Depresyonun Fare Modellerinde Koku Hedonik Yanlılıklarını Ölçmek İçin Bir Koku Tercihi Testi

Özet

Burada, fare depresyon modellerinde hem iştah açıcı hem de caydırıcı koku uyaranlarına yönelik olumsuz koku alma yanlılıklarının değerlendirilmesine izin veren bir koku tercihi testinin bir protokolünü sunuyoruz.

Özet

Depresyon, dünya çapında engelliliğe en büyük katkıda bulunan tek faktördür ve yılda 280 milyon insanı etkilemektedir. Azalan aktivite ve motivasyonun ötesinde, depresyonun olumsuz bir değerlik yanlılığı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir: hastalar, sağlıklı bireylere kıyasla nötr ve pozitif duyusal uyaranları daha az hoş ve olumsuz olanları daha rahatsız edici bulmaktadır. Özellikle, koku alma hedonik yanlılığı, hastalarda hastalığın bir durum belirtecini temsil edebilir ve fare modellerinde kolayca ölçülebilir. Bununla birlikte, hayvanlarda duygusal önyargıyı translasyonel bir şekilde ölçmek için çok az test vardır. Burada, çeşitli hedonik değerlerle ilişkili koku maddelerinin araştırılması yoluyla kontrol ve depresif benzeri farelerin koku değerliği atfının güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi için bir protokol öneriyoruz. Bu koku alma tercih testini ve çeşitli davranışsal okumaları kullanarak, iki farklı fare depresyon modelinde hem iştah açıcı hem de caydırıcı uyaranlara karşı olumsuz bir koku alma yanlılığını doğruluyoruz. Daha da önemlisi, bu yöntem hem erkek hem de kadın bireyler için geçerlidir. Son olarak, bu protokol duygusal tepkinin değerlendirilmesini iyileştirmek için çoklu adaptasyonlara izin verir ve nöronal aktivitenin canlı izlenmesi için klasik araçlarla kolayca birleştirilebilir.

Giriş

Depresyon ciddi bir duygudurum bozukluğudur ve dünya çapında önde gelen bir sakatlık nedenidir. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre yaklaşık 280 milyon kişi, yani nüfusun %4'ü depresyon yaşamaktadır. Kadınlar arasında erkeklere göre %50 daha sık görülmektedir ve COVID-19 salgını, pandeminin ilk yılında depresif bozuklukların prevalansını %25 artırmıştır (Dünya Sağlık Örgütü, 2022). Ek olarak, hastaların yaklaşık üçte biri klasik antidepresan tedavilere yanıt vermez, antidepresan etkilerin gözlemlenmesi haftalar alır ve duygudurum bozukluklarının fizyopatolojisi büyük ölçüde bilinmemektedir.

DSM-5^1'e dayanarak, depresyon tanısı, depresif ruh hali, ilgi veya zevk kaybı, önemli kilo değişimi, fiziksel ve psikolojik yavaşlama, yorgunluk, değersizlik hissi, konsantrasyon güçlüğü ve tekrarlayan ölüm düşünceleri gibi çeşitli semptomlara dayanır. Klinik çalışmalar ayrıca duygudurum bozukluklarının duyusal değişikliklerle birlikte geldiğini göstermiştir: depresif hastalar duyusal uyaranları kontrol deneklerinden daha az hoş bulmaktadır ^2,3,4.

Hedonik "değerlik", bir şeyin zevkli (pozitif değerlik) veya caydırıcı (negatif değerlik) olma derecesini ifade eder. Bir uyarana değerlik ataması, yaklaşma veya kaçınma dahil olmak üzere uyarlanmış bir davranışı tetikleyebilir⁵. İlginç bir şekilde, bu süreç böceklerden insanlara kadar türler arasında yüksek oranda korunmaktadır⁶. Depresyon bu nedenle negatif bir değerlik yanlılığı ile ilişkilidir. Bununla birlikte, klinik tanı henüz duyusal önyargı değerlendirmelerine çok az dayanmaktadır.

Duyusal modaliteler arasında, koku alma girdileri talamik röleleri büyük ölçüde atladığı ve insanlar da dahil olmak üzere memelilerde limbik sisteme yansıtıldığı için koku alma özellikle ilginçtir. Evrimsel bir bakış açısına göre, bu sistemin çevresel uyaranlara 7,8,9,10,11,12 karşı bir dizi birincil tepkiyi kodlamada kritik olduğu gösterilmiştir. Bu paylaşılan nöral devrelerin yanı sıra, klinik çalışmalar, koku alma ve depresyon arasında ikili bir ilişki olduğunu ortaya koymaktadır ve depresif hastaların koku alma değişiklikleri ve koku alma bozuklukları yaşaması depresif semptomlara neden olmaktadır¹³. Ek olarak, depresif hastalarda ilaç veya tedaviden sonra koku alma fonksiyonu geri kazanılır 14,15,16,17. Bu sonuçlar, koku alma eksikliklerinin, hastalık için özellikten (psikiyatrik bozukluğun patofizyolojisinde öncül, muhtemelen nedensel bir rol oynayan ve bu nedenle erken, pre-semptomatik tanı için kullanılabilen özellikler) ziyade bir durum biyobelirteci (hastalardaki klinik belirtilerin durumu) olabileceğini düşündürmektedir¹⁸. Buna göre, depresyonda koku alma modalitesinin nasıl değiştiğinin daha iyi ve daha iyi anlaşılması, tedaviye yanıtın teşhisi ve tespiti için yeni terapötik araçlara doğru yol açabilir.

Bu nedenle, depresyon modellerinde koku alma hedonik yanlılığının değerlendirilmesi, hem indüklenmiş depresif benzeri fenotipi değerlendirmek hem de değerlik atamasındaki bu değişikliklerin arkasındaki nöral mekanizmaları araştırmak için bir araç olarak özellikle ilgi çekici olacaktır. Önceki çalışmalar, farelerde koku değerliği atamasını değerlendirmek için davranışsal yaklaşımları zaten kullanmıştır. Bununla birlikte, bu testler birkaç uyarı sunar: çoğunlukla bir kapakla ^{kapatılmış} kutuları 19,20,21 ^içeren, koku çözeltisi^20,21,22 ile sürekli fiziksel temas içeren ve/veya çok kısa koku keşif süreleri^21,22,23 ile sonuçlanan karmaşık cihazlar 19 gerektirirler . Bu, bu tahlilleri, bağlı farelerde daha uzun örnekleme süreleri gerektiren nöronal aktivitenin canlı izlenmesi için klasik araçlarla uyumsuz hale getirir.

