Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Serbest Yüzen Normal İnsan Epitelyal-Fibroblast Küresel Ko-Kültürlerinin Üretilmesi

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68440

⸱

3 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Cell Biology (Cancer Research), Medical Faculty, University of Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, insan akciğer epitel hücrelerinin ve fibroblastların bir matrise dayanmadan doğrudan küresel birlikte yetiştirilmesi için basit ve çok pratik ama güvenilir bir protokol sunuyoruz.

Özet

Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri, doğal hücre özelliklerini ve mimarilerini yeniden üretme yetenekleri nedeniyle giderek daha popüler hale geldi, böylece doku benzeri yapıları in vitro olarak taklit ediyor. Bu modeller arasında, yarı katı bir hücre dışı matris (ECM) içine gömülü küresel hücre agregatlarının (sferoidler olarak adlandırılır) kültürü, hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimlerinin yanı sıra oksijen ve besin gradyanlarının bir sonucu olarak farklı fonksiyonel hücre durumlarına izin verdiği için gelişmiş bir yakın in vivo hücre kültürü modelini temsil eder. Sferoidler teknik olarak daha az talepkar ve elde edilmesi nispeten ucuz olduğundan, ilaç taraması ve toksisite testinde sıklıkla kullanılırlar ve klinik öncesi aşamada yeni ilaçların test edilmesi için yüksek içerikli taramaya olanak tanırlar. Bu amaçla, çeşitli tümörlerin 3 boyutlu yapıları ağırlıklı olarak yeniden oluşturulur. Aynı zamanda, Matrigel şu anda en yaygın kullanılan ECM'lerden biridir ve sferoid ve organoid yetiştiriciliğinde altın standart olarak kabul edilir, ancak bu, fare deneylerine dayanan bir 3D matris olmasına rağmen, çıkarılması - genel olarak hayvan testleri gibi - büyük etik kaygılarla ilişkilidir. Burada, insan bronşiyal epitel hücrelerinin ve fibroblastların doğrudan küresel birlikte yetiştirilmesi için matrissiz bir protokol sunuyoruz ve bu, özellikle epitelyal-fibroblast iletişimi ve ilgili sferoidler içindeki etkileşimlerle ilgili olarak, (hayvan bazlı) bir taşıyıcı matrise dayanmadan, optimize edilmiş bir birlikte yetiştirme yöntemi olarak kabul edilebilir. Bu serbest yüzen epitelyal-fibroblastoid sferoid ko-kültürleri, kanser terapötik yaklaşımlarının normal (akciğer) doku toksisitelerini modellemek için hasta odaklı bir in vitro platform olarak kurarak, sadece deney hayvanlarının sayısında bir azalma değil, aynı zamanda ilgili hayvan deneylerinin yeterli ve anlamlı bir şekilde değiştirilmesi de sağlanabilir.

Giriş

Düz tek tabakalı hücrelerin kültürlendiği, genişletildiği ve daha sonra hücre bazlı araştırma tahlilleri için kaplandığı iki boyutlu (2D) hücre kültürleri, standart klinik öncesi tarama prosedürleri için kolay, kullanışlı, uygun maliyetli ve yaygın olarak kullanılan bir yöntem olmaya devam etmektedir 1,2. Çeşitli hücre tipleri arasındaki etkileşimli (parakrin) karışmayı in vitro olarak incelemek için, başka bir hücre tipinin uyarılması için bir hücre tipinden şartlandırılmış bir ortam kullanılabilir. Ek olarak, birlikte kültürlenmiş hücreler mikro gözenekli bir zar kullanılarak fiziksel olarak ayrıldığında dolaylı yöntemler gibi çeşitli ko-kültür yöntemleri ortaya çıkmıştır. Bu 'Transwell sistemleri', geleneksel bir 2D hücre kültürü plakasına yerleştirilen bir ek (mikro gözenekli zar) içerir. Bir hücre tipi daha sonra zar üzerinde ekilir ve büyütülür, eşlik eden kuyuda büyüyen diğer tiple aynı ortamı paylaşır, böylece çift yönlü parakrin iletişimeizin verilir 2. İki hücre tipi, zarın iki tarafına bile ekilebilir, bu da bariyer yapılı dokularıaraştırmak için uygun olan doğrudan hücreden hücreye temas ko-kültürü oluşturur 3,4.

