Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tümör Dokusundan Doğal Olarak Salınan Eksozomların Toplanması

597 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67739

⸱

10 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing, Sichuan University, 2Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, 3Department of Plastic and Burn Surgery, West China School of Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, eksozomların tümör gelişimindeki işlevini incelemek için deneysel bir temel sağlamak üzere onları doğal olarak serbest bırakarak ve tekrar tekrar toplayarak tümör dokularından eksozomları çıkarmak için yeni bir yöntem göstermektedir.

Özet

Hücreler tarafından salgılanan veziküller olarak, eksozomlar çeşitli nükleik asitleri, proteinleri ve lipitleri çevreler ve aktarır ve farklı hücreler arasındaki iletişime katılır. Tümör mikroçevresindeki eksozomlar, tümör hücrelerinin biyolojik özelliklerinde önemli bir rol oynar ve diğer hücrelerin durumlarını güçlü bir şekilde etkileyebilir. Bu nedenle, tümörlerin gelişiminde eksozomların spesifik işlevlerini daha fazla incelemek için, şüphesiz eksozomları tümör dokularından çıkarmak ve izole etmek gereklidir. Eksozomların tümör dokusundan doğrudan ekstraksiyonu, in vitro hücre kültürüne olan ihtiyacı azaltır ve tümör dokusundan eksozomlar, doğal durumdakilere daha benzer olabilir. Bu nedenle, tümör dokusundaki eksozomların doğal durumunu korumak, ekstraksiyon işleminin anahtarıdır. Enzimatik sindirim, tümör dokularından eksozomları çıkarmak için genellikle ultrasantrifüjleme ile birleştirilir. Burada, tümör dokusundan eksozomları çıkarmak için yeni bir yöntem sunuyoruz. Küçük tümör dokusu parçalarını çalkalanan bir masa üzerinde inkübe etmek için serumsuz bir ortam kullandık, tümör dokusundan doğal olarak salınan eksozomları tekrar tekrar topladık ve ekstrakte ettik ve ekstrakte edilen eksozom yapısını, konsantrasyonunu ve özelliklerini tanımlayarak araştırmacılar için yeni bir yöntem sağladık. tümör gelişiminde eksozomların işlevi.

Giriş

Eksozomlar, hücreler tarafından salgılanan hücre dışı veziküllerin bir alt tipidir ve tipik olarak boyutları 30 nm ila 200 nm arasında değişir 1,2. Hücreler arası iletişime katılırlar ve nükleik asitler (örneğin, deoksiribonükleik asit (DNA), haberci RNA (mRNA), mikro ribonükleik asit (miRNA), uzun kodlamayan RNA (lncRNA), dairesel RNA (circRNA)), proteinler ve lipitler 1,3,4,5 dahil olmak üzere çeşitli sinyal moleküllerini, fizyolojik işlevlerini etkilemek için alıcı hücrelereiletirler 6,7. İlk olarak koyun retikülositleri8'de tanımlanan eksozomlar, o zamandan beri kan, tükürük, idrar, beyin omurilik sıvısı, asit, amniyotik sıvı ve anne sütü dahil olmak üzere çeşitli vücut sıvılarında tanımlanmıştır 9,10,11,12,13,14,15,16 . Ayrıca eksozomlar, lenfositler, makrofajlar, mast hücreleri, yağ hücreleri ve tümör hücreleri dahil olmak üzere birçok hücre türü tarafından salgılanabilir17. Eksozomlar, geniş dağılımları ile başta kanser olmak üzere çeşitli patolojik süreçlerde ve embriyonik gelişim, doku onarımı ve yenilenmesi ve bağışıklık regülasyonu dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerde kritik bir rol oynamaktadır 18,19,20.

Son yıllarda, eksozomların tümör oluşumunu, invazyonu, metastazı, kemoterapi direncini ve anti- veya pro-tümör bağışıklığını teşvik ettiği gösterilmiştir20,21,22. Kanserden türetilmiş eksozomlar, biyolojik fenotiplerini değiştirmek için reseptörlerde veya komşu kanser hücrelerinde gen ekspresyonunu aktive edebilir ve kanser hücreleri, kanser hücresi proliferasyonunu, istilasını ve anjiyogenezini teşvik etmek için tümör mikro çevresindeki stromal hücrelerle etkileşime girebilir 23,24,25. Tümör hücreleri tarafından salınan eksozomlar, toksik ilaçları atmalarına yardımcı olabilir ve stromal hücre kaynaklı eksozomlar, kanser hücrelerinin oluşumunu teşvik edebilir20. Kanser kaynaklı eksozomlar, komşu dokuların istilası, dolaşım sistemi yoluyla transfer ve uzak organlara yayılma dahil olmak üzere kanser hücresi metastazının çeşitli aşamalarında yer alır20. Son olarak, eksozomlar, taşıdıkları ligandlara, proteinlere ve miRNA'lara bağlı olarak kanserde hem immünoaktivasyon hem de immünosupresyon işlevlerini yerine getirirler20. Tümör dokusu kaynaklı eksozomların önemli işlevleri nedeniyle, tümörlerin erken tanısı, doğru tedavisi ve prognostik izleminde potansiyel uygulama değeri gösterirler21,22.

