Yöntem makalesi

Tandem Testinde Sıralı Protein İmmünofloresan ile RNA Yerinde Hibridizasyon

914 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68615

⸱

10 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, hedeflenen hücresel düzeyde uzamsal multipl omikleri karakterize etmek için otomatik bir platformda dokuda sıralı protein immünofloresan ile RNA in situ hibridizasyonunu detaylandırır.

Özet

Bir konak içindeki hücrelerin işlevselliği, izole edilmiş sinyallere bağlı değildir. Bunun yerine, en küçük RNA moleküllerinden en büyük proteinlere kadar tüm bileşenlerin insan vücudunda uyum ve koordinasyon içinde çalışması gerekir. Bu nedenle, hücresel düzeyde uzamsal araştırmaları çoklu omiklere entegre eden yaklaşımların önemi, hücre-hücre etkileşimlerini ve hastalığın ilerlemesini anlamak için çok önemlidir. Proteom ve transkriptomu aynı uzamsal tahlilde incelemek, yalnızca bir hücreye ne yapması talimatı verildiğini (RNA) değil, aynı zamanda kendisini içinde bulduğu mikroçevresel niş bağlamında bu talimatları nasıl yürüttüğünü anlamamıza yardımcı olur. Bu makale, sıralı immünofloresansı (SeqIF) RNA in situ hibridizasyonu (ISH) ile uzamsal bir bağlamda (seqRNA-ISH+seqIF) yüksek verimli protein ve RNA araştırması için doku üzerinde mikroakışkan güdümlü bir sistemle entegre etmeye odaklanmıştır. sıralı çalıştırmalar. Bu yöntem, florofor uyumluluğunun dikkate alınmasını ve daha yüksek pleksleme için kapsamlı optimizasyonu gerektirmeyen sıralı hedefli bir multiomik platform sağlar. Bu, hücrenin hangi mesajları hazırladığını veya mikro ortamına gönderdiğini anlamayı sağlar. Bu hedefe yönelik yaklaşım, RNA ve proteinler arasındaki etkileşimleri daha kesin bir şekilde incelerken tüm transkriptom yöntemlerinin doğrulanmasına yardımcı olur.

Giriş

İnsan vücudundaki hücrelerin karmaşık işleyişi, küçük RNA moleküllerinden büyük proteinlere kadar hepsi koordineli olarak çalışan karmaşık bir sinyal etkileşimine dayanır1. Bu etkileşim, çeşitli omik katmanlar 2,3 boyunca hücresel düzeyde uzamsal etkileşimleri inceleyen bütünleştirici yaklaşımların önemini vurgulamaktadır. Bu tür metodolojiler, hücre-hücre etkileşimlerinin karmaşıklığını ve hastalığın ilerlemesini anlamak için gereklidir. Akış sitometrisi4 ve tek hücreli dizileme5 gibi birçok geleneksel yöntem, hücre izolatları, belirli bir numunede bulunan fenotiplerin toplu oranlarını belirlemek için ayrıştırılmış numuneleri araştırmak için kullanılır. Bununla birlikte, hücrelerin analiz için izole edilmesi, doğal biyolojilerini ve yerinde işlevlerini doğru bir şekilde yansıtmayabilecek aktivasyon veya fenotipik değişiklikleri indükleyebilir 6. Uzamsal biyolojideki gelişmiş yöntemler, doku mimarisi bağlamından ve çoklu moleküler tiplerde komşu hücrelerle uzamsal ilişkilerden ödün vermeden hücreleri ve mikro çevrelerini incelemek için yeni stratejiler sunar 2,7.

Transkriptom ve proteom analizlerini, tek tek hücreleri izole etmeden aynı uzamsal tahlil içinde entegre etmek, hücresel fonksiyonun kapsamlı bir görünümünü sunar8. Bu yöntem, tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemlerine dayanır, ancak sıralı protein sorgulamalarını karmaşıklaştıran proteinaz sindirimlerini içermez8. Tek bir kesitte kullanılacak yaklaşımın esnekliği, kesitleri entegre etmek ve hizalamak için uzamsal daha yüksek çözünürlük ve daha az görüntü işleme sağlar. Bu yaklaşım, hem bir hücre (RNA) tarafından alınan talimatlar hem de bunların spesifik mikroçevresel niş içinde yürütülmesi (protein) hakkında bilgi sağlar. Araştırmacılar bu bilgi katmanlarını birleştirerek hücresel davranış ve iletişim hakkında daha derin içgörüler elde edebilirler.

Manuel yöntemler mevcut olsa da, uzamsal omik teknolojilerindeki son gelişmeler, manuel çoğullama9 kullanılarak incelenen daha fazla sayıda proteomik belirteç ile daha karmaşık analizlere olanak sağlamıştır. Bu yaklaşımlar, hem protein hem de RNA-ISH tahlillerinde 10,11,12,13,14 ve sisteme özgü konjuge antikorlar 15,16,17, görüntüleme kütle sitometrisi (IMC) 18,19,20 gerektiren otomatik metodolojilerdeki ilerlemeyi içermektedir ve kullanıma hazır birincil ve ikincil antiboedileri kullanan diğer otomatik floresan sıralı proteomik metodolojiler 2,21,22. Bu teknolojiler, hedeflenen yaklaşımlar kullanarak proteomik veya kombine transkriptomik ve proteomikleri kolaylaştırmıştır ve genellikle bunları hem problar aracılığıyla RNA'yı hem de benzer konjugatlara dayalı antikorlar aracılığıyla proteinleri görselleştirerek, eşzamanlı veya sıralı RNA ve proteinin aynı metodoloji veya araçlar kullanılarak birlikte tespit edilmesine izin verir. Bu tür yaklaşımlar, hücresel aktivitenin kapsamlı bir görünümünü sağlayarak, hücreler ve mikro çevreleri arasındaki hücresel iletişim anlayışımızı geliştirmeyi amaçlamaktadır. Hücresel etkileşimin karmaşıklığını çözmek için değerli bir araç sunar ve potansiyel olarak normal fizyolojik süreçler ve hastalık mekanizmaları hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarır.

