Yöntem makalesi

Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

1.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67616

⸱

24 Ocak 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, özellikle zebra balıklarında düşük bolluktaki proteinleri görselleştirmek için yararlı olan, yeni geliştirilen ve modifiye edilen bir in vivo sistem olan zebra balığı larvalarında proteinleri floresan protein etiketi ile etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

CRISPR/Cas9 aracılı knock-in (KI) teknolojisi, erken gelişim aşamasındaki şeffaflığı nedeniyle in vivo görüntüleme için tercih edilen bir model organizma olan zebra balığında (Danio rerio) daha kolay floresan protein etiketlemesine olanak tanır. Burada, zebra balığında sonraki fizyo-patolojik çalışmalar için kritik bir temel oluşturacak olan zebra balığı larvalarında yüksek verimli floresan geni KI, KI kurucuları için hızlı tarama ve düşük bollukta protein takibi yapmak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Mevcut protokol, ilgilenilen gen için sgRNA tasarımı, sgRNA in vitro transkripsiyon, Cas9 mRNA in vitro transkripsiyon, en yüksek verimliliğe sahip olan için in vivo sgRNA taraması, donör plazmid tasarımı ve yapımı, zebra balığı larvalarına mikroenjeksiyon, KI kurucu ekranı ve zebra balığı canlı görüntüleme için eksiksiz adımları içermektedir. Bu protokolün kritik adımları, sorun giderme ipuçları, kalite kontrol yöntemleri ve avantajları ve uygulamaları dahil edilmekte ve tartışılmaktadır. Bu protokol, düşük maliyetle hızlı ve doğru sonuçlar sağlar ve birden fazla deneme ile doğrulanmıştır.

Giriş

İyi kabul görmüş bir model organizma olan zebra balığı (Danio rerio), gelişim, rejenerasyon, tümör oluşumu, enfeksiyon ve bağışıklık vb. ile ilgili bilimsel araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3,4,5. Zebra balığı, melanogenezi inhibe eden ve zebra balığı larvalarını nispeten uzun bir süre boyunca şeffaf hale getiren toksik bir kimyasal bileşik olan PTU (1-fenil 2-tiyoüre) ile tedavi edildiğinde in vivo canlı görüntüleme için özellikle uygundur6. Casper7 ve crystal8 gibi genetiği değiştirilmiş şeffaf zebra balığı türleri de mevcuttur ve yetişkinliğe kadar canlı görselleştirme ve soy takibine olanak tanır. Yetişkin balıklarda daha iyi canlı görselleştirme için pigmentasyonun üstesinden gelmeye yönelik bu çabaların yanı sıra, araştırmamız floresan protein etiketlemesini daha verimli ve daha az yapay hale getirmek için güçlü gen düzenleme stratejileri geliştirmeye de odaklanmaktadır.

CRISPR/Cas9 aracılı mikrohomoloji aracılı uç birleştirme (MMEJ) tabanlı KI teknolojisi, nispeten yüksek KI verimliliğinedeniyle zebra balığı da dahil olmak üzere birçok organizmada genetik modifikasyonlarda yaygın olarak uygulanmaktadır 9,10,11,12. Başarılı bir in vivo görüntüleme elde etmek için iki zorluğun ele alınması gerekir. Biri, rekombinasyon işlemi ile ortaya çıkan indeller veya yara izleridir; Diğeri ise, bazı hedef genlerin endojen olarak düşük bir seviyede eksprese edilmesidir, bu da birlikte eksprese edilen floresan etiketinin zayıf sinyallerine ve in vivo tespitin başarısızlığına yol açar. Verimli ve doğru protein etiketlemeyi ve endojen gen ekspresyon seviyelerinin girişimini en aza indirmeyi amaçlayan yakın tarihli bir çalışma, floresan sinyal yükseltici "VH" etiketleme yöntemi ile düşük eksprese edilen genleri floresan etiketleme için daha uygun olan ve donör omurgasını optimize ederek ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile floresan doğrulamalarını birleştirerek önceki yöntemlerden daha verimli olan rafine bir germ hattı ekran iş akışını13 birleştiren optimize edilmiş bir strateji bildirdi Germline ekranını en düşük zaman ve çaba maliyetiyle uygulamak. Burada, embriyo hazırlama ve zebra balığı yetiştiriciliği adımları, sgRNA tasarımı, sgRNA'ların in vitro transkripsiyonu, Cas9 mRNA'nın in vitro transkripsiyonu, zebra balığı embriyo mikroenjeksiyonu, en yüksek verimliliğe sahip sgRNA'lar için in vivo tarama, donör plazmid tasarımı ve yapımı, KI zebra balığı genotiplemesi, KI germ hattı taraması ve KI zebra balığı görüntüleme ve fenotiplemesi dahil olmak üzere ayrıntılı bir adım adım protokol sunuyoruz. Son teknoloji bir floresan etiketleme yöntemi sağlayan bu hepsi bir arada protokol, şüphesiz çeşitli bilimsel alanlarda zebra balığı kullanan çalışmaları teşvik edecek ve farklı akademik geçmişlere sahip okuyuculara fayda sağlayacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm zebra balığı yetiştiriciliği ve deneyleri, Xiamen Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Yönetimi ve Etik Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı ve Xiamen Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Merkezi tarafından tanımlanan iyi hayvan uygulamalarına sıkı sıkıya bağlıydı. Çalışma, hayvan kullanımı ile ilgili tüm etik düzenlemelere uygundur.