Ayrıca, Malkesman ve ark. dişi fare idrarına maruz kalan erkek farelerin koku alma araştırmasını ölçerek kemirgenlerde ödül arama aktivitesini izlemek için Kadın İdrar Koklama Testini (FUST) geliştirmiştir²⁴. Bununla birlikte, bu test yalnızca sosyal nitelikteki belirli bir pozitif uyarana ve kısa etkileşim sürelerine verilen davranışsal tepkiyi değerlendirir. Ek olarak, bu test sadece erkek kemirgenler için tasarlanmıştır, ancak depresyon kadınlar arasında erkeklere göre iki kat daha yaygındır.

Tüm bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, burada Bigot ve ^ark.14'ten uyarlanan bir Koku Alma Tercih Testi (OPT) geliştirdik, burada hem erkek hem de dişi fareler, depresyon bağlamında hedonik yanıtı hassas bir şekilde değerlendirmek için çok çeşitli nötr, pozitif ve negatif kokulara maruz kalabilir. Koku seçimi önceki yayınlara^14,25 dayanabilir, ancak bu test aynı zamanda hem doğal bileşenleri hem de monomoleküler veya özel olarak tasarlanmış kimyasal karışımları kullanarak yeni sosyal, beslenmesel, enfeksiyonla ilgili uyaranların keşfedilmesine izin verir.

Protokol

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler ulusal ve Avrupa (2010/63/EU) yönergelerini takip etti ve Fransız Araştırma Bakanlığı tarafından onaylandı (APAFiS: #16380-2018080217358599_v1; APAFIS #51636-2024101718013761_v4). C57BL / 6JRj erkek ve dişi fareler (UCMS modeli) ve C57BL / 6NTac (CORT modeli) erkek fareler (8 haftalık) sosyal olarak barındırıldı (kafes başına 4-5 fare) ve standart koşullar altında (23 ± 1 °C; nem% 40) 14/10 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde (ışıklar sabah 7'de yanar) yiyecek ve su ad libitum ile korundu.

1. Deney düzeneği

1. Arenanın kurulumu
   1. Gri pleksiglas duvarlardan ve beyaz bir zeminden oluşan iki bölmeli bir arena (45 cm × 50 cm × 25 cm) oluşan deney düzeneğini hazırlayın. İki bölmeyi (25 cm × 45 cm) gri bir pleksiglas duvara (37 cm × 25 cm) bölün.
   2. Her bölmeden duvarın altına delikli bir Petri kabı (60 mm × 15 mm çapında 7 delikli) 5 mm çapında) yerleştirin.
   3. Petri kaplarını çift taraflı yapıştırıcı veya basınca duyarlı yapıştırıcı (örn. Blu-tack) kullanarak duvara dikey olarak sabitleyin.
   4. Hayvanların davranışlarını kaydetmek için arenanın üstüne bir kamera yerleştirin (arenanın 2 m yukarısında) ve deney boyunca hareketlerini otomatik olarak takip edin.
2. Koku seçimi
   1. Deneyden önce, test edilecek nötr, pozitif ve negatif değerlikli kokuların bir listesini seçin (örnekler için Tablo 1'e bakın).
   2. Seçilen tüm kokuların benzer buhar basıncına sahip olup olmadığını kontrol edin. Ek olarak, bir fotoiyonizasyon dedektörü (PID)²⁶ ile bazı kokular için arena boyunca difüzyonu değerlendirin.
   3. Her kokuyu ayrı bir günde test edin.
      NOT: Bir günden diğerine keşif etkilerini en aza indirmek için önce nötr kokuların, ardından iştah açıcı kokuların kullanımının planlanması ve caydırıcı kokularla bitirilmesi önerilir. Bu sipariş, bir test gününden diğerine taşıma etkilerini en aza indirir. Alternatif olarak, rastgele bir sunum kullanılabilir, ancak tüm deney grupları aynı koku dizisi ile test edilmelidir.
3. Deney gruplarının tasarımı
   1. Fareleri en az iki deney grubuna ayırın: kontrol fareleri ve depresyon modeline girecek fareler. Aynı gruptan hayvanları aynı kafeslerde barındırın.
      DİKKAT: İstatistiksel anlamlılık elde etmek için her deney grubu en az yaklaşık 7-8 birey içermelidir. Kafes etkisini en aza indirmek için kafesler hayvan barınağına yakın bir yere yerleştirilmelidir.
   2. Tercih edilen depresyon modelini kullanarak ilgili fare gruplarında depresif benzeri bir fenotipi indükleyin.
      NOT: Farelerde depresyon benzeri davranışları indüklemek için protokollerin açıklanması bu makalenin kapsamı dışındadır. Bununla birlikte, bu çalışma, bu koku alma tercihi testi için temsili sonuçlar olarak iki farklı model (Öngörülemeyen Kronik Hafif Stres [UCMS] ve Kortikosteron [CORT])^27,28 kullanılarak yapılan deneyler sunmaktadır. Kısaca, UCMS modeli, birkaç hafta boyunca çeşitli farklı çevresel stres faktörlerine maruz kalmaya dayanırken, CORT modeli, farelerin içme suyunda çözünmüş kortikosteronun kronik olarak uygulanmasından oluşur (farelerin ne kadar içtiğine bağlı olarak yaklaşık 5 mg / kg / gün).

