Method Article

Acinetobacter baumannii'de Floresan Tabanlı T6SS Aktivite Tespit Yöntemlerinin Kurulması ve Karşılaştırılması

DOI:

10.3791/67772

⸱

June 20th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University, 2Department of Respiratory Medicine, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, klinik suşların yüksek verimli analizi için uygun olan bakteriyel T6SS'nin aktivitesini verimli ve doğru bir şekilde değerlendirmek için floresan etiketlemeye (özellikle Luciferaz) dayalı kantitatif bir tespit yöntemi öneriyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tip VI Salgılama Sistemi (T6SS), Gram negatif bakterilerde, özellikle Acinetobacter baumannii gibi patojenik türlerde hücreler arası etkileşimlere aracılık eden çok önemli bir mekanizmadır. Önceki çalışmalar, A. baumannii ATCC 17978 suşundaki büyük plazmit pAB3'ün, çekirdek T6SS genlerinin ekspresyonunu inhibe eden TetR benzeri bir proteini kodladığını göstermiştir. Buna karşılık, pAB3'ten yoksun olan WTR-suşu , T6SS efektör proteini Hcp'yi kararlı bir şekilde eksprese edebilir ve salgılayabilir ve E. coli'yi öldürme yeteneği sergiler. T6SS'nin temel genlerinden biri olan tssM geni, aktivitesi için gereklidir; silinmesi doğrudan T6SS'nin etkisiz hale getirilmesine yol açar. Bununla birlikte, öldürme tahlilleri gibi geleneksel T6SS aktivite tespit yöntemleri, düşük verim ve yetersiz hassasiyetten muzdariptir. Bu sınırlamaları ele almak için, floresan etiketlemeye dayalı nicel algılama yöntemleri geliştirdik.

T6SS aktivite tespitini iyileştirmek için üç floresan etiketleme yöntemi geliştirdik: (1) Yüksek özgüllük, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile karakterize edilen ve onu yüksek verimli analiz için uygun hale getiren Luciferaz etiketlemesine dayalı kantitatif bir tespit yöntemi; (2) Çevresel parazitlere duyarlı olmasına rağmen yüksek verim avantajı sunan yeşil floresan proteini (GFP) etiketlemesine dayalı bir algılama yöntemi; (3) Bakteri canlılığını kantitatif olarak değerlendirebilen ancak operasyonel olarak karmaşık ve maliyetli olan akış sitometrisi tespiti. Kapsamlı bir karşılaştırmadan sonra, Luciferase bazlı etiketleme yönteminin en doğru, hassas ve kullanıcı dostu olduğu kanıtlandı. A. baumannii'nin 20 klinik izolatına uygulandığında, bu yöntemin T6SS aktivitesini hızlı ve doğru bir şekilde değerlendirdiği doğrulanmıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tip VI Sekresyon Sistemi (T6SS), Gram-negatif bakterilerde önemli bir protein salgılama sistemidir, bakteriyel rekabet, ökaryotik konakçılara karşı antagonizma ve konak immün yanıtlarının düzenlenmesinde yaygın olarak yer alır 1,2. T6SS, toksik efektör proteinleri komşu bakterilere veya ökaryotik hücrelere enjekte ederek, bakterilerin karmaşık ortamlarda rekabet avantajı sağlamasına yardımcı olur. Son yıllarda, T6SS'nin bakteriyel adaptasyon, patojenite ve mikrobiyal etkileşimlerdeki önemli rolü, onu, özellikle işlevlerinin yeni antibakteriyel stratejilerin geliştirilmesi için potansiyel hedefler sağladığı çoklu ilaca dirençli patojenlerde bir araştırma noktası haline getirmiştir 3,4,5.

Acinetobacter baumannii (Ab), hastane ortamlarında yaygın olarak görülen Gram negatif fırsatçı bir patojendir. Yüksek ilaç direnci ve güçlü adaptasyonu nedeniyle, dünya çapında önemli bir nozokomiyal patojen haline gelmiştir 6,7,8. A. baumannii'nin karmaşık mikrobiyal ortamlarda hayatta kalması, T6SS'nin diğer mikroplarla rekabetinde ve konakçı ile etkileşimlerinde kilit bir rol oynadığı çoklu salgılama sistemlerine dayanır. Yüksek oranda korunmuş T6SS gen kümesi ve iyi tanımlanmış fonksiyonları ile A. baumannii, T6SS mekanizmalarını incelemek için ideal bir model haline gelmiştir. Ayrıca, T6SS'nin A. baumannii'deki benzersiz yapısı, T6SS'nin çeşitliliğini ve işlevlerini daha fazla ortaya çıkarmak için farklı bir bakış açısı sağlar.