NOT: Tüm yetişkin ve larva zebra balıkları, Xiamen Üniversitesi'nin zebra balığı akvaryum sisteminde 13/11 saat aydınlık/karanlık döngüsü ile 28,5 °C'de standart protokollere göre muhafaza edilmiştir. Embriyolar, kontrollü bir inkübatörde (sıcaklık, 28 ± 0.5 °C; ışık, 13 saat ışık / 11 saat karanlık döngü) embriyo tamponunda (Tablo 1) tutuldu. Tüm zebra balıklarının beslenmesi ve genel izlenmesi günde iki kez (sabah 9 ve akşam 4) yapıldı. Bu araştırmada kullanılan vahşi tip (WT) suş Tübingen (Tü) idi.

1. İlgilenilen genlerin seçilmesi ve rehber RNA'nın tasarlanması

  1. İlgilenilen genin bilgilerini bilin. Veritabanında (https://zfin.org/) arama yapın ve gen varyantlarının sayısının bilindiğinden emin olun. Genom dizisi, cDNA dizisi ve kodlama dizisi (CDS) dahil olmak üzere Ensembl'den (https://www.ensembl.org/) hangi varyantı manipüle edeceğinize ve hedef gen bilgilerini indireceğinize karar verin. Dizilerdeki eksonları, intronları, UTR'leri işaretleyin, kodonları başlatın ve kodonları durdurun.
  2. sgRNA hedef bölgesi olarak hedef genin durdurma kodonunun (TAA, TAG veya TGA) yukarı akışında 200 bp'den fazla CDS seçmeyin.
    NOT: DNA dizilimi ile bu bölgenin tek nükleotid polimorfizmlerine (SNP'ler) sahip olmadığından emin olmak daha iyidir.
  3. Seçilen hedef bölgede aday sgRNA'lar tasarlamak ve sgRNA verimliliklerini tahmin etmek için CRISPRscan web sitesini (https://www.crisprscan.org/) kullanın.
    1. DNA dizisini tasarım çerçevesine girin.
    2. Tür, hedef dışı maksimum uyumsuzluk(lar), endonükleaz ve promotör dahil olmak üzere ilgili bilgileri seçin. Bu durumda, Zebra balığı- Danio rerio, Uyumsuzluk yok, Cas9-NGG ve in vitro T7 promotörü seçin.
    3. Bazı sgRNA'ları almak için sgRNA'ları al'a tıklayın. İn vivo ekran için yüksek CRISPRscan skoru ve düşük hedef dışı skoru olan 5-7 sgRNA'yı seçin.
  4. sgRNA/Cas9 mikroenjeksiyonundan sonra nakavt etkinliğini doğrulamak için müteakip PCR amplifikasyonu, enzimatik sindirim testi ve dizileme için ürünü yaklaşık 500 bp olan sgRNA hedef bölgelerini çevreleyen PCR primerleri tasarlayın. Yukarı ve aşağı akış bölgelerinde yaklaşık 20 bp'lik bir dizi seçin ve GC içeriğinin yaklaşık% 50 olduğundan ve Tm değerinin 50-55 ° C arasında olduğundan emin olun.
    NOT: Kombinasyon yapılması gerekiyorsa, iki yukarı akış astarı ve iki aşağı akış astarı tasarlayın.

2. sgRNA'ların hazırlanması

NOT: Ortak sgRNA iskele dizisi (Şekil 1) bir plazmide klonlanmıştır (Malzeme Tablosu).

  1. PCR, sırasıyla Tablo 2 ve Tablo 3'te gösterilen primerleri ve PCR karışımını kullanarak T7 promotörü-sgRNA konjugat dizisini amplifiye eder. Tablo 4'teki PCR programını çalıştırın. Jel elektroforezi çalıştırın (Agaroz jel, TAE tamponunda %1.2 agaroz; TAE tamponu [Tablo 1]; 200 V; ürünlerin doğru olduğundan emin olmak için 2 μL PCR ürünleri ile yaklaşık 5 dakika (MW yaklaşık 150 bp'dir).
  2. PCR ürünlerini, üreticinin talimatlarına uyarak bir saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) veya piyasada bulunan diğer kitleri kullanarak saflaştırın.
    NOT: Şu andan itibaren, RNaz içermeyen reaktifler ve materyaller kullanılmalı ve RNaz kontaminasyonunu önlemek için prosedürler özel bir dikkatle yürütülmelidir (bkz.
    1. Bağlayıcı tamponu PCR ürünlerine 5:1 hacim oranında ekleyin ve karıştırın. Karışımı 2 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirilen kolona uygulayın. 17.900 × g'da 25 °C'de 1 dakika santrifüjleyin. Akışı atın ve sütunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin.
    2. Kolona 750 μL yıkama tamponu ekleyin ve 25 °C'de 1 dakika boyunca 17.900 × g'da santrifüjleyin. Akışı atın ve sütunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin. 17.900 × g'da 25 °C'de 2 dakika santrifüjleyin. Kolonu 1,5 mL'lik temiz bir tüpe yerleştirin.
    3. Kolona 20 μL nükleaz içermeyen su ekleyin, DNA'yı elüte etmek ve bir spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçmek için 25 °C'de 2 dakika boyunca 17.900 × g'da santrifüjleyin.
  3. Saflaştırılmış DNA'nın 250 ng'ını in vitro olarak kopyalamak için Malzeme Tablosunda veya eşdeğer kitlerde T7 RNA Üretim Sistemini kullanın. RNaz içermeyen işlemler ve koşullar gereklidir.
    1. Reaksiyonu Tablo 3'e göre PCR tüplerinde (RNaz içermeyen) hazırlayın ve hafifçe karıştırın. 37 °C'de metal bir banyoda 2 saat inkübe edin.
    2. 0,5 μL DNaz I (RNaz içermeyen) ekleyin ve hafifçe karıştırın. 37 °C'de metal bir banyoda 15-20 dakika inkübe edin.
    3. Etanol çökeltme
      1. Nihai hacmin 20 μL'ye ulaşmasını sağlamak için her reaksiyona RNaz içermeyen su ekleyin ve numuneleri 1.5 mL'lik tüplere aktarın.
      2. 50 μL %100 etanol (2.5V, RNaz içermez) ekleyin, iyice karıştırın, karışımı 10 dakika buza koyun ve 21.000 × g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
      3. Süpernatanı atın, peleti 500 μL %75 etanol (RNaz içermeyen) ile yıkayın ve 21.000 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
      4. Süpernatanı atın, peleti metal bir banyoda 45 °C'de kurutun ve 40 μL RNaz içermeyen su ile çözün.
        NOT: KI için sgRNA'ların LiCl ile çökeltilmesi gerekir (aşağıya bakın), ancak KO için gerekli değildir.
    4. Agaroz jelleri çalıştırın (Agaroz jel: TAE tamponunda %1.2 agaroz; TAE tamponu [Tablo 1]; 200 V; yaklaşık 5 dakika) kaliteyi tahmin etmek için 1-2 μL RNA ile ve ardından bir spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçün.
      NOT: sgRNA'lar daha fazla kullanım için -20 °C ila -80 °C'de saklanabilir.