2. Alışma aşaması

1. Genel alışkanlık ve kullanım
   1. Varışta, fareleri herhangi bir yatak takımı değişikliği yapmadan 1 hafta boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Stresi azaltmak için kafese ek pamuk malzeme ve bir iglo ekleyin.
   2. 1 hafta sonra, tüm fareleri 3-4 gün boyunca her gün nazikçe tutun ve tercihen deney odasında fincan kullanımına alıştırın.
2. Testin deneysel koşulları
   1. Deneyin başlamasından 30 dakika önce fareyi davranışsal test odasına aktarın.
      NOT: İdeal olarak, davranış odası, test edilen fare diğerinde performans gösterirken hayvanların bir parçada olmasına izin veren iki ayrı parça içermelidir.
   2. Standart muhafaza koşullarının korunduğuna (23 ± 1 °C; nem @) ve odada rahatsız edici ses, ışık veya koku olmamasına dikkat edin.
   3. Bir lüksmetre kullanarak, arenada aydınlatmayı yaklaşık 40 lükse ayarlayın. Arenada aydınlatmanın homojen olduğundan emin olun.
3. Arenaya alışma
   1. Her iki Petri kabına (60 mm × 15 mm) temiz bir filtre kağıdı (42,5 mm) ekleyin.
   2. Petri kabının kapağını alt kısmına takmak için şeffaf bant kullanın (çünkü dikey olarak yerleştirilecektir).
   3. İlk gün, neofobiyi azaltmak için aynı kafesteki tüm fareleri 10 dakika boyunca nazikçe arenaya yerleştirin.
      DİKKAT: Kuyruktan alınmasından kaynaklanan stresi önlemek için fareleri her zaman fincan tutmasıyla arenaya yerleştirin.
   4. Ertesi gün, her fareyi ayrı ayrı, iki bölmenin hemen arasındaki arenaya getirin ve davranışı 10 dakika boyunca kaydedin.
   5. Arka arkaya 2-3 gün tekrarlayın.
4. Keşif kriteri
   1. Petri kaplarının yerleştirildiği iki alanı (25 cm, 15 cm) tanımlayın ve her bir hayvanın her bölgede geçirdiği süreyi ölçün.
   2. Bu ölçümlerin tüm bireysel alışkanlık adımlarında ortalamasını alın.
   3. Bölgelerin her birinde geçirilen ortalama süre 50 saniyeden yüksekse, kriter yerine getirilir. Değilse, kritere ulaşana kadar alışkanlık seanslarını tekrarlayın veya hayvanı analizden çıkarın.
      NOT: Günde en fazla iki alıştırma seansı yapılabilir (sabah ve öğleden sonra).

3. Test aşaması

1. Kokunun hazırlanması
   1. Test gününde, kokuyu kimyasal bir başlık altında doğru seyreltme ile hazırlayın. Kimyasal yapıya bağlı olarak kokuyu mineral yağ veya damıtılmış su ile seyreltin. Kirlenmeyi önlemek için, mineral yağı koku verici maddelerden uzak, havalandırılan ayrı bir odada saklayın.
      NOT: Yeni bir deneye başlarken yeni bir şişe mineral yağ kullanılması önerilir.
   2. Kokulu çözeltiyi bir cam şişede saklayın. Koku kontaminasyonu ekleyebilecek plastik tüp kaplarından kaçının.
   3. Her fare test edilmeden hemen önce, filtre uçlarını kullanarak bir mikropipet ile 200 μL koku solüsyonu toplayın ve iki Petri kabından birindeki filtre kağıdına yerleştirin.
   4. İkinci Petri kabındaki diğer filtre kağıdına dokunulmadan kalmasına izin verin.
   5. Petri kaplarını test odasına aktarın ve arenanın duvarına dikey olarak sabitleyin.
      DİKKAT: Koku kontaminasyonunu önlemek için koku solüsyonlarını deney odasında hazırlamayın ve atmayın. Deney sırasında eldivenleri düzenli olarak değiştirin. Koku manipülasyonu sırasında eldivenlerin kontamine olabileceğinden şüpheleniliyorsa, test için fareleri tutmadan önce eldivenleri değiştirin.
2. Davranış testi
   1. Her fareyi ayrı ayrı arenaya, iki bölmenin arasına yerleştirin.
   2. 10 dakika boyunca kayıt yapın.
   3. Fareyi arenadan çıkarın.
   4. Koku Petri kabını çıkarın.
   5. Arenayı dezenfektan bir solüsyonla (örneğin, p etanol) temizleyin ve kurulayın.
   6. Filtre kağıdını atın ve bir sonraki fare için koku hazırlığını tekrarlayın.
   7. İdeal olarak, günde sadece bir kokuyu test edin. Tercihen önce nötr kokular, sonra pozitif kokular ve son olarak negatif kokular kullanın (bkz. Şekil 1).
      DİKKAT: Hem alışkanlık hem de test adımlarını, deney günleri boyunca yaklaşık olarak günün aynı saatinde (ideal olarak sabah 9 ile öğleden sonra 3 arasında) gerçekleştirin . Hayvan sayısı daha uzun bir süre gerektiriyorsa, herhangi bir gündüz yanlılığından kaçınmak için farklı deney gruplarını dönüşümlü olarak test etmeye dikkat edin. Erkeklerin ve dişilerin aynı deneyde test edilmesi gerekiyorsa, bir cinsiyeti birbiri ardına test etmeyi tercih edin.
      NOT: Koku kontaminasyonunu önlemek için testin her günü temiz Petri kapları kullanın. Unutulmamalıdır ki, delikli Petri kapları, uygun temizlik ve koku dekontaminasyonundan sonra birkaç deney için yeniden kullanılabilir.

4. Veri analizi

1. Davranış takibi
   1. Testler aracılığıyla farenin konumunu kaydetmek için otomatik bir izleme programı kullanın.
   2. Analiz için arenada ayrı bölgeler tanımlayın (bkz. Şekil 1):
      1. Bir "koku bölgesi" (25 cm × 15 cm), filtre kağıdı koku ile ıslatılmış olarak Petri kabının yerleştirildiği alan (yani, yüzey bölmesinin yaklaşık üçte birini temsil eden kokuya en yakın alan) tanımlayın.
      2. "Koku bölgesine" simetrik bir "kontrol bölgesi" (25 cm × 15 cm) tanımlayın, ancak petri kabına herhangi bir koku eklenmemiştir.
      3. Bir "koku arkası bölgesi" (25 cm × 30 cm) tanımlayın, yani bölmenin geri kalanı koku petri kabının yerleştirildiği yerdir.
      4. Koku yapmayan bölmenin geri kalanından oluşan, "kontrol arkası bölgesine" simetrik bir "kontrol arkası bölgesi" (25 cm × 30 cm) tanımlayın.
         NOT: Fare gövdesinin merkez noktasının izlenmesi, hayvanın koku alma tercihini analiz etmek için yeterlidir. Bununla birlikte, her bir farenin burnunu özellikle izlemek, hayvanın koku araştırmasını daha kesin bir şekilde gösterebilir.
2. Hedonik tepkinin okunması
   1. Otomatik izlemeyi kullanarak, alışkanlık adımları da dahil olmak üzere testin her fare ve her günü için aşağıdaki bilgileri toplayın:
      1. Arenada taşınan toplam mesafeyi (m) kaydedin.
      2. Arena(lar)ın her bölgesinde geçirilen süreyi kaydedin.
      3. Arenanın her bölgesindeki giriş sayısını kaydedin.
   2. Ana lokomotor etkileri değerlendirmek için kat edilen toplam mesafeyi kullanın.
   3. Çeşitli kokulara karşı koku alma tercihindeki farklılıkları değerlendirmek için ana okumaları kullanın:
      1. Koku bölgesinde geçirilen zamanı kullanın.
      2. Koku bölgesindeki girişlerin sayısını kullanın.
      3. Koku bölgesinde geçirilen sürenin, alışkanlık sırasında bu bölgede geçirilen süreye normalize edilmesiyle hesaplanan bir tercih indeksi kullanın (normalleştirme, tüm gruplardan farelerde gerçekleştirilir). Ortalama, koku bölgesinde geçirilen sürenin aritmetik ortalamasını ifade eder ve sd, standart sapmasını ifade eder.
         