A. baumannii'nin T6SS gen kümesi, 12 çekirdek protein geni (tssA-tssM gibi, tssJ eksikliği gibi) ve bilinmeyen işlevlere sahip birkaç gen (tagX, tagN, tagF, vb.) içerir.2,9,10. Bunlar arasında, hemolizin koregüle proteini (Hcp), T6SS'nin önemli bir bileşenidir ve salgılanması, fonksiyonel T6SS'nin ayırt edici bir özelliği olarak kabul edilir. Çalışmalar, A. baumannii'deki büyük plazmit pAB3'ün, TetR benzeri bir düzenleyici proteini kodlayarak T6SS ekspresyonunu inhibe ettiğini göstermiştir. Buna karşılık, pAB3'ü kaybeden suşlar (WTR- gibi), önemli T6SS aktivitesi11 sergileyerek Hcp'yi stabil bir şekilde eksprese edebilir ve salgılayabilir. TssM geni, T6SS'nin temel genlerinden biridir ve silinmesi doğrudan T6SS'nin inaktivasyonuna yol açar.

Bununla birlikte, geleneksel T6SS aktivite tespit yöntemleri (öldürme deneyleri gibi), T6SS5'in derinlemesine çalışmasını ve yaygın uygulamasını ciddi şekilde kısıtlayan düşük verim, zayıf tekrarlanabilirlik ve yetersiz hassasiyet gibi sınırlamalara sahiptir. Bu nedenle, verimli ve doğru T6SS aktivite tespit yöntemlerinin geliştirilmesi, mevcut araştırmalarda acil bir ihtiyaç haline gelmiştir. Bu çalışma, geleneksel yöntemlerin eksikliklerinin üstesinden gelmek için floresan etiketlemeye dayalı T6SS aktivite tespit yöntemlerini oluşturmayı ve karşılaştırmayı amaçlamaktadır. Floresan etiketleme teknolojisi sayesinde, bakteri etkileşimlerinin incelenmesi için daha kesin ve güvenilir bir araç sağlayarak T6SS aktivitesinin gerçek zamanlı, nicel olarak izlenmesini sağladık. Bu çalışma, floresan etiketleme yöntemlerinin etkinliğini doğrulamış ve farklı floresan etiketleme stratejilerinin avantaj ve dezavantajlarını karşılaştırarak, gelecekteki araştırmalar için yeni bakış açıları ve metodolojik destek sağlamıştır. Sadece T6SS araştırmaları için yeni teknik araçlar sunmakla kalmaz, aynı zamanda bakteriyel etkileşimlerin karmaşık mekanizmalarını anlamak ve yeni antibakteriyel terapötik stratejiler geliştirmek için bilimsel bir temel oluşturur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Suş ve plazmit kaynakları

  1. A. baumannii standart suşu ATCC 17978, E. coli (pZY01) ve Jilin Üniversitesi Birinci Hastanesi Laboratuvar Tıbbı Bölümü'nden izole edilen A. baumannii'nin klinik suşunu kullanın.
  2. Laboratuvarda modifiye edilmiş ve korunmuş plazmid pZY01-GFP'yi ( A. baumannii'de kararlı ekspresyon yeteneğine sahip bir kanamisin direnç geni taşıyan) ve ticari olarak satın alınan plazmid pGEN-luxCDABE (bir ampisilin direnç geni taşıyan) kullanın.
  3. Kültür A. baumannii ve E. coli Luria-Bertani (LB) ortamında veya aşağıdakileri içeren minimal bir ortamda: 50 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.4), 15 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, tek karbon kaynağı olarak% 0.2 (a / h) sodyum süksinat ve% 0.01 (a / h) maya özütü12. Gerektiğinde aşağıdaki konsantrasyonlarda antibiyotik ekleyin: E. coli: ampisilin (100 μg/mL) ve kanamisin (50 μg/mL); A. baumannii: streptomisin (100 μg/mL).
    NOT: E. coli (pZY01) ve E. coli (pZY01-GFP) kanamisin direncini ifade eder. E. coli (pZY01) bir floresan işaretleyiciye sahip değildir, bu nedenle aşağıdaki metinde E. coli olarak adlandırılabilir.

