Genom çapında bir CRISPR / Cas9 tarama yönteminin uygulanması yoluyla dirençli ve hassas radyasyon genlerini seçmek için titiz ve yapılandırılmış bir yaklaşım verilmiştir. Bu protokol aynı zamanda klinik olarak uygulanan kimyasal ilaçlara direnç mekanizmalarını araştıran diğer araştırma çabaları için çok yönlü bir çerçeve olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Radyosensitif ve radyodirençli genleri ortaya çıkarmak için genom çapında CRISPR ekranı
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
CRISPR-Cas9 sistemi kullanıldı ve güçlü bir genom düzenleme aracı olarak yeniden tasarlandı. Araştırmacılar bu teknolojiden yararlanarak, canlı hücrelerdeki DNA dizilerini hassas bir şekilde kesebilir, yapıştırabilir ve hatta yeniden yazabilirler. Bununla birlikte, CRISPR ekran teknolojisinin uygulanması sadece deneylerin çok ötesine geçmektedir. Genetik hastalıklara karşı mücadelede çok önemli bir araç olarak hizmet eder, karmaşık genetik manzaraları sistematik olarak inceler, araştırmacıları biyolojik olayların altında yatan moleküler mekanizmaları çözme konusunda güçlendirir ve bilim adamlarının kanser, kistik fibroz ve orak hücreli anemi gibi hastalıkların temel nedenlerini belirlemelerini ve hedeflemelerini sağlar. Hepsinden önemlisi, kanser tıp için zorlu bir zorluk teşkil etmekte ve eradikasyon çabalarını teşvik etmektedir. Radyoterapi, geleneksel bir tedavi olarak, sonuç verir ancak sınırlamaları vardır. Kanser hücrelerini yok eder, aynı zamanda sağlıklı dokulara da zarar vererek yaşam kalitesini düşüren olumsuz etkilere neden olur. Ek olarak, tüm kanser hücreleri radyoterapiye yanıt vermez ve bazıları direnç geliştirerek durumu kötüleştirebilir. Bunu ele almak için, radyosensitif ve radyodirençli genlerin verimli bir şekilde tanımlanmasını sağladığı ve böylece kanser araştırma ve tedavisi alanını ilerlettiği için kapsamlı bir tam genom CRISPR ekran teknolojisi tanıtıldı. Açıklanan protokolü takiben ışınlamaya maruz kalan akciğer adenokarsinom hücrelerinde genom çapında bir CRISPR taraması yapıldı ve bu sayede hem radyorezistans hem de radyosensitivite ile ilişkili genler tanımlandı.
Giriş
Biyolojik olayların araştırılması, doğal olarak hücresel davranışların incelenmesi ile iç içedir ve sırayla, hücresel davranışların incelenmesi temel olarak genomunun araştırılmasıyla bağlantılıdır. Modern teknoloji gelişmeye devam ettikçe, tıp araştırmacıları, çeşitli hastalıkların tedavi sonuçlarını iyileştirmek için dikkatlerini gen düzenleme yoluyla hücresel davranışları değiştirmeye doğru giderek daha fazla yönlendiriyorlar. Bu bağlamda, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) teknolojisi, nispeten basit uygulaması nedeniyle genom düzenleme için devrim niteliğinde bir araç olarak ortaya çıkmıştır<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Uygun bir radyasyon dozunun seçilmesi
- Yapışık hücrelerin hazırlanması ve kaplanması
- Geçiş ve hücre büyümesi için %10 FBS içeren RPMI 1640 tam hücre kültürü ortamı ile hücre yoğunluğunu mL başına 5 x10 5 hücre olarak ayarlayın. Hücreleri farklı dozlarda radyasyon için 3,5 cm'lik kültür kaplarına dağıtın. Her yemeğe 2 mL (1 x 10,6 hücre) ekleyin ve gece boyunca 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin.