      4. Aşağıdaki gibi, hareket edilen mesafenin, koku bölgesinde geçirilen sürenin ve koku bölgesindeki giriş sayısının normalleştirilmiş değerlerinin ortalaması olarak hesaplanan bir koku keşif indeksi kullanın:
         
         
         NOT: Bu tercih indeksi, gerekirse, örneğin koku ve kontrol bölgesinde geçirilen süreleri karşılaştırarak uyarlanabilir. Gruplar, alışkanlık sırasında "koku bölgesini" araştırmalarında önemli farklılıklar gösteriyorsa, normalizasyon, tüm grupların toplamından ziyade, yalnızca kontrol grubuna göre gerçekleştirilebilir.
   4. Kontrol ve depresif benzeri fareler için bu okumaları, ortalamanın (SEM) ortalama ± standart hatası olarak görsel olarak temsil edin.
   5. Hem deney gruplarını, kokuları (tekrarlanan ölçüm faktörü) hem de etkileşim etkisi faktörlerini hesaba katmak için tekrarlanan ölçümler iki yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından post hoc testler (burada düzeltilmemiş Fisher'ın En Az Anlamlı Fark testi) kullanın. Etkileşim faktörü, gruplar arasındaki farklılıkların sunulan tüm kokularda tutarlı olup olmadığını gösterir.
   6. Uyarlanmış testler (Shapiro-Wilk testi, Bartlett testi) kullanarak normalliği ve Homoskedastisiteyi doğrulayın. İstatistiksel anlamlılık *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 olarak belirlendi.

Sonuçlar

Depresif benzeri farelerin negatif bir koku alma yanlılığı^14,29 sunduğunu ve burada tanımladığımız koku alma tercihi testinin protokolü kullanılarak güvenilir bir şekilde ölçülebileceğini doğrulamak için, iki farklı fare depresyon modelinde farklı kokulara verilen hedonik tepkiyi değerlendirdik.

İlk olarak, genç dişi C57BL / 6JRj farelerinde depresif benzeri bir fenotipi indüklemek için^28'den uyarlanmış 4 hafta süren öngörülemeyen kronik hafif stresin (UCMS) bir fare modelini kullandık (ayrıntılı protokol için Ek Dosya 1'e bakınız) (Şekil 2A, B). Bu dişi fareler, iştah açıcı bir koku olarak erkek fare idrarı (MU, saf) ve caydırıcı bir koku olarak 2,4,5-trimetiltiyazol (TMT, mineral yağda %5) ile koku tercih testinde test edildi. Ortalama olarak, her fare alışkanlık sırasında hem "kontrol" hem de "koku" bölgesinde en az 50 saniye geçirdi ve kriteri yerine getirdi (Şekil 2C). Bununla birlikte, alışkanlık yoluyla, UCMS fareleri, Kontrollere kıyasla "kontrol bölgesinde" önemli ölçüde daha fazla zaman harcadılar, ancak kokunun ekleneceği bölge ile ilgili önemli bir fark olmadığından, bu fark göz ardı edilebilir. Mesafe ile ilgili olarak, Kontrol fareleri MU'ya maruz kaldıklarında UCMS'den önemli ölçüde daha fazla hareket ettiler, ancak alışkanlık sırasında veya TMT varlığında değil (Şekil 2D). Son olarak, hedonik yanıtın tüm okumaları (koku bölgesinde geçirilen süre, koku bölgesindeki giriş sayısı ve tercih indeksi) Kontrol ve UCMS kadınları arasında önemli farklılıklar veya istatistiksel bir eğilim göstermektedir (Şekil 2E-G). Bu etki, hedonik ve lokomotor tepkinin birleşik bir ölçüsü olan küresel koku keşif indeksi aracılığıyla da görülebilir (Şekil 2H). Tutarlı bir şekilde, her okuma bu nedenle hem iştah açıcı hem de caydırıcı koku alma uyaranlarına yanıt olarak olumsuz bir hedonik önyargı gösterir. İlginç bir şekilde, çok sayıda davranışsal teste¹⁴ dayalı olarak anksiyete ve depresif benzeri fenotipin normalleştirilmiş bir değeri olarak hesaplanan duygusallık puanı, hem MU hem de TMT'nin koku keşif indeksi ile pozitif korelasyona sahiptir (Şekil 2I), pozitif ve negatif koku maddelerine davranışsal tepki ile anksiyete ve depresif benzeri fenotip arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir.

İkinci olarak, bu sefer erkek farelerde depresif benzeri bir fenotipi indüklemek için aynı UCMS protokolünü kullandık. Koku Tercih Testi sırasında, bu fareler iştah açıcı olan dişi fare idrarına (FU, saf) ve daha önce olduğu gibi negatif bir koku olarak TMT'ye maruz bırakıldı (Şekil 3A,B). Alışkanlık sırasında dört bölgede geçirilen sürede veya test boyunca hareket edilen mesafede hiçbir fark yoktur (Şekil 3C,D). Koku bölgesinde geçirilen süre, Kontrollere kıyasla UCMS'de FU ve TMT keşfinde önemli bir azalma olduğunu göstermektedir (Şekil 3E). Ek olarak, UCMS fareleri koku bölgesine önemli ölçüde daha az girer veya koku verme eğilimindedir ve hem FU hem de TMT için önemli ölçüde azaltılmış bir tercih indeksi sunar (Şekil 3F, G), bu da depresif benzeri bir durumda negatif bir koku yanlılığını doğrular. Benzer şekilde, koku araştırma indeksi, hayvanların duygusallık skoru ile pozitif korelasyon gösterme eğiliminde olan Kontrollere (Şekil 3H) kıyasla UCMS farelerinin FU ve TMT'sine negatif olarak değişen bir davranışsal tepki göstermektedir (Şekil 3I).