Bu protokol, RNA in situ hibridizasyonunun (ISH) sıralı immünofloresan (SeqIF) ile doku üzerinde mikroakışkan güdümlü bir sistemle entegre edilmesi için rehberlik sağlar. Bu, RNA ve proteinin kendi doğal uzamsal bağlamları içinde araştırılması için yüksek verimli bir araç sağlar. Tek bir çalışmada 12 adede kadar RNA ve 24 protein hedefine izin verecek olan bu yöntem (seqRNA-ISH+seqIF), sıralı çalışmalarla ek protein hedeflerinin eklenmesi mümkündür . Bu protokol belirli bir mikroakışkan sisteme odaklanırken, doku işleme, RNA kalite güvencesi ve sağlanan antikor seçimi ve titrasyon kılavuzları diğer metodolojilere uyarlanabilir. Bununla birlikte, bu yöntem, verimli, proteaz içermeyen epitop alımı için pH 9.0 antijen alımını kullanır ve RNA probu erişilebilirliğini artırmak için proteaz ile pH 6.0'da geleneksel RNA-ISH'nin aksine, bazı hedefli transkriptomikler sağlarken proteomik stabiliteyi geliştirir, ancak proteom8'i koruyamaz. seqRNA-ISH+seqIF yöntemi, Şekil 1'de görsel olarak özetlenmiştir ve RNA FISH amplifikasyonunu ve ardından birincillerin ve ikincillerin nazik bir kimyasal olarak çıkarılmasını kullanan bir birincil-ikincil antikor eşleştirme yöntemini kullanmadan önce bölünmeyi gösterir. SeqIF ve tespitin sıralı doğası, sıralı metodolojileri kullanarak florofor uyumluluğu ile ilgili sınırlamaların çoğunun üstesinden gelir23. Bu, spektral örtüşme23 için telafi gerektiren yüksek pleksi metodolojilerinde eşzamanli boyamada ihtiyaç duyulan kapsamlı optimizasyon ihtiyacını azaltır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, primer sitoredüktif cerrahi geçiren, daha önce tedavi görmemiş yüksek dereceli seröz yumurtalık karsinomu hastalarından toplanan formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) doku kesitlerini kullanır. Tüm klinik veriler, Texas Üniversitesi MD Anderson'ın Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan protokoller kapsamında Jinekolojik Onkoloji ve Üreme Tıbbı Anabilim Dalı'nın yumurtalık kanseri deposundan elde edildi. Hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam ön büro personeli tarafından alındı ve çalışmalar kabul görmüş etik kurallara uygun olarak yürütüldü.

NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm reaktifler nükleaz içermeyen deiyonize su içinde seyreltilir.

1. Örnekleri düzeltin ve gömün

NOT: Fiksatif ve fiksasyon süresi seçimi, tahlillerin performansını güçlü bir şekilde etkiler ve genel olarak uzamsal tahliller, patolojik mimariyi koruduğu için çoğunlukla FFPE ile yapılır. Bu protokol, FFPE dokusunun kullanımını özetlemektedir, bu nedenle FFPE doku örnekleri için aşağıdaki protokol önerilmektedir. Bununla birlikte, RNA kalitesi, protein epitopları gibi fiksasyon süreçlerinden etkilenir, ancak daha az ölçüde. Bu fiksasyon yöntemleri, eksik fiksasyon ve numune bozulması, antikor bazlı proteomiklerde spesifik olmayan bağlanmayı artırabilir. Üçüncüsü, yapısal floresan tipik olarak FFPE işleme sırasında söndürülür, ancak bazı floroforlar orta derecede varlığını sürdürür ve söndürüldüklerinden emin olmak için test yapılması gerekir.

  1. Düzgün fiksasyon sağlamak ve yağ kaynaklı difüzyon bariyerlerini önlemek için dokuyu ≤ 5 mm kalınlığa kadar kesitleyin. RNA ve protein 24'ü optimize etmek için bölümleri hemen 4 °C'de 24 saat boyunca %10 fosfat tamponlu formalin (pH7.0) içinde sabitleyin.
  2. Sabit dokuları bir doku işlemcisinde işleyin veya aşağıdaki adımları kullanarak manuel olarak işleyin
    1. Doku kesitlerini moleküler dereceli etanol içinde nükleaz içermeyen suda (%70, %75, %95 2x, %100 3x) her biri 1 saat boyunca dehidre edin.
    2. Ardından, dokuyu oda sıcaklığında (~23 °C) her biri 1 saat boyunca 2 kez ksilene batırın.
  3. Parafin mumunu 60 °C'ye ısıtın. Kağıt mendil kutusunu her biri 1 saat boyunca 2 kez parafin mumuna batırın.
  4. Şişirilmiş dokuyu kalıba yerleştirin ve dokuları yönlendirin, taze parafin mumu ile doldurun ve hızla 4 °C'ye soğutun25.
    NOT: RNA için en iyi sonuçlar, tüm adımların 48 saat içinde tamamlanmasıyla elde edilecektir.

2. RNA kalite değerlendirmesi

  1. Engellemenin yeterli olduğundan emin olmak için üç slaytı paralel olarak çalıştıran veya hedeflenen panelden önce kontrol slaytlarını çalıştıran üç seri bölüm kullanın. Eşleştirilmiş pozitif kontrol probları, azim farklılıklarından etkilenebilecek doku kalitesini ve doku boyunca uzamsal bütünlüğü değerlendirmek için temizlik genlerini hedefler. Yaygın olarak kullanılan kontroller arasında UBC (yüksek eksprese eden bir gen), PPIB (orta ekspresyon) ve POLR2A (düşük ekspresyon)26 bulunur. Her algılama kanalında Dab1 (bir toprak bakteri RNA'sı) gibi negatif kontrol prob setlerini kullanın. İsteğe bağlı olarak, tüm pozitif ve negatif kontrol problarını hedef probların yanına aynı numuneye dahil edin. Bu kurulumda, Dab1 negatif kontrollerini T2-T4 kanallarına yerleştirin, pozitif kontrolleri en düşükten en yükseğe ifadeyi T1, T5 ve T9'a atayın ve hedef probların kalan kanalları işgal ettiğinden emin olun.
    İSTEĞE BAĞLI: Ek olarak, RNA kalitesi bilinmeyen numuneler için bir Dağılım Değeri 200 (DV200 skoru) belirlemek faydalı olabilir. DV200 puanlarının 30'un üzerinde olması şiddetle tavsiye edilirken, 50 veya daha yüksek kaliteli örnekler tercih edilir27. Bu puan, RNA kalitesinin bir göstergesidir ve daha yüksek numune kalitesi, RNA-ISH'nin etkili bir şekilde çalışma olasılığını artırır27.