3. Cas9 mRNA'nın Hazırlanması

  1. Cas9 plazmidinin (Malzeme Tablosu) enzimatik sindirimini üreticinin talimatlarına göre XbaI kullanarak 1,5 saatten fazla gerçekleştirin (reaksiyon karışımı için Tablo 3'e bakınız). Jel elektroforezi ile test (Agaroz jel: TAE tamponunda %1.2 agaroz; TAE tamponu [Tablo 1]; 200 V; yaklaşık 10 dakika) sindirimin tam olup olmadığını kontrol etmek için 1 μL ile.
  2. Ürünleri sgRNA PCR ürünleriyle aynı şekilde saflaştırın (adım 2.2.1-2.2.3). Buradan itibaren RNaz içermeyen malzemeler ve işlemler gereklidir.
  3. Cas3 mRNA'nın in vitro transkripsiyonu için T9 transkripsiyon kitini (Malzeme Tablosu) veya eşdeğer kitleri kullanın.
    1. Reaksiyonu Tablo 3'e göre RNaz içermeyen PCR tüplerinde hazırlayın ve hafifçe karıştırın. 37 °C'de 2,5 saatten fazla inkübe edin.
    2. 1 μL RNaz içermeyen Turbo DNaz ekleyin ve 37 °C'de 15-20 dakika inkübe edin.
    3. LiCl yağışı
      1. Numuneleri 1,5 mL'lik tüplere aktarın, 30 μL LiCl (1,5 V) ekleyin ve hafifçe karıştırın.
      2. Karışımı -20 °C'de yaklaşık 30 dakika bekletin ve ardından 21.000 × g'da 30 dakika 4 °C'de santrifüjleyin.
      3. Süpernatanı atın, peletleri 500 μL %75 etanol (RNaz içermez) ile yıkayın ve 21.000 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
      4. Süpernatanı atın, peleti 45 °C'de kurutun ve 40 μL RNaz içermeyen suda çözün.
  4. Bir spektrofotometre kullanarak Cas9 mRNA'nın konsantrasyonunu ölçün. Agaroz jelleri çalıştırın (Agaroz jel: TAE tamponunda %1.2 agaroz; TAE tamponu [Tablo 1]; 200 V; yaklaşık 10 dakika) konsantrasyonu ve kaliteyi kontrol etmek için 1-2 μL RNA ile.
    NOT: Bir OD 260/280, 2.0'ın üzerinde olmalı ve konsantrasyon 1000 ng/μL civarında veya daha yüksek olmalıdır. Cas9 mRNA, daha fazla kullanım için -20 ° C ila -80 ° C'de saklanabilir.

4. Mikroenjeksiyon için hazırlık

  1. Zebra balığını hazırlayın: Mikroenjeksiyondan önceki gece, sağlıklı bir dişi zebra balığı ve iki sağlıklı erkek zebra balığını, çiftleşmeye hazırlamak için erkekleri ve dişileri ayırmak için bir bölücü kullanarak bir çiftleşme tankına yerleştirin.
  2. % 4 agaroz, lizis tamponu ve embriyo tamponu (pH 8.0) hazırlayın (Tablo 1).
  3. Mikroenjeksiyon için kılcal cam iğneler hazırlayın (Malzeme Tablosu).
  4. Mikroenjeksiyon plakalarını hazırlayın: 35 mL erimiş %4'lük agarozu 10 cm'lik bir Petri kabına dökün ve kama şeklinde oluklar oluşturmak için yavaşça plastik bir kalıp yerleştirin. Kalıba hafifçe vurarak hava kabarcıklarını önleyin. Katılaştıktan sonra üzerine bir miktar çift damıtılmış su (ddw) ekleyin ve plakayı daha sonra kullanmak üzere 4 °C'ye yerleştirin.