Üçüncü bir deneyde, erkek C57BL / 6NTac farelerinin içme suyunda kronik kortikosteron (CORT) uygulamasına dayanan başka bir depresyon modeline başvurduk, kontrol fareleri ise sadece araç (Veh) solüsyonunu (% 10 2-hidroksipropil-beta-siklodekstrin) ^{alır 27}. Dört haftalık CORT veya Veh tedavisinden sonra, fareler dört gün boyunca alıştırıldı ve daha sonra nötr bir kokuya (OCT: 2-trans oktenal, suda% 1), pozitif bir kokuya (PO: yer fıstığı yağı) ve negatif bir kokuya (TMT: 2,4,5-trimetiltiyazol, mineral yağda% 5) maruz bırakıldı (Şekil 4A, B). Alışkanlık yoluyla, Veh ve CORT arasında hiçbir fark yoktu (Şekil 4C). Bununla birlikte, her iki grup da "koku bölgesinde" "kontrol bölgesine" kıyasla önemli ölçüde daha fazla zaman harcadı. Veh farelerinin CORT'tan daha fazla hareket ettiği pozitif koku (PO) dışında, taşınan mesafe için herhangi bir fark yoktur (Şekil 4D). Daha da önemlisi, UCMS farelerinde olduğu gibi, nötr ve iştah açıcı bir kokuya maruz kaldıklarında CORT fareleri için koku bölgesinde geçirilen süre önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 4E). Azaltılmış koku keşfi, koku bölgesinde önemli bir azalma veya daha az sayıda giriş eğilimi yoluyla da görülebilir (Şekil 4F). Bu durumda, analiz edilen okumaya bağlı olarak, muhtemelen kullanılan hayvan sayısıyla ilgili sınırlamaların yanı sıra TMT maruziyetinden sonra gözlemlenen düşük keşif süresinin neden olduğu potansiyel bir zemin etkisi nedeniyle gruplar arasındaki farklılıklar ortaya çıkar. Genel olarak, CORT farelerinde tüm koku uyaranları için tercih indeksi Veh'e kıyasla önemli ölçüde daha düşüktür (Şekil 4H). Son olarak, tüm kokular için koku keşif indeksi, hayvanların duygusallık skoru ile önemli ölçüde ilişkilidir (Şekil 4I), bu koku alma tercihi testinin birkaç fare depresyon modelinde negatif duygusal yanlılığı değerlendirmek için uygun bir araç olduğunu bir kez daha göstermektedir.

Son olarak, gözlemlenen farklılıkların duygusal önyargılardan ziyade lokomotor aktivitedeki bir azalmadan kaynaklanma olasılığını göz ardı edebiliriz. Gerçekten de, hareket edilen toplam mesafeyi değerlendirirken alışma sırasında hareket gruplar arasında farklılık göstermez (Şekil 2D, Şekil 3D, Şekil 4D). Ek olarak, istatistiksel analize dayanarak, görev katılımındaki genel bir azalma veya bir yenilik etkisi de bu önyargıları açıklayamaz. Aslında, tercih indeksi analizinde koku faktörünün önemli bir etkisi olduğunu ve deney grupları ile kokular arasında anlamlı bir etkileşim olmadığını bulduk. Bu sonuçlar, depresif benzeri farelerin gerçekten de görevi yerine getirdiğini ve azaltılmış keşiflerinin her koku alma ipucu için spesifik olduğunu göstermektedir.

