Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hasta Kaynaklı Kolorektal Tümör Organoidleri ve Tümör İnfiltre Eden Lenfositlerden (TIL'ler) Oluşan Bir Ko-Kültür Sisteminin Kurulması

3.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68346

⸱

27 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory of biomarker high throughput screening and target translation of breast and gastrointestinal tumor, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, 2Department of General Surgery, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University

Bu makalede

Özet

Protokol, etkileşimlerini ve terapötik potansiyellerini incelemek için tümör infiltre eden lenfositler (TIL'ler) ile birlikte kültürlenmiş, hasta kaynaklı bir kolorektal kanser (CRC) organoid modeli oluşturmak için bir yöntemi açıklar. Bu model, tümör mikroçevresindeki immün yanıtları araştırmak ve kişiselleştirilmiş KRK tedavisi için TIL bazlı tedavinin etkinliğini tahmin etmek için klinik öncesi bir platform sağlar.

Özet

Kolorektal kanser (KRK) dünya çapında en sık görülen üçüncü kanserdir. Tümör infiltre olan lenfositler (TIL'ler) KRK'de önemli bir prognostik belirteç olarak tanımlanmıştır. TIL'lerin terapötik uygulaması, melanom ve rahim ağzı kanserinde umut verici sonuçlar göstermiştir. Bununla birlikte, KRK tedavisinde kullanımları keşif aşamasında kalmaktadır. TIL etkinliğini değerlendirmek için uygun bir in vitro model şu anda mevcut değildir ve bu alanda daha fazla ilerlemeyi engellemektedir. Orijinal tümör dokusunun özelliklerini yakından koruyan ve hastalar arası heterojenliği yansıtan hasta kaynaklı organoid (PDO) modeller, KRK ve TIL'ler arasındaki etkileşimi incelemek için mükemmel bir platform sağlar. Bu çalışmada, yeni rezeke edilmiş tümör dokusundan hasta kaynaklı bir KRK organoid modeli oluşturmak ve ardından TIL'lerin izolasyonu ve genişletilmesi için bir yöntem tanımlanmıştır. Bu sistem, CRC organoidlerinin ve TIL'lerin ko-kültürüne izin vererek, TIL aracılı sitotoksisite ve immün yanıtların değerlendirilmesini sağlar. Organoidler üzerindeki TIL öldürme etkinliğini analiz ederek, kişiselleştirilmiş KRK tedavisi için TIL bazlı immünoterapinin potansiyel sonuçları tahmin edilebilir. Ayrıca, TIL'lerin daha fazla mühendisliği, daha etkili hücresel tedaviler geliştirmek için umut verici bir strateji sunarak anti-tümör etkinliklerini artırabilir. Bu PDO-TIL ko-kültür modeli, KRK'de TIL tedavilerinin ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejilerinin klinik öncesi değerlendirmesi için güçlü bir araç sağlar.

Giriş

Kolorektal kanser (KRK), dünya çapında en yaygın ve ölümcül kanserlerden biridir ve önemli bir halk sağlığı sorununu temsil eder1. Cerrahi, kemoterapi ve immünoterapi dahil olmak üzere tedavi yöntemlerindeki ilerlemelere rağmen, KRK hastalarının, özellikle metastatik hastalığı olanların prognozu kötü kalmaktadır. Tümör mikroçevresi (TME), kansere karşı bağışıklık tepkisini etkileyen önemli bir bileşen olarak ortaya çıkan tümör infiltre eden lenfositler (TIL'ler) ile kanser ilerlemesini ve tedavi yanıtlarını şekillendirmede hayati bir rol oynar2. Tümörlerde bulunan çeşitli bir bağışıklık hücresi popülasyonu olan TIL'ler, KRK'de önemli prognostik belirteçler olarak tanımlanmıştır ve yüksek TIL infiltrasyon seviyeleri genellikle daha iyi klinik sonuçlarla ilişkilidir3. Son çalışmalar, TIL bazlı immünoterapinin umut verici etkinlik gösterdiği melanom4 ve rahim ağzı kanseri5 gibi diğer kanserlerde de TIL'lerin terapötik potansiyelini vurgulamıştır.