2. Deneyden önce bakteri suşlarının hazırlanması

  1. Deneyden 2 gün önce bakteri suşlarını -80 °C dondurucudan alın. Bakteri suşlarını, karşılık gelen antibiyotikleri içeren LB agar plakalarına aşılayın. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    NOT: Deneyin başlangıcında tüm hücrelerin plazmitleri koruduğundan emin olun.
  2. Deneyden 1 gün önce her bakteri suşundan iki bağımsız tek koloni seçin. Her koloniyi ayrı ayrı 5 mL LB sıvı ortam içeren iki ayrı tüpe aşılayın. Kültürleri gece boyunca 37 ° C'de 200 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. Bu kültürleri sonraki deneyler için kullanın.
    NOT: Yeterli miktarda bakteri biyokütlesi elde edilmesini sağlamak için bakteri üreme hızına göre kuluçka süresini optimize edin.

3. E. coli (GFP) / E. coli (Luciferase) suşlarının hazırlanması

  1. Dönüşüm
    1. Sırasıyla 100 μL E. coli DH5α yetkin hücrelerine 50 ng plazmit DNA (pZY01-GFP veya pGEN-luxCDABE, A260 / A280'de NanoDrop ile nicelleştirilir) ekleyin ve hafifçe karıştırın.
    2. Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, 42 °C'de 60 saniye boyunca ısı şoku verin ve hemen 30 saniye boyunca buzun üzerine koyun.
    3. 700 μL antibiyotiksiz LB suyu ekleyin ve 37 °C'de 180 rpm'de 2 saat çalkalayarak inkübe edin.
  2. Kaplama ve kültürleme
    1. 420 × g'da 2 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletini 100 μL antibiyotik içermeyen LB suyunda yeniden süspanse edin.
    2. pZY01 (GFP) dönüşüm ürününü 50 μg/mL kanamisin içeren LB agar plakalarına yayın.
    3. pGEN-luxCDABE dönüşüm ürününü 100 μg/mL ampisilin içeren LB agar plakalarına yayın. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  3. Pozitif klonların doğrulanması
    1. Tek kolonileri seçin ve ertesi gün polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) şablonları olarak DNA'yı çıkarın. PCR amplifikasyonu gerçekleştirin ve agaroz jel elektroforezi ile doğrulayın.
    2. Pozitif suşları onaylayın ve bunları E. coli (GFP) ve E. coli (Luciferase) olarak etiketleyin.
      NOT: Verimli dönüşüm için yetkin hücrelerin kalitesinin yüksek olduğundan emin olun. Tek koloni izolasyonu ile etkileşimi önlemek için kaplama sırasında aşırı bakteri sıvısından kaçının.

