Yöntem makalesi

Çift modaliteli Moleküler Kartografi: Multipleks mRNA Tespitinin Protein Görüntüleme Kütle Sitometrisi ile Entegre Edilmesi

DOI:

10.3791/68616

⸱

14 Kasım 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Hematopoietic Biology & Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, formalin sabit parafine gömülü doku kesitlerinde protein görüntüleme kütle sitometrisi ile multipleks mRNA tespiti için bir metodolojiyi detaylandırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aynı tahlilde protein ve mRNA'yı tespit etme yeteneği, hücrenin bir varış için nasıl hazırlandığını ve içinde bulunduğu ortamda seyahat ederken ve etkileşime girerken hangi ipuçlarını aldığını anlamamıza yardımcı olur. Daha yüksek pleksli görüntüleme artık uzamsal olarak çözülmüş mRNA'nın (uzamsal transkriptomik) ve proteinin (uzamsal proteomik) aynı anda karakterizasyonuna izin veriyor. Fazlalığı önlemek için bu analitler tek bir doku kesitinde analiz edilebilir. Birçok proteine ve birkaç mRNA'ya veya tersine izin veren birçok teknoloji vardır, ancak merkezi etkili analitler proteinler olduğundan, bu makale protein görüntüleme kütle sitometrisini (IMC) metal problar kullanarak mRNA in situ hibridizasyon (ISH) ile entegre etmeye odaklanmıştır. Bu, hücrenin mikro ortamında iletişim kurarken dünyaya hangi mesajları hazırladığını veya hızla gönderdiğini anlamamızı sağlar. Ayrıca, salgılanan proteinlerin tespiti ile ilgili sınırlamaların veya yalnızca antikorlar kullanılarak ölçülmesi ve görselleştirilmesi genellikle zor olan zorlu belirteçlerin üstesinden gelir. Bu protokol aynı zamanda, metal prob tabanlı bir algılama sisteminde floresan spektral yayılma olmadığından veya dokuya özgü otofloresan hususları olmadığından, daha yüksek pleks floresan tabanlı yöntemlerde görülen telafi veya işlem sonrası ihtiyacını da en aza indirir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanserler çeşitli hastalarda yapısal ve fonksiyonel farklılıklar gösterir. Normal ve malign hücrelerden oluşan tümör mikroçevresi (TME) hastalar arasında heterojendir. Metastaz, birincil tümörden hücre kümeleri ve tek hücreler olarak kan dolaşımına kaçan bir kalıntıdan kaynaklanır, bu da hastalığın ilerlemesi ve terapötik yanıt 1,2 hakkında ipuçları sağlar. Bu mikro ortamların karmaşıklığının anlaşılması gerekir1. Tümörler geniş hücre tipleri içermesine rağmen, klinik standart histolojik olarak değişmeye başlayan tek bir belirtece dayanmaktadır 1,2. Çoğullanmış görüntüleme teknolojileri patolojide yeni yönler sağlamıştır. İnsan kanserlerinin uzamsal olarak çözülmüş proteomikleri, genomikleri, metabolomikleri ve lipidomikleri artık tek hücre çözünürlüğünde veya yakınında mümkündür 3,4,5,6.