Bununla birlikte, bu gelişmiş 2D hücre kültürü sistemlerinin hücresel tepkileri, diğer şeylerin yanı sıra, farklı hücre tipleri arasında doğrudan sinyalleme eksikliğinden ve dolayısıyla in vivo benzeri hücresel organizasyonların eksikliğinden dolayı ilgili hayvan deneylerinin ve hatta klinik çalışmaların sonuçlarını her zaman yansıtmaz. Bu nedenle, üç boyutlu (3D) kültür sistemleri, doğal benzeri hücre özelliklerinin yetenekleri ve doku benzeri yapıları in vitroolarak taklit eden mimariler nedeniyle giderek daha popüler hale gelmiştir 5,6. Bu modeller arasında, yarı katı hücre dışı matrislere gömülü, sferoidler olarak adlandırılan küresel hücre agregatlarının kültürü, hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimlerini takip eden farklı fonksiyonel hücresel durumların yanı sıra oksijen ve beslenme gradyanlarının elde edilebileceği daha gelişmiş bir hücre ko-kültürü modeli sağlar7. İstenen bu daha karmaşık in vivo benzeri in vitro kültürler 3D kültürler, hücre gelişimini ve farklılaşmasını teşvik ederken, aynı zamanda etkili, hızlı, tutarlı ve kullanışlı olurken, hücre montaj boyutlarına göre homojen olarak üretilmeli ve korunmalıdır 7,8.

Kendi kendine toplanma ve yapışmanın doğal özelliklerini kullanarak, sferoidler (esas olarak tümör sferoidleri) genellikle asılı bırakma tekniği 9,10 kullanılarak üretilir. Embriyonik cisimler oluşturmak için kullanılan ilk tekniklerden biri olan asılı damla testi, fare tabanlı olmasına rağmen, hücre dışı matrislerin 'altın standardı' olan Matrigel kullanılarak ECM gömülmeden önce yerçekimi ve yüzey gerilimi ilkelerine dayalı olarak çok sayıda homojen sferoid oluşturmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir. İskelesiz yaklaşımlarda sferoidler oluşturmak için önemli çaba sarf edilmiştir 8,11. Örneğin, sferoidler, bir karıştırıcıya sahip bir hücre kültürü şişesi kullanılarak üretilebilir, böylece büyük ölçekte sferoidler üretmenin en basit yöntemi olan hücre tohumlaması önlenebilir12.

Hücre kültürlerinin kompleks haline getirilmesinde ve dolayısıyla bir laboratuvarda in vivo benzeri in vitro alternatifler gibi fizyolojik olarak değerli bir sistem kurmada en zor şey, birçok farklı adımdan oluşan (hala kurulması gereken) karmaşık protokollerdir. Örneğin, hücresel yapıların önce bir yöntem kullanılarak oluşturulması, hasat edilmesi ve daha sonra bir matrise gömülmesi, özellikle de ele alınması kolay olmayan matrislerin kullanılması, bir yöntemin rutin ve seri olarak kullanılabilmesi için daha fazla ikna gerektiren kritik adımlardır. Burada, akciğer epitel hücrelerinin ve fibroblastların karmaşık 3D sferoidlerini oluşturmak için kültür kabına neredeyse hiç hücre bağlanmasına izin vermeyen 96 oyuklu bir formatta ultra düşük bir bağlantı plakası kullandık. Elde edilen sferoidler 24 saat içinde oldukça düzgün ve oldukça hızlı bir şekilde oluşur, bu da deneysel zaman çizelgesini kısaltır. Uzun süreli yetiştirme ve dolayısıyla güvenilir hücre büyümesi ve farklılaşması, tüm dönem boyunca aynı kuyucukta gerçekleştirilir, böylece ilk kaplamadan sonra tüm yetiştirme dönemi boyunca sadece ortamın değiştirilmesi gerekir. Bu nedenle, hava yolu epitelini morfolojik ve fonksiyonel olarak neredeyse fizyolojik seviyelerde kopyalayan insan akciğer sferoidlerini üretmek için çok basit, hızlı ve dolayısıyla son derece pratik bir protokol sunuyoruz. Diğer bir avantaj, bu protokolün diğer hücrelere kolayca uyarlanabilmesidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm adımlar steril koşullarda (Biyogüvenlik kabini) gerçekleştirilir. Bu çalışmada kullanılan medya kompozisyonları için Tablo 1'e bakınız.

