Mitokondriyal Morfolojideki Değişikliklerin Dinamik ve Üç Boyutlu Floresan Mikrografları ile Anlaşılması

Mitokondri, tüm ökaryotik hücrelerde bulunan, onlara enerji sağlayan ve metabolizmalarını düzenleyen oldukça dinamik organellerdir. Bu nedenle, mitokondri hücresel ölüm ve hayatta kalmanın kavşağındadır. Mitokondrinin, lizozomal asitleşme ve moleküler motor etkiden kas kasılması ve sinaps ateşlemesine kadar çeşitli süreçler için gerekli olduğu gösterilmiştir ^1,2.

Mitokondri, hücrenin metabolik talebine ve stresine yanıt olarak ATP'yi verimli bir şekilde üreten bir mitokondriyal ağı sürdürmek için düzenli fisyon ve füzyon olaylarına maruz kalır. Gerçekten de, mitokondrinin, mitokondriyal fragmanların seçici olarak uzaklaştırılması olan mitofajiyi kolaylaştırmak için fisyona uğradığı gösterilmiştir. Bu nedenle, hücresel sistemde sadece aktif olarak solunum yapan ve depolarize olmayan mitokondri kalır ^3,4. Bununla birlikte, füzyon, artan bir ihtiyaç olması durumunda ağın ATP çıktısını artırmanın bir yolu olarak ortaya çıkar ^5,6. Ek olarak, hem fisyon hem de füzyonun mitokondriyal DNA'nın^{bölünmesinde} ve korunmasında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir ^7,8. Fisyon ve füzyon kapsamının, sağlıklı bir mitokondriyal ağ sağlamak için dikkatli bir homeostatik kontrol gerektirdiğine dikkat edilmelidir, çünkü her iki işlemin de çok fazla veya çok azının zararlı olduğu gösterilmiştir.

Aşırı fisyonun, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve tauopatilerde ^9,10,11 daha sonra azalmış ATP seviyeleri ile parçalanmış bir mitokondriyal ağa yol açtığı gösterilmiştir ve düşük fisyon seviyeleri, depolarize mitokondri birikimine yol açarak Parkinson hastalığı benzeri semptomlara yol açabilir 12. Ağın hiperfüzyonunun, ATP çıktısını artırmak için stres zamanlarında meydana geldiği bilinmektedir. Bununla birlikte, bu durumda uzun süre var olmanın ROS seviyelerini ve otofaji aktivitesini arttırdığı ve hücre ölümünün başlamasına neden olduğu gösterilmiştir ^9,12.

Bu nedenle, mitokondriyal ağın durumunu anlamanın, hücrenin ve dolayısıyla organizmanın durumunu anlamak için önemli bilgiler sunduğu açıktır. Mitokondriyal ağın sağlık ve hastalık bağlamında anlaşılmasının açık önemi, fisyon ve füzyon olaylarına maruz kalma kabiliyeti ve bunların hücresel sağlık üzerindeki etkisi, bu protokolün ve ilgili analiz araçlarının geliştirilmesini motive eden şeydir. Spesifik olarak, mitokondriyal dinamiklerin karakterizasyonunu sağlayan araçlar büyük ölçüde sınırlıdır ve literatürde yetersiz bir şekilde tanımlanmıştır.

Mitokondriyal morfoloji tipik olarak konfokal mikroskopi ve ardından mitokondriyal organizasyonu en iyi şekilde tanımladığı için, ham mikrografların değerlendirme kalitelerini artırmak için bir dereceye kadar işlemden geçmesini gerektiren hesaplamalı analiz kullanılarak belirlenir. Bu şekilde kullanıcılar, mitokondriyal ağın sayı, hacim, uzunluk ve en boy oranı 13,14,15 gibi birçok morfometrik sonucunu belirleyebilir. Kullanıcılar, morfolojik değerlendirmeler için 2D veya 3D mikrograflardan yararlanabilir, ancak 3D analiz, mitokondriyal ağ 3D yapılardan oluştuğu için daha fazla doğruluk ve içgörü sunar. Fisyon ve füzyonu analiz etmek amacıyla, mitokondriyal ağın¹⁶ 3 boyutluluğunu en iyi şekilde telafi ettiği için z eksenli mikrografların kullanılması önerilir.