4. Batı lekesi

  1. Numune hazırlama
    1. Hücre peletini ve süpernatanı ayırmak için bakteri kültürlerini toplayın ve santrifüjleyin (1500 × g, 10 dakika, 4 °C).
    2. Hem hücre peletine hem de süpernatanıma uygun miktarda yükleme tamponu ekleyin. 100 °C'de metal bir banyoda 10 dakika kaynatın. Santrifüjleyin (1500 g, 10 dk, 4 °C) ve süpernatanları protein örnekleri olarak toplayın.
    3. Biskinkoninik asit (BCA) veya Bradford yöntemini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün ve aynı konsantrasyona ayarlayın.
  2. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)
    1. Uygun konsantrasyonlarda SDS-PAGE jelleri hazırlayın (örn.% 12 ayırma jeli,% 5 istifleme jeli)13.
    2. 20 μg protein numunelerini, 1-2 μL'lik önceden boyanmış bir protein markörü ile birlikte jel kuyucuklarına yükleyin. Bromofenol mavisi göstergesi jelin dibine ulaşana kadar 100-120 V'ta elektroforez gerçekleştirin.
      NOT: Çalışma Tamponu: Tris 25 mM, Glisin 192 mM, SDS% 0.1 (a/h), 1 L'ye kadar damıtılmış su.
  3. Aktarma (Batı Blotting)
    1. Jeli cam plakalardan çıkarın ve transfer tamponuna batırın. Bir poliviniliden diflorür (PVDF) veya nitro selüloz (NC) membran hazırlayın, PVDF membranını metanol ile etkinleştirin ve ardından transfer tamponuna batırın.
      NOT: Transfer Tamponu: 25 mM Tris, 192 mM Glisin, %20 Metanol
    2. Transfer aparatını "sandviç" bir yapıda (filtre kağıdı-jel-membran-filtre kağıdı) monte edin. 60-90 dakika boyunca 100 V'ta aktarın (protein moleküler ağırlığına göre zamanı ayarlayın; Konak hücre proteinleri (HCP) yaklaşık 17 kDa'lık bir moleküler ağırlığa sahiptir).
      NOT: Transfer tankını buzlu suya yerleştirin ve düşük sıcaklığı korumak için buz paketleri ekleyin. Aktarım süresi uzunsa, buz paketlerini yarıda değiştirin.
  4. Engelleme
    1. Transferden sonra, membranı %5 yağsız süt bloke etme solüsyonuna yerleştirin. Oda sıcaklığında (RT) bir çalkalayıcıda 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de bloke edin.
  5. Birincil antikor inkübasyonu
    1. Membranı, her seferinde 5 dakika% 0.1 Tween 20 (TBST) tamponu içeren Tris tamponlu salin (TBS) ile üç kez yıkayın. Membranı seyreltilmiş birincil antikorlarla (fare anti-Hcp antikoru, 1:1000 seyreltme; fare anti-izositrat dehidrojenaz (ICDH) antikoru, 1:1000 seyreltme) ile gece boyunca 4 °C'de veya 2 saat RT'de inkübe edin.
  6. İkincil antikor inkübasyonu
    1. Membranı TBST tamponu ile her biri 5 dakika olmak üzere 3 kez yıkayın. Membranı seyreltilmiş ikincil antikor (Yaban turpu peroksidaz [HRP] konjuge anti-fare IgG, 1:3000 seyreltme) ile RT'de 2 saat inkübe edin.
  7. Algılama
    1. Membranı TBST tamponu ile her biri 5 dakika olmak üzere 3 kez yıkayın. ECL kemilüminesan substratı hazırlayın ve zara eşit şekilde uygulayın.
    2. Bir kemilüminesans görüntüleme sistemi kullanarak sinyalleri tespit edin ve görüntüleri yakalayın (HCP proteini yaklaşık 17 kDa'lık bir moleküler ağırlığa sahiptir, ICDH, A. baumannii'de beklenen moleküler ağırlığı yaklaşık 45 kDa'lık olan sitoplazmik bir metabolik enzimdir).
      NOT: ICDH, süpernatant fraksiyonda (salgılanan proteinleri içeren) değil, yalnızca hücre pelet fraksiyonunda (bozulmamış bakteri içeren) tespit edilebilen önemli bir kalite kontrol belirtecidir, bu nedenle numune hazırlama sırasında hücre parçalanmasının meydana gelmediğini gösterir. Hcp sekresyonu (17 kDa) sadece T6SS aktif suşlarından süpernatanlarda görülebilir olmalıdır.

5. LB agar besiyeri ile 96 oyuklu plakaların hazırlanması

  1. Önceden ısıtılmış otoklavlanmış antibiyotik içermeyen LB agar ortamını, oyuk başına 50 μL olan steril 96 oyuklu bir plakaya hızla ekleyin. Ortamın tamamen katılaşmasını sağlamak için plakanın en az 1 saat RT'de oturmasına izin verin.
  2. GFP floresansını tespit etmek için şeffaf bir tabana sahip siyah duvarlı plakalar kullanın.
  3. Çapraz kuyu floresan girişimini önlemek için Luciferaz floresansını tespit etmek için ışık geçirmez 96 oyuklu plakalar kullanın.
    NOT: Optimum bakteri temasını ve büyümesini destekleyen homojen jel kalınlığı sağlamak için ortamı eklerken kabarcık oluşturmaktan kaçının.