Bu teknolojiler, tümörlerdeki heterojen hücresel konumları ve etkileşimleri inceleyebilir. Uygun tek hücreli biyogörüntüleme metodolojisinin kullanılması, kanser tedavilerinin tasarımını bilgilendirmek için hasta biyopsilerinde hastalıkla ilişkili birçok protein biyobelirtecinin profillerinin oluşturulmasına olanak tanır. Uzamsal hücresel haritalardan elde edilen bilgiler, hedef dışı, direnç ve nüks1 ile kanserleri etkili bir şekilde ortadan kaldırabilen kombinasyon tedavisi seçimine rehberlik edebilecektir. Söz konusu olan, tipik olarak doku7'nin aynı bölümünde uyum içinde çalışmayan bu çok çeşitli teknolojileri sendikalaştırma yeteneğidir. Şekil 1'de görsel olarak özetlenen bu protokol, aynı doku kesitinde ve aynı hücrede hem proteomikleri hem de hedeflenen bir mRNA alt kümesini aynı anda eşzamanlı floresan protein+RNA-ISH8 ile mümkün olandan daha yüksek bir parlaklıkta uzamsal olarak inceleme fırsatı sunar. Bu aynı zamanda, verilerin analizini çözmek amacıyla paralel analiz 3,4,6 için bir köprü görevi görebilir. İkili tespit mevcut olsa da, mRNA üretimini hızla başlatan, ancak salgılanan proteinin, doğrudan etiketlenmiş birincil antikor yöntemlerine özgü sınırlı hassasiyet ve sinyal amplifikasyonu eksikliği nedeniyle tespit edilemeyen hücreler de incelenebilir, bu da salgılanan moleküllerin tespitini özellikle zorlaştırır. Aşağıdaki protokol, IMC'de eşzamanlı algılama için tiyol indirgenmiş modifiye problar aracılığıyla metal bazlı algılama için geçerli olacak şekilde 12 katlı bir floresan / kromojenik algılamadan uyarlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yüksek dereceli seröz yumurtalık karsinomu için primer sitoredüktif cerrahi geçiren daha önce tedavi edilmemiş hastalardan toplanan formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) dokuları kullanır. Tüm klinik veriler, Texas Üniversitesi MD Anderson'ın Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan protokoller kapsamında Jinekolojik Onkoloji ve Üreme Tıbbı Anabilim Dalı'nın deposundan elde edildi. Hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı ve çalışmalar kabul görmüş etik kurallara uygun olarak yürütüldü.

1. Önlemler ve hazırlıklar

  1. Gerekli tüm reaktifleri hazırlamak için daima nükleaz içermeyen su (NFW) kullanın.
  2. Metalin cama bağlanmasını ve metal kirlenmesini azaltmak için tüm adımları plastik kaplar kullanarak ve cam kullanmadan gerçekleştirin.
  3. Çalışma alanını çok temiz tutun ve yüzeylere ve pipetlere RNase dekontaminasyon solüsyonu ve ardından NFW ile hazırlanmış %70 etanol püskürtün.
  4. Tiyole mRNA saptama problarını (T1-T12), Schulz ve ark.7 tarafından tarif edildiği gibi, Malzeme Tablosunda protocol.io'da daha ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir malamid bağlayıcı aracılığıyla uygun metallere konjuge edin.
    NOT: Protein hedefleri, bir hücrenin doku içindeki konumunu (yapısal belirteçler), hangi hücrelerin mevcut olduğunu (fenotipik belirteçler) ve hücrelerin ne yaptığını (fonksiyonel belirteçler) belirlemek için seçilmelidir. Bazı fonksiyonel belirteçler geçici olarak eksprese edildiğinden, mRNA hedeflerinin dahil edilmesi, bu hedefleri üreten hücrelerin tanımlanmasına izin verir.