5. Mikroenjeksiyon yoluyla sgRNA verimlilik testi

  1. Mikroenjeksiyon gününde, mikroenjeksiyon karışımını Tablo 5'te listelendiği gibi RNaz içermeyen bir ortamda buz üzerinde hazırlayın.
  2. Mikroenjeksiyon solüsyonunu RNaz içermeyen bir pipet ucu kullanarak iğneye yükleyin (Malzeme Tablosu). Baloncuk getirmemeye dikkat edin.
  3. Yüklenen iğneyi bir mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre yerleştirin. Enjeksiyon iğnesinin ucunu sivri uçlu cımbızla mikroskop altında kesin, kırmak için iğnenin ucunu hafifçe sıkıştırın. Ardından, enjeksiyon basıncını, iğne tutarlı bir şekilde 1 nL'lik bir damlacık çıkarana kadar ayarlayın, bu da bir aşama mikrometresi ve bir kılcal damar kullanılarak ölçülür.
  4. Bölücüyü çıkarın ve balığın yaklaşık 6 dakika üremesine izin verin. 1 hücre aşamalı embriyoları toplayın ve embriyo tamponu içeren bir Petri kabına aktarın.
    1. Embriyoların sağlığını ışık mikroskobu altında inceleyin ve döllenmemiş yumurtaları veya kalıntıları temizleyin. 20 sağlıklı embriyoyu ayrı bir Petri kabında ve etikette enjekte edilmemiş kontroller olarak bir kenara koyun.
  5. Sağlıklı 1 hücreli aşamalı embriyoları küçük bir fırça kullanarak oda sıcaklığına (RT) ısıtılmış mikroenjeksiyon plakasının oluklarına aktarın ve nazikçe hizalayın. Fazla arabelleği çıkarın.
  6. Sonraki tüm işlemleri stereo mikroskop altında gerçekleştirin. Embriyonun konumunu, hayvan direği iğneye bakacak şekilde nazikçe ayarlamak için iğne ucunu kullanın. Karışık çözeltinin 1 nL'sini hayvan direğine enjekte edin.
  7. Bir sgRNA için yaklaşık 100 embriyonun enjeksiyonu yeterlidir. Enjeksiyondan sonra, embriyoları embriyo tamponu ile altı oyuklu bir plakaya nazikçe durulayın. Çanağı 28,5 °C sabit sıcaklıktaki bir inkübatöre koyun. Döllenmeden yaklaşık 10 saat sonra (hpf), embriyonik gelişimi stereo mikroskop altında inceleyin ve ölü embriyoları çıkarın.
  8. 24 hpf'de, genotipleme için embriyoları 1.5 mL'lik tüplerde toplayın (sgRNA başına 3 tüp ve tüp başına 5 embriyo). Fazla suyu bir pipetle dikkatlice atın, her tüpe 100 μL Proteinaz K içeren lizis tamponu (0.5 mg / mL'lik son konsantrasyonda) ekleyin ve 56 ° C'de 1 saat ve ardından 95 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
  9. 200 μL etanol (2V) ekleyin, iyice karıştırın ve RT'de 10 dakika boyunca 19.000 × g'da santrifüjleyin.
  10. Süpernatanı atın, peleti 500 μL% 70 etanol ile yıkayın ve RT'de 3 dakika boyunca 19.000 × g'da santrifüjleyin.
  11. Süpernatanı atın, peleti RT'de kurutun ve 50 μL ddw ile çözün. Ardından, PCR için reaksiyon karışımını hazırlamak için 1 μL ekstrakt kullanın (Tablo 3) (PCR primerleri için bkz. adım 1.4).
  12. Agaroz jelleri çalıştırın (Agaroz jel: TAE tamponunda %1.2 agaroz; TAE tamponu [Tablo 1]; 200 V; PCR'nin başarılı olduğunu doğrulamak için 2 μL PCR ürünleri ile yaklaşık 10 dakika ve ardından sgRNA'ların etkinliğini belirlemek için enzimatik sindirimizasyonlar yapın (Tablo 3). Enzimatik sindirim karışımını yavaşça karıştırın. Üretici tarafından önerilen süre boyunca sıcaklıkta inkübe edin.
  13. Sindirilmiş ürünler için agaroz jelleri çalıştırın (Agaroz jel: TAE tamponunda %1.2 agaroz; TAE tamponu [Tablo 1]; 200 V; yaklaşık 10 dakika) sindirilmemiş PCR ürünleri ile sindirimin gerçekleşip gerçekleşmediğini doğrulamak için kontroller olarak.
    NOT: Cas9 bölünme bölgesi, PAM'ın yaklaşık 3 bp yukarısındadır, bu nedenle kısıtlama enzimi tanıma bölgesi, PAM'ın 6 bp yukarı akışını kaplamak için en iyisidir. SgRNA verimliliği yüksekse, kesme ve yanlış onarım indellere yol açacaktır, bu nedenle kısıtlama enziminin artık kesme bölgesini tanıyamama olasılığı yüksektir. SgRNA verimsizse ve kısıtlama enzimi tanıma bölgesi sağlamsa, enzimatik sindirim normal şekilde gerçekleşebilir. Agaroz jel elektroforezi sayesinde, enzimatik sindirimin gerçekleşip gerçekleşmediği ayırt edilebilir.
  14. Uygun bir kısıtlama enzimi tanıma bölgesi yoksa, PCR ürünlerini sıralayın ve sgRNA verimliliğini TIDE (https://tide.nki.nl/) ile analiz edin. PCR yapmayı ve ayrıca WT genomik DNA'yı kontrol olarak sıralamayı unutmayın.
    1. Web sitesini açın ve TIDE'ı Başlat'a tıklayın. sgRNA'nın kılavuz dizisini Kılavuz dizisi altındaki çerçeveye girin.
    2. WT kontrolü için sıralama sonucunu girmek için Kontrol Örneği Kromatogramı (.ab1 veya .scf) altında Gözat'a tıklayın ve düzenlenen örneğin sıralama sonucunu girmek için Test Örneği Kromatogramı (.ab1 veya .scf) altında Gözat'a tıklayın.
    3. Görünümü Güncelle'yi tıklayın. Web sitesi, iki dizi arasındaki farkın bir yüzdesini verecektir. Daha büyük bir yüzde, daha yüksek bir sgRNA verimliliğini gösterir. %80'in üzerinde nakavt verimliliğine sahip bir sgRNA, sonraki KI prosedürleri için uygundur.