3. RNA önlemleri ve preparatları

NOT: RNaz alanını dekontamine etmek ve silmek ve ardından RNaz içermeyen bir alan kullanmaya ek olarak işlemeden önce çalışma alanına %70 etanol püskürtmek en iyi uygulamadır, her zaman temiz eldiven, laboratuvar önlüğü ve RNazların ciltten veya nefesten girişini en aza indirmek için maske giyin. Yalnızca RNaz içermeyen su ve sarf malzemeleri kullanın ve malzeme torbalarına ulaşmaktan kaçının. Bu önlemlerin yanı sıra doku/slaytları serin ve kuru tutmak, deneyler sırasında RNA bütünlüğünü korumak için gereklidir.

  1. Kesitleri bir mikrotom ile pozitif yüklü cam slaytlar üzerine kesin ve ilgilenilen bölgeyi, görüntüleme alanıyla koordineli olan slaydın ortasına yerleştirin (sisteme göre değişir; burada yaklaşık 12,5 mm x 12,5 mm'dir).
    NOT: FFPE dokular için her bölüm için ideal kalınlığın 4-6 μm arasında olduğunu unutmayın.
  2. FFPE Slaytlarını kuru RNAse içermeyen bir fırında, doku yukarı bakacak şekilde, 60 °C'de en az 1 saat ve aksi takdirde ayrılmaya eğilimli olan yağ dokuları veya dokular için gece boyunca pişirin.
  3. OPSİYONEL ön işlem
    NOT: Ön işlem isteğe bağlı olmakla birlikte, aşağıda belirtildiği gibi bazı adımlar ek olarak isteğe bağlıdır.
    1. %3 hidrojen peroksit hazırlayın: 50 mL'lik konik bir tüpte, 45 mL 1x PBS'ye 5 mL %30 hidrojen peroksit ekleyin. Kalan hidrojen peroksiti oda sıcaklığında (~23 °C), kapağı parafilmle sabitlenmiş halde üç aya kadar saklayın.
      NOT: Hidrojen peroksit güçlü bir oksitleyicidir. Yanıcı maddelerden, ısı kaynaklarından ve metallerden uzak tutun. Kişisel koruyucu ekipmanla (KKD; örn. gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü) kimyasal çeker ocak alanında kullanın. Cilt, göz ve soluma ile temasından kaçının. Maruz kalırsa cildi 15 dakika suyla yıkayın. Yutulması veya solunması halinde tıbbi yardım alın. Daha yüksek konsantrasyonlar ciddi yanıklara neden olabilir ve organik maddeler veya belirli metallerle tutuşabilir veya patlayabilir. Şiddetli reaksiyonları önlemek için suya daima hidrojen peroksit ekleyin.
    2. %3,7 formaldehit hazırlayın: Kimyasal çeker ocakta, 3,3 mL 1x PBS başına 1 mL %16 formaldehit ekleyin. Parafilm ile sarılmış formaldehiti üç aya kadar saklayın.
      NOT: Formaldehit ciddi göz hasarına, solunum yolu tahrişine neden olabilir ve kansere neden olduğundan şüphelenilmektedir. Uzun süreli veya tekrarlanan maruz kalma cilt hassasiyetine ve alerjik reaksiyonlara neden olabilir. Yalnızca kimyasal çeker ocakta kullanın ve uygun KKD (eldiven, gözlük/yüz siperi, maske, laboratuvar önlüğü vb.) kullanın. Cilt temasından, göz temasından ve solumaktan kaçının. Isı kaynaklarından ve açık alevlerden uzak tutun. Paraformaldehit ve kontamine malzemeleri tehlikeli atık olarak atın ve mümkünse yalnızca hemen kullanım için gereken miktarı hazırlayın.
    3. Doku slaytını aşağıdakileri içeren 50 mL'lik konik tüplere yerleştirerek yıkayarak deparafinize edin: Kimyasal bir çeker ocakta her biri 5 dakikada 3 yıkama için ksilen (40 mL).
      İSTEĞE BAĞLI: Ksilen yerine, ksilen bazlı olmayan bir histolojik temizleme maddesi kullanılabilir, ancak potansiyel olarak parafin kalıntısı bırakacak ve görüntü kalitesini etkileyecektir. Bu, dilimlerin aşağıdakileri içeren 50 mL'lik konik tüplere yerleştirilmesini içerir: Her biri 15 dakikada iki yıkama için ksilen bazlı olmayan histolojik temizleme maddesi (40 mL). Balmumu ile yapılan bloklardan kesitlerin ksilen olmayan maddelerle mumdan arındırılması zor olabilir. Bilinmeyen mum/parafin karışımları için Ksilenin doğru güvenlik önlemleriyle kullanılması tavsiye edilir. Ksilen tehlikeli ve yanıcı bir maddedir ve uzun süre maruz kalmak merkezi sinir sistemine, karaciğere ve böbreklere zarar verebilir. Yalnızca kimyasal çeker ocakta kullanın ve KKD giyin (örn. eldivenler, maskeler ve laboratuvar önlükleri.) Ksilen ve kontamine malzemeleri tehlikeli atık olarak atın. Maruz kalma durumunda derhal tıbbi yardım alın.
    4. Aşağıdakileri içeren 50 mL'lik konik tüpe yerleştirerek doku slaytını yıkayarak yeniden nemlendirin: Her biri 3 dakika boyunca 2 yıkama için %100 etanol (40 mL); Her biri 3 dakikada 2 yıkama için %95 etanol (40 mL); Her biri 3 dakikada 2 yıkama için %70 etanol (40 mL); Her biri 3 dakikada 2 yıkama için %50 etanol (40 mL); Her biri 3 dakikada 2 yıkama için %30 etanol (40 mL); 2 dakikada 1 yıkama için 1x PBS yıkama (40 mL).
    5. Peroksidaz, oda sıcaklığında (~23 °C) bir nem odasına yerleştirerek ve dokuyu yaklaşık 100-200 μL %3 hidrojen peroksit ile kaplayarak, 10 dakikada 1 yıkama için dokuyu bloke eder, ardından dokuyu 1x PBS yıkama (40 mL) ile yıkayın, her biri 2 dakikada 2 yıkama için.
      NOT: Peroksidaz blokajı isteğe bağlıdır ve spesifik olmayan boyamayı azaltmak için dokudaki kalıntı peroksidaz enzimlerini söndürür ve doku otofloresansını azaltabilir. Bu, özellikle kemik iliği, böbrek, karaciğer, akciğer, bağırsak ve beyin gibi yüksek otofloresansa sahip dokular için önemlidir ve burada güçlü arka plan sinyalleri TRITC ve FITC emisyon bantlarında 28,29,30,31,32 görüntülemeye müdahale edebilir.
    6. Dokuyu oda sıcaklığında bir nem odasına yerleştirerek ve dokuyu 10 dakikada 1 yıkama için yaklaşık 100-200 μL% 3.7 formaldehit ile kaplayarak formaldehit fiksasyonu gerçekleştirin, ardından dokuyu 1x PBS yıkama (40 mL) ile yıkayın, her biri 2 dakikada 2 yıkama için.
      NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ancak yüksek yağlı dokular veya cam slaytlara yapışma sorunu yaşayan diğer dokular için önerilir.