- Farklı radyasyon do....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Önde gelen ölüm oranına sahip akciğer kanseri, oldukça agresif ve yaygın bir tıbbi hastalığı temsil eder. Tarama koşulu olarak radyasyon ile genom çapında bir CRISPR ekranı yürütmek için örnek olarak akciğer kanseri hücre hattı A549'u kullanarak, şematik iş akışı Şekil 1'de gösterilmektedir. İlk olarak, klon oluşumu ve CCK8 deneyleri yoluyla A549 hücrelerinin farklı radyasyon dozlarına duyarlılığını keşfedin (Şekil 2). Klonojenik tahlilde, koloni sayısı 2 Gy'de .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Son teknoloji bir gen düzenleme teknolojisi olan CRISPR ekranı, bilimsel araştırma alanında derin değişikliklere yol açtı5. CRISPR-Cas9 sisteminden kaynaklanan bu teknoloji, yüksek verimliliği ve hassasiyeti nedeniyle gen fonksiyonlarını incelemek için önemli bir araç haline gelmiştir9. CRISPR/Cas9 mühendislik prensibi, Cas9 nükleazını hedef DNA dizilerini hassas bir şekilde bulmak ve kesmek için yönlendirmek için yaklaşık 20 nükleotidli sp.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hiç kimse.
Teşekkürler
Bu çalışma, Hubei Eyaleti Bölgesel Bilim ve Teknoloji İnovasyon Projesi (2024EIA001) ve Wuhan Üniversitesi Zhongnan Hastanesi (PTXM2025001) Tıp Bilimi ve Teknoloji İnovasyon Platformu İnşaat Desteği Projesi tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 , Figdraw kullanılarak oluşturulmuştur.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 150 mm hücre ve doku kültürü kabı | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 715011 | Hücre kültürü |
| 35 mm hücre ve doku kültürü kabı | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 706011 | Hücre kültürü |
| A549 hücre hattı | ATCC | - | |
| Hücre sayma kiti-8 | Shanghai Beyotime Biotech Inc | C0041 | Hücre canlılığı testi için |
| CO2< / sub> bağımsız ortam | PHCbi | MCO-50AIC | Hücre kültürü |
| Kontes 3 FL otomatik hücre sayacı | Themo Scientific | AMQAF2001 | Hücre sayımı için |
| EDTA | Gibco 25200056 | Hücre kültürü | |
| Fetal sığır serumu | Gibco | 10099141 | Hücre kültürü |
| Floresan mikroskobu | LEICA | ebq 100-04 | Floresan mikroskobu için |
| Genom çapında CRISPR lentiviral kütüphanesi | Shanghai OBiO Technology Co., Ltd. | H5070 | Lentiviral enfeksiyon için |
| MiniAmp plus PCR | Themo Scientific | C37835 | PCR amplifikasyonu için |
| NEST hücre kültürü plakaları, 12 kuyulu | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 712002 | Hücre kültürü |
| NEST hücre kültürü plakaları, 6 kuyulu | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 703002 | Hücre kültürü |
| NEST hücre kültürü plakaları, 96 kuyulu | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 701001 | Hücre kültürü |
| PBS | Gibco | C10010500BT | Hücre kültürü |
| PCR ileri astar (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) | Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd. | - | PCR amplifikasyonu için |
| PCR ters astar (GATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCA) | Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd. | - | PCR amplifikasyonu için |
| Polybrene | Shanghai Beyotime Biotech Inc | C0351 | Lentiviral enfeksiyon için |
| Puromycin | MCE | HY-K1057 | Seletion sonrası lentiviral enfeksiyon için |
| RPMI 1640 hücre kültürü ortamı | Gibco | 23400-021 | Hücre kültürü |
| TIANGENamp genomik DNA kiti | Beijing TIANGEN Biotech Co.,Ltd. | DP304 | Genomik DNA ekstraksiyonu için |
| X-ışını toz difraktometresi | PerkinElmer | Radyoterapi için |
Kaynaklar
- Barrangou, R., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas systems: Prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Mol Cell. 54 (2), 234-244 (2014).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-8....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