6. Floresan protein etiketleme için donör plazmid yapısı

  1. Önce plazmide klonlanacak ve daha sonra Şekil 2'deki gibi balık genomuna daha fazla eklenecek tasarım dizileri: tahmin edilen Cas9 bölünme bölgesinin yukarı akışında 25 bp'lik bir dizi, sol homoloji kolu olarak tasarlanmıştır ve tahmin edilen Cas9 bölünme bölgesinin aşağı akışında 25 bp'lik bir dizi sağ homoloji koludur. Endojen genin bütünlüğünü korumak için sgRNA hedef bölgesi ile durdurma kodonu arasına CDS'yi donöre yerleştirin.
    NOT: Tamamlanan CDS'nin 5'inin ( Şekil 2'deki element 4), rekombinant genomun sgRNA/Cas9 kompleksi tarafından ikincil bölünmesini önlemek için eşanlamlı olarak mutasyona uğratılması gerekir.
  2. Donör plazmid yapımı için eksonükleaz III (Malzeme Tablosu) kullanarak ligasyondan bağımsız klonlama (LIC)14 kullanın. Gibson montajı gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Klonlama primerleri Şekil 2'de gösterilmiştir. "1", "2", "3" ve "4" elementleri astarlar tarafından taşınır:
    1. Vektör, "1" elemanı ve "2" elemanının bir parçası ile örtüşen bir diziden oluşan Primer F1'i tasarlayın.
    2. "1" elemanı, "2" elemanı ve "3" elemanının bir parçasından oluşan Tasarım Astarı R2.
    3. "3", "4" elemanlarından ve sgRNA hedef bölgesini takip eden CDS'nin 5' dizisinden oluşan Primer F2'yi tasarlayın.
    4. Genin CDS'sinin 3' dizisinden ve vektörle örtüşen bir diziden oluşan Primer R1'i tasarlayın.
    5. Şablon olarak zebra balığı cDNA'sını kullanın ve primerleri kullanarak PCR'ler yapın.
      NOT: Primerler arasında veya primer ile vektör arasında önerilen örtüşme 15-20 bp'dir. Bu primerler hedef gene özgüdür ve cx39.9 ve cx44.1 için primerlerin bir örneği Tablo 2'de verilmiştir. Bu tasarım daha önce açıklandığı gibi başarıyla uygulandı13. Ayrıntılı plazmid haritaları Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2'de verilmiştir. cx39.9 ve cx44.1'in tasarlanan DNA ve protein dizileri Ek Dosya 3'te verilmiştir.
    6. PCR ürünlerini sgRNA PCR ürünleriyle aynı şekilde saflaştırın (adım 2.2.1-2.2.3).
  3. Donör vektörünü (Şekil 3 ve Tablo 6) uygun kısıtlama enzimleri ile sindirin. Bu örnekte, enzimler PciI ve Acc65I'dir (Malzeme Tablosu). Makineyi üreticinin talimatlarına göre yapın (Tablo 3). Sindirilmiş donör vektörünü sgRNA PCR ürünleriyle aynı şekilde saflaştırın (adım 2.2.1-2.2.3).
  4. Saflaştırılmış PCR fragmanlarını ve sindirilmiş donör vektörünü DNA jel elektroforezi ile ölçün (DNA jeli: TAE tamponunda %1.2 agaroz; TAE tamponu [Tablo 1]; 200 V; yaklaşık 10 dakika). LIC için reaksiyon karışımını Tablo 3'e göre hazırlayın.
    NOT: Reaksiyonun tüm tüpleri ve bileşenleri buz üzerine yerleştirilmeli ve reaksiyon ve tüm manipülasyonlar buz üzerinde yapılmalıdır. Son bileşen olarak reaksiyona 1 μL Exo III (20 birim) ekleyin ve ardından tüm bileşenleri iyice karıştırmak için hemen yukarı ve aşağı pipetleyin. Sindirilmiş vektörün kendi kendine tavlanma potansiyelini göstermek için kontrol olarak PCR fragmanları içermeyen bir reaksiyon karışımı eklemeyi unutmayın.
  5. Reaksiyon karışımını hemen buzun üzerine koyun ve 60 dakika inkübe edin.
  6. Reaksiyonu durdurmak için 1 μL 0,5 M EDTA (pH 8.0) ekleyin, iyice karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından 60 °C'de 5 dakika ve ardından 5 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  7. LIC ürünlerini kullanarak DH5α gibi yetkin hücreleri dönüştürün ve bakterileri LB plakalarında (Malzeme Tablosu ve Tablo 1) uygun antibiyotiklerle (bu durumda ampisilin) 16 saat boyunca büyütün.
  8. PCR fragmanı içeren plakalardaki koloni sayısı ile kontrol plakasındaki koloni sayısı arasında büyüklük farkları olduğundan emin olun. Enzimatik sindirim analizi ve DNA dizilimi için LIC plakalarından tek koloniler seçin.
  9. Doğru donör plazmitlerini sgRNA PCR ürünleriyle aynı şekilde bir saflaştırma kiti ile ekstrakte edin ve saflaştırın (adım 2.2.1-2.2.3). Nihai konsantrasyonun 300 ng/μL'nin üzerinde olduğundan emin olun.

