A. baumannii’nin yayılmasını azaltması gereken enfeksiyonların teşhisinde ve yönetiminde özellikle avantajlıdır. A. baumannii-DETECTR sisteminin A. baumannii’yi yüksek özgüllük ve duyarlılıkla tanımladığı bulunmuştur (Şekil 5 ve Şekil 6). Bulgularımız, gerçek zamanlı değerlendirme sırasında yalnızca A. baumannii genomunun pozitif bir floresan kıvrım değişikliği sergilediğini, diğer tüm türlerin genomlarının ise negatif sonuçlar gösterdiğini ortaya koydu (Şekil 5).
RPA-CRISPR/Cas12a tespit platformunun hassasiyetini değerlendirmek için, A. baumannii için pozitif olan rekombinant plazmitler pUC57-16s rDNA, sistemin tespit limitini (LOD) belirlemek için hedef olarak kullanıldı. Floresan bazlı RPA-CRISPR / Cas12a testinde, tespit mikrolitre başına bir kopya ile mikrolitre başına 107 kopya arasında değişmiştir ve negatif kontrol grubuna kıyasla 1 kopya / μL grubunda floresan yoğunluğunda kayda değer bir artış gözlenmiştir (Şekil 6). Daha da önemlisi, gerçek zamanlı tanı için, algılamanın sonuçları, gerçek zamanlı tanı için gerekli olan laboratuvar tabanlı ekipmandan bağımsız olarak, elde taşınan taşınabilir bir cihaz aracılığıyla doğrudan görselleştirilebilir.
Protokol26 ile ilgili olarak birkaç kritik faktör göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, A. baumannii-DETECTR testinin yüksek hassasiyeti göz önüne alındığında, numune toplama işlemi sırasında çapraz kontaminasyonu önlemek önemlidir. Ek olarak, reaksiyon reaktifleri doğrudan güneş ışığına maruz kalmaktan korunmalıdır. Tüm prosedür adımlarına bağlı kalmak, mümkün olan en iyi sonuçları elde etmek için çok önemlidir. Pratik uygulamalarda A. baumannii-DETECTR sisteminin uygun işlevselliğini doğrulamak için A. baumannii’ye özgü gen fragmanlarını barındıran bir plazmitten oluşan pozitif bir kontrol dahil edilmelidir.
Protokol, parametrelerin belirli laboratuvar koşulları ve primer konsantrasyonu, reaksiyon süresi ve diğer değişkenler gibi numune türleri için optimize edilebileceğini göstermektedir. Bu deneyde, en yüksek amplifikasyon verimliliğini ve özgüllüğünü üretmek için RPA amplifikasyonu için optimum primer kombinasyonu, primer konsantrasyonları ve reaksiyon süreleri seçilmiştir. Bu, agaroz jel elektroforezi ile belirlendi (Şekil 2 ve Şekil 3). Ek olarak, protokolde doğruluğu sağlamak için kontrol olarak A. baumannii genomunun korunmuş bir bölgesini içeren pozitif bir rekombinant plazmit kullanıldı. Ticari bakteriyel genomik DNA ekstraksiyon kitlerinin, bu protokolde DNA ekstraksiyonu için standartlaştırılmış ve güvenilir bir yöntem sağladığını belirtmekte fayda var. Bununla birlikte, gelecekteki çalışmalarda, klinik veya çevresel numuneler gibi farklı numune türleri, A. baumannii DNA’sını etkili bir şekilde izole etmek için özel ekstraksiyon yöntemleri28 gerektirebilir.
Pozitif kontrolden tespit edilebilir floresan sinyallerinin yokluğunda, reaksiyon karışımında reaktiflerin değiştirilmesini gerektiren inhibitörlerin bulunması muhtemeldir. Tersine, floresan yoğunluğu net farklılaşma için yetersizse, inkübasyon süresinin uzatılması faydalı olabilir. Bununla birlikte, uzun süreli inkübasyon da yanlış pozitiflere neden olabilir26.
A. baumannii için mevcut tespit metodolojileri, pahalı PCR ekipmanının, sabit operasyonel konumların ve uzman personelin kullanılmasını gerektirmektedir. Buna karşılık, burada önerilen yöntem, A. baumannii’nin saha ortamlarında doğru ve hassas teşhisini kolaylaştırarak daha geniş bir demografi için erişilebilir olmasını sağlar.
