Yöntem makalesi

Meme kanseri hasta kaynaklı ksenogreftlerin yüksek verimli dissosiyasyonu ve ortotopik implantasyonu

1.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67607

⸱

20 Aralık 2024

 ,  ,  , 
1Division of Exercise Physiology, Department of Health Professions, West Virginia University School of Medicine, 2Cancer Institute, West Virginia University School of Medicine, 33Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Bu protokol, farelerde meme kanseri hastasından türetilen ksenogreftlerin ortotopik implantasyonu için etkili, cerrahi olmayan bir yöntemi tanımlar. Teknik, enzimatik tümör ayrışmasını ve ardından meme yağ yastıkçıklarına doğrudan enjeksiyonu içerir ve yüksek verimli implantasyonu mümkün kılar. Kapsamlı doğrulama, çeşitli meme kanseri alt tiplerinde titiz çalışmaları kolaylaştırarak model aslına uygunluğunu sağlar.

Özet

Hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX'ler), meme kanseri (BC) bilgisini ilerletmek için gerekli olan, tümörle ilgili hücre tiplerini ve tümör mikroçevresini özetlemek için klinik olarak ilgili bir yöntem sağlar. Ek olarak, PDX modelleri, in vitro modeller kullanılarak mümkün olmayan BC sistemik etkilerinin incelenmesini sağlar. BC ksenogreftlerinin implante edilmesi için geleneksel yöntemler tipik olarak zaman alıcı, invaziv olan ve BC araştırmalarında PDX modellerinin ölçeklenebilirliğini sınırlayan anestezi ve steril cerrahi prosedürleri içerir. Bu protokol, farelerde BC PDX'lerin ortotopik implantasyonu için basit ve ölçeklenebilir bir yöntemi tanımlar. PDX aşılaması için immün yetmezliği olan fare suşu NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) kullanıldı. IRB onaylı hastalardan elde edilen insan BC örnekleri mekanik ve enzimatik olarak ayrıştırıldı, daha sonra bir bazal membran özütü (BME) ve RPMI 1640 çözeltisi içinde yeniden süspanse edildi. Hayvanlar tırmıklama ile zaptedildi ve dördüncü kasık meme ucundaki yağ yastıkçıklarından tüyleri çıkarmak için tüy dökücü krem uygulandı, ardından enjeksiyon yapıldı. 100 μL'lik bir süspansiyonda yaklaşık 2 milyon hücre, 26 G'lik bir iğne kullanılarak meme yağ yastıkçıklarına iki taraflı olarak ortotopik olarak enjekte edildi. Özellikle, anestezik gerekmedi ve hücre hazırlığından enjeksiyona kadar toplam işlem süresi 5 dakikanın altındaydı. Birkaç aylık bir büyüme döneminden sonra, tümörler eksize edildi ve kimlik doğrulama için işlendi. Doğrulama, geleneksel BC reseptörleri (ör., ER, PR, HER2) için spesifik antikorlarla immünohistokimya kullanılarak reseptör durum değerlendirmesini içeriyordu. Tümör morfolojisi hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması ile doğrulandı ve bu durum bir patolog tarafından yorumlandı. Hasta örneğine genetik benzerlik, toplu RNA dizilimi ve kısa tandem tekrar (STR) analizi ile doğrulandı. PDX aşılama ve validasyonuna yönelik bu yaklaşım, modellerin titiz bir şekilde geliştirilmesini ve yüksek verimli tümör implantasyonunu destekleyerek, çeşitli BC alt tiplerinde iyi güçlü çalışmalara olanak tanır.

Giriş

Meme kanseri (BC) her yıl dünya çapında 2 milyondan fazla kadında teşhis edilmektedir1. BC'nin temel biyolojik anlayışını ilerletmek ve yeni terapötikleri onaylanmış tedavilere başarılı bir şekilde dönüştürmek için, hasta tümörlerinin tanımlayıcı özelliklerini koruyan klinik öncesi hayvan modelleri gereklidir. Hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX'ler), histopatoloji, reseptör ekspresyonu ve genetik anormallikler dahil olmak üzere orttopik olarak implante edildiğinde tümör heterojenliğini yüksek doğrulukla özetlediği gösterilmiştir 2,3,4. Daha da önemlisi, damar sistemi, bağışıklık hücreleri ve kanserle ilişkili fibroblastlar gibi tümörün mikro çevresine katkıda bulunan stromal hücreleri de tutarlar. Bununla birlikte, yavaş yavaş 5 ile murin konakçı stromal hücreler iledeğiştirilirler. PDX'ler ayrıca, şu anda in vitro modeller kullanılarak mümkün olmayan yorgunluk 6,7 gibi tümör büyümesinden kaynaklanan sistemik komplikasyonların incelenmesini de sağlar.