6. A. baumannii öldürme deneyi

  1. Standart öldürme deneyi
    1. Kültür WTR- ve ΔtssM mutant suşları, 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş LB ortamında çalkalanarak 37 ° C'de gece boyunca, aynı koşullar altında 50 μg / mL kanamisin içeren LB ortamında ayrı ayrı E. coli'yi büyütür.
    2. Bakteri kültürlerini steril PBS ile iki kez yıkayın ve taze antibiyotik içermeyen LB ortamında tekrar süspanse edin. Standardizasyon için OD600'ü 1.0'a ayarlayın.
    3. WTR- ve ΔtssM mutant suşlarını E. coli ile 1: 1 oranında karıştırın.
    4. Karışık bakteri süspansiyonunun 10 μL'sini antibiyotik içermeyen LB agar plakalarına yerleştirin ve 37 ° C'de 6 saat inkübe edin.
    5. Bakteri lekelerini kazıyın ve 1 mL PBS'de tekrar süspanse edin. Beş adet 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin.
    6. Seyreltilmiş bakteri süspansiyonlarının 10 μL'sini kanamisin içeren LB plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    7. Koloni sayımı ile WTR- ve ΔtssM mutant suşlarının T6SS'ye bağlı antibakteriyel aktivitesini analiz edin.
      NOT: Deneysel hataları önlemek için bakteriyel süspansiyonların iyice karıştırıldığından emin olun. Veri güvenilirliğini sağlamak için her örnek için en az üç bağımsız çoğaltma gerçekleştirin.
  2. Lusiferaz etiketleme kullanılarak T6SS aktivitesinin kantitatif tespiti
    1. E. coli (Luciferase), WTR-, ΔtssM mutantları ve diğer suşların OD600'ünü (örneğin, ATCC 17978, E. coli, Ab # 40, Ab # 170, Ab # 180) 1.0'a standartlaştırın. Antibiyotik içermeyen LB agar içeren 96 oyuklu bir plakaya 5 μL bakteri süspansiyonu ekleyin. Karanlıkta havayla kuruduktan sonra, E. coli'nin (Luciferase) lüminesans özgüllüğünü doğrulamak için lusiferaz bazlı biyolüminesansı ölçün.
    2. E. coli'nin (Luciferase) 5 kat seri seyreltmesini gerçekleştirin. Seyreltilmiş bakteri süspansiyonunun 10 μL'sini LB agar ve boş bir 96 oyuklu plaka (her ikisi de ışık geçirmez) ile 96 oyuklu bir plaka üzerine yerleştirin. Lusiferaz bazlı algılama yönteminin hassasiyetini değerlendirmek ve LB agarın lüminesans sinyaline müdahale edip etmediğini doğrulamak için lusiferaz bazlı biyolüminesansı ölçün.
    3. E. coli'yi (Luciferase) WTR-, ΔtssM mutantları ve 20 klinik suş (OD600 1.0'a standardize edilmiş) ile 1: 1 oranında karıştırın. 10 kat seyreltin, 96 oyuklu bir plakaya 5 μL ekleyin ve üç teknik kopya oluşturun.
    4. Karanlıkta havayla kuruduktan sonra biyolüminesansı ölçün. Karanlıkta 37 °C'de 4-6 saat inkübe edin, ardından biyolüminesansı tekrar ölçün (emisyon dalga boyu: 562 nm).
    5. Ko-kültür öncesi ve sonrası biyolüminesans değerlerini karşılaştırarak T6SS'ye bağlı antibakteriyel aktiviteyi kantitatif olarak değerlendirin.
      NOT: Deneysel hataları önlemek için bakteriyel süspansiyonların iyice karıştırıldığından emin olun. Veri güvenilirliğini sağlamak için her örnek için en az üç bağımsız çoğaltma gerçekleştirin. İstatistiksel analiz için Student'ın t-testini kullanın.
  3. GFP etiketlemesi kullanılarak T6SS aktivitesinin tespiti
    1. Lusiferaz etiketleme deneyi ile aynı prosedürü izleyin (Uyarma dalga boyu: 480 nm, emisyon dalga boyu: 509 nm).
    2. E. coli'yi (GFP) WTR- ve ΔtssM mutantları (OD600 1.0'a standartlaştırılmış) ile 1: 1 oranında karıştırın. Antibiyotik içermeyen LB agar plakalarına 10 μL yerleştirin. RT'de havayla kuruduktan sonra, çok işlevli bir görüntüleme sisteminin GFP floresan kanalını (Alex488 programı, uyarma: 488 nm, emisyon: 509 nm) kullanarak görüntüler yakalayın.
    3. 37 °C'de karanlıkta 4-6 saat inkübe edin, ardından tekrar fotoğraf çekin. Bakteriyel lekelerin floresan yoğunluğundaki değişikliklere dayalı olarak T6SS aktivitesini değerlendirin.