4. Antijen alımı

NOT: Burada önerilen ve özetlenen mum alma ve antijen alma yöntemi, büyük kapasiteli kontrollü bir ısı antijeni alma cihazı kullanan üretici tarafından seqRNA-ISH + seqIF için önerilen yöntemden farklıdır.

  1. Mikrodalga kullanarak Isı Kaynaklı Antijen Alımı (HEIR)
    1. Sıcaklık izlemeli bir mikrodalga kullanarak, varsa, termometrenin altındaki slayt tutucudaki slaytları kapatmak için piyasada bulunan yeterli pH 9.0 HEIR Tampon çözeltisi (yaklaşık 250 mL) ekleyin.
      NOT: RNA için antijen alımı tipik olarak pH 6.0'da yapılır, ancak aşağıdaki metodolojiler, antikor bağlanmasının daha yüksek verimliliği için pH 9.0 içindir.
  2. Slaytları tampon solüsyon içinde mikrodalgaya yerleştirin ve varsa boş odaları çift damıtılmış su ile dengeleyin. Slaytları mikrodalgada 107 °C'de 15 dakika ısıtın (HEIR tamponunun sıcaklığa ulaşması için toplam süre genellikle 30 dakikadır).
  3. Slaytları oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika kimyasal çeker ocak altına yerleştirerek soğutun.
  4. Slaytları 50 mL'lik konik bir tüpte (40 mL) 1x PBS'de 2 dakika boyunca 1 yıkama için yıkayın.
  5. Slaytları vidalı kapaklı bir slayt postasında veya 1x PBS (veya ticari bir çoklu boyama tamponu) ile doldurulmuş 50 mL'lik konik tüpte saklayın ve hemen devam edin veya 4 °C'de 7 güne kadar, ancak ideal olarak seqRNA-ISH+seqIF ile devam etmeden önce 72 saatten daha kısa bir süre saklayın.

5. Stok çözeltileri hazırlayın

  1. 40x RNA görüntüleme tamponu hazırlayın
    1. 400 mg toz RNA görüntüleme tamponu ve 25 mL nükleaz içermeyen deiyonize suyu birleştirerek 40x RNA Görüntüleme Tamponu hazırlayın
    2. Elde edilen çözeltiyi tamamen eriyene kadar vorteksleyin ve ardından 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine (tüp başına 1 mL) bölün
    3. Dondurun ve -20 °C'de üç aya kadar saklayın, donma-çözülme döngülerinden kaçının.
  2. 20x salin-sodyum sitrat tamponu (SSC) hazırlayın
    1. 157.3 g sodyum klorür (NaCl) ve 88.2 g sodyum sitrat (Na3C6H5O7) 800 mL nükleaz içermeyen deiyonize suda çözün.
    2. pH'ı ölçün ve 1 M hidroklorik asit (HCl) ile damla damla pH 7,0'a titre edin.
    3. Sterilize etmek için otoklav.
      NOT: Steril 20x SSC farklı firmalardan da satın alınabilir. Açtıktan sonra oda sıcaklığında 4 °C'ye kadar saklayın.
    4. 1 mL 20x SSC stoğunu 4 mL Nükleaz İçermeyen deiyonize su ile birleştirerek 4x SSC tamponu hazırlayın

6. Sıralı RNA-ISH + sıralı immünofloresan

NOT: Burada özetlenen tüm adımlar, Malzeme Tablosunda özetlenen seqRNA-ISH+seqIF için üretici protokolünden uyarlanmıştır, çünkü çoğu reaktif sistem uyumlu, ticari reaktifler olarak tanımlanır. Bu reaktifler üretici tarafından tanımlanır ve/veya sağlanır ve sistemle uyumlu olacak şekilde tasarlanır. Değişiklikler mümkündür ve tartışmada ana hatlarıyla belirtilmiştir, ancak birikmeyi önlemek için ek testler ve akışkan yıkama gerektirebilir. Yazılım, panel ve protokol tasarlanıp girildikten sonra ihtiyaç duyulan toplam reaktif hacmini hesaplayacaktır. Ancak, önerilen değişiklikler sunulmuştur. Toplam hacim her zaman protokol başına kaç döngü ve hedef kullanıldığına bağlı olarak değişecektir. Bununla birlikte, antikor ve RNA-ISH dilüsyonları, her bir kombinasyon veri tabanına benzersiz bir öğe olarak girilmedikçe sistem tarafından hesaplanmayacaktır. Bu protokol için numune lamı başına 400 uL antikor kokteyli gereklidir.