Bununla birlikte, başarılı BC PDX aşılaması, en yaygın olarak kullanılan suş NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) olmak üzere immün yetmezliği olan bir fare suşu gerektirir. NSG fareleri adaptif bağışıklıktan yoksundur ve oldukça kusurlu doğuştan gelen bağışıklık sergiler8. BC PDX aşılaması, SCID/Bej (CB17.Cg-PrkdcscidLystbg-J/Crl) gibi diğer immün yetmezlik suşlarında benzer aşılama oranlarıyla elde edilmiştir4.

BC PDX'leri implante etmenin geleneksel yöntemleri, bir tümör parçasının meme yağ yastığına9 cerrahi olarak implante edilmesini içerir ve bu yaklaşım, uygun oranlarda başarılı bir aşılamaya yol açar. Bununla birlikte, steril cerrahi prosedürlere ve anestezik kullanımına duyulan ihtiyaç, onu zaman alıcı hale getirir, böylece belirli bir zaman aralığında implante edilebilecek fare sayısını sınırlar. PDX'lerin tümörlerdeki ilaç yanıtlarının ve hassas tıpta kullanımın potansiyel öngörücü faydaları göz önüne alındığında10, PDX'leri fareler arasında homojen bir şekilde implante etmek için basit ve tekrarlanabilir bir iş akışına sahip olmak hayati önem taşır. Bu makale, insan meme tümörlerinin tek hücreli bir süspansiyona ayrışmasını ve ardından immün yetmezliği olan farelerin meme yağ yastıklarına ortotopik enjeksiyonu göstermektedir.

Protokol

Bu protokol, West Virginia Üniversitesi (WVU) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen yönergelere bağlıdır. Tümör hücresi enjeksiyonları için 8 haftalık veya daha büyük yaşta ve yaklaşık 25 g ağırlığında dişi NOD.Cg-PrkdcscidIl2rg tm1Wjl/SzJ (NSG) fareleri kullanıldı. Meme kanseri tümör dokusu, West Virginia Üniversitesi Kanser Enstitüsü'nde (Morgantown, WV) ve NCI Kooperatif İnsan Dokusu Ağı tarafından onaylanmış WVU Kurumsal İnceleme Kurulu protokolü ve WVU Kanser Enstitüsü Protokolü İnceleme ve İzleme Komitesi kapsamında temin edildi. Hastalardan bilgilendirilmiş yazılı onam alındı. Tüm prosedürler, uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) protokolleri izlenerek Sınıf II biyolojik güvenlik kabini içinde aseptik koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan hayvanların, reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Tümör dokusunun yüksek verimli enzimatik ayrışması