Tümör dokusu kaynaklı eksozomların önemi göz önüne alındığında, birçok araştırmacı özelliklerini ve işlevlerini daha fazla incelemek için onları çıkarmaya çalışmıştır. Eksozomların tümör dokularından doğrudan ekstraksiyonu sadece in vitro hücre kültürüne olan ihtiyacı azaltmakla kalmaz, aynı zamanda eksozomların doğal durumuna daha çok benzer. Bu nedenle, tümör dokusundaki eksozomların doğal durumunu korumak, ekstraksiyon işleminin anahtarıdır. Eksozomların fiziksel özellikleri, yaygın ekstraksiyon yöntemlerinin temelidir ve nadiren, ekstraksiyon işlemi sırasında stimülasyonun neden olduğu eksozom bileşenlerindeki değişiklikler dikkate alınır. Aslında, eksozomların kalitesi, farklı eksozom ekstraksiyon prosedürlerinden güçlü bir şekilde etkilenir26,27. Günümüzde tümör dokuları enzimler tarafından sindirilmekte ve ayırma işleminden önce yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, ultrasantrifüjleme, ultrafiltrasyon, boyut dışlama kromatografisi (SEC), polimer çökeltme, immünoaffinite kromatografisi ve mikroakışkan yöntemler gibi yöntemlere tabi tutulmaktadır 2,21,28,29 . Burada, tümör dokusundan eksozomların çıkarılması için bir yöntem sunuyoruz. Bir çalkalayıcıda küçük tümör dokusu bloklarını kültürlemek için serumsuz bir ortam kullandık, daha sonra tümör dokusu tarafından doğal olarak salınan eksozomları topladık ve ekstrakte ettik ve ekstrakte edilen eksozomların konsantrasyonunu ve özelliklerini belirledik, tümör gelişiminde eksozomların işlevini incelemek için temel materyaller ve deneysel kanıtlar sağladık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tümör dokusu eksozomu ile ilgili tüm deneyler, ilgili yönergelere ve düzenlemelere göre yürütülmüştür. Bu çalışma, Sichuan Üniversitesi (20220301101) Batı Çin Hastanesi Etik Komitesi'nin yönergeleri tarafından onaylanmış ve yürütülmüştür. SGC-7901 hücreleri ile aşılamadan dört hafta sonra, bir çıplak fare (BALB / c, Erkek, 8 haftalık, 26 g) servikal çıkık yoluyla ötenazi yapıldı.

1. Tümör dokusunun elde edilmesi

  1. 5 dakika boyunca% 75 alkolde bekletin.
  2. Steril bir ameliyat masasına geçin, ektopik tümörün dış derisini açmak için steril cerrahi makas kullanın.
  3. Ektopik tümör dokusunu soyun, ardından eşit ağırlıkta iki parça elde etmek için kesin ve tartın.
    NOT: Bu protokol kapsamında eksozom ekstraksiyonu için bir parça tümör dokusu kullanılır ve enzim sindirimi30 ile eksozom ekstraksiyonu için eşit ağırlıkta başka bir tümör dokusu parçası kullanılır.

2. Tümör dokusunun ön koşullandırılması

NOT: Bu adımları buz üzerinde ve steril bir ortamda gerçekleştirin.

  1. Yüzeydeki kan ve yağı çıkarmak için tümör dokusunu yıkamak için 10 mL önceden soğutulmuş Fosfat Tampon Salin (PBS) (0,01 M) pipetleyin.
  2. Tümör dokusunu (~ 400 mm 3) 10 cm'lik steril bir Petri kabında 2 mM etilen diamintetraasetik asit (EDTA) ile 20 mL PBS'de oftalmik makas kullanarak 1-2 mm'lik parçalar halinde kesin. Yukarıdaki karışımı 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.