Birçok çalışma, ağı tanımlamanın bir yolu olarak mitokondrinin parçalanmış, filamentli veya ara durumlara sınıflandırılmasını içerir^16,17. 3D analiz, mitokondrinin hücrede aldığı farklı şekiller nedeniyle özellikle faydalıdır. Birinin çalışmasına 3 boyutluluk eklemek, özellikle mitokondriyal sayımlara güven verir, çünkü mitokondrinin bir z ekseni boyunca yukarı veya aşağı hareket etmesi muhtemeldir. MEL, 3D yakalanan görüntülere bağlı olan bir ImageJ eklentisidir¹⁸. Burada, mitokondriyal ağı ve hücrenin çekirdeğini görselleştirmek için TMRE ve Hoechst ile boyanmış GT1-7 fare hipokampal nöronal hücrelerini kullandık. Hücreler daha sonra görüntü analizine hazırlanırken mikrografların kalitesini artırmak için bir ön işleme boru hattından geçirildi.

Statik metriklere dayalı olarak mitokondriyal morfolojinin belirlenmesine izin veren birçok teknik kullanıma sunulmuştur. Çok azı fisyon ve füzyon aktivitelerini içerir ve mitokondrinin dinamik davranışının kantitatif olarak yakalanmasını sağlar 13,19,20,21. Burada, mitokondriyal fisyon ve füzyon aktivitesine odaklanarak, ağ özelliklerinin belirlenmesinden önce görüntü geliştirme için bir protokol açıklayacağız. Bu tekniğin, mitokondriyal morfolojiyi belirlemek için daha önce yayınlanmış yöntemleri nasıl tamamlayabileceğini göstereceğiz.

1. Hücre tedavisi ve mikroskopi edinimi

1. Kültür GT1-7 hücreleri, DMEM'de 8 odacıklı tabaklarda %10 FBS ve %1 Penstrep (tam ortam) ile desteklenmiştir. Hücrelerin gece boyunca bağlanmasına izin verin ve daha sonra 72 saat boyunca% 10 FBS ile DMEM'de yapılan 2.5 mM metformin hidroklorür ile muamele edin, ortamı her 24 saatte bir değiştirdiğinizden emin olun. Görüntülemeden 6 saat önce hücreleri 10 μM CCCP ve görüntülemeden 4 saat önce 400 nM Bafilomisin A1 (Baf) ile birlikte tedavi edin.
   NOT: Bu, tercih edilen herhangi bir ökaryotik hücre hattı ile yapılabilir.
2. Görüntülemeden önce, 5 nM Hoechst ve 100 nM TMRE içeren önceden ısıtılmış tam ortamlardan oluşan bir kokteyl hazırlayın.
3. Hücre tedavi ortamını görüntüleme kokteyli ile değiştirin ve görüntülemeden önce 10 dakika inkübasyon süresine izin verin.
   NOT: Mitokondrinin dinamik aktivitesi nedeniyle, hücreler, 37 °C ve %5 CO_2'ye ayarlanmış bir inkübasyon odası ile mikroskop kullanılarak görüntülenmelidir.

2. Görüntüleme

1. 1,4 NA ile 100x büyütme kullanan görüntü hücreleri.
2. Lazer gücünü, foto ağartmayı önlemek için güç, ~% 2 olacak şekilde ayarlayın. Tarama hızının yüksek olduğundan emin olun. 512 x 512 çözünürlükte görüntü yakalayın.
3. Z dilimi aralıklarını 0,25 μm'lik artışlarla ayarlayın. Bu protokolü takip etmek için, hücreleri 10 Z yığınından oluşacak şekilde görüntüleyin. Bir Z yığınının edinilmesi arasında herhangi bir aralık olmadan beş zaman çerçevesi elde edin.
   NOT: Optimize edildikten sonra, bu protokol tedavi grupları veya deney grupları arasında ayarlanmamalıdır, çünkü burada listelenen makrolar görüntüleme protokolünün tüm hücrelerde standartlaştırılmasını gerektirir.

3. Hesaplamalı değerlendirme

NOT: Sonraki tüm işlemler ImageJ v1.53t kullanılarak yapılmıştır. MEL eklentisi ve destekleyici modüller https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin'da bulunabilirken, kullanılan tüm makrolar https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections'da bulunabilir.