Şekil 1: Koku alma tercihi testinin zaman çizelgesi ve kurulumunun genel şeması. Fareler ilk önce arenaya alıştırılır. Alışkanlığın ilk gününde, neofobiyi azaltmak için aynı konut kafesinden fareler bir araya getirilir. Ertesi gün, bireysel olarak arenaya yerleştirilirler. Alışkanlıktan sonra, odalardan birine bir koku eklenir. Nötr kokular tercihen önce test edilir, ardından pozitif kokular ve son olarak negatif kokular gelir. Analiz için arena dört farklı bölgeye ayrılabilir. Biorender ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bir UCMS dişi fare depresyon modelinde negatif koku alma yanlılığı. (A,B) Çalışmanın zaman çizelgesi ve deney grupları: Kontrol ve UCMS (Öngörülemeyen Kronik Hafif Stres) dişi fareler, Koku Tercih Testinde pozitif (MU: erkek fare idrarı, saf) ve negatif koku (TMT: 2,4,5-trimetiltiyazol, mineral yağda %5) ile test edilmiştir. Biorender ile oluşturuldu. (C) UCMS fareleri, Alışma sırasındaki Kontrollere kıyasla "kontrol bölgesinde" ortalama olarak önemli ölçüde daha fazla zaman ve "koku arkası bölgesinde" daha az zaman harcadı (Grup: F (1, 12) = 74.03, p < 0.0001; Bölge: F(2.434, 29.21) = 7.688, p = 0.0012; Etkileşim: F(3, 36) = 5.148, p = 0.0046). (D) MU'ya maruz kaldığında UCMS'de taşınan toplam mesafe önemli ölçüde azalmıştır, ancak Habituation (Hab) ve TMT için değil (Grup: F(1, 12) = 4.664, p = 0.0518; Koku: F(1.871, 22.45) = 4.846, p = 0.0195; Etkileşim: F(2, 24) = 4.797, p = 0.0177). (E) UCMS fareleri MU ve TMT'yi keşfetmek için önemli ölçüde daha az zaman harcadılar (Grup: F(1, 12) = 24.39, p = 0.0003; Koku: F(1, 12) = 59.69, p < 0.0001; Etkileşim: F(1, 12) = 2.267, p = 0.1580). (F) UCMS fareleri koku bölgesinden daha az girdi veya (Grup: F(1, 12) = 9.279, p = 0.0102; Koku: F(1, 12) = 5.100, p = 0.0433; Etkileşim: F(1, 12) = 1.649, p = 0.2233). (G) UCMS farelerinde MU ve TMT tercih indeksi önemli ölçüde azalmıştır (Grup: F(1, 12) = 24.39, p = 0.0003; Koku: F(1, 12) = 59.69, p < 0.0001; Etkileşim: F(1, 12) = 2.267, p = 0.1580). (H) MU ve TMT için koku keşif indeksi, UCMS farelerinde önemli ölçüde azalmıştır (F(1, 12) = 14.71, p = 0.0024; Koku: F(1, 12) = 0, p > 0.9999; Etkileşim: F(1, 12) = 0.02630, p = 0.8739). (I) MU ve TMT için koku keşif indeksinin her ikisi de hayvanların duygusallık puanı ile pozitif ilişkilidir (MU: Pearson R² = 0.4837, F(1,12) = 11.24, **p = 0.0058; TMT: Pearson R² = 0.5340, F(1,12) = 13.75, **p = 0.0030). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bir UCMS erkek fare depresyon modelinde negatif koku yanlılığı. (A,B) Çalışmanın zaman çizelgesi ve deney grupları: Kontrol ve UCMS erkek fareler, Koku Tercih Testinde pozitif (FU: dişi fare idrarı, saf) ve negatif koku (TMT: 2,4,5-trimetiltiyazol, mineral yağda %5) ile test edilmiştir. Biorender ile oluşturuldu. (C) Alışma yoluyla arenanın farklı bölgelerinde geçirilen süre arasında ortalama olarak bir fark yoktur (Grup: F(1, 13) = 3.921, p = 0.0693; Bölge = F(1.688, 21.94) = 34.57, p < 0.0001; Etkileşim: F(3, 39) = 0.7385, p = 0.5355). (D) Kontroller ve UCMS arasında taşınan toplam mesafede fark yoktur (Grup: F(1, 13) = 2.313, p = 0.1522; Koku: F(1.722, 22.38) = 1.746, p = 0.1998; Etkileşim: F(2, 26) = 0.8806, p = 0.4266). (E) FU ve TMT ile koku bölgesini keşfetmek için harcanan zaman, UCMS farelerinde önemli ölçüde azalmıştır (Grup: F(1, 13) = 6.808, p = 0.0216; Koku: F(1, 13) = 16.21, p = 0.0014; Etkileşim: F(1, 13) = 0.3304, p = 0.5753). (F) UCMS fareleri, TMT için koku bölgesinin önemli ölçüde daha az katına girdi ve FU için eğilimli oldu (Grup: F(1, 13) = 6.572, p = 0.0236; Koku: F(1, 13) = 3.784, p = 0.0737; Etkileşim: F(1, 13) = 0.2145, p = 0.6509). (G) UCMS farelerinin tercih indeksi FU ve TMT için önemli ölçüde azalmıştır (Grup: F(1,13 ) = 6.808, p = 0.0216; Koku: F(1, 13) = 16.21, p = 0.0014; Etkileşim: F(1, 13) = 0.3304, p = 0.5753); (H) UCMS'nin koku keşif indeksi her iki koku için de önemli ölçüde azalmıştır (Grup: F(1, 13) = 12.42, p = 0.0037; Koku: F(1, 13) = 0.002580, p = 0.9603; Etkileşim: F(1, 13) = 0.5804, p = 0.4598). (I) FU ve TMT için koku keşif indeksi, hayvanların duygusallık puanı ile pozitif korelasyon gösterme eğilimindedir (FU: Pearson R² = 0.2573, F(1, 13) = 4.504, p = 0.0536; TMT: Pearson R² = 0.2266, F(1, 13) = 3.809, p = 0.0729). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Bir CORT erkek fare depresyon modelinde negatif koku yanlılığı. (A,B) Çalışmanın zaman çizelgesi ve deney grupları: Veh ve CORT erkek fareler, Koku Tercih Testinde nötr (OCT: trans-2-oktenal, suda %1), pozitif (PO: yer fıstığı yağı, saf) ve negatif koku (TMT: 2,4,5-trimetiltiyazol, mineral yağda %5) ile test edilmiştir. Veh ve CORT fareleri, deneyin tüm süresi boyunca sırasıyla Araç ve Araç + Kortikosteron çözeltisi ile uygulanır. Biorender ile oluşturuldu. (C) Alışma sırasında arenanın farklı bölgelerinde geçirilen ortalama süre (Grup: F(1, 10) = 0.07588, p = 0.7886; Bölge: F(2.224, 22.24) = 6.939, p = 0.0036; Etkileşim: F(3, 30) = 0.7033, p = 0.5575). (D) Alışkanlık (Hab) ve farklı kokular için test sırasında hareket edilen toplam mesafe (Grup: F(1, 10) = 4.193, p = 0.0678; Koku: F(3, 30) = 11.80, p < 0.0001; Etkileşim: F(3, 30) = 1.489, p = 0.2375). (E) CORT fareleri, koku bölgesinde OCT ve PO için Veh'den daha az zaman harcarlar (Grup: F(1, 10) = 5.094, p = 0.0476; Koku: F(2, 20) = 28.87, p < 0.0001; Etkileşim: F(2, 20) = 3.841, p = 0.0388). (F) CORT fareleri, Veh'e kıyasla koku bölgesinin daha az girme veya eğilimli olma eğiliminde olma eğilimindedir (Grup: F(1, 10) = 6.832, p = 0.0259; Koku: F(2, 20) = 2.738, p = 0.0889; Etkileşim: F(2, 20) = 0.2902, p = 0.7512). (G) CORT fareleri OCT ve PO için daha düşük tercih indeksi göstermektedir (Grup: F(1, 10) = 5.895, p = 0.0356; Koku: F(2, 20) = 20.83, p < 0.0001; Etkileşim: F(2, 20) = 1.437, p = 0.2611). (H) Koku araştırma indeksi, UCMS farelerinde tüm kokular için önemli ölçüde azalmıştır (Grup: F(1, 10) = 12.35, p = 0.0056; Koku: F(2, 20) = 0.04381, p = 0.9572; Etkileşim: F(2, 20) = 0.3622, p = 0.7006). (I) Her bir koku için koku araştırma indeksi, hayvanların duygusallık puanı ile pozitif korelasyon göstermektedir (OCT: Pearson R² = 0.5601, F(1, 10) = 12.73, **p = 0.0051; PO: Pearson R² = 0.4495, F(1, 10) = 8.165, *p = 0.0170; TMT: Pearson R² = 0.5061, F(1, 10) = 10.25, **p = 0.0095). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ad	Kısaltma	Seyreltme	Valence
2,4,5-Trimetiltiyazol	TMT (Türkçe)	Mineral yağda %5	Negatif
2-trans-oktenal	EKİM	Suda% 1	Nötr
Dişi fare idrarı	FU	Saf	Pozitif
Erkek fare idrarı	MÜ	Saf	Pozitif
Fıstık yağı	PO	Saf	Pozitif

Tablo 1: Nötr, pozitif ve negatif değerlikli kokulara örnekler.