Bununla birlikte, TIL'lerin bazı kanser türlerindeki başarısına rağmen, KRK'deki uygulamaları devam eden bir araştırma alanı olmaya devam etmektedir. KRK'nın karmaşıklığı ve heterojenliği, immünosupresif tümör mikroçevresi ile birleştiğinde, etkili TIL bazlı immünoterapi için zorluklar ortaya çıkarmaktadır6. CRC tümörleri sıklıkla, düzenleyici T hücrelerinin (Treg'ler), miyeloid kaynaklı baskılayıcı hücrelerin (MDSC'ler) ve tümörle ilişkili makrofajların (TAM'lar) varlığı ile karakterize edilen ve tümü TIL fonksiyonunu aktif olarak inhibe eden yüksek derecede immünosüpresif bir TME7 sergiler. Ayrıca, CRC hücreleri sıklıkla PD-L1 gibi bağışıklık kontrol noktası moleküllerini eksprese eder ve bu da TIL aracılı öldürmeyi daha da engelleyebilir8. Ek olarak, CRC tümörlerinin genetik heterojenliği, immünosupresif bir stroma ile birleştiğinde, TIL'lerin tümör hücrelerini etkili bir şekilde hedefleme ve ortadan kaldırma yeteneğini karmaşıklaştırarak, melanom ve rahim ağzı kanserinde görülen aynı başarı düzeyine ulaşmayı zorlaştırır9. Mevcut araştırmalardaki kritik bir boşluk, CRC ve TIL'ler arasındaki etkileşimleri doğru bir şekilde simüle edebilen uygun in vitro modellerin eksikliğidir. Bu tür modeller, KRK tedavisinde TIL'lerin potansiyelini değerlendirmek ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri için uygulamalarını optimize etmek için gereklidir.

Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar), insan kanserlerini modellemek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır10. Hasta tümör dokularından türetilen bu 3D kültürler, orijinal tümörlerin histolojik ve genetik özelliklerini yakından taklit ederek, geleneksel 2D hücre hatlarına kıyasla tümör biyolojisinin daha doğru bir temsilini sağlar. PDO modelleri ayrıca hastalar arası heterojenliği korur ve bu da onları kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları için ideal hale getirir11. CRC'de, PDO'lar ilaç taraması ve tümör biyolojisini incelemek için kullanılmıştır12, ancak immün yanıtların değerlendirilmesinde - özellikle TIL'ler bağlamında - kullanımları sınırlı kalmaktadır. Bir PDO-immün hücre ko-kültür modelinin tasarımı, mikro çevrenin karmaşıklığını deneysel kontrol edilebilirlik ile dengelemelidir. Makrofajlar ve dendritik hücreler gibi bileşenler biyomimikriyi artırabilse de, periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) erişilebilirlikleri nedeniyle ana akım tercih haline gelmiştir. Bununla birlikte, PBMC'ler düşük oranda tümöre özgü T hücrelerine sahiptir ve monosit alt popülasyonları mikroçevresel stabiliteye müdahale edebilir13. Buna karşılık, TIL'ler doğal olarak tümör reaktif klonlarını zenginleştirir ve in situ tükenme fenotipi taşır, bu da onları kolorektal kanserde immün kaçınma mekanizmalarını hassas bir şekilde analiz etmek için üstün bir model haline getirir.

