Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

744 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68617

⸱

7 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Bu makalede

Özet

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Özet

Geleneksel prob tabanlı in situ hibridizasyon (ISH) görüntüleme algılama yöntemleri kullanıldığında, 19 ila 25 nükleotid arasında değişen boyutları nedeniyle mikroRNA'ların (miRNA'lar) yakalanması zordur. Bununla birlikte, miRNA'lar normal fizyolojiye ve çok sayıda patolojik duruma katkıda bulunan anahtar epigenetik düzenleyiciler olduğundan, miRNA'ların uzay-zamansal davranışını anlamak, hücresel ve hücre altı düzeylerdeki işlevlerini çözmek için önemlidir. Bu, yeterli algılama ve görselleştirme tekniklerine açık bir ihtiyaç yaratır. Bu nedenle, multipleks immünofloresan boyama ve bir miRNA'yı hedefleyen kilitli nükleik asit (LNA) probları kullanılarak geliştirilen ve optimize edilen Kilitli nükleik asit in situ hibridizatioN (MARLIN) aracılığıyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanıma'yı oluşturduk. Bu yöntem, miRNA'yı, tümör mikroçevresi (TME) içindeki hücre içi ve hücre dışı miRNA'nın yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile ölçülmesine izin veren çoğullanmış protein ekspresyonu ile ölçebilir. miRNA tespiti ve protein yakalama testlerinin birlikte kullanımı, bu TME içindeki hücresel fonksiyonların ve düzenleyici mekanizmaların kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını da sağlayabilir.

Giriş

mikroRNA'lar
MikroRNA'lar (miRNA) inanılmaz derecede küçük olmasına ve uzunlukları 19-25 nükleotid arasında değişmesine rağmen, bu tek sarmallı RNA molekülleri, gen ekspresyonunda güçlü düzenleyicilerdir ve diziye özgü etkileşimler yoluyla transkripsiyon sonrası haberci RNA'ları (mRNA'lar) modüle eder1. Özünde, miRNA'lar, tamamlayıcılık derecesine bağlı olarak, hedef mRNA'lara bağlanarak, translasyonlarını önleyerek veya mRNA bölünmesi yoluyla bozulmalarını teşvik ederek negatif düzenleyiciler olarak hareket eder, bu da sonuçta hedeflenen genden protein çıktısının azalmasına yol açar. miRNA'lar temelde kodlamayan RNA olsa da, tüm miRNA'ların yaklaşık %40'ı hala protein kodlayan genlerinintronlarında veya eksonlarında bulunur 2. miRNA'ların işlevsel amacı, hücre proliferasyonu, anjiyogenez, apoptoz vb. gibi birkaç temel biyolojik süreci kapsar. Özellikle, spesifik miRNA'ların anormal ekspresyonu ve miRNA aracılı gen regülasyonu, çoklu kanser tiplerinde onkojenik transformasyon ile ilişkilendirildiğinden, miRNA'ların düzensizliği tümör oluşumunda rol oynamıştır3.

Keşfedilmelerinden bu yana, miRNA'lar, nörodejeneratif bozukluklar, otoimmün bozukluklar ve çeşitli kanserler dahil olmak üzere birçok hastalıkla bağlantılı düzensizlikleri ile dokuya özgü ekspresyonları ve düzenleyici işlevleri nedeniyle çeşitli hastalıklarda kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır 4,5,6. miRNA'ların ekspresyon paternleri, kanser tipi, evresi ve klinik değişkenlerle ilişkilendirilebilir, bu da miRNA profillemesini kanser teşhisi ve prognozu için değerli bir araç haline getirir 4,5,6,7. Yeni miRNA'ların keşfi, yüksek verimli dizileme teknolojilerindeki gelişmelerle de hızlandırılmış ve çeşitli biyolojik süreçlerde miRNA katılımının anlaşılmasını geliştirmiştir8. miRNA'ların önemi, miRNA'nın transkripsiyon sonrası düzenleme9'daki işlevini keşfetmeleri nedeniyle Victor Ambros ve Gary Ruvkun'a verilen 2024 Nobel Tıp Ödülü ile vurgulanmıştır.