2. Numune hazırlama ve ön işleme

  1. Kağıt mendil kesitlerini gece boyunca 60 °C'de kuru bir fırında pişirin.
  2. Deparafinizasyon gerçekleştirin: Her turda 5 dakika boyunca üç tur Ksilen ve her turda 3 dakika boyunca 10 tur rehidrasyon (%100 etanol (EtOH) x2, %95 EtOH x2, %70 EtOH x2, %50 EtOH x2, %30 EtOH x2). 1x tris tamponlu salin (TBS) ile 2 dakika boyunca bir kez yıkayın. Aynı anda kaç numunenin işlendiğine bağlı olarak, 50 mL konik tüpler (maks. 2 slayt) veya 350 mL IHC boyama kasetleri (maks. 24 slayt) kullanın.
    NOT: Bu mum alma adımı, tavsiye edilmesine rağmen, isteğe bağlıdır ve doku tipine bağlıdır.
  3. Doku slaytlarını 50 mL'lik bir tüpte doku bölümünü kaplayacak kadar PFA çözeltisi ile inkübe ederek 10 dakika boyunca% 3.7 Paraformaldehit (PFA) çözeltisi uygulayın.
  4. Mikrodalga kullanarak Isı Kaynaklı Antijen Alımı (HEIR): Sıcaklık izlemeli bir mikrodalga kullanarak, bir tepsiyi pH 6 HEIR Antijen alma tamponu (350 mL) ve kalan tepsileri NFW ile doldurun. Doku kesitlerini mikroskop slaytları için bir boyama rafına yerleştirin ve bunları antijen alma tamponu ile tepsiye ekleyin.
    NOT: Antijen alımı gerçekleştirirken, kullanmadan önce antijen alma tamponunun oda sıcaklığında (RT) olduğundan emin olun.
  5. 107 °C'de 15 dakika boyunca antijen alımı gerçekleştirin, ardından doku slaytlarının kimyasal bir başlıkta 20 dakika RT'de soğumasını bekleyin.
  6. Antijen alımı sırasında, nemlendirme kağıdını suyla durulayın, nem kontrollü slayt boyama tepsisine yerleştirin ve tepsiyi 60 °C'de bir hibridizasyon fırınına yerleştirin.
  7. Slaytları RNaz içermeyen TBS'de 3 dakika durulayın, ardından slaytları 3 dakika kurutun.

3. Proteaz tedavisi

  1. Hidrofobik bariyer kalemi ile her doku bölümünün etrafına hidrofobik bir bariyer çizin. Bariyerin yaklaşık 2 dakika tamamen kurumasını bekleyin.
  2. Salıncak cl'yi açarak kuru slaytları nem tepsisinin slayt tutucusuna yükleyin.amp.
  3. Doku bölümünü tamamen kaplayacak kadar proteaz damlası ekleyin. Önceden ısıtılmış nem kontrol tepsisini (60 °C, adım 2.6) hibridizasyon fırınından çıkarın ve sürgü tutucuyu nem kontrol tepsisine yerleştirin. Nem kontrol tepsisini tekrar kapatın ve hibridizasyon fırınına geri koyun. 40 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  4. Bu inkübasyon sırasında RNA-ISH Test materyallerini hazırlayın.
    1. 50x stoğu NFW ile seyrelterek 500 mL 1x RNA-ISH yıkama tamponu hazırlayın. RT'de bir aya kadar saklayın.
      NOT: 50x yıkama tamponunda çökelme meydana gelirse, 1x yıkama tamponunu hazırlamadan önce tamponu 10-20 dakika boyunca 40 °C'ye ısıtarak yeniden askıya alın.
  5. 1 L DPBS-T'ye 5 mL Tween ekleyerek NFW'de 1 L DTBS-T (%0,5 Tween) hazırlayın.
  6. RNA-ISH ZZ eşleştirilmiş Hedef Probları Hazırlayın:
    1. Ilık mRNA prob stokları ve RNA-ISH seyrelticisi 40 °C'de kuru bir fırında 10 dakika boyunca. Probları vorteksleyin ve tezgah üstü bir mini santrifüjde döndürün.
    2. Stok 50x probları RNA-ISH seyrelticisinde seyrelterek 1x karışım (12 proba kadar, Tablo 1) hazırlayın ve tüm doku bölümünü kaplayacak kadar nihai hacme sahip olduğunuzdan emin olun.
    3. İyice vorteksleyin ve karışık probları ve RNA-ISH seyrelticisini kullanıma kadar RT'de bırakın.
  7. Nem kontrol tepsisini hibridizasyon fırınından çıkarın ve sürgü tutucuyu çıkarın. Tepsiyi fırına geri koyun.
  8. Slaytları NFW ile önceden yıkanmış şeffaf bir slayt tutucuya yerleştirin. Slaytları NFW'de 5 dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkayın.
  9. Yıkama adımını taze NFW ile 5 dakika tekrarlayın.

