Protokol, etkileşimlerini ve terapötik potansiyellerini incelemek için tümör infiltre eden lenfositler (TIL'ler) ile birlikte kültürlenmiş, hasta kaynaklı bir kolorektal kanser (CRC) organoid modeli oluşturmak için bir yöntemi açıklar. Bu model, tümör mikroçevresindeki immün yanıtları araştırmak ve kişiselleştirilmiş KRK tedavisi için TIL bazlı tedavinin etkinliğini tahmin etmek için klinik öncesi bir platform sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hasta Kaynaklı Kolorektal Tümör Organoidleri ve Tümör İnfiltre Eden Lenfositlerden (TIL'ler) Oluşan Bir Ko-Kültür Sisteminin Kurulması
Bu makalede
Özet
Özet
Kolorektal kanser (KRK) dünya çapında en sık görülen üçüncü kanserdir. Tümör infiltre olan lenfositler (TIL'ler) KRK'de önemli bir prognostik belirteç olarak tanımlanmıştır. TIL'lerin terapötik uygulaması, melanom ve rahim ağzı kanserinde umut verici sonuçlar göstermiştir. Bununla birlikte, KRK tedavisinde kullanımları keşif aşamasında kalmaktadır. TIL etkinliğini değerlendirmek için uygun bir in vitro model şu anda mevcut değildir ve bu alanda daha fazla ilerlemeyi engellemektedir. Orijinal tümör dokusunun özelliklerini yakından koruyan ve hastalar arası heterojenliği yansıtan hasta kaynaklı organoid (PDO) modeller, KRK ve TIL'ler arasındaki etkileşimi incelemek için mükemmel bir platform sağlar. Bu çalışmada, yeni rezeke edilmiş tümör dokusundan hasta kaynaklı bir KRK organoid modeli oluşturmak ve ardından TIL'lerin izolasyonu ve genişletilmesi için bir yöntem tanımlanmıştır. Bu sistem, CRC organoidlerinin ve TIL'lerin ko-kültürüne izin vererek, TIL aracılı sitotoksisite ve immün yanıtların değerlendirilmesini sağlar. Organoidler üzerindeki TIL öldürme etkinliğini analiz ederek, kişiselleştirilmiş KRK tedavisi için TIL bazlı immünoterapinin potansiyel sonuçları tahmin edilebilir. Ayrıca, TIL'lerin daha fazla mühendisliği, daha etkili hücresel tedaviler geliştirmek için umut verici bir strateji sunarak anti-tümör etkinliklerini artırabilir. Bu PDO-TIL ko-kültür modeli, KRK'de TIL tedavilerinin ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejilerinin klinik öncesi değerlendirmesi için güçlü bir araç sağlar.
Giriş
Kolorektal kanser (KRK), dünya çapında en yaygın ve ölümcül kanserlerden biridir ve önemli bir halk sağlığı sorununu temsil eder1. Cerrahi, kemoterapi ve immünoterapi dahil olmak üzere tedavi yöntemlerindeki ilerlemelere rağmen, KRK hastalarının, özellikle metastatik hastalığı olanların prognozu kötü kalmaktadır. Tümör mikroçevresi (TME), kansere karşı bağışıklık tepkisini etkileyen önemli bir bileşen olarak ortaya çıkan tümör infiltre eden lenfositler (TIL'ler) ile kanser ilerlemesini ve tedavi yanıtlarını şekillendirmede hayati bir rol oynar2. Tümörlerde bulunan çeşitli bir bağışıklık ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
İnsan kaynaklı materyalleri içeren tüm deneyler, Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Dalian Üniversitesi'ne bağlı Zhongshan Hastanesi Etik Kurulu tarafından önceden onaylanmıştır (onay numaraları: KY2023-206-1). Bu çalışma için klinik örnek veren tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
Dahil edilme kriterleri arasında patolojik olarak doğrulanmış primer kolorektal kanser dokusu, yeterli örneklem büyüklüğü (≥1cm3), neoadjuvan tedavi öyküsü (kemoradyasyon veya hedef....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
CRC PDO'ların kurulması ve karakterizasyonu
Tümör örnekleri KRK hastalarından elde edildi. Taze rezeke edilmiş CRC tümör dokusu, daha sonra PDO-TIL ko-kültür deneylerinde kullanılan PDO'lar ve TIL'ler oluşturmak için kullanıldı (Şekil 1).
Şekil 1: Genel deneysel iş akışının şeması........
