Acinetobacter baumannii'de Floresan Tabanlı T6SS Aktivite Tespit Yöntemlerinin Kurulması ve Karşılaştırılması

Wenjing Yang; Jing Jie; Chunxiuli Li; Dong Chen; Shuang Zhao; Sanwei Gu; Jiancheng Xu; Lei Song

doi:10.3791/67772

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Acinetobacter baumannii'de Floresan Tabanlı T6SS Aktivite Tespit Yöntemlerinin Kurulması ve Karşılaştırılması

808 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67772

⸱

20 Haziran 2025

Wenjing Yang¹ , Jing Jie² , Chunxiuli Li² , Dong Chen² , Shuang Zhao² , Sanwei Gu^*² , Jiancheng Xu^*¹ , Lei Song^*²

¹Clinical Laboratory, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University, ²Department of Respiratory Medicine, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, klinik suşların yüksek verimli analizi için uygun olan bakteriyel T6SS'nin aktivitesini verimli ve doğru bir şekilde değerlendirmek için floresan etiketlemeye (özellikle Luciferaz) dayalı kantitatif bir tespit yöntemi öneriyoruz.

Özet

Tip VI Salgılama Sistemi (T6SS), Gram negatif bakterilerde, özellikle Acinetobacter baumannii gibi patojenik türlerde hücreler arası etkileşimlere aracılık eden çok önemli bir mekanizmadır. Önceki çalışmalar, A. baumannii ATCC 17978 suşundaki büyük plazmit pAB3'ün, çekirdek T6SS genlerinin ekspresyonunu inhibe eden TetR benzeri bir proteini kodladığını göstermiştir. Buna karşılık, pAB3'ten yoksun olan WT^R-suşu , T6SS efektör proteini Hcp'yi kararlı bir şekilde eksprese edebilir ve salgılayabilir ve E. coli'yi öldürme yeteneği sergiler. T6SS'nin temel genlerinden biri olan tssM geni, aktivitesi için gereklidir; silinmesi doğrudan T6SS'nin etkisiz hale getirilmesine yol açar. Bununla birlikte, öldürme tahlilleri gibi geleneksel T6SS aktivite tespit yöntemleri, düşük verim ve yetersiz hassasiyetten muzdariptir. Bu sınırlamaları ele almak için, floresan etiketlemeye dayalı nicel algılama yöntemleri geliştirdik.

T6SS aktivite tespitini iyileştirmek için üç floresan etiketleme yöntemi geliştirdik: (1) Yüksek özgüllük, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile karakterize edilen ve onu yüksek verimli analiz için uygun hale getiren Luciferaz etiketlemesine dayalı kantitatif bir tespit yöntemi; (2) Çevresel parazitlere duyarlı olmasına rağmen yüksek verim avantajı sunan yeşil floresan proteini (GFP) etiketlemesine dayalı bir algılama yöntemi; (3) Bakteri canlılığını kantitatif olarak değerlendirebilen ancak operasyonel olarak karmaşık ve maliyetli olan akış sitometrisi tespiti. Kapsamlı bir karşılaştırmadan sonra, Luciferase bazlı etiketleme yönteminin en doğru, hassas ve kullanıcı dostu olduğu kanıtlandı. A. baumannii'nin 20 klinik izolatına uygulandığında, bu yöntemin T6SS aktivitesini hızlı ve doğru bir şekilde değerlendirdiği doğrulanmıştır.

Giriş

Tip VI Sekresyon Sistemi (T6SS), Gram-negatif bakterilerde önemli bir protein salgılama sistemidir, bakteriyel rekabet, ökaryotik konakçılara karşı antagonizma ve konak immün yanıtlarının düzenlenmesinde yaygın olarak yer alır ^1,2. T6SS, toksik efektör proteinleri komşu bakterilere veya ökaryotik hücrelere enjekte ederek, bakterilerin karmaşık ortamlarda rekabet avantajı sağlamasına yardımcı olur. Son yıllarda, T6SS'nin bakteriyel adaptasyon, patojenite ve mikrobiyal etkileşimlerdeki önemli rolü, onu, özellikle işlevlerinin yeni antibakteriyel stratejilerin geliştirilmesi için....