4. Hedef prob hibridizasyonu

  1. Slaytlardaki fazla sıvıyı çıkarın. Nem kontrol tepsisini fırından çıkarın ve sürgü tutucuyu tepsiye yerleştirin.
  2. Her doku bölümünü tamamen kaplayacak kadar uygun prob karışımı ekleyin. Tepsiyi kapatın ve 40 °C'de 2 saat fırına koyun.
  3. Adım 5.2'de kullanmak üzere inkübasyonun bitiminden 30 dakika önce RT'de dengelenmesi için RNA-ISH Amplifikatör 1 (T1 ila T4 kuyrukları için ZZ kuyruk ağaçları) reaktifini yerleştirin.
  4. İnkübasyon tamamlandıktan sonra nem kontrol tepsisini hibridizasyon fırınından çıkarın ve slayt tutucuyu çıkarın. Tepsiyi fırına geri koyun.
  5. Slaytları NFW ile önceden yıkanmış şeffaf bir slayt tutucuya yerleştirin. Slaytları 1x yıkama tamponunda 2 dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkayın.
  6. Yıkama adımını RT'de 2 dakika boyunca taze 1x Yıkama Tamponu ile tekrarlayın.

5. RNA-ISH amplifikatörü 1'i hibritleştirin

  1. Slaytlardaki fazla sıvıyı alın ve slaytları nem tepsisinin slayt tutucusuna yerleştirin. Slayt tutucuyu nem kontrol tepsisine yerleştirin.
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 1 ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde ekleyin. Tepsiyi kapatın ve 40 °C'de 30 dakika hibridizasyon fırınına yerleştirin. Adım 6.2'de kullanmak için RNA-ISH Amplifikatörü 2 (T5 ila T8 kuyrukları için ZZ kuyruk ağaçları) reaktifini RT'ye yerleştirin.
  3. Nem kontrol tepsisini hibridizasyon fırınından çıkarın ve sürgü tutucuyu çıkarın. Tepsiyi fırına geri koyun.
  4. Slaytları NFW ile önceden yıkanmış şeffaf bir slayt tutucuya yerleştirin. Slaytları 1x yıkama tamponunda 2 dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkayın.
  5. Yıkama adımını RT'de 2 dakika boyunca taze 1x yıkama tamponu ile tekrarlayın.

6. RNA-ISH amplifikatörü 2'yi hibritleştirin

  1. Slaytlardaki fazla sıvıyı çıkarın. Nem kontrol tepsisini fırından çıkarın ve sürgü tutucuyu tepsiye yerleştirin
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 2 ve her bölümü kapsayacak şekilde ekleyin. Tepsiyi kapatın ve 40 °C'de 30 dakika hibridizasyon fırınına yerleştirin.
  3. Adım 7.2'de kullanmak üzere RNA-ISH Amplifikatörü 3 (T9 ila T 12 kuyrukları için ZZ kuyruk ağaçları) reaktifini RT'ye yerleştirin. Slayt tutucuyu tepsiden çıkarın. Tepsiyi tekrar fırına yerleştirin.
  4. Slaytları NFW ile önceden yıkanmış şeffaf bir slayt tutucuya yerleştirin. Slaytları 1x yıkama tamponunda 2 dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkayın.
  5. Yıkama adımını RT'de 2 dakika boyunca taze 1x yıkama tamponu ile tekrarlayın.

7. RNA-ISH amplifikatörü 3'ü hibridize edin

  1. Slaytlardaki fazla sıvıyı çıkarın. Nem kontrol tepsisini fırından çıkarın ve sürgü tutucuyu tepsiye yerleştirin
  2. Vorteks RNA-ISH Amplifikatörü 3 ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde ekleyin. Tepsiyi kapatın ve 40 °C'de 30 dakika hibridizasyon fırınına yerleştirin.
  3. İnkübasyon sırasında, 8. adım için metal oligo karışımını hazırlayın. Her oligo 1:15 konsantrasyonda kullanılır (10 uM stoktan, tüm doku bölümünü kaplayacak kadar nihai hacme sahip olduğundan emin olun). İyice vorteksleyin ve karışık metal oligoları kullanıma kadar RT'de bırakın. Nem kontrol tepsisini fırından çıkarın, ardından sürgü tutucuyu tepsiden çıkarın. Daha sonra tepsiyi tekrar fırına verin
  4. Slaytları NFW ile önceden yıkanmış şeffaf bir slayt tutucuya yerleştirin. Slaytları 1x yıkama tamponunda 2 dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkayın.
  5. Yıkama adımını RT'de 2 dakika boyunca taze 1x Yıkama Tamponu ile tekrarlayın.