3. Eksozomların serbest bırakılması

  1. Tüpü adım 1.2'den itibaren 200 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  2. Süpernatanı atın ve peleti 20 mL Minimum Esansiyel Orta α (α-MEM) ortamla yeniden süspanse edin. 37 °C'de 100 rpm'de sabit sıcaklıklı bir çalkalayıcıda 1 saat inkübe edin.
  3. 200 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı atın ve peleti 10 mL α-MEM ortamı ile yeniden süspanse edin. 37 ° C'de 100 rpm'de 6 saat boyunca sabit sıcaklıktaki bir çalkalayıcıda inkübe edin.
    NOT: Tüm adımlarda nazik olun. Hücre içi veziküller ve organeller de dahil olmak üzere kesme nedeniyle sızan hücre içi bileşenleri çıkarmak için kısa bir inkübasyon ve α-MEM ortamı ile bir yıkama yeterlidir.
  5. 200 × g'da 5 dakika, 4 °C santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpte toplayın.
  6. Tümör dokusunu 10 mL α-MEM ortamı ile yeniden süspanse edin.
  7. Adım 2.4'ten itibaren inkübasyonu tekrarlayın ve ardından adım 2.5'i izleyin.
  8. Adım 2.5 ve 2.7'de toplanan orta süpernatanları karıştırın.
    NOT: Tüm adımlarda nazik olun. İki 6 saatlik inkübasyon, tümör dokusu parçalarından eksozomların doğal salınımını indükledi.

4. Ultrasantrifüjleme

  1. Süpernatanı 0,45 μm mikro gözenekli bir filtreden süzün.
  2. Büyük vezikülleri çıkarmak için süpernatanı 12.000 × g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
  3. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve eksozomları toplamak için 120.000 × g'da 4 ° C'de 90 dakika santrifüjleyin.
  4. Eksozom çökeltisini PBS (0,01 M) ile yıkayın ve 140.000 × g'da 4 °C'de 60 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
  5. Çökelmiş eksozomları hemen kullanım veya -80 ° C'de depolama için PBS'de (0.01 M) askıya alın.
    NOT: Tüm adımlarda nazik olun. Her adımı mümkün olan en küçük merkezkaç kuvveti ve en kısa merkezkaç süresi ile gerçekleştirin.

5. Eksozom tanımlama sonuçlarının sunumu

  1. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)30 ile tümör dokusundan eksozomların morfolojisini tanımlayın.
  2. Nanopartikül izleme analizi (NTA)30 ile tümör dokusundan eksozomların boyutunu ve konsantrasyonunu belirleyin.
  3. Ekzozomal protein belirteçleri CD9 ve CD63'ü western blot (WB)30 ile tanımlayın.
    NOT: Eksozom belirteçleri için kriter olarak CD63, CD9'un kullanımı da dahil olmak üzere eksozom araştırmaları için son kılavuzlar31.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

TEM, bu yöntemle tümör dokusundan türetilen eksozomların tipik cup benzeri yapılara sahip olduğunu (Şekil 1A) ve bu yöntemle ekstrakte edilen eksozomların şekli ile enzim sindirimi arasında önemli bir fark olmadığını ortaya koydu (Şekil 1B). NTA sonuçları, ortalama eksozom çapının 172.8 nm olduğunu, bunun 30-200 nm aralığında olduğunu ve eksozomların boyutuyla tutarlı olduğunu ortaya koydu; partikül konsantrasyonu 5.9 × 106 / mL idi (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yöntemde, tümör dokusundan türetilen eksozomlar, çıplak farelerin ektopik mide kanseri dokularından ekstrakte edildi ve anahtar adımlar, eksozomların serbest bırakılması, eksüdasyonu, ayrılması ve saflaştırılmasıydı. Eksozom 2,21,28,29'un fiziksel özelliklerine ve bileşimine göre, her biri avantaj ve dezavantajlara sahip çeşitli eksozom ayırma yöntemleri tasarlanmış ve doğrulanmıştır, ancak amaç, farklı eksozom ekstraksiyon pr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Destek Programı (2024NSFSC0592, 2023YFS0064) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
α-MEMHyCloneSH30265.01B
Anti-CD63 antikoruBiossbsm-43117M
Anti-CD9 antikoruBiossbs-2489R
Santrifüj tüpüThermo339650
Sabit sıcaklık çalkalayıcıThermoMAXQ4450
Tek kullanımlık steril pipet-10 mLJET
EDTABiosharpBS107
Elektrikli pipetThermo9501
Yatay kontrollü sıcaklık santrifüjüThermoSorvall ST1R plus
Nanopartikül izleme analizörüMalvinNanoSight Pro
Oftalmik makasJinzhongY3D010
PBSHyCloneSH30256.01B
Fosfotungstik asit   Sigma455970-10G
Cerrahi makasJinzhongJ21010
İkincil antikorBiossBs-0295GKeçi Anti-Tavşan IgG H & L/FITC
Transmisyon Elektron MikroskobuNikonPlan Apo WF
Ultrasantrifüj tüpBeckman355618
GSP01001