  1. İnsan tümör ayrışma kitinden H, R ve A enzimlerini steril bir C-tüpünde çözün ve birleştirin. 200 μL enzim H, 100 μL enzim R ve 25 μL enzim A ekleyin. C-tüpüne 4.7 mL steril RPMI 1640 ortamı ekleyerek son hacmi ~ 5 mL'ye getirin.
    NOT: Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'u (DMEM), RPMI 1640 yerine kullanılabilir.
  2. Tümör fragmanları mevcut protokol9'da tarif edildiği gibi kesilebilir ve dondurulabilir. Çözülmüş tümör parçalarını ve beraberindeki dondurma ortamını 100 mm'lik steril bir kültür kabının yarısına aktarın. Steril forseps kullanarak, tümör parçalarını steril 5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
    NOT: Forsepslere alternatif olarak steril bir hipodermik iğne kullanılabilir. 5 mL'lik bir mikrotüp yerine 35 mm'lik bir tabak kullanılabilir.
  3. Tümör parçalarını 1-3 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS, 1x) ile yıkayın. Artık dondurma ortamının tamamen çıkarılmasını sağlamak için forseps kullanarak çözeltideki parçaları manipüle edin.
  4. Yıkanan parçaları forseps kullanarak 2 mL'lik bir mikrotüpe aktarın. Tümör parçalarına 1 mL üçlü antibiyotik (TAB) solüsyonu uygulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    NOT: İstenirse bu adım atlanabilir. %1 gentamisin, %1 klindamisin ve %0.5 polimiksin B sülfatın steril 1x PBS'de çözülmesiyle 10x TAB stoğu yapılabilir. Steril 1x PBS'de 1x TAB çözeltisine seyreltin.
  5. Steril forseps kullanarak, dezenfekte edilmiş parçaları yeni bir 5 mL mikrotüpe aktarın. 1-3 mL steril PBS ile ikinci bir yıkama yapın. Yıkanan parçaları, adım 1.2'den itibaren 100 mm'lik kültür kabının kuru yarısına aktarın.
  6. İki steril No. 10 neşter bıçağı kullanarak, tümör dokusunu iyice kıyın. Kıyılmış tümör parçalarını bir bıçağa aktarın ve bunları hazırlanan enzim çözeltisini içeren C-tüpüne yerleştirin. Son bir tık sesi hissedilene kadar tüp kapağını güvenli bir şekilde sabitleyin.
  7. Enzim çözeltisi içinde tümör parçalarının eşit dağılımını sağlamak için C-tüpünü birkaç kez ters çevirin.
  8. C-tüpünü mekanik ayırıcıya yerleştirin. Tüpü ters çevirin ve tüm içeriğin ortama daldırıldığından emin olun. Tüp, makinede ters konumda olacaktır.
    1. Boruyu, girintili kısım operatöre bakacak şekilde bir yuvaya sabitleyin. Varsa, ısıtıcıyı borunun etrafına yerleştirin.
  9. Dokunmatik ekran arayüzünden 37C_h_TDK_3 programını seçin. Bu program 37 °C'de 60 dakika boyunca çalışır. Daha yumuşak tümörler için 37C_h_TDK_1 veya 2 kullanılabilir.
    NOT: En yüksek verim için, farelerin bu ayrışma döneminde enjeksiyon bölgelerine tüy dökücü krem sürülerek enjeksiyona hazırlanmaları önerilir.
  10. Ayrışma programının tamamlanmasının ardından, tüp içeriğini inceleyin. Görünür tümör parçaları kalmamalıdır.
    NOT: Parçalar varsa, ek ayrışma süresi gerekebilir. Bu gibi durumlarda, programı 20-30 dakika daha çalıştırın.
  11. Yeterli ayrışma sağlandıktan sonra, ayrışmış hücreleri peletlemek için C-tüpünü 200 x g'da 4 ° C'de 5-8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı vakum aspirasyonu veya pipet kullanarak dikkatlice çıkarın.
  12. Hücre peletini 5-10 mL taze RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Daha kolay manipülasyon için hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu 200 x g'da 4 ° C'de 5-8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin.
    NOT: Hücre peleti küçükse bu adım atlanabilir. Bu gibi durumlarda, hücreler doğrudan istenen hacimde yeniden süspanse edilir ve daha sonra hücre kaybını en aza indirmek için bazal membran özütü (Matrigel) ile birleştirilir.
  13. Hücre peletini, istenen son enjeksiyon hacminin yarısına eşdeğer olan RPMI 1640'lık bir hacimde yeniden süspanse edin. RPMI 1640 ve Matrigel, enjeksiyon bölgesi başına 100 μL'lik bir nihai enjeksiyon hacmi ile 1: 1 v / v oranında birleştirilecektir.
    NOT: 4 farede bilateral enjeksiyon için gereken toplam hacim 800 μL'dir. Bu nedenle, hücreleri en az 400 μL RPMI 1640 içinde yeniden süspanse edin. Potansiyel hacim kaybını hesaba katmak için, 1:1 v/v oranını koruyarak nihai hacme %20 daha eklenmesi önerilir. Alternatif olarak, RPMI 1640 yerine DMEM veya 1x PBS kullanılabilir.
  14. Bir hemositometre veya otomatik yöntem kullanarak yeniden askıya alınan hücreleri sayın. Enjeksiyon için istenen konsantrasyonu elde etmek için gerektiği kadar seyreltin. Enjeksiyon bölgesi başına yaklaşık 1-2 milyon hücrelik bir başlangıç noktası önerilmektedir.
  15. 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir mikrosantrifüj tüpünde, RPMI'de istenen miktarda seyreltilmiş hücre süspansiyonunu eşit hacimde Matrigel ile birleştirin. Homojenliği sağlamak için süspansiyonu tekrar tekrar pipetleyerek nazikçe karıştırın.
    NOT: Önceki adımı takiben, 400 μL Matrigel'e 400 μL seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin. Kullanılacak enjeksiyon iğnelerinin sayısını göz önünde bulundurun ve ilgili hacim kayıplarını hesaba katın. Matrigel'i her zaman buz üzerinde tutun. Hücreler yeniden süspanse edilene kadar çözmeyin, çünkü hızlı bir şekilde katılaşacaktır. 2 mL'lik tüpte hızlı çözülme ve kombinasyon için küçük alikotların (örn., 120 μL) korunması önerilir.
  16. Enjeksiyona hazır olana kadar hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun.