Hastalık teşhisi ve prognozu için değerli biyobelirteçler olarak, miRNA'ların terapötik potansiyeli araştırılmış ve miRNA hedefli ilaçların geliştirilmesine yol açmıştır. MiRNA'ların kanser tedavisindeki terapötik potansiyeli, gen modüllerini koordineli olarak düzenleme ve potansiyel olarak normal hücresel fonksiyonları geri yükleme yeteneklerinde yatmaktadır10. Daha önce, miRNA bazlı antikanser tedavileri, tedavi yanıtlarını geliştirmek ve iyileşme oranlarını artırmak için monoterapi olarak veya mevcut hedefe yönelik tedavilerle kombinasyon halinde geliştirilmiştir11. MiRNA'ların dinamik spektrumu, onları yenilikçi kanser tedavi stratejileri için temel kaynaklar olarak konumlandırmıştır. Terapötik direnç bağlamında, miRNA'ları hedeflemek, nüksü ve geleneksel kanser tedavilerine direnci azaltmada umut vaat ediyor ve kanser hücrelerini hedefleyerek potansiyel olarak hasta sağkalımını iyileştiriyor12. Tümör mikroçevresindeki (TME) çeşitli hücre tiplerinin aktivitelerini modüle etmede miRNA'ların rollerini keşfederek, benzersiz ve klinik olarak ilgili kanser tedavileri potansiyel olarak keşfedilebilir.

miRNA'ları tespit etmek için mevcut testler
Şu anda, miRNA ölçümü için en yaygın yöntem, uzamsal bağlamı kaybederek kantitatif gerçek zamanlı PCR (q-RT-PCR) veya Yeni Nesil Dizileme (NGS) için ekstrakte edilmiş RNA'ya dayanmaktadır. cDNA sentezi için hedefe özgü kök ilmek primerleri kullanan TaqMan mikroRNA tahlillerini ve evrensel cDNA sentezine sahip SYBR Green boya bazlı kimyaları sağlayacak şirketler var. Bu tahliller yüksek hassasiyet ve özgüllük sunabilir ve bir dizi q-RT-PCR cihazında çalıştırılabilir. Ne yazık ki, TaqMan tahlilleri mutlak niceleme sağlayamaz, bu da yanlış pozitifler ve sonuçlarda değişkenlik gibi sorunlara yol açabilir13. Ayrıca, yüksek hassasiyetlerine rağmen, bu tahlillerin farklı numune türlerinde uygulanması, kapsamlı numune hazırlama ihtiyacı ve numunedeki diğer bileşenlerden kaynaklanan potansiyel girişim nedeniyle sınırlandırılabilir.

Yeni Nesil Dizileme (NGS): miRNA-seq, biyoakışkanların tüm miRNome'unda diferansiyel ekspresyon analizi için giderek daha popüler hale geliyor. miRNA-seq gibi NGS teknolojilerinin bir yararı, miRNA'ların genom çapında ekspresyonunun büyük paralel analizlerine izin vermeleri, bireysel miRNA'ların miktarının belirlenmesini, dizi varyasyonlarının tanımlanmasını ve yeni miRNA'larınkeşfedilmesini sağlamalarıdır 14. IlluminaTruSeq Küçük RNA Numune Hazırlama Kiti gibi dizileme tabanlı yöntemlerin önemli bir dezavantajı, büyük ölçüde miRNA'ların14 homolojisi ve daha küçük okuma uzunlukları nedeniyle diferansiyel ekspresyon analizlerinin doğruluğunu etkileyen kantitatif önyargıların indüklenmesidir. Sadece bu da değil, izomiR'lerin (kanonik miRNA dizisinden dizi veya uzunluk bakımından farklı varyantlar) ve teknik artefaktların varlığı, veri yorumlamayı karmaşıklaştırabilir ve potansiyel olarak biyobelirteç tahlillerinde yanlış algılamalara ve kafa karıştırıcı faktörlere yol açabilir14. Ayrıca, sRNAbench ve miRDeep2 gibi miRNA-seq veri analizi için farklı araçlar, yeni miRNA keşfinintutarlılığını ve güvenilirliğini etkileyen farklı sonuçlar verebilir 15,16. Mikrodizi teknolojisi gibi bir şey bile çoğu durumda yetersiz kalabilir. MiRNA veya gen ekspresyon seviyelerini tespit etmek için güçlü, yüksek verimli bir platform sağlayabilmesine ve genom çapında çalışmalar için uygun hale getirmesine rağmen, teknoloji hala önceden tanımlanmış miRNA'ların sayısı ile sınırlıdır ve miRNA-hedef etkileşimlerini doğrudan doğrulayamaz, bu da fonksiyonel çalışmalarda kullanımlarını sınırlar17.