8. Metal oligoları hibritleştirin

  1. Slaytlardaki fazla sıvıyı çıkarın. Nem kontrol tepsisini fırından çıkarın ve sürgü tutucuyu tepsiye yerleştirin. Adım 7.3'te hazırlanan karışık metal oligoları ekleyin (kullanmadan önce girdap).
  2. Tepsiyi kapatın ve 40 °C'de 45 dakika hibridizasyon fırınına yerleştirin.
  3. Nem kontrol tepsisini hibridizasyon fırınından çıkarın ve sürgü tutucuyu çıkarın. Tepsiyi fırına geri koyun.
  4. Slaytları NFW ile önceden yıkanmış şeffaf bir slayt tutucuya yerleştirin. Slaytları 1x yıkama tamponunda 2 dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkayın.
  5. Yıkama adımını RT'de 2 dakika boyunca taze 1x Yıkama Tamponu ile tekrarlayın.

9. Metal konjuge antikorlar

  1. Spesifik olmayan bölgeleri bloke etmek için, tüm doku bölümünü kaplayacak kadar yeterli hacimde bloke edici tampon uygulayın ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
  2. İnkübasyon sırasında, antikorları (Tablo 1) Antikor seyreltici tamponunda seyrelterek adım 10.1'de kullanılacak antikor karışımını hazırlayın.

10. Metal konjuge antikorlarla inkübasyon

  1. Tampon inkübasyonunu bloke ettikten sonra, bloke edici tamponu doku slaytlarından atın ve tüm doku bölümünü kaplayacak kadar Ab karışımı (adım 9.2'den itibaren) dağıtın.
  2. Slaytı bir nem odasına yerleştirin ve gece boyunca (~16 saat) 4 °C'de inkübe edin.

11. DNA boyama

  1. Taze Ir-Intercalator solüsyonu hazırlayın.
    1. 500 μM'lik bir stok çözeltisinden, RNaz içermeyen TBS'de 1:2000 çalışma çözeltisi hazırlayın. Çalışma çözeltisi aliquote edilebilir ve -20 °C'de saklanabilir (dondurmayın-çözülmeyin).
  2. Slaytları NFW ile önceden yıkanmış şeffaf bir slayt tutucuya yerleştirin. Slaytları TBS-T tamponunda 5 dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkayın.
  3. TBS-T'de yıkamayı tekrarlayın.
  4. RT'de 5 dakika boyunca Ir çalışma solüsyonu (adım 11.1.1'den itibaren) ile leke kaymaları.
  5. Slaytları NFW ile önceden yıkanmış şeffaf bir slayt tutucuya yerleştirin. Slaytları TBS-T tamponunda 5 dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkayın.
  6. TBS-T'de yıkamayı tekrarlayın.
  7. TBS'de 5 dakika iki kez yıkayın (yavaşça karıştırın).
  8. TBS'de bulunan tuzların doku üzerinde kristalleşmesini önlemek için slaytı hızlı bir şekilde ddH2O'ya batırın.
  9. Slaytı kimyasal bir başlık altında kurutun (10 dakika) ve görüntü elde edilene kadar 4 °C'de saklayın.