1. Deney materyalinin hazırlanması

  1. İnsan normal akciğer epitel hücrelerini (HBEC3-KT) standart bir inkübatör13 kullanarak normal epitelyal büyüme ortamında standart plastik hücre kültürü kaplarında (T75 şişeleri) kültürleyin ve genişletin (bkz. Tablo 1).
    NOT: Daha iyi büyüme için, ortam ek olarak% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ile desteklenebilir.
  2. % 10 fetal buzağı serumu ve penisilin / streptomisin10,14 ile desteklenmiş RPMI Ortamında kültür insan fibroblastları (HS-5) (bakınız Tablo 1).
  3. DMEM / F12'yi N-2, B27, penisilin-streptomisin, sığır serum albümini, monotiogliserol, askorbik asit, KGF / FGF7, FGF10, ATRA ve CHIR99021 ile takviye ederek dallanan akciğer organoid ortamını (BLO-Medium) hazırlayın. (Tablo 1 ve Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Ortamın en azından KGF/FGF7, FGF10, ATRA ve CHIR99021 ilavesiyle taze olarak hazırlanması önerilir. Kısa bir süre içinde daha fazla ortama ihtiyaç duyulursa, 4 °C'de yalnızca birkaç günlük (1 haftaya kadar) kısa bir saklama süresi önerilir. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen PneumaCult Airway Organoid Farklılaşma Ortamı kullanılabilir.

2. Epitel hücrelerinin ve fibroblastların hazırlanması

NOT: Hücreler yaklaşık %80 birleşime ulaştığında her iki hücre tipini de kullanın. Her hücre tipini ayrı ayrı hazırlayın.

  1. Kültür ortamını çıkarın ve atın.
  2. Hücre tabakasını 5 mL PBS ile kısa bir süre durulayarak hücreleri yıkayın.
  3. 2 mL% 0.5 Tripsin-EDTA ekleyerek epitel hücrelerini tripsinize edin, ardından 37 ° C'de 4-8 dakika boyunca kısa bir inkübasyon yapın.
  4. 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak normal büyüme ortamı veya% 10 FCS ile desteklenmiş PBS ekleyerek yuvarlak ve neredeyse ayrılmış hücreleri hasat edin.
  5. Hücre kümelerini daha da ayırmak ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarmak için T75 şişesinde (büyüme yüzeyi boyunca) uygun hacmi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
  6. HS5 fibroblastlarını sırasıyla TE tripsinizasyonu kullanarak 37 ° C'de 3-5 dakika hasat edin.
  7. Her hücre tipini (ve dolayısıyla tripsin içermez) santrifüjleme ile peletleyin (ör., oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300-400 × g [RT]) ve 1-2 mL normal epitel büyüme ortamında yeniden süspansiyon (hem epitel hücreleri hem de fibroblastlar) sayımdan önce.
  8. Uygun bir hacimde yeniden askıya alınmış hücre kullanarak canlı hücre sayılarını belirleyin; her biri mikroskop altında bir Neubauer sayım odasında %0.4 Tripan Mavi Leke kullanılarak 1/5 oranında seyreltilir.

3. Epitelyal-fibroblast 3D sferoid kültürlerinin oluşturulması

  1. 15 mL'lik bir tüp kullanarak normal epitelyal büyüme ortamında istenen sayıda hücreyi seyreltin. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğu için 100 μL ortamda 50 fibroblastlı 2000 epitel hücresini hesaplayın. Bir 96 oyuklu plaka için yeterli olan hücre sayıları, 10 mL normal epitelyal büyüme ortamında 200.000 HBEC hücresi ve 5.000 HS5 fibroblastıdır.
  2. 10 mL steril serolojik pipetler kullanarak nazikçe karıştırın.
  3. Hücre süspansiyonunu çok kanallı bir mikropipet için steril bir reaktif rezervuarına aktarın.
  4. (12 kanallı) çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 100 μL hücre süspansiyonu aktararak hücreleri ultra düşük bir bağlantı plakasına tohumlayın.
  5. Nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C ve% 5 CO2'de standart hücre kültürü koşulları altında inkübe edin.
    NOT: Sferoid oluşumu, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak düzenli mikroskobik inceleme ve istenen her zaman noktası için sferoidlerin fotoğraflanması yoluyla değerlendirilir.
  6. 4 gün sonra, oluşturulan sferoidlere oyuk başına 100 μL BLO-Medium ekleyin.
  7. Nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C ve% 5 CO2'de standart hücre kültürü koşulları altında daha fazla inkübe edin.