1. Görüntü hazırlığı
   1. Ham dosyayı ImageJ'de açın.
   2. Tek bir mikrograftan birden çok hücreyi kırpmak için, görüntüyü analiz edilecek tek hücre sayısına kadar çoğaltarak başlayın.
   3. Bir görüş alanında birden çok hücrenin bulunduğu bir ilgi alanı etrafında bir ilgi alanı çizmek için pencereleri senkronize etme aracını, serbest çizim aracını ve renk ayarını kullanın (Ek Şekil S1).
   4. Düzenle | Dışı temiz.
   5. Kırmızı ve mavi kanalları birbirinden ayırın ve mitokondriyal kanalı bir . Tiff dosyası.
2. Nokta yayılım fonksiyonu üretimi ve evrişim bozukluğu
   1. Bir nokta yayılma işlevi (PSF) oluşturmak için, gömülü mikrograf bilgilerini kullanarak PSF oluşturucu eklentisini kullanın. Eklentilere Git | Eklentiyi açmak için PSF Generator. Ek olarak, şuraya gidin: Görüntü | Bilgi göster... tıklayın veya görüntü bilgilerini açmak için I tuşuna basın ve en alta kaydırın. Voksel boyutunu ve derinliğini kullanarak, gösteri bilgi kutusundan Pixelsize XY'yi 166.1 nm ve Z-step'i 200 nm olarak değiştirin. Dalga Boyunu 568 nm, Boyut XYZ'yi 512 x 512 görüntü çözünürlüğüne ve 10 Z diliminden oluşan bir Z yığınına uyacak şekilde değiştirin (Ek Şekil S2).
   2. Eklentilere Git | Makrolar | Düzenle | Deconvolution_time_lapse_mine.ijm makroları.
   3. Giriş ve çıkış satırlarını düzenleyin ve çalıştır'a basın (Ek Şekil S3).
3. Görüntü kontrastı geliştirme ve bulanıklaştırma
   1. Eklentilere Git | Makrolar | Düzenle | Önişleme.ijm.
   2. Preprocessing.ijm makrolarında, yuvarlanan top yarıçapı 6'ya eşit olan bir arka plan çıkarma işlemi kullanın. Sigma Filter Plus'ı, yarıçap 1'e eşit, kullanılan pikseller 2'ye eşit ve minimum piksel fraksiyonu 0,2'ye eşit olacak şekilde ayarlayın ve eklenti aykırı değere duyarlı olacaktır. CLAHE ayarlarını, blok boyutu 64 olacak şekilde ayarlayın; histogram bölmelerini 256'ya, maksimum eğimi 2,5'e ve Gama'yı 0,8'e ayarlayın.
      NOT: Tüm bu ayarlar veri kümelerimize göre optimize edilmiştir ve değerler uygulanmadan önce alternatif veri kümeleri için optimize edilmelidir. Sigma filtreleme, görüntüyü yumuşatmak ve tutarlı yapılar sağlamak için yakındaki pikselleri etkili bir şekilde karıştırmak için uygulanır. Açık ve koyu pikseller arasındaki kontrastı artırmak için yerel kontrast uygulanır ve gamadaki bir değişiklikle birleştiğinde, arka plan piksellerini en aza indirirken mitokondriyal yapıların varlığını geliştirir.
   3. Giriş satırını, evrişim bozukluğu geçirmiş mikrografları içeren klasöre değiştirin (Ek Şekil S4).
   4. Çalıştır'a tıklayın.
4. Görüntü eşikleme
   NOT: Kullanıcılar seçtikleri herhangi bir eşik aracını kullanabilseler de, Qingzong Tseng'in (https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold) uyarlanabilir eşik eklentisini öneririz.
   1. ImageJ'de Preprocessing.ijm makroları tarafından değiştirilmiş bir ilgi dosyasını açın.
   2. Eklentilere Git | adaptiveThr.
   3. Kullanıcının tercihine göre yerel eşiği Ağırlıklı Ortalama ve piksel blok boyutu olarak ayarlayın.
      NOT: Piksel bloğu boyutu, hücreler arasında tutarlı tutulmalıdır, çünkü bu değer hacim veya en boy oranı gibi mitokondriyal boyutsal değerlendirmeleri etkiler.
   4. Zamanı optimize etmek için önizlemeye tıklayın ve blok boyutunu mümkün olduğunca çok sayıda mitokondri açıkça dahil edilecek şekilde ayarlayın. Ayrıca, gereksiz arka planı ortadan kaldırmak için her hücre için çıkarma değerini ayarlayın. Mikrograf dosyalarını, çıkarma değeriyle ilişkili klasörlere kaydedin (Ek Şekil S5).
      NOT: Threshold.ijm makroları, daha küçük parçacıkları ortadan kaldırmak için bir boyut filtresi içerir.
   5. Eklentileri Seçin | Makrolar | Düzenle | Eşik.ijm.
   6. input_path ve output_path satırlarının yanı sıra blockSize'ı düzenleyin ve makro komut dosyasındaki satırları çıkarın (Ek Şekil S6).
   7. Çalıştır'a tıklayın.
5. Mitokondriyal olay yerelleştirici (MEL) eklentisi ile fisyon ve füzyon olaylarının tespiti
   NOT: MEL, bir seferde tek bir Tiff olarak kaydedilen tek bir kanaldan oluşan hızlandırılmış bir z-yığını dizisini işlemek için tasarlanmıştır. Bu, giriş satırını ilgilenilen eşikli Tiff dosyasına değiştirerek yapılabilse de, ImageJ'deki birleştirme işlevini kullanarak birden çok Tiff dosyasını aynı anda işleme yöntemini de göstereceğiz.
   1. Aynı tedavi koşullarına ait 10 adede kadar eşikli mikrograf açın.
      NOT: Bunun çalışması için mikrografların aynı sayıda z dilimine sahip olması gerekir.
   2. Resme Git | Yığınlar |Araçlar | Birleştirin ve Tamam'a basın.
   3. Eşikleme tarafından geride kalan küçük puncta'yı kaldırmak için Eklentiler | İntegral Görüntü Dosyalayıcıları | Aykırı değerleri kaldırın. Gerekli parçaları kaldırmak üzere X ve Y boyutlarını ayarlamak için önizlemeyi kullanın.
   4. Birleştirilmiş dosyayı Tiff olarak kaydedin.
   5. Eklentilere Git | Makrolar | Düzenle | Quicktest_new.ijm ve giriş ve çıkış yollarını gerektiği gibi düzenleyin (Ek Şekil S7).
      NOT: Tamamlandığında, tüm MEL sonuçlarıyla birlikte çıktı klasöründe "MEL_results" adlı bir klasör bulunacaktır. Bunlar, her zaman noktasında tespit edilen fisyon ve füzyon olayları olarak gösterilir ve MEL'in çalışma şekli nedeniyle son zaman noktası her zaman kaldırılmalıdır¹⁸.