Bu çalışmanın amacı, KRK'lerde TIL aracılı anti-tümör yanıtlarını değerlendirmek için yeni bir in vitro platform geliştirmek ve KRK'ler, PDO'lar ve TIL'lerden oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmaktır. Bu model, CRC PDO'lara karşı TIL sitotoksisitesinin doğrudan değerlendirilmesini ve hastaya özgü bir bağlamda immün yanıtların analizini sağlar. Bu sistemin kullanılması, KRK için TIL tabanlı immünoterapilerin potansiyeli hakkında daha derin bilgiler sağlayabilir ve mühendislik yaklaşımları yoluyla TIL etkinliğini artırmaya yönelik stratejilerin araştırılmasını destekleyebilir. Önceki yöntemler az sayıda TIL ile sınırlıydı14. Çoğu durumda, PBMC'ler ilk olarak iki hafta boyunca PDO'larla birlikte kültürlendi, daha sonra tümöre özgü TIL'ler PBMC'lerden genişletilebilir ve daha sonra sitotoksik etkileri gözlemlemek için PDO'larla daha fazla birlikte kültürlenebilir15. Bununla birlikte, bu yaklaşım aynı zamanda uzun modelleme süresinden ve düşük toplam verimden muzdariptir. Buna karşılık, tarif edilen yöntem, daha sonra doğrudan birlikte kültürlenebilen daha küçük tümör dokusu örneklerinden PDO'ların ve TIL'lerin izolasyonuna ve oluşturulmasına izin verir. Bu yaklaşım hem metodoloji hem de verimlilik açısından daha fazla kolaylık sağlayabilir. Sonuç olarak, bu sistem, KRK hastaları için sonuçları iyileştirebilecek kişiselleştirilmiş tedavi stratejilerinin önünü açarak, TIL tedavilerinin klinik öncesi değerlendirmesi için güçlü bir araç sağlamayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan kaynaklı materyalleri içeren tüm deneyler, Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Dalian Üniversitesi'ne bağlı Zhongshan Hastanesi Etik Kurulu tarafından önceden onaylanmıştır (onay numaraları: KY2023-206-1). Bu çalışma için klinik örnek veren tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

Dahil edilme kriterleri arasında patolojik olarak doğrulanmış primer kolorektal kanser dokusu, yeterli örneklem büyüklüğü (≥1cm3), neoadjuvan tedavi öyküsü (kemoradyasyon veya hedefe yönelik tedavi) ve imzalı bilgilendirilmiş onam vardı. Dışlama kriterleri, %50'yi aşan nekroz veya fibroz ile düşük numune kalitesi, eşzamanlı ciddi enfeksiyon veya otoimmün hastalık varlığı, diğer malignitelerin öyküsü ve hastanın katılmayı reddetmesinden oluşuyordu.

1. Hücre kültürü reaktif hazırlığı

  1. CRC PDO'lar için kültür ortamı: CRC PDO'ları Komple Ortamı Tablo 1'de açıklanan bileşime göre hazırlayın.
  2. TIL'ler için komple ortam (CM)16: %10 FBS, %1 penisilin-streptomisin, HEPES, 2-merkaptoetanol ve 3000 IU/mL IL-2 ile RPMI1640 ortamı takviye edin.
  3. TIL genleşme ortamı (EM): %10 FBS, %1 penisilin-streptomisin, HEPES ve 600 IU/mL IL-2 ile RPMI1640 ortamını destekleyin.
  4. AdDMEM++++: Gelişmiş DMEM'i %1 penisilin-streptomisin, %1 HEPES, %1 glutamin ve 5 mM Y-27632 ile destekleyin.
  5. CRC sindirim tamponu: AdDMEM++++'a 50 μL kollajenaz tip IV ve 10 μL Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B Çözeltisi ekleyin.
  6. Doku yıkama solüsyonu: PBS'ye% 2 penisilin-streptomisin ekleyin.

2. Hasta kaynaklı doku işleme

  1. Primer kolorektal kanser tümör dokusunu rezeke edin (deneyimli cerrahlar tarafından yapılmalıdır). Toplandıktan sonra dokuyu iki parçaya bölün. Bir parçayı AdDMEM++++ içine bir buz kutusuna yerleştirin ve tümör hücresi ayrışması ve kültürü için laboratuvara taşıyın. Diğer kısmı histopatolojik analiz için %4 paraformaldehit içine yerleştirin17.
  2. Matrigel'i 4 °C'lik bir buzdolabında yavaşça çözdürün. Eritrosit lizis tamponunu oda sıcaklığına önceden ısıtın. Doku makası, forseps, AdDMEM++++ ortamı ve CRC sindirim tamponu hazırlayın.
  3. Dokuyu bir petri kabına aktarın ve 5 mL PBS ile üç kez durulayın. Yeni bir tabakla değiştirin ve kontaminasyonu en aza indirmek için 5 mL doku yıkama tamponu ile üç kez durulayın.
  4. Dokuyu makasla kıyın, sindirim tamponuna aktarın ve tamamen ayrışana kadar 37 ° C'lik bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
  5. Dokuyu doku makası ile kesin ve doku sindirim solüsyonuna aktarın. Dokuyu 37 ° C'lik bir su banyosunda sindirin ve doku ayrışması tamamlanana kadar izleyin.
  6. Sindirimi nötralize etmek için eşit miktarda AdDMEM++++ ekleyin. 380 × g'da 25 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın. Peletteki eritrosit sayısını gözlemleyin. 1-3 mL eritrosit lizat ekleyin ve 25 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    1. Lizisi eşit hacimde AdDMEM++++ ile sonlandırın. 380 × g'da yaklaşık 25 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve hücre peletini uygun bir hacimde AdDMEM++++ içinde yeniden süspanse edin.
  9. Tümör dokusunun tek hücreli bir süspansiyonunu elde etmek için tripan mavisi dışlamasını kullanarak canlı hücreleri ölçün.