Ek Dosya 1: 4 haftalık öngörülemeyen kronik hafif stres için protokol. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Negatif duygusal önyargı, depresif bozuklukların önemli bir özelliğidir ve hastalığın fizyopatolojisini daha iyi anlamak için özellikle ilgi çekicidir. Bu nedenle, depresif benzeri fenotipin karakterizasyonunu iyileştirmek ve duygusal işlemenin ve patolojik koşullardaki değişikliklerin altında hangi biyolojik mekanizmaların yattığını araştırmak için klinik öncesi modellerde duyusal önyargıların değerlendirilmesini dahil etmek çok önemlidir. Dahası, koku alma, duygusal önyargıları incelemek için bir seçim duygusudur. Translasyonel bir perspektiften bakıldığında, hem farelerde hem de insanlarda duygusal işlemeyi değerlendirmek etolojik olarak önemlidir. Ek olarak, koku alma ve duygusal sistemler oldukça iç içedir ve evrim boyunca ortak nöronal yapıları paylaşırlar. Bozulmuş koku alma ile depresyon¹⁰ arasında güçlü, karşılıklı bir ilişki vardır, bu da koku almayı tanı ve tedaviye yanıt vermenin yanı sıra temel araştırmalarda kullanılmak üzere umut verici ve güçlü bir araç haline getirir.

Burada, iki fare depresyon modelinde koku alma duygusal önyargılarını değerlendirmek için bir koku alma tercihi testi için bir protokol geliştirdik. Daha da önemlisi, bu yöntem, hem pozitif hem de negatif değişken değerlikli çok çeşitli uyaranlara ve ayrıca patolojik koşullar altında değeri değiştirilebilen nötr uyaranlara verilen yanıtın değerlendirilmesine izin verir. Bu sonraki uyaranlar, testin geçerliliği için zorunlu değildir, ancak deneye ilginç ek bilgiler getirebilirler. Bu test aynı zamanda farklı koku konsantrasyonları kullanılarak yanıtın ölçeklenebilirliğinin değerlendirilmesine de olanak tanır. Depresyon bağlamında farklı hedonik değerlere sahip uyaranlara verilen tepkiyi değerlendirmek ve olumlu duygusal işlemeyi olumsuz duygusal işlemeden ayırmak çok önemlidir. Gerçekten de, klinik öncesi sonuçlar, antidepresan tedavisinin eşit derecede pozitif ve negatif koku işlemeyi eşit derecede geri yükleyemeyebileceğini göstermektedir¹⁴. Doğuştan göze çarpan iştah açıcı veya caydırıcı koku alma uyaranlarının kendiliğinden keşfi, depresif benzeri durumlarla ilişkili bilişsel veya motivasyonel eksikliklerden kaynaklanan kafa karıştırıcı faktörleri de önler^30,31. Bu nedenle, bu protokol teknik faydaları olan uzun öğrenme aşamaları gerektirmez. Bu çalışmada kullanılan her iki modelin de yetişkinlikte gerçekleştirilen müdahalelere dayandığına dikkat etmek önemlidir, bu nedenle bu protokolün erken yaşam sıkıntıları da dahil olmak üzere diğer depresyon risk faktörlerini değerlendirmeye duyarlı olup olmadığını değerlendirmek için gelecekteki deneyler gerekecektir.

Daha da önemlisi, bu protokol hem erkek hem de kadın bireyler için geçerlidir, bu da kadınların depresyondan erkeklere göre iki kat daha fazla etkilenme olasılığı olduğu için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, Shi ve ^ark.32'de gözden geçirildiği gibi, erkeklerin sosyal beklentiler, utanç veya damgalanma nedeniyle depresyondan yetersiz teşhis konması muhtemeldir. Bununla birlikte, depresyon semptomatoloji (klinik belirtiler), etiyoloji (biyolojik nedenler) ve tedavi öngörülebilirliği açısından erkekler ve kadınlar arasında farklılık göstermektedir 33,34,35, ancak birçok depresyon modeli ve testi hala öncelikle sadece erkek denekler için tasarlanmıştır. Örneğin, standart kadın idrar koklama testi²⁴ benzer bir protokol kullanır ancak benzersiz bir sosyal koku ipucuna dayanır. Çok bilgilendirici olmasına rağmen, bu test kısa bir keşif süresi (kontrollerde 30 s) ile sonuçlanır ve dişi idrarı her iki cinsiyet için de aynı etolojik ve hedonik öneme sahip olmadığı için esas olarak erkek farelere uyarlanır. Son olarak, koku alma hedonik tepkisinin antidepresan tedavisine¹⁴ duyarlı olduğu görülmektedir, bu da testimizi depresif benzeri durumları güvenilir bir şekilde karakterize etmek için tercih edilen bir araç haline getirmekte ve kuvvet yüzme testi ^36,37,38 gibi diğer tartışmalı tahlillerin yerini almaktadır.

Daha da önemlisi, test, daha önce açıklanan testlere kıyasla daha uzun uyaran keşif süreleri (100-200 s) ile sonuçlanır 21,22,23. Artan keşif süresi, bu test, örneğin nöronal aktivitenin canlı izleme teknikleriyle birleştirildiğinde özellikle önemlidir. Ek olarak, bu test metabolik karıştırıcı faktörlerden kaçınarak yiyecek / su yoksunluğu gerektirmez. Son olarak, bu test ışık periyodu boyunca gerçekleştirilebilir ve deneysel kısıtlamaları (ters döngü, kızılötesi kayıtlar) azaltır.