12. Görüntü edinme

  1. Sürgüyü IMC'nin ablasyon odasına yükleyin.
  2. İlgilenilen bölgeyi (ROI) belirlemek için bir panorama görüntüsü yakalayın.
  3. Görüntü alma yazılımında yatırım getirilerinin haritasını çıkarın.
  4. Alım şablonunu uygulayın.
  5. Lazer gücünü (ablasyon enerjisi) numune tipine göre ayarlayın. Varsayılan değer 0 dB olarak ayarlanmıştır.
    NOT: Ablasyon enerjisinin birden fazla küçük doku alanıyla (30 μm x 30 μm) test edilmesi ve gücün her seferinde 1 dB artırılması önerilir. Numuneyi slayta yakmadan temizleyen en düşük ablasyon enerjisini seçin. Normalde bu, 3-4 dB'lik bir lazer gücü ile sonuçlanır. Bazen, doku önerilenden daha kalınsa, lazer gücü 5 dB'ye yükselecektir.
  6. Lazer ablasyonunu başlatın. Sistem, lazeri ROI'ye yönlendirir ve metal etiketli proteinleri keserek, tüylerin plazmada buharlaştırıldığı, atomize edildiği ve iyonize edildiği endüktif olarak eşleşmiş plazma (ICP) Torcuna aktarılan aerosol bulutları üretir.
  7. Dedektör tarafından ölçülen ve veriye dönüştürülen her izotopun miktarını ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aynı tahlilde protein ve mRNA'yı tespit etme yeteneği, hücrenin bir varış için nasıl hazırlandığını, aynı zamanda seyahat ederken ve çevresiyle etkileşime girerken hangi kuyrukları aldığını anlamamıza yardımcı olur. Temsili verilerde görüldüğü gibi, mRNA ve protein tespiti, mekansal biyoloji araştırmalarında kritik bileşenlerdir, çünkü algılamanın alt sınırları, etiketleme, dedektör ve/veya görüntüleme adımlarının ilerleme şekline bağlı olarak oldukça zor olabilir. Sadece proteazların da...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipleks multi-omik, hastalığın ilerlemesini ve tedavisini etkileyen hücreden hücreye ve hücreden komşuluğa etkileşimleri hedefleyen, toplanan verilerde kritik bir evrimdir. Bu verilerin aynı numunede ve dolayısıyla aynı hücrede analiz edilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü birçok protein hedefi geçici olarak eksprese edilir veya mRNA ve protein ekspresyon seviyesinde farklılık gösterir, böylece protein ile birleştirilmiş hedeflenen bir mRNA tespitinin getirilmesi, tespit edilmesi zor v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jared K. Burks, Standard BioTools'un danışmanıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından MD Anderson'ın Kanser Merkezi Destek Hibesi P30 CA016672 aracılığıyla desteklenen Akış Sitometrisi ve Hücresel Görüntüleme Çekirdek Tesisi ile işbirliği içinde gerçekleştirildi. Bu araştırma aynı zamanda kısmen MD Anderson Kanser Merkezi'nin Destek Hibe Geliştirme Ödülü, RNAscope, P30CA016672, NIH/NCI, PI - Pisters aracılığıyla Kütle Sitometrisi Uzamsal Transkriptomik Görüntüleme tarafından da desteklenmiştir. JKB'nin çabası kısmen P30 CA016672 ve NCI Araştırma Uzmanı 1 R50 CA243707-01A1 tarafından desteklendi. SFB çabası kısmen Yumurtalık Kanseri Araştırma İttifakı (OCRA 811621 ve 891490), Saygıdeğer Tina Brozman Yumurtalık Kanseri Araştırma Vakfı, MDACC Yumurtalık Kanseri SPORE Gelişimsel Araştırma Programı, NIH 1R01CA261952-01A1 tarafından desteklenmiştir. SFB, JKB ve BG çabaları kısmen 1U01CA294459-01 hibesi ile desteklendi. Yazarlar, kullanılan örnekleri kesitleyen ve sağlayan Samuel Mok'a teşekkür etmek isterler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