4. Düzenli bir medya değişikliği yapmak

  1. 7-8 gün sonra düzenli bir medya değişikliği yapın. Bu nedenle, plakayı hafif bir açıyla konumlandırın, böylece sferoidler yerçekimine göre eğilme yönünde batar.
  2. Süpernatanı 100-200 μL'lik bir pipet ucuyla dikkatlice ve mümkün olan en iyi şekilde aspire edin.
  3. Plakayı yatay olarak yeniden konumlandırın ve oyuk başına 100-150 μL BLO ortamı ile doldurun (çok kanallı bir pipet kullanarak)
  4. Nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C ve% 5 CO2'de standart hücre kültürü koşulları altında daha fazla inkübe edin veya bir deney / tedaviye başlayın.
    NOT: Sferoidler daha uzun süreler boyunca (21 güne kadar) kültürlenebilir. Daha sonra, haftada en az iki kez tam bir orta değişim yapılmalıdır.

5. Aşağı akış analizleri (sferoidlerin toplanması)

  1. Küresel boyut ölçümleri ve hacim hesaplamaları ile birlikte fotoğraf çekerek düzenli mikroskobik inceleme ve dokümantasyon gerçekleştirin, son olarak tedavileri takiben küresel büyümenin ve potansiyel büyüme değişikliklerinin nicelleştirilmesine izin verin.
  2. İstenilen zaman noktalarında canlı hücre görüntüleme için, sferoidleri çekirdek boyama için 1 μg / mL Hoechst 33342 (veya DAPI) ile 15 dakika daha inkübe edin ve floresan mikroskobu ile analiz edin.
  3. Çapı artırmak için çıkışı kesilmiş (steril tutun) 200 μL'lik bir pipet kullanarak oluşturulan sferoidleri istenen zaman noktasında hasat edin. Bu nedenle, sferoidi içeren ortamı da aspire edin. Sferoidleri 2-5 mL'lik bir tüpte birleştirin ve toplayın. 2-5 dakika sonra, sferoidler yerçekimi nedeniyle battığında, süpernatanı çıkarın ve aşağı akış analizine devam edin.
  4. Bütün sferoid protein lizatlarının üretilmesi için, doğrudan buz gibi soğuk lizis tamponu (150 mmol/L NaCl, %1 NP40, %0.5 sodyum-deoksikolat, %0.1 sodyum-dodesilsülfat, 50 mmol/L Tris/HCl, pH 8, proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenmiş) ekleyin hasat edilen sferoidleri içeren tüpe. İki ila üç donma ve çözülme döngüsünden sonra, lizatların protein içeriğini belirleyin ve aşağı akış analizine geçin, örneğin, Western blot analizi15.
  5. Bütün sferoid RNA lizatlarının üretilmesi için, hasat edilen sferoidleri içeren tüpe doğrudan RNA lizis tamponu ekleyin ve kullanılan ilgili RNA izolasyon kitinin üretici talimatlarına göre RNA izolasyonu gerçekleştirin.
  6. İmmünohistokimya (IHC) ve immünofloresan boyama için 5.6.1-5.6.3 adımlarını izleyin.
    1. Hasat edilen sferoidleri 30 dakika boyunca 1-2 mL% 4 paraformaldehit/fosfat tamponlu salin (PBS) ile muamele edin ve ardından parafin gömme ve kesit alma (3-5 μm) işlemine tabi tutun.
    2. İmmünofloresan boyamadan önce, azalan bir dizi alkol kullanarak numuneler hazırlayın ve bir hedef geri alma çözeltisi ile inkübasyon yapın. Daha sonra, spesifik olmayan etkileşimleri azaltmak ve birincil antikorları gece boyunca 4 ° C'de inkübe etmek için slaytları bir bloke edici solüsyonla (% 2 normal keçi serumu / PBS) bloke edin.
    3. Floresan etiketli ikincil antikorlarla antijenleri tespit edin. DAPI ile karşı leke çekirdekleri. Histolojik değerlendirme için üreticinin protokollerine göre ek boyama (örn., PAS boyama kiti) yapın.
  7. Tek hücreli süspansiyonlar için 5.7.1 ve 5.7.2 adımlarını izleyin.
    1. Hasat edilen sferoidleri 100 U / mL DNaz I içeren 1-2 mL TrypLE içinde yeniden askıya alın ve ardından 37 ° C'de 15 dakikalık bir inkübasyon izleyin. % 2-5 FCS, 2 mM EDTA ve DNAse I içeren PBS ekleyerek sindirimi durdurun.
    2. Hücresel çözeltiyi, aşağı akış analizinden önce 70 μm'lik bir hücre süzgecinden yeni bir konik tüpe geçirin (ör., akış sitometrisi veya tek hücre analizi).
  8. Tek hücreli RNA dizileme analizi için 5.8.1-5.8.3 adımlarını izleyin.
    1. Üreticinin talimatlarına göre (insan) tek hücreli çoğullama kiti kullanarak farklı zaman noktalarını veya tedavileri temsil eden farklı tek hücreli süspansiyonları etiketleyin.
    2. Numuneleri daha sonra birleştirin ve 10.000-40.000 hücreyi hedefleyen tek hücreli bir kartuş üzerinde bir şeride yükleyin.
    3. Tek hücreleri alın, üreticinin talimatlarına göre ters transkripsiyon ve kitaplık hazırlığı gerçekleştirin ve izole edilmiş RNA'yı dizileyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu basit protokol, insan bronşiyal epitel hücrelerinin ve fibroblastların ultra düşük bağlanma plakaları ile kombinasyon halinde matrissiz küresel birlikte kültivasyonunu sağlar (Şekil 1A). Kültivasyon işlemi sırasında, canlı hücre görüntüleme (Şekil 1B), immünohistokimya (Şekil 1C) ve immünofloresan (Şekil 1D) kullanılarak yapılan morfolojik analizlerle ortaya çıktığı gibi, doğrudan hücresel etkileşiml...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