Uygun hücrelerin seçilmesi
Kullanıcılar, mitokondriyal ağın hücrenin mitotik durumuna bağlı olarak değiştiğinin farkında olmalıdır. Çekirdek dambıl veya U şeklinde görünüyorsa veya çekirdeğin yakınında floresan sinyali eksikliği olan bir boşluk varsa, bu hücrenin mitoza yaklaştığını gösterebilir. Bu durumda, mitokondri muhtemelen hücre bölünmesi nedeniyle fisyona uğramaktadır ve tedavi müdahalesi ve ağ üzerindeki etkisi nedeniyle değil (Ek Şekil S8).

Metformin, mitokondriyal füzyonu indüklediği gösterilen antidiyabetik bir ilaçtır22. GT1-7 fare hipotalamik hücreleri, mitokondriyal bozulmayı inhibe etmek için 4 saat boyunca 400 nM bafilomisin (Baf), mitokondriyal depolarizasyona neden olmak için 6 saat boyunca 10 μM CCCP ve DMEM'de TMRE ve Hoechst içeren bir kokteylde inkübe edilmeden önce 72 saat boyunca 5 mM metformin hidroklorür (Metf) ile muamele edildi. Ham görüntüler, 405 nm ve 561 nm lazerler kullanılarak beş zaman diliminde yakalanan 0,25 μm z adım genişliğine sahip 10 mikrograftan oluşuyordu. Her zaman noktasının yakalanması 30 saniye sürdü ve bir z-yığınının alınmasını takiben zaman noktaları arasında herhangi bir aralık kullanılmadı. Gösterilen veriler, tedavi grubu başına toplam n olmak üzere dört deneyin ortalama ± standart sapmasının bir temsilidir.

Şekil 1, işleme boru hattının, ham görüntüden başlayarak ve daha sonra MEL tarafından analiz edilen eşikli görüntüye kadar uzanan temsili mikrograflar üzerindeki etkilerini göstermektedir. Dekonvolüsyon, mitokondriyal çözünürlük kalitesini artırırken ışık saçılımını düzeltir. Ön işleme işlem hattı, arka plan çıkarma, bulanıklaştırma ve kontrastı standart bir şekilde artırma işlemlerinden sorumludur. Kontrast arttırıldıktan sonra, yapılar eşiklenir ve MEL tarafından analize ve kullanıcının gerçekleştirmeyi seçebileceği diğer morfolojik değerlendirmelere hazırlık için küçük parçacıklar çıkarılır.