Mevcut tüm bu seçenekleri karşılaştırırken burada vurgulanabilecek en önemli faktör, mekansal bağlamın olmamasıdır. Hücreler içindeki doku morfolojisi veya uzay-zamansal dağılım ile ilgili herhangi bir bağlam sağlamazlar. MiRNA'ların uzay-zamansal davranışlarını görselleştirmek, hücresel ve hücre altı seviyelerdeki işlevlerini çözmek için gereklidir. Şu anda, miRNAscope in situ Hibridizasyon (ISH) testlerine genellikle kromojenik tespit yöntemleri kullanılarak erişilebilir. Bu tahliller, miRNA'nın tek hücre çözünürlüğü ile görselleştirilmesine izin verirken, sonuçlar kaliteden yoksundur, bu da miRNA ekspresyonu ile numunenin arka planı arasında ayrım yapmayı zorlaştırır. Genel olarak, bunların çoğu, güvenilmez olan ve genellikle manuel miktar belirleme gerektiren düşük kaliteli tahliller üretir.

Bu nedenle, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) dokular içinde multipleks immünofloresan boyama (Opal protein boyama ile) ve bir miRNA'yı hedefleyen kilitli nükleik asit (LNA) probları kullanarak Kilitli nükleik asit in situ hibridizatioN (MARLIN) yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanımayı geliştirdik. Bunu, bir Anti-Digoksigenin (DIG) Yaban Turpu Peroksidaz (HRP) Konjugat antikoru tarafından aktive edilen bir Tiramid Sinyal Amplifikasyonu (TSA) sistemi uygulayarak başardık. HRP, TSA'ya katalizör görevi görürken, Anti-DIG, LNA sondasına bağlanır. Bu tahlil, proteinler ve potansiyel olarak diğer RNA'lar ile aynı anda transkriptomik sonrası modifikasyonda miR'lerin temel doğasını anlamada özellikle yararlıdır. Ayrıca, hem miRNA hem de protein ekspresyonunu ölçebilen ticari olarak temin edilebilen bir tahlilin bulunmaması nedeniyle MARLIN, FFPE numuneleri içindeki miR'lerin ve proteinlerin yerinde ilişkilerini anlamak için etkili bir yol sağlar.

MARLIN kullanılarak miR-181c-3p'nin miktarının belirlenmesinden elde edilen ilk sonuçlar, insan yumurtalık FFPE dokusunun doğal uzamsal bağlamında miRNA'ların ve proteinlerin paralel analizinin fizibilitesini gösterdi. Bu örneğin ötesinde, MARLIN'in bileşenlerine dayanarak, Alexa Fluor gibi ticari floresan çoğullayıcı floroforları veya diğer küçük moleküllü boyaları18 kullanarak dört proteine kadar genişletmek teorik olarak mümkündür.