İzotermal amplifikasyonun özellikleri ve floresan yoluyla toplanan veriler, A. baumannii-DETCTER iş akışını basit ve düşük ekipman gereksinimleri haline getirmenin yanı sıra uzak bölgelerde veya salgınlar sırasında hızlı patojen tespiti gerçekleştirmeyi mümkün kılar. Yeni bir izotermal nükleik asit amplifikasyon tekniği olan RPA-LFS 29,30,31,32, operasyonel basitliği ve azaltılmış zamansal talepleri nedeniyle viral, bakteriyel, fungal ve parazitik patojenlerin tespitinde önemli bir ilgi görmüştür. Protokol, ultraviyole (UV) ışık veya Transilluminatör ve yanal akış şeritleri (LFS) algılama altında numunenin floresan sinyalini detaylandırır. Görsel inceleme kısa sürede sonuçlandığı için yüksek hassasiyetli cihazlara ve uzman teknisyenlere bağımlılığı önleyebilir (Şekil 7), böylece pahalı ve karmaşık laboratuvar ekipmanlarına ve operasyonel nüfusa olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Ayrıca, tek tüp yöntemi sadece zaman kazandırmakla kalmaz, aynı zamanda amplikon kontaminasyonu riskini de azaltır33.
Gelecekteki çalışmalar, daha verimli ve daha düşük maliyetli DNA ekstraksiyon tekniklerinin araştırılması gibi, çeşitli numune türleri ve farklı çevresel koşullar için uygulanabilir hale getirmek için yöntemi geliştirmeyi amaçlamalıdır. A. baumannii-DETECTR’in kullanımı sadece klinik tanı için değil, aynı zamanda çevresel değerlendirme, salgınların izlenmesi ve yönetimi için de kullanılabilir, bu da toplulukların ve hastanelerin A. baumannii’yi hızlı bir şekilde tanımlamasını sağlar. Ayrıca, crRNA ve primerleri modifiye ederek, bu moleküler tanı yaklaşımı, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus ve Enterobacter gibi çeşitli solunum yolu bakteriyel enfeksiyonlarının tespiti için uyarlanabilir.
Özetle, A. baumannii-DETECTR, yüksek hassasiyeti ve özgüllüğü, kullanıcı dostu tasarımı ve taşınabilirliği sayesinde A. baumannii’yi mümkün olduğunca hızlı ve doğru bir şekilde tanımlayabilir. Bu yöntem, zamanında ve etkili tedaviyi, enfeksiyon kontrolünü kolaylaştırarak ve antibiyotik direncinin çoğalmasını azaltarak hasta sağlığı sonuçlarını iyileştirebilir ve aynı zamanda A. baumannii enfeksiyonlarının artan tehdidiyle mücadele edebilir.
The authors have nothing to disclose.
-20 °C Freezer | Haier | HYCD-290 | China |
Agarose Basic | BioFroxx | 1110GR100 | China |
All oligonucleotides and crRNA were synthesized by company | www.comatebio.com | ||
Cas12a cutting substrate – ssDNA – fluorescent type | EZassay Biotech. Co. Ltd. | DNA-FAM-BHQ | China |
Cas12a cutting substrate – ssDNA – test paper type | EZassay Biotech. Co. Ltd. | DNA-FAM-BIO | China |
Electrophoresis apparatus | BIO-RAD | POWER PAC1000 | USA |
Fluorescence quantitative PCR instrument | BIO-RAD | CFX Connect | USA |
Gel Imaging System | BIO-RAD | Gel Doc 2000 | USA |
https://ezassay.com/rna | |||
https://www.ezassay.com/primer | |||
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast | |||
Lateral flow paper strip (Biotin/FAM) | EZassay Biotech. Co. Ltd. | HD-FMBO | China |
LbaCas12a (Cpf1) enhanced protein | EZassay Biotech. Co. Ltd. | CAS-12E-001 | China |
LED Transilluminator | LABGIC | BL-20 | China |
Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
Microcentrifuge | allsheng | Mini-6k | China |
PCR strip tubes | PCR strip tubes | PST-0208-FT-C | China |
TGrade Dry Bath Incubator | Tiangen biochemical technology | OSE-DB-01 | China |
Tianamp Bacteria DNA Kit | Tiangen biochemical technology | DP302-02 | China |
TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.; LTD. | DP302 | China |
TransStart FastPfu DNA Polymerase | TransGen Biotech. Co. Ltd. | AP221 | China |
TwistAmp Basic Kit | TwistDX | TABAS03KIT | UK |
Universal DNA Purification Kit | Tiangen biochemical technology | DP214-03 | China |