Şekil 1: Görüntü analizi hazırlama hattı. (A) Ham mikrografların kanalları ayrıldı ve (B) çerçeve başına tek hücreler seçildi. (C) Bu hücreler daha sonra (D) arka plan çıkarılmasına tabi tutulmadan önce dekonvolvasyon yapıldı ve kontrast arttırıldı. (E) Son olarak, mikrograflar, fisyon ve füzyon olayı tespiti için MEL eklentisi tarafından analiz edilmeden önce (F) eşiklemeye tabi tutulmuştur. Ölçek çubukları = 10 μm (ana mikrograflar), 2 μm (büyütülmüş bölümler). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2, fisyon ve füzyon aktivitesinin nasıl sınırlandırıldığını ve görselleştirildiğini, daha önce açıklandığı gibi zaman içinde ve 3 boyutlu olarak nasıl gerçekleştiğini göstermektedir18. Fisyon olayları kırmızı puncta ile işaretlenirken, füzyon olayları zaman içindeki dinamik aktiviteyi görsel olarak lokalize etmek için yeşil puncta ile işaretlenir. MEL, z-yığılmış mikrograf boyunca kareden kareye bir şekilde algılar, böylece fisyon ve füzyon aktivitesini 3D olarak gözlemler.

Şekil 2: Fisyon ve füzyon olaylarını 3 boyutlu ve zaman içinde tespit etme. Temsili görüntüler, mitokondriyal ağdaki değişiklikleri art arda üç zaman dilimi boyunca gösterir ve temsili bir ilgi alanı 2B ve 3B olarak gösterilir. Yeşil punkta füzyon olaylarını görselleştirirken, kırmızı puncta fisyon olaylarını görselleştirir. Ölçek çubukları = 10 μm (ana mikrograflar), 2 μm (büyütülmüş bölümler). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Mitokondriyal ağ morfolojisini tanımlamak için birçok teknik yayınlanmış olsa da, çok azı fisyon ve füzyon aktivitesini içerir. Fisyon ve füzyon okumalarının eklenmesi, beş zaman dilimindeki kısa görüntüleme süremiz göz önüne alındığında birbirinden önemli ölçüde farklı olmasa da, CCCP ve Baf ile birlikte tedavi edilen metformin ilavesini takiben olay sayısında önemli bir değişiklik göstermek için yeterliydi (Şekil 3D). Mitokondriyal ağın fisyon ve füzyon aktivitelerindeki artış, ağın dinamik olduğunu ve büyük miktarda yeniden şekillenme geçirdiğini gösterir; Bununla birlikte, fisyon ve füzyon tek başına mitokondriyal ağı tanımlamanız gerekmez. Mitokondriyal sayı ve hacim, ağın yaygın olarak kullanılan morfolojik tanımlayıcılarıdır.

Burada, CCCP ve Baf varlığında Metf'in mitokondriyal sayısında bir artışa ve hacimde bir azalmaya neden olduğunu, fisyon geçirmiş bir mitokondriyal ağ ile tutarlı özelliklere sahip olduğunu gösterdik (Şekil 3C). Önceki bir yayında, fisyon ve füzyonun yanı sıra yapı sayısı vehacim 23 bağlamında mitokondriyal ağı anlamanın faydalarını gösterdik. Burada, toplam mitokondriyal yapı sayısı ile ilgili oldukları için dinamik aktivitenin kapsamını anlamanın önemini de gösteriyoruz (Şekil 3E). Bu şekilde, mitokondri sayısına göre, metforminin, Baf ve CCCP ile birlikte tedavi edilen metforminden daha yüksek derecede dinamik aktiviteye neden olduğunu tespit edebildik (Şekil 3G), mitokondri sayıları kontrole kıyasla değişmese de, metformin tedavisini takiben (Şekil 3D) ağın yeniden şekillenme aktivitesinde önemli bir artış olduğunu göstermektedir (Şekil 3G).