3. PDO modeli kurulumu ve TIL kültürü

  1. Tümör dokusunun tek hücreli süspansiyonunu iki kısma bölün: birini PDO modeli oluşturmak için, diğerini TIL kültürü için kullanın.
  2. Hücre sayımından sonra, PDO modeli oluşturulması için hücre süspansiyonunun oyuğu başına 80.000 hücreyi Matrigel ile 1: 1 oranında karıştırın.
  3. TIL kültürü için 1 × 106 hücre / mL konsantrasyonda 24 oyuklu bir plakada CM'de kalan hücre süspansiyonunu yeniden süspanse edin.
  4. Her gün gözlemleyin. PDO'ların ve TIL'lerin durumunu kaydetmek için fotoğraf çekin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.

4. TIL'lerin saflaştırılması ve genişletilmesi

  1. Saflaştırmadan önce 10-20 gün boyunca kültür TIL'leri.
  2. TIL'leri bir santrifüj tüpüne toplayın. Kuyu plakasını taze ortamla durulayın ve kalan hücreleri kuyu plakasından toplayın.
  3. 125 × g'da yaklaşık 25 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın. 2 mL PBS ile yıkayın ve yaklaşık 25 ° C'de 5 dakika boyunca 125 × g'da tekrar santrifüjleyin.
  5. Hücre sayımı gerçekleştirin.
  6. CD3 + T hücrelerini izole etmek için sıralama için CD3 + manyetik boncuklar kullanın18.
  7. Antikoru hücre süspansiyonu ile 4 ° C'de 10-15 dakika inkübe edin.
  8. Manyetik boncukları antikor hücre süspansiyonu ile 4 ° C'de 10-15 dakika inkübe edin.
  9. Sıralama sütununu sıralama mıknatısına yerleştirin. Hücre süspansiyonunu sütuna ekleyin ve sıralama sütununda yalnızca manyetik boncuk etiketli pozitif hücrelerin tutulmasına izin verin.
  10. Sıralama sütununu manyetik alandan çıkarın. Sütunda tutulan pozitif hücreleri elüte etmek için tampon çözeltisi ekleyin. Hücreleri 2 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve yaklaşık 25 ° C'de 5 dakika boyunca 195 × g'da santrifüjleyin.
  11. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın. Hücreleri, 1 × 106 hücre / mL konsantrasyonda taze EM ortamı ile 12 oyuklu bir plakada yeniden süspanse edin. 5 μg/mL CD3 antikoru ekleyin. Hücreleri her 3 günde bir yeni kültür şişelerine geçirin.

5. PDO'ların histolojisi ve IHC karakterizasyonu

  1. Organoidler 50 μm'lik bir boyuta ulaştıktan sonra kültür ortamını aspire edin.
  2. Organoid küreleri doğrudan% 4 paraformaldehit içine sabitleyin. Organoidleri aspire edin, yaklaşık 25 ° C'de 5 dakika boyunca 195 × g'da santrifüjleyin,% 2 agaroz içine gömün, sertleşmesine izin verin ve% 4 paraformaldehite aktarın gece boyunca fiksasyon için.
  3. Ertesi gün, gradyan dehidrasyonu yapın. Balmumu blokları hazırlayın, 4 μm'lik bölümleri kesin, bir gradyan kullanarak rehidre edin ve CK7, CK20, Ki-67 ve CDX-2 antikorlarını kullanarak immünohistokimyasal boyama yapın.

