Bu protokol, protein sentezinin doğal ürün/küçük molekül inhibitörlerini belirlemek için optimize edilmiş bir florometrik tarama metodolojisi tanıtmaktadır. Pratikliği, hem ilaç keşif teknikleri lisans eğitimi için hem de tıbbi kimya kampanyalarında uygulanması için uygun hale getirir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Doğal Kaynaklardan Protein Sentezi İnhibitörlerinin Ön Taraması için Flüoresans Tabanlı Protokol
Bu makalede
Özet
Özet
Doğal ürünler, özellikle kanser olmak üzere birçok hastalıkta uygulanan zengin bir terapötik bileşik kaynağıdır. Bu biyomolekülleri ilaç keşfinde yapısal şablon olarak kullanarak, araştırmacılar hem daha hızlı geliştirme zaman çizelgeleri hem de tam sentetik bileşiklere kıyasla daha iyi biyolojik etkinlik sağlamışlardır. Protein sentezi yolu, özellikle tedavisi zor kanserlerde rol oynadığı göz önüne alındığında, doğal ürünler için cazip bir hedef haline gelmiştir. Streptomyces griseus'tan türetilen güçlü protein sentezi inhibitörü cycloheximid, bu alandaki doğal bileşiklerin potansiyelini örneklemektedir. Bu doğal ürün türevleri ilaç benzeri moleküllere dönüştürülürken, protein sentezi inhibitör aktivitelerinin doğrulanması kritik bir doğrulama adımı olmaya devam ediyor. Ana amaç, bileşik inhibisyon aktivitesinin hızlı değerlendirilmesi için lisans düzeyine uygun bir protokol sağlamaktır. Protokol, bu doğal ürünlerin inhibitör yeteneklerini sistematik olarak tespit etmek ve ölçmek için floresan bir alt ve gelişmiş floresan mikroskopi teknikleri kullanır. Çalışma, Pinus sylvestris ve Psoralea corylifolia olmak üzere iki bitki türünden türetilen bileşikleri inceledi. Referans inhibitörü olarak sikloheksimidi kullanarak, her iki doğal ürün de protein sentezi inhibisyonunda farklı seviyelerde bulundu.
Giriş
Protein sentezi, transkripsiyon ve çeviri gibi yüksek derecede düzenlenmiş süreçleri içerir. Transkripsiyon sırasında, genlerin DNA dizileri kopyalanır ve haberci RNA (mRNA) üretilir. RNA polimeraz enzimi, DNA çift sarmalını ayırmak için çalışır ve bir ipliği rehber olarak kullanarak uyumlu bir mRNA molekülü oluşturur. mRNA tam olarak oluştuktan sonra, çekirdeğinden sitoplazmaya doğru translasyon için ilerler. Çeviri ribozomda gerçekleşir; burada mRNA, amino asitleri polipeptid zincirine monte etmek için şablon olarak kullanılır. Bu polipeptid zinciri, ribozomun çıkış tünelinden ayrıldıktan sonra fonksiyonel bir proteine katlanır. Tra....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Setten reaktif hazırlamak
NOT: Yeterince karıştırın, spin yapın ve tüm reaktifleri kullanıma kadar buzda tutun.
- Protein sentezi inhibisyon kiti, PBS tamponu, hücre kültürü ortamı, hücre kültürü ile işlenmiş plakalar, 15 mL konik steril polipropilen santrifüj tüpleri, 2 mL santrifüj tüpleri, p10, p20, p200 ve p1000 pipetleri ve uygun uçları organize edin ve elde edinin.
- Yıkama tamponu hazırlayın.
- 10x yıkama tamponunu 37 °C'de şişeni elde fincanla çözerek çöz. Ellerdeki vücut ısısını kullanarak eritme için ve sık sık çözülmenin tamamlanıp tamamlanmadığını kontrol edin. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu test, farklı doğal ürünlerin protein sentezini engelleme yeteneğini görselleştirmek ve nicelik göstermek için floresans kullandı. Cycloheximid (CHX), etki şekli uzamak11 sırasında translokasyon sürecine müdahale etmeyi içeren bilinen bir protein sentezi inhibitörüdür. Bu çalışmada, canlı hücreler yeşil, floresan bir nükleer boyayla tespit edildi. OPP, puromisin'in bir türevidir ve yeni başlayanproteinlere kovalent olarak bağlanır. 12. MD.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, doğal ürünlerin ve küçük moleküllerin protein sentezini inhibe etme yeteneklerini değerlendirmek için florometrik tarama metodolojisi sağlar. Bu protokolün basitliği, lisans öğrencilerinin bunu doğru şekilde uygulamasını sağlar ve bilimsel bilgiye önemli katkılar yapmalarını sağlar. Protokol, biyolojik yöntemler ve tekniklerin temel bir anlaşılmasını gerektirir ve doğru ve güvenilir sonuçlar için dikkatli adımlar uygulanmasını gerektirir.
Örneğin,.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu araştırma, NIGMS R15GM148983 numaralı hibe birimi, Louisiana Yönetim Kurulu LEQSF(2021-25)-RD-A-05 ve ABD Ulusal Bilim Vakfı'nın bir kısmı tarafından OIA-1946231 numaralı f.r.'ye kadar desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agilent Biotek Cytation 1 Hücre Görüntüleme Çok Modlu Okuyucu | Agilent | BTCYT1V | |
| Bileşik 1 (Dehidroabietilamin, CAS 1446-61-3) | Enamin | EN300-7409771 | |
| Bileşik 2 (Bakuchiol, CAS 10309-37-2) | ChemFaces | CFN99047 | |
| Heraeus Megafuge 16R | Termo Bilimci | 75004271 | |
| Ibidi Gmbh-slide 96-kuyu plakası | İbidi | 80826 | |
| MDA-MB-231 Hücre Hatları | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| Fosfatla tamponlu tuzlu pH 7.4 | ATCC | ATCC 30-2200 | |
| Protein Sentezi Test Kiti (Yeşil) | Abcam | Ab239725 |
Kaynaklar
- Merrick, W. C. Mechanism and regulation of eukaryotic protein synthesis. Microbiol Rev. 56, 291-315 (1992).
- Ng, L., Navarro, A., Law, W. -L. Editorial: evolving roles of piRNAs in solid tumors. Front Oncol. 13, 1178634(2023).
- Brown, J. M., Giaccia, A. J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
