Method Article

Mitokondriyal Morfolojideki Değişikliklerin Dinamik ve Üç Boyutlu Floresan Mikrografları ile Anlaşılması

DOI:

10.3791/68478

⸱

August 15th, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Stellenbosch University, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, Stellenbosch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, zaman içinde mitokondriyal fisyon ve füzyon aktivitesindeki 3 boyutlu değişikliklerin nicelleştirilmesinde yararlı olan bir ImageJ eklentisi olan mitokondriyal olay yerelleştiricisini (MEL) açıklıyoruz. Ayrıca, ImageJ'de analizden önce mikrografların temizlenmesi için yararlı olan bir görüntü işleme hattını da açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri, herhangi bir hayvanın hayatta kalması için hayati önem taşıyan, konakçının ihtiyaçlarına veya streslerine yanıt olarak düzenli fisyon ve füzyon olaylarına maruz kalan ve mitokondriyal ağın sürekli olarak yeniden şekillenmesine yol açan oldukça dinamik organellerdir. Bu nedenle, mitokondriyal ağı üç boyutta ve zaman içinde değerlendirebilmek, sistemin stres veya farmasötik müdahale gibi faktörlere nasıl tepki verdiğini anlamada bir fayda sağlar. Hücrelerin mitokondriyal ağlarının floresan görüntülemesi, bu değişiklikleri görselleştirme ve izleme yeteneğini sağlar. Bununla birlikte, mitokondriyal ağ genellikle standartlaştırılmamış metriklerle tanımlanan iki boyutlu ve statik bir yapı olarak tanımlanır. Bu nedenle, kullanıcının görüntülerini mitokondriyal ağdaki fisyon ve füzyon olaylarını zaman içinde ve 3 boyutlu bir şekilde algılayan bir ImageJ eklenti aracı olan mitokondriyal olay yerelleştiricisi (MEL) için hazırlamasını sağlayan bir boru hattını tanımlamak için yola çıktık, böylece bu ağın geçirdiği dinamik değişiklikler hakkında fikir veriyor. Ek olarak, mitokondriyal sayımdaki değişiklikler ve morfolojik değişiklikler ışığında fisyon ve füzyonu anlamanın faydalarını açıklıyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri, tüm ökaryotik hücrelerde bulunan, onlara enerji sağlayan ve metabolizmalarını düzenleyen oldukça dinamik organellerdir. Bu nedenle, mitokondri hücresel ölüm ve hayatta kalmanın kavşağındadır. Mitokondrinin, lizozomal asitleşme ve moleküler motor etkiden kas kasılması ve sinaps ateşlemesine kadar çeşitli süreçler için gerekli olduğu gösterilmiştir 1,2.

Mitokondri, hücrenin metabolik talebine ve stresine yanıt olarak ATP'yi verimli bir şekilde üreten bir mitokondriyal ağı sürdürmek için düzenli fisyon ve füzyon olaylarına maruz kalır. Gerç....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre tedavisi ve mikroskopi edinimi

  1. Kültür GT1-7 hücreleri, DMEM'de 8 odacıklı tabaklarda %10 FBS ve %1 Penstrep (tam ortam) ile desteklenmiştir. Hücrelerin gece boyunca bağlanmasına izin verin ve daha sonra 72 saat boyunca% 10 FBS ile DMEM'de yapılan 2.5 mM metformin hidroklorür ile muamele edin, ortamı her 24 saatte bir değiştirdiğinizden emin olun. Görüntülemeden 6 saat önce hücreleri 10 μM CCCP ve görüntülemeden 4 saat önce 400 nM Bafilomisin A1 (Baf) ile birlikte tedavi edin.
    NOT: Bu, tercih edilen herhangi bir ökaryotik hücre hattı ile yapılabilir.
  2. Görüntülemeden önce, 5 nM Hoechst v....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uygun hücrelerin seçilmesi
Kullanıcılar, mitokondriyal ağın hücrenin mitotik durumuna bağlı olarak değiştiğinin farkında olmalıdır. Çekirdek dambıl veya U şeklinde görünüyorsa veya çekirdeğin yakınında floresan sinyali eksikliği olan bir boşluk varsa, bu hücrenin mitoza yaklaştığını gösterebilir. Bu durumda, mitokondri muhtemelen hücre bölünmesi nedeniyle fisyona uğramaktadır ve tedavi müdahalesi ve ağ üzerindeki etkisi nedeniyle değil (Ek Şekil S8).

Metfor.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal morfolojiyi tanımlamak için giderek artan sayıda yaklaşım mevcut olmasına rağmen, mitokondriyal dinamikleri nicel bir şekilde yeterince yakalamak için sınırlı teknikler mevcuttur. Ek olarak, mitokondriyal ağ morfolojisinin ve bu morfolojiyi yöneten mekanizmaların doğası gereği çeşitli olduğuna dikkat edilmelidir. Bu, gelişmiş enerji çıkışı için dallı bir oluşumdan, mitofajiyi kolaylaştırmak için zamansal olarak farklı fisyon bölgelerine kadar hücrenin ihtiyaçlarına bağlı ağ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Güney Afrika'daki Stellenbosch Üniversitesi, Güney Afrika Tıbbi Araştırma Konseyi (SAMRC) ve Güney Afrika Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) ile Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) ve Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) tarafından finanse edildi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
8 oda tabağıTermo Fisher#Z734853
Ayarlanmış eşiklemehttps://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
Bafilomisin A1LKT laboratuvarları#B0026
Karbonil siyanür klorofenilhidrazon (CCCP)Merck#C2759
Konfokal mikroskopCarl Zeiss AGLSM780 ELYRA PS.1 süper çözünürlüklü platform
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Termo Fisher#341956062
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma-Aldrich#F0679
Github bağlantısıhttps://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
GraphPad Prizma v7.06
GT1-7 hücreleriATCCSCC116 Serisi
HoecshtSigma-AldrichH6024 (İngilizce)
ImageJ v1.53tFiji
Makrohttps://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
MetforminAvrupa FarmakopesiM06050000
Penisilin/streptomisin (PenStrep)Sigma-Aldrich#P4333
T25'lerBiyo-Akıllı Bilimsel#70025
TMRETermo Fisher#T669
TripsinSigma-Aldrich#T4049

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  2. Bhabha, G., Johnson, G. T., Schroeder, C. M., Vale, R. D. How dynein moves along microtubules. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial MorphologyMitochondrial DynamicsFluorescence MicrographsMitochondrial FissionMitochondrial FusionThree Dimensional ImagingImageJ AnalysisMitochondrial NetworkDeconvolution MicroscopyMitochondrial Event Localizer

Related Articles