6. TIL'lerin IF karakterizasyonu

  1. TIL'leri saflaştırın, yeterli sayıya ulaşılana kadar kültürleyin ve karakterizasyon için bir kısmını çıkarın.
  2. Pullanma yöntemini kullanarak süspansiyon hücrelerini karakterize edin. Pullayıcının dönüş hızını yaklaşık 343 ×C'de 4 dakika boyunca 25 g olarak ayarlayın.
  3. Hücreleri slayt başına 1 × 104 olacak şekilde sayın ve tohumlayın.
  4. Hücreleri santrifüjleme ile slaytlara sıkıca tutturun.
  5. Hücreleri 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve PBS ile üç kez yıkayın.
  6. 1 saat boyunca bloke edici çözelti (% 2 FBS içeren PBS) ile inkübe edin.
  7. Birincil antikorlarla (CD45, CD3, EpCAM) oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. PBS ile üç kez yıkayın.
  8. İkincil antikoru, üreticinin önerdiği konsantrasyona göre oda sıcaklığında 1 saat hazırlayın ve inkübe edin. PBS ile üç kez yıkayın.
    NOT: Antikor homolojisine dikkat edin.
  9. DAPI ile yaklaşık 25 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
  10. Lekeli hücreleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin.

7. PDO'lar ve TIL'ler ko-kültür sistemi

  1. Antijen sunumunu geliştirmek için organoid ortama IFN-γ ekleyin. 37 ° C'de% 5 CO2 ile 24 saat15 inkübe edin.
  2. Anti-CD28 antikorunu PBS ile seyreltin. Her oyuğa 50 μL antikor çözeltisi ekleyerek 96 oyuklu bir plakayı kaplayın. Plakayı sızdırmazlık filmi ile kapatın ve 4 ° C'de 24 saat inkübe edin.
  3. 24 saat sonra, organoidleri TrypLE kullanarak tek hücrelere ayırın. Hücreleri sayın ve PBS ile iki kez yıkayın.
  4. Eşleştirilmiş TIL'leri toplayın, hücreleri sayın ve PBS ile iki kez yıkayın.
  5. Organoidleri oyuk başına 1 × 104 hücrede aşılayın ve ko-kültür için 10: 1'lik bir efektör-hedef (E: T) oranı elde etmek için TIL'leri oyuk başına 1 × 105 hücrede aşılayın.
  6. % 10 FBS,% 1 penisilin-streptomisin, 3000 U / mL IL-2 ve 20 μg / mL anti-PD-1 bloke edici antikor ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamında ko-kültür gerçekleştirin. 3 gün kuluçkaya yatın ve gözlem ve dokümantasyon için görüntüler yakalayın.
    NOT: TIL'ler olmadan organoidleri kontrol grubu olarak ayarlayın.

8. Akış sitometrisi ile TIL'lerin fonksiyonel analizi

  1. Ortak kültür döneminin sonunda PDO'ları ve TIL'leri toplayın.
  2. Hücreleri PBS ile iki kez, her seferinde 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleme ile yıkayın. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın.
  3. CD3-FITC, CD4-APC / Siyanin7, CD8-APC, CD107a-PE-Siyanin7, CD279-PE ve 7-AAD içeren antikor kokteylini hazırlayın.
  4. Hücreleri 100 μL antikor kokteylinde yeniden süspanse edin ve ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  5. Hücreleri yıkamak için 1 mL PBS ekleyin. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipet kullanarak atın.
  6. Hücreleri 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
  7. Akış sitometrisi analizi yapın. Ayrıntılı analiz stratejisi için Ek Şekil 1'e bakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CRC PDO'ların kurulması ve karakterizasyonu
Tümör örnekleri KRK hastalarından elde edildi. Taze rezeke edilmiş CRC tümör dokusu, daha sonra PDO-TIL ko-kültür deneylerinde kullanılan PDO'lar ve TIL'ler oluşturmak için kullanıldı (Şekil 1).

figure-results-1
Şekil 1: Genel deneysel iş akışının şeması....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, hem tümör hücrelerini hem de PDO'ların oluşturulduğu ve TIL'lerin genişletildiği TIL'leri elde etmek için hasta kaynaklı KRK dokusunu kullanır. Bu iki bileşen arasındaki etkileşim daha sonra bir ko-kültür sistemi aracılığıyla araştırılır.