2. Dissosiyated PDX'in ortotopik kasık meme yağ yastığı enjeksiyonu

  1. Kalibre edilmiş bir terazi kullanarak her farenin kütlesini belirleyin. Hedef enjeksiyon bölge(ler)ine ince bir tabaka tüy dökücü krem sürün. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, kürkün hızlı bir şekilde çıkarılmasını kolaylaştırmak için kreme saat yönünde ve saat yönünün tersine değişen hareketlerle masaj yapın.
    1. Steril tuzlu suya batırılmış gazlı bez süngeri kullanarak fazla kürkü ve tüy dökücü kremi çıkarın. Enjeksiyon bölgesinde epilasyonun tamamen yapıldığından emin olun.
      NOT: Cilt tahrişini önlemek için tüy dökücü krem maruziyetini 60 saniyeyi aşmayın. Maruz kalma süresini daha da en aza indirmek için tüy dökücü krem uygulanmadan önce fareler tıraş edilebilir. Bu adım, zaman verimliliğini optimize etmek ve buz üzerinde hücre süspansiyonu depolama süresini en aza indirmek için tümör ayrışması sırasında gerçekleştirilebilir.
  2. Enjeksiyona uygunluğu değerlendirmek için her farenin kapsamlı bir görsel incelemesini yapın. Herhangi bir ağrı belirtisi olup olmadığını değerlendirin, sıkıntı, hastalık, veya diğer kontrendikasyonlar.
  3. Takılı bir iğne olmadan 1 mL'lik bir şırınga kullanarak, homojenliği sağlamak için hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı nazikçe aspire edin. 1 mL şırıngaya 26 G'lik bir iğne takın ve istenen enjeksiyon hacmini geri çekin. Hafifçe vurarak veya hafifçe vurarak şırıngadaki hava kabarcıklarını ortadan kaldırın.
    NOT: Tek elle enjeksiyonu kolaylaştırmak için şırınga başına 600 μL'yi aşmamanız önerilir.
  4. Hazırlanan şırıngayı, iğne operatörden uzağa bakacak şekilde buz kabının üzerine yatay olarak yerleştirin. Buz kabını ve iğneyi, operatörün baskın eli veya tercih ettiği enjeksiyon eli ile aynı tarafa yerleştirin. Fareyi yuvasından çıkarın ve bir alkol temizleme pedi kullanarak enjeksiyon alanını dezenfekte edin.
  5. Sırt derisini ense ve sırttan sıkıca kavrayarak fareyi güvenli bir şekilde tutun. Meme yağ yastıkçıklarını net bir şekilde ortaya çıkarmak için yeterli immobilizasyon sağlayın. Kasık meme yağ yastığı meme başından kalçanın tepesine kadar uzanır. Deri altında tarif edilen bölgede yumuşak, pembemsi bir doku olarak gözlenebilir.
    NOT: Bir yardımcı operatör, yağ yastığını içeren cildi sıkıştırmak ve yükseltmek için düz kenarlı forseps kullanabilir. Bu teknik, enjeksiyonu gerçekleştiren operatörün yağ pedini başarılı bir şekilde hedeflemesini sağlamaya yardımcı olur.
  6. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin. İğneyi (eğim yukarı) 45 derecelik bir açıyla, kalçaya doğru yağ yastığına yaklaşık 0,5-1 cm kaudal bakacak şekilde yerleştirin ve iğne uzunluğunu ayarlayın.
    1. İğneyi yağ yastığının içine ilerletin. Kontrollü bir şekilde, istenen hacimde hücre süspansiyonu enjekte edin. Verimli enjeksiyon hızı, uzun süreli kısıtlamadan kaynaklanan hayvan ajitasyonunu en aza indirmeye yardımcı olacaktır.
      NOT: Hayvan sıkıntısını en aza indirmek için, sürekli manuel kısıtlamanın maksimum süresi 30 saniyeyi geçmemelidir. Kısıtlama süresi 30 saniyeyi aşarsa, hayvan ikinci bir denemeden önce iyileşmesi için kafese bırakılmalıdır.
  7. Enjeksiyondan sonra iğneyi 180 derece döndürün (eğim aşağı). Enjeksiyon bölgesinden hücre kaybını en aza indirmek için yavaş çekilmeden önce iğne pozisyonunu kısa bir süre koruyun. Herhangi bir kanama olursa, gerektiği gibi standart gazlı bez veya hemostatik gazlı bez uygulayın.
  8. Bilateral enjeksiyonlar gerekiyorsa, kontralateral yağ yastığı için 2.6 ve 2.7 adımlarını tekrarlayın. Birden fazla hayvan için, 2.2-2.7 adımlarını gerektiği kadar tekrarlayın.