  1. Sistem hazırlığı
    1. SeqRNA-ISH+seqIF'den önce, tüm mikroakışkanları nükleaz içermeyen suyla iyice yıkayın.
    2. Sistemin dışına RNAse dekontaminasyon solüsyonu ve ardından %70 etanol püskürtün.
  2. Genel reaktifleri hazırlayın
    1. Yıkama Tamponu: 50 mL 20x sistem uyumlu, ticari, çok boyalı tampon + 950 mL nükleaz içermeyen deiyonize su
    2. Su: 100 mL nükleaz içermeyen deiyonize su.
    3. Etanol: 100 mL %70 Etanol.
    4. Görüntüleme Tamponu: 16 mL 10x sistem uyumlu, ticari, görüntüleme solüsyonu + 140 mL nükleaz içermeyen deiyonize su + 4 mL sistem uyumlu, ticari, görüntüleme stoğu.
    5. Elüsyon Tamponu: 152 sistem uyumlu, ticari, Elüsyon Solüsyonu 1 + 8 sistem uyumlu, ticari, Elüsyon Solüsyonu 2
    6. Söndürme Tamponu: 130 mL nükleaz içermeyen deiyonize su + 14 mL sistem uyumlu, ticari, Söndürme Solüsyonu 1 + 16 mL sistem uyumlu, ticari, Söndürme Solüsyonu 2.
  3. RNA-ISH protokolü için boyama reaktifleri hazırlayın
    NOT: Bu adım bir gece önceden tamamlanabilir ve karanlıkta 4 °C'de saklanabilir. Üretici tavsiyeleri, havuzlanmış probların bir yıla kadar kullanılabileceğini belirtse de, kontaminasyon endişeleri nedeniyle probların bir haftadan daha uzun süre havuzda toplanması önerilmez. Problar için, karıştırmak için yukarı ve aşağı hafifçe vurmak veya hafifçe pipetlemek ve kullanmadan önce aşağı doğru döndürmek için hafifçe santrifüjlemek en iyisidir.
    1. Sistemle uyumlu bir mikrosantrifüj tüpünde slayt başına 500 μL'de sistem uyumlu, ticari, proteinaz içermeyen geçirgenleştirme solüsyonu yükleyin.
    2. Havuz RNA-ISH Amplifikatörleri, sistemle uyumlu bir mikrosantrifüj tüpünde aşağıdakilerin her biri için slayt başına toplam 500 μL için döngüye (Tablo 1) dayalıdır: i) T1 ila T4 kuyrukları için ZZ kuyruk ağaçları, ii) T5 ila T8 kuyrukları için ZZ kuyruk ağaçları, iii) T9 ila T 12 kuyrukları için ZZ kuyruk ağaçları.
    3. Havuz kuyruğu ağacına özgü, amplifikatör eşleştirme, sistem uyumlu bir mikrosantrifüj tüpünde aşağıdakilerin her biri için slayt başına toplam 500 μL floroforlar: i) T1 ila T4 ağacı için florofor, ii) T5 ila T8 ağacı için florofor, iii) T9 ila T 12 için florofor.
      NOT: Bu adım ışığa duyarlıdır
    4. Slayt başına nükleaz içermeyen deiyonize su ile yapılan ticari çok boyalı tamponda 1 mL 1:200 seyreltme ticari DAPI (1 mg / mL stok konsantrasyonu) hazırlayın
      NOT: Prosedür, standart reaktiflerin bir parçası olarak DAPI'yi içeren üreticiye göre gerçekleştirilmiştir. N,N-Dimetilformamid (DMF) içinde seyreltilmiş özel DAPI formülasyonları kullanılıyorsa, seyreltmeler değişebilir ve titrasyon testlerinin yapılması gerekecektir. Bununla birlikte, 1 mg/mL stok konsantrasyonunun 1:1000-1:2000 civarında bir konsantrasyon kullanılması tavsiye edilir. Tipik olarak, bu, birden fazla görüntüleme ve sıyırma turundan geçmesi gerektiğinden, manuel boyama protokollerinden normalden daha yüksek bir konsantrasyondadır. DMF'deki DAPI taze yapılmış formülasyonları, ticari olarak temin edilebilen DAPI formülasyonlarından daha parlak olma eğilimindedir. DAPI gibi formamid içeren reaktifler, kimyasal bir çeker ocak altında tahsis edilecektir. Formamid üreme toksisitesine ve organ hasarına neden olabilir ve kanserojen olduğundan şüphelenilmektedir. Uygun KKD kullanın (örn. eldiven ve laboratuvar önlüğü).
    5. 12.125 nükleaz içermeyen deiyonize su, 1.5 mL 10x görüntüleme tamponu stok B ve 275 μL 40x Görüntüleme Tampon Stok A (çözülmüş veya taze yapılmış) ile kullanımdan hemen önce RNA-ISH görüntüleme tamponu hazırlayın
    6. Sistemle uyumlu bir mikrosantrifüj tüpünde slayt başına toplam 400 μL için ticari çoklu boyama tamponunda titrasyon testinden geçirilmiş seyreltmelere göre seqIF için 10 çifte kadar birincil antikor (birincil protein antikorları Tablo 2'de özetlenmiştir) hazırlayın. Her seqIF döngüsünün, konakçı tür başına yalnızca bir birincil antikor içerdiğinden emin olun.
    7. Titrasyon testi yapılmış seyreltmelere göre seqIF için adım 6.3.7'deki birincil antikor kombinasyonlarına göre ikincil floroforlar (Tablo 3) artı DAPI hazırlayın. Minimum 1 mL ölü hacme sahip 50 mL'lik konik bir tüpte döngü başına toplam 400 μL'de çoklu boyama tamponunda seyreltin. İkincil Alexa Fluor antikorları ve DAPI için örnek konsantrasyonlar aşağıdaki gibidir: Alexa Fluor 555 için 1:200 seyreltme, Alexa Fluor 647 için 1:400 seyreltme, DAPI için 1:1800 seyreltme (DMF'de 1 mg/mL DAPI'den)
      NOT: Bu adım ışığa duyarlıdır. DAPI'nin ikincillere eklenmesi, üreticinin protokolüne uygun değildir, çünkü birden fazla seqIF döngüsü boyunca DAPI ifadesinin korunmasına yardımcı olabilir, bu da çalışma sonrası görüntülerin hizalanmasına yardımcı olur. Bu sisteme dahil olanlar gibi çoğu görüntü işleme yazılımı, floresan kolokalizasyon için döngüsel görüntülemenin hizalanmasını doğrulamak için DAPI sinyalini kullanır.
  4. Sistem başlatma
    1. Adım 6.3'teki reaktiflerin her birini sistem tarafından belirtilen sırayla yükleyin. Genel olarak sıranın yukarıdaki gibi olacağını unutmayın, ancak her zaman reaktiflerin yüklendikleri yerle eşleştiğinden emin olun
    2. Antijen alınan slaytı tutucuya yükleyin ve sistem uyumlu mikroakışkan çipi üstüne yerleştirmeden ve yerine kilitlemeden önce slayt görüntüleme penceresinin görüntüleme alanının ortasına hizalandığından emin olun.
      NOT: Mikroakışkan çipler, contalar sağlam kaldığı sürece, bir defaya kadar daha temizlenip uygun şekilde saklanırsa seqIF titrasyon testleri için yeniden kullanılabilir. Mikroakışkan çipler, potansiyel kontaminasyon nedeniyle bir RNA paneli çalıştırılıyorsa yeniden kullanılamaz.
    3. 1.35 mL 4x SSC ve 150 mL ticari 10x yarma çözeltisini karıştırarak Yarma Çözeltisini hazırlayın.
      NOT: 10x Yarma Çözeltisi hızla oksitlenir ve bir seqRNA-ISH+seqIF deney çalışmasında kullanımdan hemen önce kırılması gereken bir cam ampulde saklanır.