7. KI geni için zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyonu

  1. Mikroenjeksiyon solüsyonunu Tablo 7'ye göre hazırlamak dışında yukarıda açıklanan tüm mikroenjeksiyon manipülasyonlarını gerçekleştirin.

8. Floresan proteini etiketli döllerin taranması ve tanımlanması

  1. Mikroenjeksiyondan 12-48 saat sonra stereo floresan mikroskobu altında floresansı gözlemleyin.
  2. Yeni kurulan bir ekran yöntemini uygulayın13. Belirgin bir floresan gözlenirse, floresan larvaları toplayın ve onları yetiştirin. Sadece bir floresan izi gözlenirse veya hatta floresan gözlenmezse, enjekte edilen tüm larvaları geri alın.
  3. 1 aylıkken, mikroenjekte edilen zebra balığını% 0.02 tricaine ile uyuşturun (Tablo 1). Her zebra balığı için, kuyruk yüzgecinin küçük bir parçasını etiketli bir PCR tüpüne toplayın ve karşılık gelen anestezi uygulanmış zebra balığını, aynı etikete sahip UV ile sterilize edilmiş filtrelenmiş su (pH 7.2) içeren altı oyuklu bir plakanın bir oyuğunda tutun.
  4. Genomik DNA ekstraksiyonu için alkalin lizis yöntemini ( Tablo 1'deki lizis tamponu) 15 ve ardından 5'-eklem PCR'yi kullanın. Sol homoloji kolunun yukarı akışında ileri astarı ve ek parça üzerinde ters astarı tasarlayın (Şekil 4). PCR ürününün boyutu 500 bp civarındadır. Primer örnekleri için Tablo 2'ye bakınız.
    NOT: Floresan zebra balığı için bu PCR, KI'nin doğruluğunu doğrulamak için kullanılır, bu nedenle PCR ürünü daha sonra dizilemeye tabi tutulur. Floresan içermeyen zebra balığı için bu PCR, KI'nin oluşup oluşmadığını doğrulamak için kullanılır. PCR pozitif balıkları seçin ve onları F0 olarak yetişkinliğe yükseltin.
  5. Taranan F0'ın WT ile eşleştirilmesinden elde edilen F1 embriyolarını GFP ekspresyon paternleri için inceleyin ve bağlantı PCR ile genotiplendirin.
    NOT: Hedef yerleştirme F1'de meydana gelirse (mükemmel olsun ya da olmasın), karşılık gelen F0 , PCR ürünü daha sonra sıralanan kalıtsal F0 olarak tanımlanır. Yerleştirme doğruysa, karşılık gelen F0 , istenen F0 olarak tanımlanır.
  6. İstenilen F0 elde edildiğinde, hedef proteini gözlemlemek ve izlemek için görüntüleme için dölleri kullanın.

9. Görüntüleme ve veri işleme

  1. Görüntülenecek gelişim aşamasını belirleyin. Balıkları önceden hazırlayın. Gerekirse pigmentleri çıkarmak için balığa seyreltilmiş 1-fenil 2-tiyoüre (PTU;% 0.003, Malzeme Tablosu) ekleyin.
    NOT: PTU, 24 hpf'den sonra uygulanırsa daha az etkili olacaktır. Bu örnekte, PTU embriyo tamponuna 24 hpf'den önce eklendi ve zebra balığı larvaları görüntüleme için işlendiğinde 48 hpf'ye kadar tamponda tutuldu.
  2. 35 mm'lik bir tabağa 2 mL eritilmiş %4 agaroz (Tablo 1) ekleyin ve katılaşması için bir kenara bırakın. Balıkları %0.02 trikain içeren embriyo tamponuna aktarın (Tablo 1).
  3. 200 μL erimiş %4 agarozu 1 mL ddw içinde seyreltin. Anestezi uygulanmış balığı, agaroz soğuduğunda 1 mL'lik bir pipet kullanarak seyreltilmiş agarozun içine aktarın. Balık montaj agarozunu yavaşça karıştırın ve adım 9.2'de hazırlanan katılaşmış %4 agaroz jeli içeren tabağa aktarın.
  4. Balıkları, ilgilenilen kısım üstte olacak şekilde konumlandırın.
  5. Üreticinin talimatlarını izleyerek görüntüleme ve veri işleme için dik bir konfokal floresan mikroskobu kullanın (Malzeme Tablosu).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Konneksinler adı verilen polimerik proteinlerden oluşan boşluk bağlantıları, temas eden hücreler arasında düşük moleküler ağırlıklı metabolitlerin ve iyonların değişimi için gereklidir. Yukarıda tarif edilen floresan protein etiketleme yöntemi, sırasıyla connexin 39.9 (Şekil 5A) ve connexin 44.1'i (Şekil 5B) etiketlemek için kullanıldı. Doğru KI, bağlantı PCR'leri ile doğrulandı (Şekil 6). Yayınlanmış veriler