3. Takip prosedürleri

  1. Tüm kesici aletleri belirtilen kesici alet kaplarına atın. Diğer tüm içerikleri uygun atık kaplarına atın.
  2. Enjeksiyon sırasında kanama meydana gelirse, hemostazı sağlamak için fareleri en az 1 saat izleyin.
  3. Vücut kütlesini haftalık olarak izleyin. Büyüme hissedilir hale geldiğinde tümör hacmini değerlendirin.

Sonuçlar

Bu çalışma, farelerde hasta kaynaklı meme kanseri ksenogreftlerinin ortotopik implantasyonu için etkili ve cerrahi olmayan bir yaklaşımı özetlemektedir. Meme tümör dokusu, insana özgü enzimler ve mekanik ajitasyon kullanılarak ayrıştırıldı, Matrigel: RPMI 1640'ın 1: 1 v / v oranında yeniden süspanse edildi ve NSG farelerinin kasık meme yağ yastıklarına orttopik olarak enjekte edildi (Şekil 1 ve Şekil 2). PDX modellerinin aslına uygunluğunu sağlamak için, orijinal hasta tümör örneğinin pasajlı tümörlerle uyumu, yerleşik histopatolojik ve genomik tekniklerle doğrulandı. Reseptör ekspresyonu, östrojen reseptörü (ER), progesteron reseptörü (PR) ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) dahil olmak üzere standart meme kanseri reseptörlerinin immünohistokimya (IHC) boyaması kullanılarak profillendi (Şekil 3). Hücresel morfoloji, kesitli tümör kesitlerinin hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması ve boyanmış kesitlerin uzman patolog yorumu kullanılarak değerlendirildi. Genetik manzaranın korunması ve insan hücrelerinin tutulması, toplu RNA dizilimi ve kısa tandem tekrar (STR) kimlik doğrulaması kullanılarak doğrulandı (Şekil 4 ve Tablo 1). Ek olarak, patojen testi, immün yetmezliği olan farelerin kullanımı göz önüne alındığında önemli bir doğrulama adımı olan hastada veya pasajlı tümör örneklerinde herhangi bir kontaminasyon tespit etmedi.

figure-results-1
Şekil 1: Protokole genel bakış. Tümör ayrışması ve enjeksiyon iş akışının temsili. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NSG fareleri, kasık meme yağ yastıkçığı alanından kürkü tamamen çıkarmak için saat yönünde ve saat yönünün tersine değişen hareketlerle uygulanan bir tüy dökücü krem kullanılarak enjeksiyona hazırlandı (Şekil 2A). Fazla tüy dökücü krem açıkta kalan karın derisinden steril gazlı bez ile silindi ve bölge alkollü ped ile dezenfekte edildi (Şekil 2B). Ayrışmış tümör hücreleri yüklü steril bir iğne, dördüncü inguinal meme başı meme yağ yastıkçıklarına yaklaşık 45 derecelik bir açıyla 0.5-1 mm kaudal olarak yerleştirildi (Şekil 2C). Tümör hücreleri kontrollü bir şekilde dördüncü inguinal meme başı meme yağ yastıkçıklarına enjekte edildi (Şekil 2D). Tümör büyümesi başlangıçta yağ yastıkçıklarının dijital palpasyonu ile tespit edildi. Daha sonra, tümör hacmi ilerlemesi manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanılarak kantitatif olarak izlendi (Şekil 2E). Hem vücut ağırlığı (Şekil 2F) hem de tümör hacimleri (Şekil 2G), ağırlıktaki dalgalanmaları ve tümör hacimlerinin ilerlemesini izlemek için haftalık olarak ölçüldü. Tümörler, erken sonlandırmayı gerektirecek ülserasyon gibi yaraları izlemek için görsel olarak incelendi. PDX'in inguinal meme yağ yastıkçıklarında başarılı bilateral aşılanması Şekil 2H'de gösterilmiştir ve tümörlerin eksizyonunu takiben yağ yastıkçıkları Şekil 2I'de gösterilmiştir.