3D hücre kültürü modelleri, 2D kültürler ve in vivo çalışmalar arasındaki boşluğu kapatmak için önerilmiştir, çünkü bu tip (ko-) kültür, in vivo olarak mevcut fizyolojik, morfolojik ve patolojik özellikleri daha iyi taklit eder, çünkü daha fazla in vivo benzeri hücre-hücre etkileşimleri, hücre-ECM etkileşimleri, uyaranlara yanıtlar, gen ekspresyonu, protein ekspresyonu ve farklılaşma mevcuttur17, 18. Ço...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar kişisel ya da kurumsal bir çıkar çatışması olmadığını belirtmektedirler.

Teşekkürler

Mohammed Benchellal, Eva Gau, Sabine Senkel ve Olga Kruse'ye mükemmel teknik yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF) (LuOrgNTT: 16LW0293 - D.K., SeniRad: 02NUK086C - V.J., D.K.) ve DFG Araştırma Eğitim Grubu 2762 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 mL steril serolojik pipetler ThermoFischer170356NNunc steril serolojik pipetler veya eşdeğeri
15 mL konik tüpCorning430052veya eşdeğeri
37 derece; C /% 5 CO2< / sub> nemlendirilmiş  inkübatör
5 mL steril serolojik pipetler ThermoFischer170355NNunc steril serolojik pipetler veya eşdeğeri
50 mL konik tüpCorningCLS430829veya eşdeğeri
ATRA (All-Trans Retinoik Asit)Kök Hücre TeknolojileriCat#7226250 nM
B-27 Takviyesi (50x), ThermoFischer/GibcoCat#175040441x
BD Rhapsody WTA Amplifikasyon KitiBD BioscienceCat#633801üreticinin talimatlarına göre kullanım Biyogüvenlik
kabini
Sığır Serumu AlbüminRocheCat#BSAVHS-RO%0.4 (h/h)
Hücre SüzgeciCorning352350Falcon 70 ve mikro; m Hücre Süzgeci, Beyaz, Steril, Ayrı Ayrı Paketlenmiş
SantrifüjEppendorfhttps://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001 örneğin, Eppendorf Santrifüj 5804 - Tezgah Üstü Santrifüj
DMEM/F12InvitrogenCat#11330-032500 mL
DNaz I, RNaz içermez (1  U/μ L)ThermoFischer Kedi# EN0521100 U / mL & nbsp;
EDTA (0,5 M), pH 8,0, RNaz içermeyenThermoFischerAM9260G2 mM
Eppendorf Research plus 12 kanallı çok kanallı pipet Eppendorförneğin, #3125000044 (10– 100 ve mikro; L) veya #3125000060 (30– 300 ve mikro; L)
Fetal buzağı serumuThermoFischer / GibcoCat # A525670110% (h / h)
HBEC3-KT & nbsp;ATCCCRL-4051insan normal akciğer epitel hücre hattı 
Heparin Çözeltisi (%0.2)Kök Hücre TeknolojileriCat#79800.8 mL
Hoechst 33342 ThermoFischer Kedisi#H13991 & g/mL
HS-5 ATCCCRL-3611insan stromal fibroblastları
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACFKök Hücre TeknolojileriCat#78173.110 ng/mL