Ek olarak, bu metodoloji standart histoloji yöntemlerinde varyasyonlar kullandığından, uygun prob ve antikor seçimi verildiğinde diğer memeli FFPE dokuları ile uyumlu olmalıdır. Bu metodoloji, uzamsal mimariyi korur ve hücresel ve hücre altı miRNA ve protein kolokalizasyonunun nicelleştirilmesine izin verir. Bu yaklaşım, doğal doku mimarileri içinde doğrudan bağlamsallaştırılabilen miRNA'lar-protein ortak ekspresyon modellerini ve uzamsal dağılımı haritalayarak uzamsal biyolojideki kritik bir boşluğu giderir. Burada MARLIN'e Şekil 1'de ayrıntılı bir grafiksel genel bakış sunuyoruz. Sunulan protokol miR-181c-3p için optimize edilmiş olsa da, uygun bir prob tasarımı verildiğinde diğer miR'lerin incelenmesi mümkündür. Bu yöntem için kritik parametreler şunları içerir: doku kalitesinin değerlendirilmesi ve prob konsantrasyonlarının optimizasyonu. Doku bloğunun RNA bütünlüğünün, iki adet 10 μm'lik kesit kullanılarak ve tüm RNA fragman boyutlarını koruyan bir protokol kullanılarak RNA'nın ekstrakte edilmesiyle bir DV200 metriği kullanılarak değerlendirilmesi önerilir. DV200 puanı 50 veya daha yüksek olan numunelerin ve protokol konsantrasyonlarının sistematik olarak test edilmesi gerekir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, HGSC'li hastalardan alınan insan yumurtalık tümörü doku kesitlerinin formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) dokularını kullanır. Bu örnekler, yumurtalık kanseri için primer sitoredüktif cerrahi geçiren daha önce tedavi edilmemiş hastalardan toplandı. Tüm örnekler ve klinik veriler, Texas Üniversitesi MD Anderson'ın Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan protokoller kapsamında Jinekolojik Onkoloji ve Üreme Tıbbı Anabilim Dalı'nın yumurtalık kanseri deposundan elde edildi. Hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam ön büro personeli tarafından alındı ve çalışmalar kabul görmüş etik kurallara uygun olarak yürütüldü.

1. Doku hazırlığı

  1. Tüm FFPE numunelerini gece boyunca 60 °C'de pişirin ve her bir ekipman ve alet parçasını RNAse içermeyen suyla temizleyin. Bölümlerin yaklaşık 5 μm kalınlığında olduğundan emin olun.
    NOT: Bu protokol yumurtalık tümörleri için optimize edilmiştir, ancak daha ileri testlerden sonra potansiyel olarak diğer doku tipleriyle birlikte kullanılabilir.
  2. Her turda 5 dakika boyunca üç tur Ksilen ile deparafinizasyon ve her turda 3 dakika boyunca 10 tur rehidrasyon gerçekleştirin (%100 etanol (EtOH) 2x, %95 EtOH 2x, %70 EtOH 2x, %50 EtOH 2x, %30 EtOH 2x). 1x tris tamponlu salin (TBS) ile 2 dakika boyunca bir kez yıkayın.
    NOT: Bu mum alma adımı, tavsiye edilmesine rağmen, isteğe bağlıdır ve doku tipine bağlıdır.
  3. Deparafinizasyon ve rehidrasyondan sonra, 10 dakika boyunca% 3 Hidrojen Peroksit (H2O2 ) çözeltisi uygulayın. 1x TBS, 2x ile 2 dakika yıkayın. Ardından, 10 dakika boyunca% 3.7 Paraformaldehit (PFA) çözeltisi uygulayın. 1x TBS, 2x ile 2 dakika yıkayın.
    NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve yalnızca yağ dokuları veya ayrılmaya eğilimli numuneler için düşünülmelidir.
  4. Antijen alımının ilk turuna geçin. Bu protokol EZ-Retriever IR Sistemini kullanır. Sistemin talimatlarını izleyerek, numuneleri taze EZ-AR1 tamponuna batırılmış halde 95 °C'de 15 dakika mikrodalgada ısıtın. 20 dakika soğumaya bırakın.
  5. 1x TBS ile 2 dakika yıkayın. Daha sonra 2x TBS-T (%1 Ara ile 0.1x TBS) ile 2 dakika, 2x.