figure-results-2
Şekil 2: Farelerin hazırlanması, PDX enjeksiyonu ve tümör ilerlemesinin izlenmesi. (A) Meme yağ yastıkçıkları iyice epilasyon yapıldı. (B) Hedef enjeksiyon alanlarının net bir şekilde görülebilmesi ile enjeksiyon bölgesinin sunumu. (C) Şırınganın yağ pedi üzerindeki konumu, iğne uzunluğuna bağlı olarak tipik olarak kaudal ila yağ pedi. Beyaz ok, yerleştirme sırasında iğne için hedef alanı gösterir. (D) Sol dördüncü kasık meme ucu meme yağ yastığına ayrışmış hücre enjeksiyonunun tasviri. İğne, enjeksiyon için gösterildiği gibi yaklaşık 45 derecelik bir açıyla tutulmalıdır. (E) Enjeksiyon bölgesinde bilateral olarak aşılanmış tümörlerin temsili MRG görüntüsü. Tümörler yeşil renkle vurgulanmıştır. (F) Tümör hücresi enjeksiyonunu takiben vücut ağırlıklarının gram cinsinden temsili ilerlemesi (n = 5). Koyu mavi çizgi, önemli ölçüde sıfırdan farklı olan basit doğrusal regresyonu temsil eder (p < 0.0001); Fareler ortalama olarak 22 mg kazandı.Gün-1

&E

figure-results-3
&E&E&E





























figure-results-4

Tartışma

Bu makale, immün yetmezliği olan farelerin kasık meme yağ yastıklarına BC PDX'leri ortototopik olarak implante etmek için verimli, yüksek verimli bir yöntem sunmaktadır. Bu optimize edilmiş iş akışı, tek bir araştırmacının PDX'leri günde düzinelerce fareye implante etmesini sağlayarak büyük ölçekli ve yeterli güçte çalışmaları destekler. Birden fazla benzersiz PDX'i aynı anda ayrıştırma ve implante etme kapasitesi, hassas onkoloji yaklaşımlarını da mümkün kılar. Zaman verimliliğinin ötesinde, tümörlerin ayrışması, fareler arasında eşit olarak dağılmış homojen bir hücre tipi süspansiyonu oluşturur. Deneyimlerimize göre, bu homojenlik tutarlı engraftman ve tümör büyüme oranlarına katkıda bulunur.

Genel olarak etkili olsa da, bu protokol belirli senaryolarda değişiklik gerektirebilir. Örneğin, mekanik ayrışmadaki standart 1 saatlik çalışma süresi bazen tam tümör dokusu ayrışması için yetersiz kalmaktadır. C-tüpünü sıkıca kavrarken, altta başıboş doku birikmesi için birkaç kez aşağı doğru itin. Görünür doku parçaları kalırsa, ayrışmaya devam edin ve 15 dakikalık aralıklarla tekrar inceleyin. Bazı dokuların, özellikle fibröz veya yağ dokusunun, ayrışmaya direnebileceğini ve enjeksiyon sırasında iğne tıkanmasını önlemek için manuel olarak çıkarılması gerekebileceğini unutmamak önemlidir.