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF Kök Hücre Teknolojileri Kedi# 78186.110 ng / mL
İnsan Tek Hücreli Çoğullama KitiBD BioscienceCat#633781üreticinin talimatlarına göre kullanın
Hidrokortisin Stok Çözeltisi Kök Hücre TeknolojileriCat#7926500 mL başına 0,5 mL
Laduviglusib (CHIR-99021)Biozol/SelleckchemCat#S12633 &
ML-Askorbik asitSigma-Aldrich Cat# A9290250 & mikro; g/mL
MikroskopZEISS
MonotiogliserolSigma-AldrichCat # M61450.4 & mikro; M
N-2 Takviyesi (100x)ThermoFischer/GibcoCat#175020481x
Neubauer sayma haznesiMerckBR718605örneğin, BRAND  sayma odası BLAUBRAND  Neubauer deseni
Normal keçi serumuThermoFischerCat # 31873
Cat# 492016NP-40-Alternatifinde% 2
PAS Boyama KitiSigma AldrichCat # 1016460001üreticinin talimatlarına göre kullanın
PBSThermoFischerCat # 100100231x
Penisilin-Streptomisin (10.000  U/mL), 100xThermoFischer/GibcoKedisi#151401221x
PFAThermoFischerKedisi#J61899. AKParaformaldehid, PBS'de %4
PneumaCult Airway Organoid Farklılaşma Ortamı (ODM)StemCellCat#05060PneumaCult Airway Organoid Bazal Ortam (#05061, 360 mL) ve PneumaCult Airway Organoid Farklılaşma Takviyesi* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus OrtaKök Hücre TeknolojileriKedisi#5040PneumaCult-Ex Plus Bazal Ortam (#05041, 490 mL ) ve PneumaCult-Ex Plus 50X Takviyesi*(#05042, 10 mL)
Proteaz inhibitörü kokteyliMerck/RocheCat#46931320011 sekme/10 mL
Rhapsody cDNA KitiBD BioscienceCat#633773üreticinin talimatlarına göre kullanım
RPMI 1640 OrtaThermoFischer/GibcoCat#11875093500 mL
Sodyum KlorürMerck/Sigma-AldrichS9625150 mmol/L
Sodyum SitratMerck/Sigma-AldrichKedi#1613859-1G%0.10
Sodyum DeoksikolatSigma-AldrichKedi#30970%0.50
Sodyum Dodesil Sülfat Merck/Sigma-AldrichCat # 11667289001%0,10
steril reaktif rezervuarı (örn. 60 ml)ThermoFischer9510037 veya eşdeğeri
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ckSarstedt (veya fasellitate)83.3925.400 (veya F202003)ultra düşük bağlantı plakası
Tris/HClThermoFischerCat#AM9855G50 mmol/L, pH 8
Triton  X-100Sigma-Aldrich Kedisi#X100-5ML0.05 % 
Tripan Mavi Leke (% 0.4)ThermoFischerCat # 15250061ile 1/5 (h / h)
ThermoFischerCat #12604013 1x
Tripsin-EDTA (0.5 %)ThermoFischerCat # 15400054Fosfat tamponlu salin (kalsiyum ve magnezyum olmadan) kullanılarak aseptik olarak 1X'e seyreltilmiş %0.05 Tripsin-EDTA (TE) çözeltisi
WST-1 reaktifiCELLPRO-RO, RocheCat#5015944001Hücre Proliferasyon Reaktifi 
PBS NP-40 Merck/Millipore (h / h), %1 Technologies / Çok kanallı mikropipet için NGM TrypLE