Ancak bu protokolün başarılı bir şekilde yürütülmesi için bazı teknik adımlar kritik öneme sahiptir. İlk olarak, deneylerin çok kontrollü ve stressiz bir ortamda yapılması esastır: aydınlatma homojen olmalı ve çok parlak olmamalı ve odada rahatsız edici bir ses veya koku olmamalıdır. Fareler arenada günde bir kez test edilebilir ve test her gün yaklaşık olarak aynı saatte yapılmalıdır. Ek olarak, hayvan stresini azaltmak için bu deneyleri yaparken benzersiz bir deneyci önerilir.

İkinci olarak, alışma günleri boyunca arenanın yeterli şekilde araştırılması sağlanmalıdır. Bir fare, alışkanlık sırasında petri kaplarının yerleştirildiği bölgelerden herhangi birinde ortalama 50 saniyeden daha az zaman harcıyorsa, kokuları test etmeden önce bir veya iki ek alışkanlık günü eklenebilir. Fare hala arenayı yeterince uzun süre keşfetmiyorsa, analizden çıkarılmalıdır. Deney grupları arasında alışkanlık sırasında "koku bölgesinin" ilk simetrik olmayan keşfi durumunda, tercih indeksinin hesaplanması, örneğin her bir gruba göre alışkanlık sırasında harcanan zamana göre normalleştirilerek, hatta alışkanlık sırasında kendi keşiflerine göre normalleştirilerek, farklı spontan tercih yanlılıklarını düzeltmek için uyarlanabilir. Aslında, başka bir zorluk, deney grupları arasında yüksek değişkenlik olabilir. Sorun ortaya çıkarsa, birey içi değişkenliği sınırlamak için, fareler aynı koku ile art arda iki gün test edilebilir. Sonuçlar daha sonra iki gün arasında ortalama alınabilir. Daha da önemlisi, koku alma tepkisinin ardışık olarak test edilmesinin keşif davranışını önemli ölçüde etkilemesi beklenmemektedir¹⁴.

Koku hazırlama ile ilgili olarak, çözeltiler testten farklı bir odada hazırlanmalı ve deneyciler, çözeltinin davranışsal odada aşırı derecede yayılmadığının farkında olmalıdır. Son olarak, çözeltiler tercihen testten kısa bir süre önce hazırlanmalı ve kokunun kaybolmaması veya kirlenmemesi için kokusuz bir cam şişede saklanmalıdır. Erkek ve dişi fare idrarı gibi çok iştah açıcı olduğu varsayılan bazı kokular için, kontrol fareleri yüksek pozitif değerlik ile ilişkili keşif okumaları sunmuyorsa, çözelti kontrol edilmelidir. Özellikle, fare idrarı testten kısa bir süre önce (en fazla 2-3 gün önce) genç farelerden (en fazla 5 aylık) taze olarak toplanmalı ve koku alma özelliklerini korumak için 4 °C'de saklanmalıdır. Dikkat edilmesi gereken, art arda birkaç günden toplama, dişi farelerde östrus döngüsü aşamalarına bağlı etkileri önlemelidir. Gerekirse, daha uzun süreli saklama için idrar -20 °C'de tutulabilir, ancak bu prosedür koku yoğunluğunu makul ölçüde azalttığı için önerilmez. Benzer şekilde, yer fıstığı yağının algılanan hoşluğu da, örneğin partiye veya markaya bağlı olarak değişken olabilir. Daha da önemlisi, iki koku çözeltisi arasındaki tercihi ölçmek için koku olmayan "kontrol bölgesi" yerine bölmelere iki farklı koku veya farklı konsantrasyonlarda kokular eklenebilir.

Son olarak, koku alma tercihi testi, tasarımını geliştirmek ve potansiyel uygulamalarını genişletmek için çeşitli şekillerde uyarlanabilir. Gerçekten de, motor okumanın yanı sıra, bu test yoluyla duygusal tepkinin değerlendirilmesi, duyguların çeşitli bileşenlerini ölçmek için farklı tekniklerin birleştirilmesiyle geliştirilebilir⁶. Örneğin, belirli pozitif ve negatif uyaranlara yanıt olarak yayılabilen ultrasonik seslendirmeleri kaydetmek için arenanın yanına bir ultrason mikrofonu yerleştirilebilir^24,39. Vücut ısısı ayrıca bir kızılötesi kamera veya implante edilebilir bir gerçek zamanlı telemetri vericisi^40,41,42 kullanılarak da izlenebilir. Bu vericilerden bazıları kalp ve solunum hızlarına bile erişebilir 43,44,45. Bu araçları birleştirmek, duygusal tepkinin daha rafine bir davranışsal değerlendirmesinin oluşturulmasına yardımcı olacaktır. Koku tercih testi, optogenetik, fiber fotometri veya mini skop canlı görüntüleme veya in vivo elektrofizyoloji kayıtları gibi duygusal düzensizliğin arkasındaki nöronal mekanizmaları daha fazla aydınlatmak için diğer tekniklerle de kolayca birleştirilebilir. Son olarak, bu protokol, duyusal önyargıların ve hedonik koku alma tepkisinin değerlendirmesini insan araştırmalarına entegre ederek ve hatta bir teşhis veya tedaviye yanıt verme aracı olarak kliniğe kolayca tercüme edilebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2,4,5-Trimetiltiyazol	Sigma-Aldrich	W332518-100G-K
2-trans oktenal	Sigma-Aldrich	52464-1ML
Blu-tack	UHU	YOK
Filtre kağıdı	Fisher Bilimsel	11710125	42,5 mm
Cam şişe	DUTSCHER DOMINIQUE	958983
Madeni yağ	Sigma-Aldrich	M5904-500ML
Noldus Ethovision	Noldus Ethovision	Sürüm 17.5	Alternatif olarak, açık kaynaklı ICY yazılımındaki Tek Fare İzleyici veya Deeplabcut kullanılabilir
Petri kabı	Doğan	351007	60 mm x 15 mm Petri kabı, 5 mm çapında 7 adet özel yapım delik
Pleksiglas arena	Özel yapım	YOK	45 cm x 50 cm x 25 cm boyutlarında pleksiglas arena, ortada 37 cm x 25 cm boyutlarında bir duvarla iki odaya bölünmüştür.