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu deneyi sorunsuz ve başarılı bir şekilde yürütmek için bazı önemli hususlara daha fazla dikkat etmek gerekir. Enjeksiyon için en uygun zebra balığı gelişim aşaması tek hücreli aşama olmalıdır. Bu aşamada enjeksiyonun tamamlanması, sonraki bölünme yoluyla üretilen tüm hücrelerin KI için gerekli bileşenleri içermesini sağlayabilir, böylece tüm hücrelerde aynı anda KI oluşma olasılığını artırabilir ve KI'nin genel başarı oranını iyileştirebilir. Ortam sıcaklığının düşürülmesi zebra balığı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar bu yazıda hiçbir rekabet çıkarı beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu el yazmasını düzelttiği ve düzenlediği için Lu Zhou'ya (Xiamen Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (JH'ye 82388201 hibe; NZ'ye 31801158 hibe), Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2020YFA0803500'den JH'ye), CAMS Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (CIFMS) (2019-I2M-5-062'den JH'ye), Fujian Eyaleti Yerel Bilim ve Teknoloji Geliştirme Özel Programı Merkezi (2022L3079'dan JH'ye), ve FuXia-Quan Zi-Chuang Bölgesi İşbirliği Programı (3502ZCQXT2022003'ten JH'ye). Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayın kararları veya makale hazırlamada hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1000 ve mikro; L  ipuçlarıHerhangi bir markaN/ATüm manipülasyonlar için
1,5 mL tüplerHerhangi bir markaN/AÇeşitli solüsyonların depolanması ve santrifüjlenmesi için
1,5 mL tüpler (RNase içermez)Herhangi bir markaN/ARNaz içermeyen solüsyonların depolanması ve santrifüjlenmesi için
10 & mikro; L ipuçlarıHerhangi bir markaN/ATüm manipülasyonlar için
10 & L uçlar (RNaz içermez)Herhangi bir markaN/ARNaz içermeyen manipülasyonlar için
1000 ve mikro; L  ipuçları (RNaz içermez)Herhangi bir markaN / ARNaz içermeyen manipülasyonlar için
1-fenil 2-tiyoüre (PTU)SigmaP7629Melanogenezi inhibe etmek ve larvaları şeffaf
tutmak için 200 & L ipuçlarıHerhangi bir markaN/ATüm manipülasyonlar için
200 & L ipuçları (RNaz içermez)Herhangi bir markaN/ARNaz içermeyen manipülasyonlar için
2x Taq Plus Master Mix II (Boya Artı)VazymeP213-03sgRNA verimlilik testleri için PCR
35 mm tabaklarCorning430165
6 oyuklu plakalarıHerhangi bir markaN/AZebra balığı tek tek ve geçici olarak yetiştirmek için
Acc65INEBR0599Sİçin enzimatik sindirim
ASETIK asitSigma695092TAE tampon hazırlama için
AgarBiofroxx8211GR500LB plakaları için
Ampisilin, sodyum tuzuSangon A610028LB plakaları için
CaCl2SigmaC5080Embriyo tamponu hazırlama için
Kılcal tüplerHarvard Aparatı30-0016Enjeksiyon için iğneler için Kılcal
borularHerhangi bir markakimliği (iç çap) = 0,1 mm1 nL'lik bir damlacık miktarını belirlemek için
CRISPRscanCRISPRscan  http://www.crisprscan.org/sgRNA tasarımı
DH5 ve alfa için;TIANGENCB101Dönüşüm için
EDTASigmaE6758Lizis tamponu ve TAE tamponu hazırlama için
EnsemblEnsembl   https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/IndexGen bilgisini bulmak için
DNAsaflaştırma ve ekstraksiyon içinHUSHI64-17-5
Eksonükleaz IIITakara2170ALIC
Gazla çalışan mikro enjektörWarner InstrumentsPLI-100AMikroenjeksiyon
için Jel elektroforez sistemiWIXWIX-EP3000Jel için elektroforez
EldivenlerHerhangi bir markaN/ATüm manipülasyonlar için
Glikozsgdbio10010518LB plakaları için
GliserolSangonA501745LB plakaları için
gRNA-pMD19-TÇin Zebra Balığı Kaynak Merkezi (CZRC)CZP3sgRNA plazmidi içeren sgRNA iskelesi
KClSigmaP5405Embriyo için Tampon hazırlama
Lityum klorür çökeltme çözeltisiThermofisherAM9480sgRNA'ların çökelmesi, RNaz içermez
Düşük erime noktalı agarozSangonA600015%4 agaroz jellerinin hazırlanması için
Magnezyum sülfatsgdbio20025118LB plakalar için
Metal banyosuHerhangi bir markaN/ASabit sıcaklıkta inkübasyon için
Metilen mavisiSigmaM9140Embriyo tamponu hazırlama için
Microinection kalıbıEv yapımıN/A Mikroenjeksiyonsırasında embriyoları tutmak için oluklar oluşturmak için
Mikroyükleyici, Femtotips ve diğer cam mikrokılcal damarları doldurmak için uç, steril, 0.5 – 20 &mikro; U, 100 mm, açık gri, 192 adet. (2 raf ve kez; 96 adet)Eppendorf5242956003Mikroenjeksiyon solüsyonunu enjeksiyon iğnesine yüklemek için, RNaz içermeyen
Mikropipet çektirme SutterAletiP-97Enjeksiyon için iğne oluşturmak için
MikropipetlerEppendorfN/ATüm manipülasyonlar için
MikrodalgaHerhangi bir markaN/A Enjeksiyonplakası ve agaroz jelleri dökümü için
MinElute PCR Saflaştırma Kiti (50)QIAGEN28004PCR ürünlerini ve sindirim ürünlerini saflaştırmak için, RNaz içermeyen