7. Sistem çalışması

  1. Sistemi üretici talimatlarına göre çalıştırın, 20 katlı bir protein seqIF'li 12 katlı bir seqRNA-ISH'de iki slayt için yaklaşık çalışma süreleri, 12,5 cm x 12,5 cm'lik bir görüntüleme penceresi için 48 saattir.
  2. SeqRNA-ISH+seqIF çalışması tamamlandıktan sonra, slayt çıkarılabilir ve 1x PBS'de saklanabilir veya ek seqIF için hemen kullanılabilir (40 proteine kadar).
    NOT: Kontaminasyon potansiyelini azaltmak için her çalıştırmadan önce ve sonra sistem mikroakışkanlarını nükleaz içermeyen su kullanarak temizlemek ve yıkamak önemlidir.

8. İSTEĞE BAĞLI: Görüntü ve istatistiksel analiz

  1. Görüntü analizi veya patoloji analiz araçları aracılığıyla görüntü ve istatistiksel analize devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu yöntemin bir örneği olarak, aşağıdaki seqRNA-ISH (Tablo 1) + SeqIF'yi (Tablo 2 ve Tablo 3) bir insan yüksek dereceli seröz yumurtalık karsinomundan alınan iki slayt üzerinde çalıştırdık.

Şekil 2, bir yumurtalık tümör dokusu örneği üzerinde seqRNA-ISH+seqIF'nin üst üste bindirilmesini göstermektedir. Kollajen 1 gibi yapısal protein belirteçleri, tümör bölgelerini tanımlamak için kullanılırken, CD33, CD8 ve Granz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Numunelerin hazırlanması ve işlenmesindeki en kritik adım, RNAse kontaminasyonunu azaltmaktır. Bu, nefesten kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için maskeler kullanılarak ve çalışma yüzeylerinin bir RNaz dekontaminasyon solüsyonu ve nükleaz içermeyen su ile yapılan %70 etanol ile silinmesiyle başarılabilir. FFPE slaytları için, seqRNA-ISH+seqIF için FFPE bloklarından birden fazla bitişik slayt kesmek ve bunları kurutucu ile 4 °C'de saklamak en iyisidir. Kalite kontrol için, doku blokların...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma kısmen Yumurtalık Kanseri Araştırma İttifakı (OCRA 811621 ve 891490), Sie Vakfı ve Stephanie C. Stelter Bağış Fonu tarafından finanse edildi. Bu araştırma, kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından MD Anderson'ın Kanser Merkezi Destek Hibesi P30 CA016672 ve Jared Burks'un NCI'nin Araştırma Uzmanı 1 R50 CA243707-01A1 aracılığıyla desteklenen Akış Sitometrisi ve Hücresel Görüntüleme Çekirdek Tesisi ile işbirliği içinde gerçekleştirildi.

Ayrıca teknik yardım ve eğitim için Lunaphore'dan Emily Martersteck'e teşekkür ederiz.