Şekil 3: Mitokondriyal ağın dinamik ve morfolojik değişimleri. MEL eklentisi tarafından işlendikten sonra (A) kontrol, (B) Metformin ile muamele edilen ve (C) Metformin, CCCP ve Baf ile birlikte muamele edilen hücrelerin temsili maksimum yoğunluk projeksiyonları. (D) Fisyon (mavi çubuk) ve füzyon olayları (turuncu çubuk) zaman içinde tespit edildi ve tedavi grubu başına ortalaması alındı. Daha sonra, (E) mitokondriyal yapı sayısını ve (F) mitokondriyal hacmi tespit etmek için ikincil bir morfoloji aracı kullanıldı. (G) Son olarak, fisyon ve füzyon olaylarının sayısı, her tedaviyi takiben ağın göreceli dinamik aktivitesini anlamak için mevcut olan toplam mitokondri sayısı ile ilişkilendirildi. Gösterilen sonuçlar, her hücrenin art arda beş zaman diliminde değerlendirildiği 12 hücrenin ortalamasını temsil eder. Analiz edilen toplam hücre sayısı n = 12 idi. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak gösterilir. İstatistiksel analiz tek yönlü varyans analizi kullanılarak yapıldı ve ardından Fisher-LSD testi yapıldı. Ölçek çubukları = 10 μm. * < 0,05'lik bir p değerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Metformin, CCCP ve Baf (Metf + CCCP + Baf) ile birlikte muamele edilen GT1-7 hücreleri, kontrol ve metformin (Metf) ile tedavi edilen hücrelere kıyasla hem fisyon hem de füzyonda önemli bir artış gösterdi (Şekil 3D). Mitokondriyal yapı sayımı ve hacim değerlendirmesi yaygın olarak kullanıldığından, fisyon ve füzyon aktivitesinin hücrelerdeki toplam mitokondri sayısı ile nasıl ilişkili olduğunu da gösterdik, böylece Metf + CCCP + Baf tedavisini takiben fisyon ve füzyon olaylarının sayısının yüksek olmasına rağmen, bunun en aktif mitokondriyal ağ olmadığını gösterdik. Bu sayede mitokondriyal ağın aktivite seviyesini belirleyebiliyoruz.

Ek Şekil S1: Tek hücrelerin seçilmesi. Serbest el aracını kullanarak, kenarlıklarını bulmak için maksimum kontrastı artırarak ilgilenilen hücrenin etrafına bir şekil çizin. Şekil çizildikten sonra, ilgilenilen pencereyi seçin ve bu hücreyi ayırmak için Dışını Temizle'yi tıklatın. İkinci pencerede, hücre 1'i kaldırmak için Temizle'yi seçin ve mitokondri dahil etme olasılığını ortadan kaldırın. Prosedürü hücre 2 ile tekrarlayın. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: Bir nokta yayılma fonksiyonu oluşturma. Solda, bir PSF oluşturmak için ilgili veriler gösterilmiştir (sağda görülür). Kısaltma: PSF = nokta yayılma fonksiyonu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S3: Evrişim makroları. PSF'ler "psf_file" içine girilir. "input_file", evrişimden önce görüntülerin depolandığı klasör yolunu yansıtmalıdır. "output_path", dekonvolvasyondan sonra görüntüler için istenen hedefi yansıtır. Yineleme sayısı 55. satırda değiştirilebilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S4: Makroları ön işleme. "deconv-path", tüm deconvolved görüntüleri içeren klasör konumunu belirtirken, "output_path", makrolardan geçen görüntülerin kaydedildiği klasör konumunu belirtir. ... Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S5: Uyarlanabilir eşikleme. Hesaplama aracı olarak "ağırlıklı ortalamayı" kullanarak, piksel blok boyutumuzu 150 olarak ayarladık ve paraziti ortadan kaldırırken mümkün olduğunca çok yapıyı dahil etmek için doğru çıkarma değerini seçtik. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S6: Makroları eşikleme. "input_path", önceden işlenmiş tüm görüntüleri içeren klasör konumunu belirtirken, "output_path", makrolardan geçen görüntülerin kaydedildiği klasör konumunu belirtir. Blok boyutu, uyarlanabilir eşik değerine göre 12. satırda değiştirilir ve çıkarma değeri makrolarda pozitif bir değer olarak gösterilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S7: Mitokondriyal olay yerelleştirici makroları. " inputPathToTimeLapse", işlenecek eşikli bir görüntü içeren tek bir dosya konumunu belirtirken, "outputPath", makrolardan kaynaklanan görüntülerin ve veri dosyalarının kaydedildiği klasör konumunu belirtir. Kısaltma: MEL = mitokondriyal olay yerelleştirici. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S8: Mitoz bölünmeyi tanıma. Sarı ok, mitokondrinin mitoz bölünmeden önce uzaklaştığı bir bölgeyi gösterir. Bu hücreler, MEL değerlendirmesinin bir parçası olarak dahil edilmemelidir, çünkü muhtemelen artan dinamik olaylar meydana gelmektedir. Kısaltma: MEL = mitokondriyal olay yerelleştirici. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.