      NOT: Floresan sinyalleriyle etkileşimi önlemek için tüm adımları karanlıkta gerçekleştirin. Deneysel hatalardan kaçınmak için bakteriyel süspansiyonların iyice karıştırıldığından emin olun. Veri güvenilirliğini sağlamak için her örnek için en az üç bağımsız çoğaltma gerçekleştirin.
  4. Akış sitometrisi algılama
    1. WTR-' yi E. coli (GFP) ve ΔtssM mutantlarını E. coli (GFP) ile 1: 1 oranında karıştırın. Uygun miktarda karışık bakteri süspansiyonu alın ve steril PBS veya 1× tampon kullanarak uygun bir konsantrasyona (tipik olarak OD600 0.1-0.5) seyreltin.
      NOT: 1× tampon, Akış Sitometrisi Boyama Tamponunu (1×) ifade eder, bileşenler şunları içerir: 1× PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4), ile desteklenmiş: %2-5 (h/h) ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS (veya alternatif olarak %1 BSA), 2 mM EDTA.
    2. Seyreltilmiş karışık bakteri süspansiyonunu 300 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peleti 1 mL steril PBS veya 1× tampon içinde tekrar süspanse edin ve hafifçe karıştırın. Agregaları çıkarmak ve tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için yeniden süspanse edilmiş çözeltiyi 35 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
    3. Akış sitometresini açın, lazeri önceden ısıtın ve cihazı kalibre edin.
      1. Algılama parametrelerini ayarlayın: GFP'yi uyarmak için 488 nm lazer kullanın. Algılama kanalı: FL1 (tipik olarak GFP floresan tespiti için 530/30 nm filtre). Bakteri hücrelerini ayırt etmek için ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) parametrelerini ayarlayın.
      2. Etiketsiz E. coli'yi negatif kontrol olarak kullanın, voltajı ve kazancı ayarlayın ve GFP-negatif popülasyonun floresan sinyalinin taban çizgisinde olduğundan emin olun.
    4. Filtrelenmiş numuneyi yavaşça karıştırın ve 100 μL'yi bir akış sitometri tüpüne aktarın.
      1. Aşağıdaki cihaz ayarlarını kullanarak numuneleri analiz edin: 100 (FSC), 110 (SSC) ve 80 (FITC) kazanç değerleriyle kalıntıları dışlamak için FSC-H eşiğini 19.000'e ayarlayın.
      2. Geçit için, başlangıçta FSC-A ve SSC-A dağılım grafiğindeki enkaz ve hedef olmayan sinyalleri hariç tutun, ardından FITC kanalında nüfus analizi yapın. Her örnek için hedef popülasyondan (FSC/SSC özelliklerine göre tanımlanan) en az 10.000 olay elde edin.
    5. Akış sitometrisi yazılımı (örneğin, FlowJo, BD FACSDiva) kullanarak verileri analiz edin.
      1. Hedef bakteri popülasyonunu geçit etmek için FSC ve SSC dağılım grafiklerini çizin. GFP pozitif ve GFP negatif popülasyonları ayırt etmek için FL1 floresan histogramlarını çizin.
      2. GFP pozitif hücrelerin yüzdesini ve ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) hesaplayın.
    6. Kalan karışık bakteri süspansiyonunu 300 g'da 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peletleri 10 μL steril suda tekrar süspanse edin ve antibiyotik içermeyen LB agar plakalarına yerleştirin.
    7. Karanlıkta 37 ° C'de 5 saat inkübe edin, ardından bakteri lekelerini kazıyın ve 500 μL 1× PBS'de yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş çözeltiden 100 μL alın, uygun şekilde seyreltin ve 6.4.4-6.4.5 adımlarını tekrarlayarak akış sitometrisi tespiti yapın.
    8. Ko-kültür öncesi ve sonrası GFP pozitif hücrelerin yüzdesini ve floresan yoğunluğunu karşılaştırın. WTR- ve ΔtssM mutantlarının E. coli (GFP) üzerindeki öldürme etkisini değerlendirin.