mMESSAGE mMACHINE T3 Transkripsiyon KitiInvitrogenAM1348Cas9 mRNA'nın in-vitro transkripsiyonu, RNaz içermeyen
N2Herhangi bir markaN/AMikroenjeksiyon için
NaClSigmaS5886Embriyo tamponu ve lizis tamponu hazırlığı için
NaHCO3SigmaS5761Embriyo tampon hazırlama için
NaOHSangonA100173TAE tampon hazırlama için
Nükleaz içermeyen suThermofisherR0581RNA ile ilgili manipülasyonlar, RNaz içermeyen
PciINEBR0655SEnzimatik sindirim
için PCR makinesiHerhangi bir markaN/APCR amplifikasyonu
PCR şerit tüpleriHerhangi bir markaN/APCR PCR
tüpleriFEITONGKANGblp-200PCR
Petri kabıHerhangi bir markaN/AZebra balığı larvaları vb. yetiştirmek için.
Fenol kırmızısıSigmaP0290Mikroenjeksiyon için, RNaz içermeyen
Pipet tutucuWarner InstrumentsPLI-PH1Mikroenjeksiyon için
PrimeStar (Premix)TakaraDR040AMoleküler klonlama için
Proteinaz K Merck539480Genomik DNA ekstraksiyonu için
pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)Çin Zebra Balığı Kaynak Merkezi (CZRC)CZP11Cas9 plazmit şablonu
Soğutmalı santrifüjHerhangi bir markaN/ARNA ile ilgili santrifüjleme için
ÖlçekSartoriusBCE124-1CCNEnjeksiyon plakası ve agaroz jellerin dökümü için
MakasHerhangi bir markaN/AYetişkin balık kuyruklarını kırpmak için
SDSSangonA600485Lizis tamponu hazırlığı için
Küçük fırçalarHerhangi bir markaN/A Mikroenjeksiyonplakaları üzerinde embriyoları nazikçe hareket ettirmek için
SpektrofotometreThermofisherNanoDrop 2000DNA/RNA konsantrasyon ölçümleri için
Aşama mikrometresiHerhangi bir markaDIV (Bölme) = 0,01 mm1 nL damlacığı ölçmek için
Stereo floresan mikroskobuOlympusSZX16Gen ekspresyonunun gözlemlenmesi için
Stereo mikroskopMoticSMZ-168Gözlem ve mikroenjeksiyon için
T7 RiboMAX Express Büyük Ölçekli RNA Üretim SistemiPromegaP1320sgRNA'ların in-vitro transkripsiyonu, RNaz içermeyen
Sıcaklık kontrollü inkübatörEmbriyo inkübasyonu içinherhangi bir markaN/A
TIDEhttps://tide.nki.nl/sgRNA verimlilik analizi için 
Trikain metansülfonatSigmaA5040Trikama çözeltisi hazırlama için
TrisSangonA600194Trikin çözeltisi, lizis tamponu ve TAE tampon hazırlama için
TriptonOXOIDLP0042LB plakaları için
CımbızHerhangi bir markaN/AEnjeksiyon iğnelerini kesmek için
XbaINEBR0145SEnzimatik için sindirim
Maya özüOXOIDLP0021LB plakaları için
Zebra balığı akvaryum sistemiESENESEN-AW-S1Yetişkin balıkların yetiştirilmesi için
Zebra balığı çiftleşme tankları (bölücülü)Herhangi bir markaN/ABalığın çiftleşmesi için
Zeiss LSM 900+Airyscan2ZEISSZeiss LSM900Floresan etiketli balıkların konfokal görüntülenmesi ve veri analizi için
ZFIN web sitesiZFINhttp://zfin.org/Gen bilgisini bulmak için
görüntülemek için Etanol için için

Kaynaklar

  1. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).
  2. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  3. Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis. Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).
  4. Gomes, M. C., Mostowy, S. The case for modeling human infection in zebrafish. Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).
  5. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
  6. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  7. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  8. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Sci Rep. 6, 29490(2016).
  9. He, M. D., et al. Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos. Mutat Res. 780, 86-96 (2015).
  10. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Sci Rep. 5, 8841(2015).
  11. Luo, J. J., et al. CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy. FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).
  12. Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. Elife. 9, e53968(2020).
  13. Liu, J., et al. Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish. Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).
  14. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  15. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282(2014).
  16. Hirata, H., et al. Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish. J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).
  17. Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein. Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).
  18. Urushibata, H., et al. Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
  19. Yu, D., et al. Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking. Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zebra Bal G r nt lemeCRISPR Knock InGen EtiketlemeZebra Bal MikroenjeksiyonusgRNA Tasar mDon r Plazmit KonstruksiyonuCanl Zebra Bal G r nt lemeProtein zleme

İlgili makaleler