2. Protein uygulaması

  1. Hidrofobik bariyer kalemi ile her doku bölümünün etrafına bir bariyer çizin.
  2. 1x Antikor bloke edici solüsyon (tüm doku alanını kaplayacak kadar) ekleyin ve oda sıcaklığında bir nem odasında (ortam ve kontrolsüz nem) 30 dakika inkübe edin.
  3. Daha sonra, ilk birincil antikoru aynı bloke edici çözelti ile seyreltin, tüm doku alanını kaplayacak kadar uygulayın ve bir nem odasında oda sıcaklığında 1 saat inkübe etmeye bırakın.
    NOT: Bu protokolün geliştirilmesi sırasında, Anti-CD8 1:75'lik bir seyreltmede kullanılmıştır.
  4. 1x TBS-T, 3x'te 2 dakika yıkayın. Daha sonra Anti-Ms + Rb HRP'yi ekleyin ve numuneleri oda sıcaklığında bir nem odasında (ortam ve kontrolsüz nem) 10 dakika inkübe etmeye bırakın.
  5. 1x TBS-T, 3x'te 2 dakika yıkayın. İlk floroforu amplifikasyon seyreltici ile 1:100'de seyreltin ve nem odasında oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu protokolün geliştirilmesi sırasında 690 nm emisyon floroforu kullanılmıştır. Bu noktadan itibaren, ilk florofor turu uygulandıktan sonra prosedürün geri kalanı için minimum aydınlatma kullanılması önerilir.
  6. 1x TBS-T, 3x'te 2 dakika yıkayın. Numuneleri tekrar 15 dakika boyunca 95 ° C'de taze EZ-AR1 tamponuna daldırarak, ardından 20 dakika soğutarak, mikrodalgada ikinci tur antijen alımı ile ikinci tur antikor boyama turuna başlayın.
  7. 1x TBS ile 2 dakika yıkayın. Ardından 1x TBS-T, 2x ile 2 dakika yıkayın.
  8. 1x Antikor bloke edici solüsyonu oda sıcaklığında (ortam ve kontrolsüz nem) bir nem odasında 30 dakika boyunca tekrar uygulayın.
  9. İkinci birincil antikoru aynı bloke edici çözelti ile seyreltin, tüm doku alanını kaplayacak kadar uygulayın ve gece boyunca 4 °C'de bir nem odasında en az 16 saat inkübe etmeye bırakın.
    NOT: Bu protokolün geliştirilmesi sırasında, Anti-EpCAM 1:200'lük bir seyreltmede kullanılmıştır.
  10. Ertesi güne 2x TBS-T, 1x'te 3 dakika yıkayarak başlayın. Daha sonra Anti-Ms + Rb HRP'yi ekleyin ve numuneleri oda sıcaklığında bir nem odasında (ortam ve kontrolsüz nem) 10 dakika inkübe etmeye bırakın.
  11. 1x TBS-T, 3x'te 2 dakika yıkayın. İkinci floroforu amplifikasyon seyreltici ile 1:100'de seyreltin ve nem odasında oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu protokolün geliştirilmesi sırasında 620 nm emisyon floroforu kullanılmıştır.

3. Prob uygulaması

  1. 1x TBS-T, 3x'te 2 dakika yıkayın.
  2. Üçüncü ve son antijen alımını EZ-AR1 Elegance ile mikrodalgada 107 °C'de 15 dakika başlatın. 20 dakika soğumaya bırakın. 1x TBS'de 3 dakika yıkayın.
  3. RNAscope Proteaz Plus'ı (tüm doku alanını kaplayacak kadar) uygulayın ve 40 °C'de 30 dakika tutun. Bir fırın kullanın. 1x TBS, 2x'te 5 dakika yıkayın.
  4. miRNA LNA probunun 4 dakikası boyunca 90 °C'de denatürasyon yoluyla prob hazırlığı gerçekleştirin. Ardından probu hemen miRNA-ISH tamponu kullanarak seyreltin. Prob çözeltisini vorteksleyin ve döndürün.
    NOT: Bu protokolün geliştirilmesi sırasında miR-181c-3p hedef probu 1:250'lik bir seyreltmede kullanıldı.
  5. Probu uygulayın (tüm doku alanını kaplayacak kadar) ve 60 °C'de 1 saat fırına geri koyun. 5x Salin Sodyum Sitrat (SSC) tamponunda 5 dakika yıkayın.
  6. 60 °C'de önceden ısıtılmış SSC'de aşağıdaki sırayla beş sıkı yıkama ve her turda 5 dakika seyreltme gerçekleştirin: bir tur 5x SSC, iki tur 1x SSC ve iki tur 0,2x SSC.
  7. Oda sıcaklığında 0,2x SSC'de 5 dakika yıkayın. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bloke edici tampon ile inkübe edin. 1x TBS ve %0,5 Bloke Edici Reaktif Tozu kombinasyonunu kullanın, uygulamadan önce bloke edici solüsyonu girdap haline getirdiğinizden ve döndürdüğünüzden emin olun.
  8. Bir Anti-Digoxigenin (Fare) HRP Konjugatı uygulayın (bu numuneler için 1:500'lük bir seyreltme kullanılmıştır) ve nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  9. 1x TBS-T'de 5 dakika yıkayın, 3x Oda sıcaklığında (ortam ve kontrolsüz nem) bir nem odasında 10 dakika boyunca önerilen 1:50 oranında Tyramide Signal Amplification Plus Cyanine 3 (TSA+Cy3) florofor seyreltme uygulayın. Uygulamadan önce TSA+Cy3 solüsyonunu girdap haline getirdiğinizden ve döndürdüğünüzden emin olun.
  10. 1x TBS-T, 3x'te 5 dakika yıkayın.