Önceki çalışmalarda, TIL'ler karmaşık enstrümantasyon19 kullanılarak veya doğrudan tümör dokusu süspansiyonlarından20 ekstrakte edildi. Bununla birlikte, bu yöntemle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [82172822] tarafından desteklenmiştir; Dalian Bilim ve Teknoloji Bürosu Üst Düzey Yetenek İnovasyon Destek Programı [2021RD02]; Liaoning İl Bilim ve Teknoloji Programı Ortak Planı [2024JH2/102600067]; Liaoning İli Uluslararası Bilim ve Teknoloji İşbirliği Projesi [2024JH2/101900006].

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Gelişmiş DMEM/F-12Gibco12634028
2-MerkaptoetanolSigma63689
%4 paraformaldehitBBIE672002-0100
7-AADBiyolojik Efsane420403
A83-01 SerisiTocris Hakkında2939
B27 takviyesiGibco17504-44
CD107a-PE-Siyanin7Biyolojik Efsane328618
CD279-PEBiyolojik Efsane329906
CD3 Monoklonal Antikor (OKT3)Davetli14-0037-82
CD3-FITCBiyolojik Efsane300406
CD45 (Hücre İçi Alan) (D9M8I) CST13917S
CD4-APC/Siyanin7Biyolojik Efsane300518
CD8-APCBiyolojik Efsane344722
CDX-2MXBRMA-0631 Serisi
CK20 SerisiMXBTakım Seti-0025
CK7MXBTakım Takımı-0021
Dylight 488, Keçi Anti-Tavşan IgGAbbkineA23220 Serisi
Dylight 549, Keçi Anti-Fare IgGAbbkineA23310 Serisi
EGFPeprotechAF-100-15 Serisi
EpCAMCST36746T
Fetal Sığır Serumu (FBS)Hücre maksSA211.02
FGF 10Peprotech100-26
Gastrin (İnsan)Tocris Hakkında3006
GlutaMax 100xGibco35050-061
HepesSigmaH4034 Serisi
HEPESSigmaH4034 Serisi
İnsan CD3+ Hücre Ayırma Kiti (RUO)Geri sarK1201-10 Serisi
İnsan IFN-gama Rekombinant ProteiniPeproTech300-02-20UG
Ki-67CST9449'lar
MatrisCorning354234
N-AsetilsisteinSigmaA9165 Serisi
NikotinamidSigmaN0636 Serisi
Nivolumab (anti-PD-1)SatıcıA2002 
Penisilin/StreptomisinSigmaV900929
penisilin-streptomisinNCM BiyoteknolojiC100C5 Serisi
PrimocinInvivogenKarınca-pm-1
RBC Lizis Tamponutermo-invitrogen00-4300-54
Rekombinant İnsan IL-2 (taşıyıcısız)Biyolojik Efsane589104
RPMI 1640Gibco
SB202190SatıcıS1077
Tripan Mavisi leke %0,4termo-invitrogenT10282
Ultra-LEAF Saflaştırılmış anti-insan CD28 AntikoruBiyolojik Efsane302934
Ultra-LEAF Saflaştırılmış anti-insan CD3 AntikoruBiyolojik Efsane317325
Y-27632SatıcıS1049 Serisi