Yazar(lar), Bio-Techne'den indirimli bir fiyata erken erişim programının bir parçası olarak bir dizi RNAScope hedefli ve kontrol probu aldı ve bazı reaktifler bu çalışmada kullanılmak üzere ücretsiz olarak sağlandı. Üreticinin çalışma tasarımında, veri toplama ve analizinde veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher Bilimsel/ DavetliEN62248 / 62248Nükleer boyama için (bu çalışma sırasında kullanılan ürün, 62247 üretimi durdurulmuştur)
50mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj TüpleriThermo Fisher Bilimsel339652Alikotlar için kullanılır & Karışık ikincil çözümler
%70 Steril İzopropanol AlkolTeksli silmeTX3270 SerisiYüzey dekontaminasyonu için
AntikorÇeşitliÇeşitliBirincil hedefler için kullanılır, kullanılan kanala göre değişir
APOE - Ana Bilgisayar: Fare, Klon: 960318R& DMAB41443-100(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
aSMA - Ana Bilgisayar: Fare, Klon: 1A4CST69319SF(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
Otomatik kesilmiş mikrotomLeica14051956472Doku kesitleri
CD10 - Ana Bilgisayar: Tavşan, Klon: E5P7SCST65534S(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD11c - Ana Bilgisayar: Tavşan, Klon: D3V1ECST93233SF(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD163 - Ana Bilgisayar: Tavşan, Klon: D6U1JCST93498S(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD163 - Ev sahibi: Tavşan, Klon: ja51-30DavetliMA5-32684(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD20 - Ana Bilgisayar: Fare, Klon: L26EtilA500-017ACF(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD31 - Ana Bilgisayar: Fare, Klon: 3F8E2Protein Teknolojisi66065-2-IG(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD33 - Sunucu: Tavşan, Klon: BLR061GEtilA700-061CF fotoğraf makinesi(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD4 - Sunucu: Tavşan, Klon: EPR6855AbcamAB181724(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD45 - Ev Sahibi: Tavşan, Klon: BL-178-12C7EtilA700-012 Serisi(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD45RO - Ana Bilgisayar: Fare, Klon: UCHL1EtilA500-020ACF(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD56 - Ev sahibi: Tavşan, Klon: BLR152JEtil99746(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD66b - Ana Bilgisayar: Tavşan, Klon: BLR111HDavetliMA5-44413(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD68 - Ana Bilgisayar: Fare, Klon: KP-1Biyolojik Efsane916104(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD8 - Ana Bilgisayar: Fare, Klon: C8/144BBiyolojik Efsane372902(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
CD86 - Ana Bilgisayar: Tavşan, Klon: E2G8PCST76755SF Serisi(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
Sütun 1A1 - Ana Bilgisayar: Fare, Klon: E3E1XCST66948S(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
DNA LoBind Tüpleri 2mLEppendorf Belediyesi22431048Karışık RNA Probe çözeltileri için kullanılır
Drierite 21005 Kurutucuyu GösterirCole-Palmer Hakkında21005Desikatör için kurutucu
Edge-Rite Mikrotom BıçaklarıThermo Fisher Bilimsel / Davetli4280 LHistoloji - Numuneleri kesit alırken kullanılır
Etil Alkol %100 (200 Kanıt)Eczacılık111000200Deparafinizasyon için
EZ-AR2 Elegance TamponuBiyoGeneXHK547-XAKFFPE doku kesitlerinin antijen alımı için kullanılır
FOXP3 - Ev sahibi: Tavşan, klon: poliklonalEtilA700-034CF(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
Keçi anti-Fare IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Bilimsel/ DavetliA-21425(not: Bu çalışmaya özel) F(ab')2-Keçi anti-Fare IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor™ 555
Keçi anti-Fare IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Bilimsel/ DavetliA-48289/A-21237(not: Bu çalışmaya özel) F(ab')2-Keçi anti-Fare IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor™ Artı 647
Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Bilimsel/ DavetliA-21430(not: Bu çalışmaya özel) F(ab')2-Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor™ 555
Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Bilimsel/ DavetliA-21246(not: Bu çalışmaya özel) F(ab')2-Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor™ 647
GZMB - Ev sahibi: Tavşan, klon: poliklonalProtein Teknolojisi13588-1-AP(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
Hs-POLR2A-T1ACD Biyoteknoloji310457-T1İnsan düşük eksprese probu
Hs-PPIB-T5ACD Biyoteknoloji313907-T5İnsan orta ifade eden prob kontrolü
Hs-UBC-T9ACD Biyoteknoloji310047-T9İnsan yüksek ifade kontrolü
Hidrojen Peroksit Çözeltisi %30Sigma-AldrichHX0640-5 SerisiDoku hazırlığı için. Endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmeye ve yüksek renkli ürünler elde etmeye yardımcı olur. %3 Hidrojen Peroksit Çözeltisi yapmak için
Ker8/18 - Ana Bilgisayar: Fare, Klon: PoliklonalProtein Teknolojisi66187-1-PBS(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
LRP5 - Ev sahibi: Tavşan, Klon: HPA030505SigmaHPA030505-100UL(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
Lunaphore 20x Çok Boyama TamponuBiyo-TeknolojiBU06Seyreltici olarak ve COMET için yıkamalarda kullanılır
Lunaphore COMET ÇipiBiyo-TeknolojiMK03 SerisiCOMET cihazı için mcirofluidics çip
Lunafor KUYRUKLU YILDIZIBiyo-TeknolojiCM10-SSeq-IF otomatik boyama makinesi
Lunafor Elüsyon Tampon KitiBiyo-TeknolojiBU07-LÇözüm 1 & COMET'in elüsyon adımları için 2. çözüm
Lunaphore Görüntüleme Tampon KitiBiyo-TeknolojiBU09Çözünen ve COMET çalışması sırasında görüntüleme için kullanılan çözücü
Lunafor Söndürme TamponlarıBiyo-TeknolojiBU08-LÇözüm 1 & COMET'in söndürme adımları için 2. çözüm
MikropipetÇeşitliYOKreaktif hazırlama için
Periostin - Ana Bilgisayar: Fare, Klon: 1A11A3Protein Teknolojisi66491-1-PBS(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
Pierce %16 Formaldehit (a/h), Metanol içermezThermo Fisher Bilimsel28908Doku hazırlığı için %3.7 PFA yapmak
Prob 320102 (T2 kanalı)ACD Biyoteknoloji300040T2'de negatif kontrol DapB
Prob 320102 (T3 kanalı)ACD Biyoteknoloji300040T3'te negatif kontrol DapB
Prob 320102 (T4 kanalı)ACD Biyoteknoloji300040T4'te negatif kontrol DapB
RNAscope HiPlex Yarma Stok ÇözeltisiBiyo-TeknolojiP/N 324399RNAScope testi sırasında yarma için reaktif
COMET 12-plex, 20-slayt Kiti için RNAscope HiPlex ProBiyo-Teknoloji322075Reaktifler & RNAScope için Tamponlar
RNAscope HiPlex Probu- Hs-APOE-T2ACD Biyoteknoloji433093-T2(not: Bu çalışmaya özel) Erken Erişim RNAscope™ HiPlex CS Probu - Hs-APOE-T2
RNAscope HiPlex Probu- Hs-ARG1-T4ACD Biyoteknoloji401581-T4(not: Bu çalışmaya özel) Erken Erişim RNAscope™ HiPlex CS Probu - HS-ARG1-T4
RNAscope HiPlex Probu- Hs-CD274-T1ACD Biyoteknoloji600863-T1(not: Bu çalışmaya özel) Erken Erişim RNAscope™ HiPlex CS Probu - Hs-CD274-T1
RNAscope HiPlex Probu- Hs-CD40-T6ACD Biyoteknoloji445973-T6(not: Bu çalışmaya özel) Erken Erişim RNAscope™ HiPlex CS Probu - HS-CD40-T6
RNAscope HiPlex Probu- Hs-CXCL1-01-T12ACD Biyoteknoloji1256473-T12(not: Bu çalışmaya özel) Erken Erişim RNAscope™ HiPlex CS Probu - Hs-CXCL1-01-T12
RNAscope HiPlex Probu- Hs-GZMB-T7ACD Biyoteknoloji468453-T7(not: Bu çalışmaya özel) Erken Erişim RNAscope™ HiPlex CS Probu - Hs-GZMB-T7
RNAscope HiPlex Probu- Hs-IFNG-T3ACD Biyoteknoloji310503-T3(not: Bu çalışmaya özel) Erken Erişim RNAscope™ HiPlex CS Probu - Hs-IFNG-T3
RNAscope HiPlex Probu- Hs-IL23a-T8ACD Biyoteknoloji562853-T8(not: Bu çalışmaya özel) Erken Erişim RNAscope™ HiPlex CS Probu - Hs-IL23a-T8
RNAscope HiPlex Probu- Hs-IL6-T9ACD Biyoteknoloji400883-T9(not: Bu çalışmaya özel) Erken Erişim RNAscope™ HiPlex CS Probu - Hs-IL6-T9
RNAscope HiPlex Probu- Hs-TNFa-T11ACD Biyoteknoloji310423-T11(not: Bu çalışmaya özel) Erken Erişim RNAscope™ HiPlex CS Probu - Hs-TNFa-T11
RNAscope HiPlex Probu- Hs-VEGFa-T5ACD Biyoteknoloji423163-T5(not: Bu çalışmaya özel) Erken Erişim RNAscope™ HiPlex CS Probu - Hs-VEGFa-T5
RNAscope HiPlex Probu- Hs-VISTA-T10ACD Biyoteknoloji491513-T10(not: Bu çalışmaya özel) Erken Erişim RNAscope™ HiPlex CS Probu - Hs-VISTA-T10
RNAscope HiPlex12 CS Negatif Kontrol ProbuACD Biyoteknoloji324347Üretici tarafından önerilen tam 12 plex negatif kontrol paneli. T1-T12'de DapB.
RNAscope HiPlex12 CS Pozitif Kontrol Probu-HsACD Biyoteknoloji324317Üretici tarafından önerilen tam 12 plex İnsan pozitif kontrol paneli. Hs -RTU, T1 ila T12 kanallarında aşağıdaki temizlik geni için: Polr2a, PPIB, UBC, HPRT1, TUBB, RPL28, RPL5, B2M, ACTB, LDHA-O1, RPLP0-X-RPLP0P2, GAPDH.
RNAse içermeyen suCorning46-000-CMTüm ekipmanları temizlemek ve hazırlamak ve gerektiğinde seyreltici olarak kullanmak
RNaseZap RNase Dekontaminasyon SolüsyonuThermo Fisher BilimselAM9782 SerisiRNazları yok eden bir yüzey dekontaminasyon çözümü
RNeasy FFPE TakımıQiagen73504 & 19093RNA Ekstraksiyonu ve DV200 ölçümü
Slayt PostasıSimport BilimselM9504MAslaytları sıvı tamponda saklamak için.
Cerrahi Tasarım Genel Amaçlı Endüstriyel Tıraş BıçağıThermo Fisher Bilimsel / Davetli13-812-236Histoloji - Numuneleri kesit alırken kullanılır
TOX 1/2 - Ana Bilgisayar: Tavşan, Klon: E613QCST62886SF(not: Bu çalışmaya özel) Birincil protein Antikoru
Ksilen Histolojik DerecesiThermo Fisher BilimselUN1307Deparafinizasyon için