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma, hem tümör hücrelerini hem de PDO'ların oluşturulduğu ve TIL'lerin genişletildiği TIL'leri elde etmek için hasta kaynaklı KRK dokusunu kullanır. Bu iki bileşen arasındaki etkileşim daha sonra bir ko-kültür sistemi aracılığıyla araştırılır.
Önceki çalışmalarda, TIL'ler karmaşık enstrümantasyon19 kullanılarak veya doğrudan tümör dokusu süspansiyonlarından20 ekstrakte edildi. Bununla birlikte, bu yöntemle.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [82172822] tarafından desteklenmiştir; Dalian Bilim ve Teknoloji Bürosu Üst Düzey Yetenek İnovasyon Destek Programı [2021RD02]; Liaoning İl Bilim ve Teknoloji Programı Ortak Planı [2024JH2/102600067]; Liaoning İli Uluslararası Bilim ve Teknoloji İşbirliği Projesi [2024JH2/101900006].
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Gelişmiş DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| 2-Merkaptoetanol | Sigma | 63689 | |
| %4 paraformaldehit | BBI | E672002-0100 | |
| 7-AAD | Biyolojik Efsane | 420403 | |
| A83-01 Serisi | Tocris Hakkında | 2939 | |
| B27 takviyesi | Gibco | 17504-44 | |
| CD107a-PE-Siyanin7 | Biyolojik Efsane | 328618 | |
| CD279-PE | Biyolojik Efsane | 329906 | |
| CD3 Monoklonal Antikor (OKT3) | Davetli | 14-0037-82 | |
| CD3-FITC | Biyolojik Efsane | 300406 | |
| CD45 (Hücre İçi Alan) (D9M8I) | CST | 13917S | |
| CD4-APC/Siyanin7 | Biyolojik Efsane | 300518 | |
| CD8-APC | Biyolojik Efsane | 344722 | |
| CDX-2 | MXB | RMA-0631 Serisi | |
| CK20 Serisi | MXB | Takım Seti-0025 | |
| CK7 | MXB | Takım Takımı-0021 | |
| Dylight 488, Keçi Anti-Tavşan IgG | Abbkine | A23220 Serisi | |
| Dylight 549, Keçi Anti-Fare IgG | Abbkine | A23310 Serisi | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 Serisi | |
| EpCAM | CST | 36746T | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Hücre maks | SA211.02 | |
| FGF 10 | Peprotech | 100-26 | |
| Gastrin (İnsan) | Tocris Hakkında | 3006 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050-061 | |
| Hepes | Sigma | H4034 Serisi | |
| HEPES | Sigma | H4034 Serisi | |
| İnsan CD3+ Hücre Ayırma Kiti (RUO) | Geri sar | K1201-10 Serisi | |
| İnsan IFN-gama Rekombinant Proteini | PeproTech | 300-02-20UG | |
| Ki-67 | CST | 9449'lar | |
| Matris | Corning | 354234 | |
| N-Asetilsistein | Sigma | A9165 Serisi | |
| Nikotinamid | Sigma | N0636 Serisi | |
| Nivolumab (anti-PD-1) | Satıcı | A2002 | |
| Penisilin/Streptomisin | Sigma | V900929 | |
| penisilin-streptomisin | NCM Biyoteknoloji | C100C5 Serisi | |
| Primocin | Invivogen | Karınca-pm-1 | |
| RBC Lizis Tamponu | termo-invitrogen | 00-4300-54 | |
| Rekombinant İnsan IL-2 (taşıyıcısız) | Biyolojik Efsane | 589104 | |
| RPMI 1640 | Gibco | ||
| SB202190 | Satıcı | S1077 | |
| Tripan Mavisi leke %0,4 | termo-invitrogen | T10282 | |
| Ultra-LEAF Saflaştırılmış anti-insan CD28 Antikoru | Biyolojik Efsane | 302934 | |
| Ultra-LEAF Saflaştırılmış anti-insan CD3 Antikoru | Biyolojik Efsane | 317325 | |
| Y-27632 | Satıcı | S1049 Serisi |
Kaynaklar
- Eng, C., et al. Colorectal cancer. Lancet. 404 (10449), 294-310 (2024).
- Sarnaik, A. A., Hwu, P., Mulé, J. J., Pilon-Thomas, S. Tumor-infiltrating lymphocytes: A new hope. Cancer Cell. 42 (8), 1315-1318 (2024).
- Paijens, S. T., Vledder, A., De Bruyn, M., Nijman, H. W.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