  https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.Protocols.IOdx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2Görüntüleme kütle sitometrisi V.2  için oligonukleotid-polimer konjugasyonu;
10x TBS RNAse-FreeThermo Fisher Scientific J62780. K7Adımlar arasında aralıklı yıkamalar için
ACD HybEZ II Hibritizasyon SistemiACD Biotechne321711Fırın mendil slaytları için
Antikor SulandırıcıDakoS0809 Antikor seyreltici tamponu
Antikor: B7-H3BetilA700-025CF, A700-026CFKlon: BLR025F, BLR026F
Antikor: B7-H4Thermo Fisher Scientific 14-5949-82Klon: H74
Antikor: BRD4(6F11)BetilA700-005CFKlon: BL-151-6F11
Antikor: CCR6R& DMAB195-100Klon: 53103
Antikor: CD11bAbcam ab209970Klon: EPR1344
Antikor: CD25Abcam ab215378Klon: EPR6452
Antikor: CD278/ICOSCST 89601BFKlon: D1K2T
Antikor: CD31Abcam ab207090Klon: EPR3094
Antikor: CD33Abcam ab238784Klon: SP266
Antikor: CD3e CST85061BFKlon: D7A6E
Antikor: CD4AbcamAB181724Klon: EPR6855
Antikor: CD44Thermo Fisher Scientific MA1-10225Klon: IM7
Antikor: CD45Thermo Fisher Scientific 14-9457-82Klon: CD45-2B11
Antikor: CD8aCST 85336BFKlon: D8A8Y
Antikor: CXCL13R& DAF801Klon: Poliklonal
Antikor: CXCR5R& DMAB190-100Klon: CXCR5
Antikor: gamma-H2AXBetilA700-053CFKlon: BLR053F
Antikor: Granzyme BSanta CruzSC-8022 XKlon: 2C5
Antikor: KAP1BetilA700-014CFKlon: BL-248-2G6
Antikor: Ki67BetilA700-021CFKlon: BLR021E
Antikor: LCK CST2984BFKlon: D88
Antikor: MFAP5YokYokPMID: 31332047 / Klon: 130A  (Not: özel tasarım) 
Antikor: SMACST56856BFKlon: 1A4
Antikor: VEGFSTB-Fluidigm3163028DKlon: G153-494
Antikor: VISTACST64953BFKlon: D1L2G
AZ-AR1 Elegance Citra BioGeneXHK546-XAKAntijen geri alma tamponu
Etil Alkol %100 (200 Proof)Pharmco111000200Deparafinizasyon için
EZ – Retriever IRBioGeneXMW016-IRFFPE doku kesitleri için antijen toplama sistemi
HybEZ II Hibritizasyon SistemiACD Biotechne321710Sistem şunları içerir: HybEZ fırın (PN 321710/321720), nem kontrol tepsisi (PN 310012), HybEZ Nem Verici Kağıt (2 sayfa PN 310025), EZ-Batch Yıkama Tepsisi (PN 321717), EZ-Batch Sürgü Tutucu (PN 321716)
ImmEdge Hidrofobik Bariyer PAP Pen VectorLabsH-4000Hidrofobik Bariyer Kalemi
Ir Intercalator ÇözümüThermo Fisher Scientific NC1038184Çekirdekli hücrelerin tanımlanmasında kullanılır
KERATIN 8/18CST 4546BFKlon: C51
Metal OligosÇeşitliÇeşitliMetal etiket, hangisi gerektiğine göre T1'den T12'ye kadar değişiyor
Nükleazsız su (NFW)Corning 46-000-CM Tüm ekipmanları temizlemek ve hazırlamak, gerektiğinde diltatan olarak kullanmak
RNAscope Proteaz Plus ACD Biotechne322331 Numunelerin hücre zarlarını geçirimli etmek için kullanılır
RNAscope EZ-Batch Sürgü TutucuACD Biotechne31001720'ye kadar slaytı verimli şekilde manuel olarak partilemek için tasarlanmıştır
RNAscope HiPlex12 Reaktif Kiti v2 ACD Biotechne324409RNAScope için reaktifler
RNAscope HiPlex Prob - Hedef ProblarACD BiotechneÇeşitliHangisinin gerektiğine bağlı olarak T1 ile T12 arasında değişiklik
RNaseZap RNase Dekontekromasyon ÇözeltisiThermo Fisher ScientificAM9782RNazları yok eden yüzey dekontaminasyon çözümü
Boyama Rafı Mikroskop Sürgü Sepeti Tutucu 24 Lok Kimyasallara Dayanıklı PlastikOptimal Bilimsel3028Birden fazla sürgü boyamak için
Tween 20Thermo Fisher Scientific AAJ20605APAdımlar arasında aralıklı yıkamalar için
Ultravision Protein BloğuThermo Fisher Scientific TA125PBQEngelleme tamponu