Hayvan sıkıntısını en aza indirmek ve enjeksiyon bölgesinden hücre geri akışı riskini azaltmak için mümkün olan en küçük ölçü iğnesini (27 G veya 26 G) kullanmanızı öneririz, bu da aşılama başarısını ve tümör büyüme oranlarını etkileyebilir. Bununla birlikte, ayrışmamış doku veya yağ parçaları kalırsa, kanama veya hücre kaybı riskleri artmış olsa da, daha büyük bir ölçü iğnesi (16 G veya 18 G) gerekli olabilir. Seçilen iğne ölçerden bağımsız olarak, hayvan taşıma yeterliliği, enjeksiyonların etkili bir şekilde gerçekleştirilmesinde en önemli bileşendir. Bu protokolde anestezi kullanılmaz ve bu zaman kazandırırken, aynı zamanda enjeksiyonlar yapılırken hayvanın bir dereceye kadar hareketliliğe sahip olmasını sağlar. Sıyırma sırasında yeterli kısıtlama sağlanmazsa, ani uzuv hareketleri damarların delinmesine, hücre tutulmasını önleyen bir çıkış yarasının oluşmasına veya karın duvarı delinmelerine neden olabilir. Değerli hücreleri enjekte etmeden önce yeterli pratik enjeksiyonu şiddetle tavsiye edilir.

Tarif edilen ayrışma tekniği oldukça aktarılabilir ve hem ortotopik hem de subkutan modeller için çok sayıda başka tümör tipinin implantasyonunda kullanılabilir. Bununla birlikte, en azından BC bağlamında, deri altı implantasyondan kaçınılmalıdır. Ortotopik BC PDX enjeksiyonu, aşılanmış tümörün subkutan yağ pedine kıyasla daha üstün konak vaskülarizasyonu ile sonuçlanır ve inguinal yağ yastıkçığı implantasyonu, torasik yağ yastığı11'den daha yüksek aşılama oranlarına yol açar. Ek olarak, ortotopik olarak implante edilmiş PDX'ler, deri altı enjeksiyonlara kıyasla daha kısa bir aşılama süresine ve daha hızlı bir büyüme oranına sahiptir12. Ayrıca, ayrışmanın hızlı tümör hücresi enjeksiyonunu kolaylaştırırken, doğası gereği hücreden hücreye bağlam kaybına neden olduğu da belirtilmelidir; bu nedenle, her durumda uygun bir yaklaşım olmayabilir. Otantik hücre etkileşimi gerektiren durumlar için (örneğin, tümörlerin uzamsal transkriptomikleri), kıyılmış tümör parçalarının enjekte edilmesi veya parçaların implante edilmesi tercih edilebilir.

PDX çalışmaları için gerekli olmakla birlikte, immün yetmezliği olan farelerin kullanımı bazı sınırlamalar getirmektedir. Lojistik açıdan bakıldığında, barınma, yiyecek ve su dahil olmak üzere tamamen steril bir ortam gereklidir. Bu ayrıca, enfeksiyon riskini azaltmak için bağışıklık yetmezliği olan hayvanlar için özel barınma alanları gerektirir ve potansiyel olarak barınma maliyetlerini artırır. Enfeksiyonlara karşı bu artan duyarlılık, ayrışmadan önce tümör fragmanları için bir antibiyotik inkübasyon adımının önerilmesinin nedenidir. Bununla birlikte, bazı çalışmalar hücre kültüründe antibiyotik kullanımının gen ekspresyon profillerinde değişikliklere yol açtığını göstermiştir13. Bu göz önüne alındığında, araştırmacılar her çalışma için antibiyotik kullanımını değerlendirmelidir. Bir bağışıklık sisteminin etkili bir şekilde yokluğu, PDX'lerin aşılanmasına izin verirken, aynı zamanda BC ilerlemesi üzerindeki sayısız bağışıklık sistemi etkisinin incelenmesini de engeller14.

Bu yöntem, hasta tümör örneklerine yüksek doğruluk gösterir. Histopatolojik kimlik doğrulama, beklendiği gibi, pasajlı PDX'in hasta tümör örneğine göre uyumunu doğruladı. Okumaların insan genomuna yüksek oranda hizalanması, PDX'in geçişi takiben insan hücrelerinin yüksek bir yüzdesini koruduğunu güçlü bir şekilde göstermektedir. Bu, STR profillerindeki %>80'lik benzerlik ve hasta tümörü ile PDX arasındaki RNA-seq verilerindeki güçlü pozitif korelasyon ile daha da desteklenmektedir. Meme tümörü büyümesini takiben PDX farelerinin periferik dokularındaki moleküler adaptasyonlar, insan BC hastalarındaki moleküler adaptasyonlarla da tutarlıdır. BC PDX farelerinden alınan iskelet kaslarının toplu RNA-seq ve proteomik analizleri, erken evre BC6,7 teşhisi konan hastalardan elde edilen kas biyopsilerindeki moleküler değişikliklerle çarpıcı bir şekilde uyumludur. Toplu olarak, STR profillemesi ve RNA-seq'in benzerliği, periferik dokulardaki tutarlı adaptasyonlarla birleştiğinde, BC PDX farelerinin klinik öncesi çalışmalarda kullanımı için ikna edici veriler sağlar.