Kaynaklar

  1. Eng, C., et al. Colorectal cancer. Lancet. 404 (10449), 294-310 (2024).
  2. Sarnaik, A. A., Hwu, P., Mulé, J. J., Pilon-Thomas, S. Tumor-infiltrating lymphocytes: A new hope. Cancer Cell. 42 (8), 1315-1318 (2024).
  3. Paijens, S. T., Vledder, A., De Bruyn, M., Nijman, H. W. Tumor-infiltrating lymphocytes in the immunotherapy era. Cell Mol Immunol. 18 (4), 842-859 (2021).
  4. Betof Warner, A., Corrie, P. G., Hamid, O. Tumor-infiltrating lymphocyte therapy in melanoma: Facts to the future. Clin Cancer Res. 29 (10), 1835-1854 (2023).
  5. Huang, H., et al. Phase I study of adjuvant immunotherapy with autologous tumor-infiltrating lymphocytes in locally advanced cervical cancer. J Clin Invest. 132 (15), e157726(2022).
  6. Mengus, C., et al. In vitro modeling of tumor-immune system interaction. ACS Biomater Sci Eng. 4 (2), 314-323 (2018).
  7. Wang, H., Tian, T., Zhang, J. Tumor-associated macrophages (tams) in colorectal cancer (crc): From mechanism to therapy and prognosis. Int J Mol Sci. 22 (16), 8470(2021).
  8. Rasyid, N. R., et al. The potential of PD-1 and PD-L1 as prognostic and predictive biomarkers in colorectal adenocarcinoma based on TILs grading. Curr Oncol. 31 (12), 7476-7493 (2024).
  9. Chen, E., Zeng, Z., Zhou, W. The key role of matrix stiffness in colorectal cancer immunotherapy: Mechanisms and therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1879 (6), 189198(2024).
  10. Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. J Hematol Oncol. 15 (1), 58(2022).
  11. Lv, J., et al. Construction of tumor organoids and their application to cancer research and therapy. Theranostics. 14 (3), 1101-1125 (2024).
  12. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Sci Transl Med. 11 (513), eaay2574(2019).
  13. Magré, L., et al. Emerging organoid-immune co-culture models for cancer research: From oncoimmunology to personalized immunotherapies. J Immunother Cancer. 11 (5), e006290(2023).
  14. Matsueda, S., Chen, L., Li, H., Yao, H., Yu, F. Recent clinical researches and technological development in til therapy. Cancer Immunol Immunother. 73 (11), 232(2024).
  15. Cattaneo, C. M., et al. Tumor organoid-t-cell co-culture systems. Nat Protoc. 15 (1), 15-39 (2020).
  16. Itzhaki, O., et al. Establishment and large-scale expansion of minimally cultured "young" tumor infiltrating lymphocytes for adoptive transfer therapy. J Immunother. 34 (2), 212-220 (2011).
  17. Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26.e16 (2020).
  18. Moore, D. K., Motaung, B., Du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. Isolation of b-cells using miltenyi macs bead isolation kits. PLoS One. 14 (3), e0213832(2019).
  19. Albrecht, H. C., et al. Generation of colon cancer-derived tumor-infiltrating t cells (tils) for adoptive cell therapy. Cytotherapy. 25 (5), 537-547 (2023).
  20. Tan, Y. S., Lei, Y. L. Isolation of tumor-infiltrating lymphocytes by ficoll-paque density gradient centrifugation. Methods Mol Biol. 1960, 93-99 (2019).
  21. Ou, L., et al. Patient-derived melanoma organoid models facilitate the assessment of immunotherapies. EBioMedicine. 92, 104614(2023).
  22. Huang, H., et al. Patient-derived organoids as personalized avatars and a potential immunotherapy model in cervical cancer. iScience. 26 (11), 108198(2023).
  23. Parikh, A. Y., et al. Using patient-derived tumor organoids from common epithelial cancers to analyze personalized T-cell responses to neoantigens. Cancer Immunol Immunother. 72 (10), 3149-3162 (2023).
  24. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
  25. Xu, Y., et al. An engineered IL-15 cytokine mutein fused to an anti-PD1 improves intratumoral T-cell function and antitumor immunity. Cancer Immunol Res. 9 (10), 1141-1157 (2021).
  26. Chang, C. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  27. Trefny, M. P., et al. Deletion of Snx9 alleviates CD8 T cell exhaustion for effective cellular cancer immunotherapy. Nat Commun. 14 (1), 86(2023).
  28. Sarnaik, A. A., et al. Lifileucel, a tumor-infiltrating lymphocyte therapy, in metastatic melanoma. J Clin Oncol. 39 (24), 2656-2666 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kolorektal Kanser OrganoidleriOrganoid Ko-KültürüHasta Türevli OrganoidlerTIL EkspansiyonuCD3 Manyetik BoncuklarıAkış Sitometrisiİmmün Hücre İzolasyonuSitotoksisite Değerlendirmesiİmmünofloresan Boyama
Hasta Kaynaklı Kolorektal Tümör Organoidleri ve Tümör İnfiltre Eden Lenfositlerden (TIL'ler) Oluşan Bir Ko-Kültür Sisteminin Kurulması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.