Kaynaklar

  1. Rasouli, M., Safari, F. Principles of indirect co-culture method using Transwell. Methods Mol Biol. , (2024).
  2. Fontoura, J. C., et al. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance. Mater Sci Eng C. 107, 110264(2020).
  3. Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84 (6), 736-752 (2004).
  4. Huang, X., et al. Current advances in 3D dynamic cell culture systems. Gels. 8 (12), 829(2022).
  5. Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: progress so far and future prospects. Pharmaceutics. 15 (8), 926(2022).
  6. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  7. Baarsma, H. A., et al. Epithelial 3D-spheroids as a tool to study air pollutant-induced lung pathology. SLAS Discov. 27 (3), 185-190 (2022).
  8. Shah, D. D., Raghani, N. R., Chorawala, M. R., Singh, S., Prajapati, B. G. Harnessing three-dimensional (3D) cell culture models for pulmonary infections: state of the art and future directions. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol. 396 (11), 2861-2880 (2023).
  9. Ketteler, J., et al. Caveolin-1 regulates the ASMase/ceramide-mediated radiation response of endothelial cells in the context of tumor-stroma interactions. Cell Death Dis. 11 (4), 228(2020).
  10. Wittka, A., et al. Stromal fibroblasts counteract the caveolin-1-dependent radiation response of LNCaP prostate carcinoma cells. Front Oncol. 12, 802482(2022).
  11. Budeus, B., Kroepel, C., Stasch, L. M., Klein, D. Matrix-free human lung organoids derived from induced pluripotent stem cells to model lung injury. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 468(2024).
  12. Białkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Miłowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  13. Hansel, C., et al. Metformin protects against radiation-induced acute effects by limiting senescence of bronchial-epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (13), 7064(2021).
  14. Panic, A., et al. Progression-related loss of stromal caveolin 1 levels fosters the growth of human PC3 xenografts and mediates radiation resistance. Sci Rep. 7, 41138(2017).
  15. Sentek, H., Braun, A., Budeus, B., Klein, D. Non-small cell lung cancer cells and concomitant cancer therapy induce a resistance-promoting phenotype of tumor-associated mesenchymal stem cells. Front Oncol. 14, 1406268(2024).
  16. Steens, J., et al. Direct conversion of human fibroblasts into therapeutically active vascular wall-typical mesenchymal stem cells. Cell Mol Life Sci. 77 (17), 3401-3422 (2020).
  17. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  18. Arora, S., et al. Spheroids in cancer research: recent advances and opportunities. J Drug Deliv Sci Technol. 100, 106033(2024).
  19. Chen, S., et al. 3D co-culture of lung cancer cells with CAFs: An in vitro model system to study tumor progression. J Vis Exp. , e20235(2025).
  20. Hey, S., Linder, S. A macrophage-tumor spheroid co-invasion assay. JoVE. (215), (2025).
  21. Miranda, G., et al. Cost-effective 3D lung tissue spheroid as a model for SARS-CoV-2 infection and drug screening. Artif Organs. 48 (7), 723-733 (2024).
  22. Celis, T., Bullens, D. M. A., Hoet, P. H. M., Ghosh, M. Development and validation of a human bronchial epithelial spheroid model to study respiratory toxicity in vitro. Arch Toxicol. 98 (2), 493-505 (2024).
  23. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of normal human bronchial epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Sci Rep. 9 (1), 500(2019).
  24. Basil, M. C., et al. The cellular and physiological basis for lung repair and regeneration: past, present, and future. Cell Stem Cell. 26 (4), 482-502 (2020).
  25. Klein, D. Lung multipotent stem cells of mesenchymal nature: cellular basis, clinical relevance, and implications for stem cell therapy. Antioxid Redox Signal. 35 (3), 204-216 (2021).
  26. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. J Clin Invest. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  27. Shakir, S., Hackett, T. L., Mostaço-Guidolin, L. B. Bioengineering lungs: an overview of current methods, requirements, and challenges for constructing scaffolds. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1011800(2022).
  28. Budeus, B., Kroepel, C., Stasch, L. M., Klein, D. Free-floating human lung organoids derived from induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. , (2025).
  29. Li, C., et al. Establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids. JoVE. (181), e63684(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

3B H cre K lt rSferoid Ko K lt rEpiteliyal Fibroblast SferoidleriMatriks i ermeyen Sferoidlernsan Bron iyal EpiteliyalFibroblast Ko K lt rH cre H cre Etkile imleriDoku Mimikrisila TaramaHayvans z Model

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.