4. Nükleer boyama ve montaj

  1. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çalışma solüsyonunu (tüm doku alanını kaplayacak kadar) oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada (ortam ve kontrolsüz nem) 5 dakika uygulayın.
    NOT: Bu protokol için, TBS içinde seyreltilmiş çalışan DAPI stoğu ile 1:1000'lik bir seyreltme kullanılmıştır.)
  2. 1x TBS-T, 3x'te 5 dakika yıkayın. Tamamlandığında, montaj medyasını kullanarak lameller uygulayın ve slaytları 10 dakika kurumaya bırakın. Slaytları 4 °C'de, görüntülemeden 24-72 saat önce ve üç ay sonrasına kadar karanlıkta saklayın.

5. Görüntüleme ve analiz

  1. Görüntüleme için, 40x büyütmede bir slayt tarama mikroskobu (tercih edilir) kullanın.
  2. Hücre segmentasyonu ve fenotipleme için DAPI ve protein karşı boyama kullanarak punkta'yı numaralandırmak için müteakip kantitatif analiz gerçekleştirin.
    NOT: Bu protokol sırasında, bir Fenogörüntüleyici HT ile görüntüleme kullandık. Tam slayt taramaları, mevcut floroforlar için uygun filtreler kullanılarak 40x büyütmede yakalandı ve çoğullanmış görüntüler daha sonra OME-TIFF dosyaları olarak dışa aktarıldı. Taranan görüntüler daha sonra nicel analiz için Visiopharm Görüntü Analiz Yazılımına yüklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolü test ederken, doğruluk ve karşılaştırma için aynı temsili numunenin iki seri bölümüne sahip olmak önemlidir. Bu durumda, sonuçları karşılaştırmak için Yüksek Dereceli Yumurtalık Kanseri (HGSC) örneği kullanıldı. Sadece miRNA boyamasından geçecek bir kontrol lamı (Şekil 2A-B) ve hem protein hem de miRNA boyamasına tabi tutulacak bir test lamı (Şekil 2C-J