      NOT: Hücre toplanmasının algılama sonuçlarını etkilemesini önlemek için tek hücreli bir süspansiyon sağlayın. Floresan sinyallerinin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için algılamadan önce cihazı kalibre edin. GFP floresan söndürmeyi önlemek için deney sırasında numuneleri güçlü ışığa maruz bırakmaktan kaçının. Veri güvenilirliğini sağlamak için her örnek için en az üç çoğaltma gerçekleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T6SS aktivitesini tespit etmek için geleneksel yöntemler tipik olarak, antibiyotik içermeyen LB agar plakaları üzerinde 5 saat boyunca avcı ve hedef suşların birlikte kültürlenmesini, ardından bakteri lekelerinin kazınmasını, yeniden süspanse edilmesini ve seri seyreltmelerin gerçekleştirilmesini içerir. Seyreltilmiş bakteri süspansiyonu daha sonra seçici agar plakaları üzerinde lekelenir. Ertesi gün plakalar üzerindeki hedef suşun kolonilerini sayarak, T6SS aktivitesi kalitatif olarak değerlendirilebilir. Bununla birlik...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tip VI Salgılama Sistemi (T6SS), işlevleri esas olarak efektör proteinlerin salgılanması yoluyla gerçekleştirilen karmaşık bir çoklu protein mekanizmasıdır. Bu efektör proteinler, diğer bakteri türlerini öldürerek veya inhibe ederek bakteriler arası rekabete aracılık eder, böylece konakçı bakteriye mikrobiyal topluluklarda rekabet avantajı sağlar15. Rekabetteki rolünün ötesinde, çalışmalar T6SS'nin bakteri kolonizasyonu, çevresel adaptasyon, biyofilm oluşumu, adez...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknik destek ve makale incelemesi konusundaki yardımları için tüm yazarlara ve tüm laboratuvara teşekkür eder, teşekkür ederiz. Bu çalışma, Jilin Üniversitesi 2024B20'nin Bethune Projesi ve Changchun Şehri 23YQ10 Bilim ve Teknoloji Geliştirme Projesi ve Bulaşıcı Olmayan Kronik Hastalıklar-Ulusal Bilim ve Teknoloji Büyük Projesi 2024ZD0529700 tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
%10, %15 SDS-PAGE Jel Hazırlama KitiEpizymePG112-20
° C DondurucuHaierHYCD-290
37 > C Kuluçka MakinesiBluepard181254254
4 & derece; C BuzdolabıHaierHYC390-80
° C DondurucuHaierDW-86L726G (726L)
96 oyuklu plakaJETTCP010096
AgarBiofrox8211KG001
Amonyum Persülfat (APS)Thermo7727-54-0
Biyolojik Güvenlik KabiniESCOAC2-4S1 
Elektronik TeraziSartorius AGBSA124S-CW
Elektroforez cihazıBIO-RADPOWER
Yaprak Buz MakinesiGRANTXB70
Akış SitometresiBECKMAN COULTERAW38143
Akış Sitometrisi Boyama TamponuproteintechPF00018
Jel Görüntüleme SistemiBIO-RADJel Doc 2000
GlisinZikeZK-L2577
Yüksek Hızlı SantrifüjEppendorf5405IN106358
HRP konjuge Tavşan / Fare İkincil AntikorproteintechSA00001-2
LB Et SuyuSolarbioL8291
Düşük Sıcaklık Yüksek Hızlı SantrifüjThermo17R
MetanolThermoR40121
Mikro UV-Vis SpektrofotometreTermoNanodrop bir
MikrosantrifüjallshengMini-6k
Mikroplaka OkuyucuBio-TekH1M
NuPAGE LDS Numune TamponuThermoNP0007
Fosfat Tampon Çözeltisi (PBS)ZikeZK-L1649
Precision Plus Protein Çift Renk StandartlarıBio-Rad1610374
SDS Numune Yükleme TamponuBeyotimepoo15L
Yağsız SütTozu TermoLP0033B
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)Zike zk6885
Termostatik Su BanyosuJingHongDK-420S
Transfer AparatıBio-RadPowerPac HC
Tris(hidroksimetil)aminometan (Tris)ZikeZK-L2557
Dikey Elektroforez AparatıBio-RadMii-PROTEAN Tetra
PAC1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapitein, N., Mogk, A. Type VI secretion system helps find a niche. Cell Host Microbe. 16 (1), 5-6 (2014).
  2. Carruthers, M. D., Nicholson, P. A., Tracy, E. N., Munson, R. S. Jr Acinetobacter baumannii utilizes a type VI secretion system for bacterial competition. PLoS One. 8 (3), e59388(2013).
  3. Kandolo, O., et al. Acinetobacter type VI secretion system comprises a non-canonical membrane complex. PLoS Pathog. 19 (9), e1011687(2023).