Kaynaklar

  1. Levine, E., Hwa, T. Small RNAs establish gene expression thresholds. Curr Opin Microbiol. 11 (6), 574-579 (2008).
  2. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  3. Carstens, J. L., et al. Spatial multiplexing and omics. Nat Rev Methods Primers. 4 (1), 1-12 (2024).
  4. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eur J Immunol. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  5. Macosko, Z. E., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  6. Nichols, A. E. C., et al. Impact of isolation method on cellular activation and presence of specific tendon cell subpopulations during in vitro culture. FASEB J. 35 (7), e21733(2021).
  7. Grünwald, D., Singer, R. H., Czaplinski, K. Methods Enzymol. , Elsevier. London. (2008).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Shih, J. D., Waks, Z., Kedersha, N., Silver, P. A. Visualization of single mRNAs reveals temporal association of proteins with microRNA-regulated mRNA. Nucleic Acids Res. 39 (17), 7740-7749 (2011).
  10. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  11. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nat Protoc. 8 (11), 2158-2179 (2013).
  12. Meyer, C., Garzia, A., Tuschl, T. Simultaneous detection of the subcellular localization of RNAs and proteins in cultured cells by combined multicolor RNA-FISH and IF. Methods. 118-119, 101-110 (2017).
  13. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).
  14. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  15. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981.e15 (2018).
  16. Cheng, Y., Burrack, R. K., Li, Q. Spatially resolved and highly multiplexed protein and RNA in situ detection by combining CODEX with RNAscope in situ hybridization. J Histochem Cytochem. 70 (8), 571-581 (2022).
  17. Pourmaleki, M., et al. Tumor MHC class I expression associates with intralesional IL-2 response in melanoma. Cancer Immunol Res. 10 (3), 303-313 (2022).
  18. Johnstone, R. W., Andrew, S. M., Hogarth, M. P., Pietersz, G. A., McKenzie, I. F. C. The effect of temperature on the binding kinetics and equilibrium constants of monoclonal antibodies to cell surface antigens. Mol Immunol. 27 (4), 327-333 (1990).
  19. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  20. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  21. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-10 (2023).
  22. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  23. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 1-12 (2021).
  24. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
  25. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  26. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  27. Matsubara, T., et al. DV200 index for assessing RNA integrity in next-generation sequencing. Biomed Res Int. 2020 (1), 1-6 (2020).
  28. Davis, A. S., et al. Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
  29. Jenvey, C. J., Stabel, J. R. Autofluorescence and nonspecific immunofluorescent labeling in frozen bovine intestinal tissue sections: solutions for multicolor immunofluorescence experiments. J Histochem Cytochem. 65 (9), 531-541 (2017).
  30. Walters, D. K., Jelinek, D. F. Multiplex immunofluorescence of bone marrow core biopsies: visualizing the bone marrow immune contexture. J Histochem Cytochem. 68 (2), 99-112 (2020).
  31. Zoppolato, E., et al. Optimized immunofluorescence for liver structure analysis: enhancing 3D resolution and minimizing tissue autofluorescence. Biol Methods Protoc. 10 (1), 1-12 (2025).
  32. Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
  33. Suresh, S., O'Donnell, K. A. Translational control of immune evasion in cancer. Trends Cancer. 7 (7), 580-582 (2021).
  34. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  35. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: a tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), 1-12 (2014).
  36. Croce, A. C., Bottiroli, G. New light in flavin autofluorescence. Eur J Histochem. 59 (4), 1-10 (2015).
  37. Dubois, L., Andersson, K., Asplund, A., Björkelund, H. Evaluating real-time immunohistochemistry on multiple tissue samples, multiple targets and multiple antibody labeling methods. BMC Res Notes. 6 (1), 542(2013).
  38. Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Anal Chem. 80 (19), 7437-7444 (2008).
  39. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Methods Mol Biol. , Humana Press. New York. (2010).
  40. Weber, J., Peng, H., Rader, C. From rabbit antibody repertoires to rabbit monoclonal antibodies. Exp Mol Med. 49 (3), e305(2017).
  41. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  42. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  43. Kersigo, J., et al. An RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell Tissue Res. 374 (2), 251-262 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ard k mm nofloresanMekansal TranskriptomikMultiomik PlatformH cre Mikro evresiProtein HedefleriRNA HibritlemeDoku zerinde Mikroak kanlarH cre H cre Etkile imleri

İlgili makaleler