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

MiRNA'ların önemi kabul edilip anlaşılsa da, hem normal gelişim hem de hastalık durumlarının gözlemlenmesi şu anda standart yöntemler kullanarak miRNA'ları incelemenin zorluğu nedeniyle engellenmektedir. Yerinde yöntemlerin azlığı, MARLIN'in (miRNA FISH tahlili) geliştirilmesine yol açtı. miRNA'ların homolojisi ve kısa uzunluğu göz önüne alındığında, konumlarını ve transkriptomik sonrası düzenleme üzerindeki etkilerini görselleştirmek zor hale gelir. Bu protokol geliştirme, Kili...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Tahlil geliştirilirken Basant'ın tez komitesinin bir parçası olan Chi Lam Au Yeung ve Manjunath Nimmakayalu'ya teşekkür ederiz. Ayrıca, kullanılan örnekleri kesitleyen ve sağlayan Samuel Mok. Son olarak, analiz ve Visiopharm yazılımının kullanımı sırasında kapsamlı yardım sağlayan Johan Doré ve Dan Winkowski'ye teşekkür ederiz. Bu araştırma kısmen Yumurtalık Kanseri Araştırma İttifakı (OCRA 811621 ve 891490), Sie Vakfı ve Stephanie C. Stelter Bağış Fonu tarafından finanse edildi. Bu araştırma, kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından MD Anderson'ın Kanser Merkezi Destek Hibesi P30 CA016672 ve Jared Burks'un NCI'nin Araştırma Uzmanı 1 R50 CA243707-01A1 aracılığıyla desteklenen Akış Sitometrisi ve Hücresel Görüntüleme Çekirdek Tesisi ile işbirliği içinde gerçekleştirildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x TRIS tamponlu tuzlu (TBS) pH 7.6 Thermo Fisher Scientific  J62662  K7Adımlar arasında aralıklı yıkamalar için
1x Opal Antikor Sulandırıcı/Blok ve Blok;Akoya BiosciencesARD1001EAProtein bloklama çözeltisi
1x Plus Otomasyon Amplifikasyon SulandırıcıAkoya Biosciences FP1609Opal floroforları seyreltmek için kullanılır
20x Konsantre & nbsp; Tuzlu Sodyum Sitrat (SSC) TamponuSigma-AldrichS6639-1LProb hibridizasyonundan sonra miRNA yıkamaları için
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) Thermo Fisher Bilimsel/ InvitrogenEN62248 / 62248Nükleer boyama için
ACD HybEZ II Hibritizasyon SistemiACD Biotechne321711miRNAscope protokolü sırasında sıcaklığı düzenlemek için kullanılan fırın
Anti-CD8 (D8A8Y), Tavşan mAbHücre Sinyal Teknolojileri85336SBu protokolü optimize etmek için kullanılan birincil antikor örneği
Anti-Digoksijenin (fare) HRP KonjugatıRevvity Sağlık Bilimleri MMNEF832001EAmiRNA tespiti için kullanılan ikincil reaktif
Anti-EpCAM (E6V8Y), Tavşan mAbHücre Sinyal Teknolojileri93790Bu protokolü optimize etmek için kullanılan birincil antikor örneği
Engelleyici Reaktif TozuAkoya Biosciences FP1012miRNA bloke çözümü
Etil Alkol %100 (200 Proof)Pharmco111000200Deparafinizasyon için
EZ-AR1 BufferBioGeneXHK521-XAKProtein aşamasında FFPE doku kesitlerinin antijen geri alınması için kullanılır
EZ-AR1 Elegance BufferBioGeneXHK546-XAKmiRNA prob aşamasında FFPE doku kesitlerinin antijen geri alınması için kullanılır
EZ-Retriever IR SistemiBioGeneXMW015-IRFFPE doku kesitlerinin antijen geri alınmasında kullanılan mikrodalga
Hidrojen Peroksit Çözeltisi %30 Sigma-Aldrich HX0640-5 Doku hazırlığı için. Endojen peroksidaz aktivitesini engellemeye ve yüksek renkli ürünler elde etmeye yardımcı olur
miR-181c-3p miRNA ProbuQiagen339112Bu protokolü optimize etmek için kullanılan miRNA probuna örnek
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)Qiagen339450 miRNA probunu seyreltmek için kullanılır
Opal 620Akoya Biosciences FP1495001KTPrimer antikoru tanımlamak için florofor
Opal 690 Akoya Biosciences FP1497001KTPrimer antikoru tanımlamak için florofor
Opal Anti-Ms + Rb HRPAkoya BiosciencesARH1001EATespit ajanı olarak kullanılan ikincil antikor
Pierce 16% Formaldehit (w/v), Metanol içermeyenThermo Fisher Scientific28908doku hazırlığı için %3,7 PFA yapmak
ProLong Diamond AntifadeThermo Fisher ScientificP36970Montaj medyası
RNAscope Proteaz PlusACD Biotechne322331Doku kesitlerini geçirimlileştirmek için  proteinleri kısmen sindirerek ve hedef miRNA moleküllerini açığa çıkarmak
RNAssız su Corning 46-000-CM Tüm ekipmanları temizlemek ve hazırlamak, gerektiğinde dilatant olarak kullanmak ve gerekli olduğunda dilatant olarak kullanmak  
Tween 20Sigma-AldrichP1379-25MLTBS-T yapmak için
Tiramid Sinyal Güçlendirmesi Plus Siyanin 3Akoya Biosciences NEL744001KTmiRNA'yı tanımlamak için florofor
U6 ve Scramble miRNA ProblarıQiagen339459Isteğe bağlı kontrol probları
Ksilen Histolojik DerecesiThermo Fisher ScientificUN1307Deparafinizasyon için