  4. Boyer, F., Fichant, G., Berthod, J., Vandenbrouck, Y., Attree, I. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome-wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources. BMC Genomics. 10, 104(2009).
  5. Russell, A. B., Peterson, S. B., Mougous, J. D. Type VI secretion system effectors: poisons with a purpose. Nat Rev Microbiol. 12 (2), 137-148 (2014).
  6. Pogue, J. M., Kaye, K. S., Cohen, D. A., Marchaim, D. Appropriate antimicrobial therapy in the era of multidrug-resistant human pathogens. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 302-312 (2015).
  7. McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiol Rev. 37 (2), 130-155 (2013).
  8. Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clin Microbiol Rev. 30 (1), 409-447 (2017).
  9. de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol Syst Biol. 4, 174(2008).
  10. Weber, B. S., et al. Genetic dissection of the type VI secretion system in Acinetobacter and identification of a novel peptidoglycan hydrolase, TagX, required for its biogenesis. mBio. 7 (5), e01253-e01316 (2016).
  11. Scherzinger, E., et al. Replication of the broad host range plasmid RSF1010: requirement for three plasmid-encoded proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (3), 654-658 (1984).
  12. Weber, B. S., Ly, P. M., Irwin, J. N., Pukatzki, S., Feldman, M. F. A multidrug resistance plasmid contains the molecular switch for type VI secretion in Acinetobacter baumannii. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9442-9447 (2015).
  13. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 10 (unit 10.2A), (2012).
  14. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  15. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends Microbiol. 24 (1), 51-62 (2016).
  16. Hood, R. D., et al. A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
  17. Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and regulation of the type VI secretion system. Annu Rev Microbiol. 66, 453-472 (2012).
  18. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes Dev. 21 (5), 601-614 (2007).
  19. Repizo, G. D., et al. Differential role of the T6SS in Acinetobacter baumannii virulence. PLoS One. 10 (9), e0138265(2015).
  20. Lin, J., et al. A Pseudomonas T6SS effector recruits PQS-containing outer membrane vesicles for iron acquisition. Nat Commun. 8, 14888(2017).
  21. Bernard, C. S., Brunet, Y. R., Gueguen, E., Cascales, E. Nooks and crannies in type VI secretion regulation. J Bacteriol. 192 (15), 3850-3860 (2010).
  22. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  23. Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
  24. Meighen, E. A. Bacterial bioluminescence: organization, regulation, and application of the lux genes. Faseb J. 7 (11), 1016-1022 (1993).
  25. Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS One. 5 (8), e12441(2010).
  26. Pletzer, D., et al. The Pseudomonas aeruginosa PA14 ABC transporter NppA1A2BCD is required for uptake of peptidyl nucleoside antibiotics. J Bacteriol. 197 (13), 2217-2228 (2015).
  27. Szittner, R., Meighen, E. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium. J Biol Chem. 265 (27), 16581-16587 (1990).
  28. Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Sci Rep. 6, 37246(2016).
  29. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Type VI SecretionT6SS ActivityAcinetobacter BaumanniiFluorescence DetectionLuciferase LabelingGFP LabelingFlow CytometryBacterial Killing AssayHcp SecretionTssM Gene
Video Coming Soon

Related Articles