Açıklamalar

Yazarlar, açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

PDX'lerin geliştirilmesi için tümör örnekleri sağlayan hastaların cömert katkılarını takdir etmek isteriz. Emidio Pistilli, Hannah Wilson, MD / PhD'nin önceki önemli katkılarını kabul eder. Bu araştırma aşağıdaki kuruluşlar tarafından desteklenmiştir: Ulusal Artrit, Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüleri (NIAMS) R01AR079445 numaralı ödül numarası altında (Pistilli); WVU Genomik Çekirdek Tesisi (U54GM104942); WVU Hayvan Modeli ve Görüntüleme Tesisi (P20GM121322, U54GM104942, P20GM144230, P30GM103488); Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüleri ödül numarası P20GM121322 (Lockman). Şekil 1 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL tüberkülin şırıngaBD305945steril
1x fosfat tamponlu salin, pH 7.4Gibco10010023steril
2.0 mL yuvarlak tabanlı mikrosantrifüj tüpüEppendorf0030123620steril
26 G iğne, & frac12; içinde.BD305111steril
5.0 mL mikrotüpEppendorf0030119401
steril 8+ haftalık NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) farelerJackson Laboratuvarı#005557
Alkol hazırlama pedleriFisher Scientific22-363-750steril
Bazal membran özü (Matrigel)Cultrex3632-005-02
Pamuk uçlu aplikatörler, 6 inç.Fisher Scientific22-029-553
Orta Tırtıksız Uçlu Steril Kavisli Forseps, 152 mmElektron Mikroskobu Bilimleri50-365-845steril
Tüy dökücü kremNair
gentleMACS C TüpleriMiltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS Isıtıcılı Octo ayrıştırıcıMiltenyi Biotec130-096-427
10 numaralı neşter bıçaklarıFisher Scientific12-000-162steril
Dokumasız gazlı bez süngerler, 4x4 inçFisher Scientific22-028-558steril
RPMI 1640 1x + L-GlutaminGibco11875093steril
Tümör ayrışma kiti, insanMiltenyi Biotec130-095-929

Kaynaklar

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 3 (3), 209-249 (2021).
  2. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
  5. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 1-16 (2020).
  6. Wilson, H. E., et al. Human breast cancer xenograft model implicates peroxisome proliferator-activated receptor signaling as driver of cancer-induced muscle fatigue. Clin Cancer Res. 25 (7), 2336-2347 (2019).
  7. Wilson, H. E., et al. Skeletal muscle reprogramming by breast cancer regardless of treatment history or tumor molecular subtype. NPJ Breast Cancer. 6 (1), 18(2020).
  8. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  9. DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: Protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. 14, Unit14.23(2013).
  10. Whittle, J. R., Lewis, M. T., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Patient-derived xenograft models of breast cancer and their predictive power. Breast Cancer Res. 17 (1), 17(2015).
  11. Fleming, J. M., Miller, T. C., Meyer, M. J., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. Local regulation of human breast xenograft models. J Cell Physiol. 224 (3), 795-806 (2010).
  12. Okano, M., et al. Orthotopic implantation achieves better engraftment and faster growth than subcutaneous implantation in breast cancer patient-derived xenografts. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
  13. Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. Use antibiotics in cell culture with caution: Genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 1 (1), 7533(2017).
  14. Amens, J. N., Bahçecioglu, G., Zorlutuna, P. Immune system effects on breast cancer. Cell Mol Bioeng. 14 (4), 279-292 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Meme Kanseri PDXT m r DisosyasyonuMeme Ya YastH cre S spansiyonu Haz rlamamm nodefisyen FarelerRPMI 1640 MedyumuResept r Durumu De erlendirmesiHematoksilin Eozin Boyama
Meme kanseri hasta kaynaklı ksenogreftlerin yüksek verimli dissosiyasyonu ve ortotopik implantasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.