Kaynaklar

  1. Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers. 14 (10), 2569(2022).
  2. Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. Microrna in cancer: The involvement of aberrant microrna biogenesis regulatory pathways. Genes Cancer. 1 (11), 1100-1114 (2010).
  3. Peng, Y., Croce, C. M. The role of microRNAs in human cancer. Signal Transduct Targeted Ther. 1 (1), 15004(2016).
  4. Shi, Y., et al. Mirnas and cancer: Key link in diagnosis and therapy. Genes. 12 (8), 1289(2021).
  5. Juźwik, C. A., et al. MicroRNA dysregulation in neurodegenerative diseases: A systematic review. Prog Neurobiol. 182, 101664(2019).
  6. Pauley, K. M., Cha, S., Chan, E. K. L. Microrna in autoimmunity and autoimmune diseases. J Autoimmun. 32 (3-4), 189-194 (2009).
  7. Lee, Y. S., Dutta, A. Micrornas in cancer. Ann Rev Pathol Mech Dis. 4 (1), 199-227 (2009).
  8. Thomson, D. W., et al. Assessing the gene regulatory properties of argonaute-bound small rnas of diverse genomic origin. Nuc Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
  9. Kim, Y. K., Han, J. Nobel-winning microRNA, the microRNAestro of gene silencing. Mol Cells. 47 (11), 100123(2024).
  10. Lai, X., Eberhardt, M., Schmitz, U., Vera, J. Systems biology-based investigation of cooperating microRNAs as monotherapy or adjuvant therapy in cancer. Nuc Acid Res. 47 (15), 7753-7766 (2019).
  11. Garzon, R., Marcucci, G., Croce, C. M. Targeting micrornas in cancer: Rationale, strategies and challenges. Nat Rev Drug Disc. 9 (10), 775-789 (2010).
  12. Jiao, X., et al. MicroRNA: The impact on cancer stemness and therapeutic resistance. Cells. 9 (1), 8(2019).
  13. Lin, B., Jiang, J., Jia, J., Zhou, X. Recent advances in exosomal miRNA biosensing for liquid biopsy. Molecules. 27 (21), 7145(2022).
  14. Farrell, D., et al. The identification of circulating miRNAs in bovine serum and their potential as novel biomarkers of early Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection. PLoS One. 10 (7), e0134310(2015).
  15. Aparicio-Puerta, E., et al. Srnabench and srnatoolbox 2022 update: Accurate mirna and sncrna profiling for model and non-model organisms. Nuc Acid Res. 50 (W1), W710-W717 (2022).
  16. Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. Mirdeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nuc Acid Res. 40 (1), 37-52 (2012).
  17. Chou, C. H., et al. Mirtarbase 2016: Updates to the experimentally validated miRNA-target interactions database. Nuc Acid Res. 44 (D1), D239-D247 (2016).
  18. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  19. Eichert, A., et al. The crystal structure of an 'all locked' nucleic acid duplex. Nuc Acid Res. 38 (19), 6729-6736 (2010).
  20. Viratham Pulsawatdi, A., et al. A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment. Mol Oncol. 14 (10), 2384-2402 (2020).
  21. Janati-Idrissi, S., et al. Looking for a needle in a haystack: De novo phenotypic target identification reveals hippo pathway-mediated mir-202 regulation of egg production. Nuc Acid Res. 52 (2), 738-754 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

MikroRNA TespitiMultiplex mm nofloresanT m r Mikro evresiProtein KolokalizasyonuFFPE DokuTiramid Sinyal AmplifikasyonuUzamsal TranskriptomikEpCAM Antikoru
Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.