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  2. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncol. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  3. Parolini, M., et al. Microplastic contamination in snow from western Italian Alps. Int J Environ Res Public Health. 18 (2), 768(2021).
  4. Carstens, J. L., et al. Stabilized epithelial phenotype of cancer cells in primary tumors leads to increased colonization of liver metastasis in pancreatic cancer. Cell Rep. 35 (2), 108990(2021).
  5. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precis Oncol. 4 (1), 1-12 (2020).
  6. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  7. Schulz, D., et al. Simultaneous multiplexed imaging of mRNA and proteins with subcellular resolution in breast cancer tissue samples by mass cytometry. Cell Syst. 6 (1), 25-36.e25 (2018).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  10. Mok, S. C., et al. A gene signature predictive for outcome in advanced ovarian cancer identifies a survival factor: microfibril-associated glycoprotein 2. Cancer Cell. 16 (6), 521-532 (2009).
  11. Yeung, T. L., et al. Anticancer immunotherapy by MFAP5 blockade inhibits fibrosis and enhances chemosensitivity in ovarian and pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 25 (21), 6417-6428 (2019).
  12. Ogura, H., et al. Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induction. Immunity. 29 (4), 628-636 (2008).
  13. Murakami, M., et al. Local microbleeding facilitates IL-6- and IL-17-dependent arthritis in the absence of tissue antigen recognition by activated T cells. J Exp Med. 208 (1), 103-114 (2011).
  14. Hou, W., Jin, Y. -H., Kang, H. S., Kim, B. S. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibiting cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. J Virol. 88 (15), 8479-8489 (2014).
  15. Geskin, L. J., Viragova, S., Stolz, D. B., Fuschiotti, P. Interleukin-13 is overexpressed in cutaneous T-cell lymphoma cells and regulates their proliferation. Blood. 125 (18), 2798-2805 (2015).
  16. Aspord, C., et al. Breast cancer instructs dendritic cells to prime interleukin 13-secreting CD4+ T cells that facilitate tumor development. J Exp Med. 204 (5), 1037-1047 (2007).
  17. Votava, M., et al. The expression profiles of CD47 in the tumor microenvironment of salivary gland cancers: a next step in histology-driven immunotherapy. BMC Cancer. 22 (1), 1-12 (2022).
  18. Liu, X., Kwon, H., Li, Z., Fu, Y. X. Is CD47 an innate immune checkpoint for tumor evasion. J Hematol Oncol. 10 (1), 1-10 (2017).
  19. Salerno, F., Guislain, A., Cansever, D., Wolkers, M. C. TLR-mediated innate production of IFN-γ by CD8+ T cells is independent of glycolysis. J Immunol. 196 (9), 3695-3705 (2016).
  20. Kalia, V., et al. Prolonged interleukin-2Rα expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 32 (1), 91-103 (2010).
  21. Cancino-Díaz, J. C., et al. Interleukin-13 receptor in psoriatic keratinocytes: overexpression of the mRNA and underexpression of the protein. J Invest Dermatol. 119 (5), 1114-1120 (2002).
  22. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  23. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  24. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  25. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  26. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), 612-620.e15 (2018).
  27. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J Histochem Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  28. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. In situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  29. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-12 (2023).
  30. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  31. Glasson, Y., et al. Single-cell high-dimensional imaging mass cytometry: one step beyond in oncology. Semin Immunopathol. 46 (1), 1-12 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Uzamsal TranskriptomikIn Situ HibridizasyonMetal Prob TespitiOver Kanseri Biyobelirte leriCD8 T H creleriKanserle li kili FibroblastlarUzamsal Proteomik

İlgili makaleler