Kaynaklar

  1. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  2. Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduct Target Ther. 5, 144(2020).
  3. Rani, S., O'Brien, K., Kelleher, F., Corcoran, C., Germano, S., Radomski, M., et al. Isolation of exosomes for subsequent mRNA, MicroRNA, and protein profiling. Methods Mol Biol. 784, 181-195 (2011).
  4. Zhou, L., et al. The biology, function and clinical implications of exosomes in lung cancer. Cancer Lett. 407, 84-92 (2017).
  5. D'Agostino, E., et al. Exosomal microRNAs: Comprehensive methods from exosome isolation to miRNA extraction and purity Analysis. MicroRNA Profiling. 2595, 75-92 (2022).
  6. Whiteside, T. Tumor-derived exosomes and their role in cancer progression. Adv Clin Chem. 74, 103-141 (2016).
  7. Ludwig, N., Whiteside, T., Reichert, T. Challenges in exosome isolation and analysis in health and disease. Int J Mol Sci. 20 (19), 4684(2019).
  8. Johnstone, R., Adam, M., Hammond, J., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262, 9412-9420 (1987).
  9. Li, B., Cao, Y., Sun, M., Feng, H. Expression, regulation, and of exosome-derived miRNAs in cancer progression and therapy. FASEB J. 35 (10), e21916(2021).
  10. Caby, M., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17, 879-887 (2015).
  11. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  12. Street, J., et al. Identification and proteomic profiling of exosomes in human cerebrospinal fluid. J Transl Med. 10, 5(2012).
  13. Palanisamy, V., et al. Nanostructural and transcriptomic analyses of human saliva derived exosomes. PLoS ONE. 5, e8577(2010).
  14. Runz, S., et al. Malignant ascites-derived exosomes of ovarian carcinoma patients contain CD24 and EpCAM. Gynecol Oncol. 107, 563-571 (2007).
  15. Keller, S., et al. CD24 is a marker of exosomes secreted into urine and amniotic fluid. Kidney Int. 72, 1095-1102 (2007).
  16. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  17. Simpson, R., Lim, J., Moritz, R., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6 (3), 267-283 (2009).
  18. Sung, B. H., Parent, C. A. Extracellular vesicles: Critical players during cell migration. Dev Cell. 56, 1861-1874 (2021).
  19. Xie, Q., et al. Exosome-mediated immunosuppression in tumor microenvironments. Cells. 11 (12), 1946(1946).
  20. Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
  21. Jiang, Z., Wang, H., Mou, Y., Li, L., Jin, W. Functions and clinical applications of exosomes in pancreatic cancer. Mol Biol Rep. 49 (11), 11037-11048 (2022).
  22. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annu Rev Biochem. 88 (1), 487-514 (2019).
  23. Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFR VIII by microvesicles derived from tumour cells. Nat Cell Biol. 10, 619-624 (2008).
  24. Nazarenko, I., et al. Cell surface tetraspanin Tspan8 contributes to molecular pathways of exosome-induced endothelial cell activation. Cancer Res. 70, 1668-1678 (2010).
  25. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
  26. Macias, M., et al. Liquid biopsy: from basic research to clinical practice. Adv Clin Chem. 83, 73-119 (2018).
  27. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10, 1039(2020).
  28. Hu, J., et al. Application exosomes as nanocarriers in cancer therapy. J Mater Chem B. 11 (44), 10595-10612 (2023).
  29. Wang, C., et al. A light-activated magnetic bead strategy utilized in spatio-temporal controllable exosomes isolation. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1006374(2022).
  30. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  31. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  32. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  33. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. J Extracell Vesicles. 5, 32945(2016).
  34. Li, W., et al. Comparison of the yield and purity of plasma exosomes extracted by ultracentrifugation, precipitation, and membrane-based approaches. Open Chem. 20, 182-191 (2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tümör EkzozomlarıEkzozom İzolasyonuEkzozom EkstraksiyonuTümör MikroçevresiUltrasantrifügasyonEnzimle SindirimHücre İletişimiEkzozom KarakterizasyonuSerumsuz Besiyeri

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.