Method Article

Kütle Spektrometresi Görüntüleme ile Formalinle Sabitlenmiş, Parafine Gömülü Numunelerde Biyomoleküllerin Sıralı Tespiti

DOI:

10.3791/68618

⸱

October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Texas at Austin, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku örneklerinde sıralı metabolit, N-bağlı glikan ve triptik peptit tespiti için bir Kütle Spektrometresi Görüntüleme protokolü sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokular, organın işlevlerini yerine getirmek için birbirleriyle etkileşime giren çok çeşitli hücre tiplerinden ve biyomoleküllerden oluşan karmaşık hücresel ortamlardır. Geleneksel olarak, metabolitler, glikanlar ve proteinler gibi biyomoleküllerin analizine yönelik teknikler, dokunun homojenizasyonunu ve tüm uzamsal bilgilerin yok edilmesini içeriyordu. Bu geleneksel yöntemler, karmaşık hücre içi ve hücre dışı moleküler etkileşimlerin tam olarak anlaşılmasını engelledi. Kütle Spektrometresi Görüntüleme (MSI) ise dokudaki biyomoleküllerin uzamsal bilgilerini korumakla kalmaz, aynı zamanda tek hücreye yakın çözünürlükte sıralı analiz yoluyla aynı doku kesitinden birden fazla analit sınıfının tespit edilmesine de olanak tanır. Bu, farklı biyomolekül sınıfları arasındaki moleküler etkileşimlerin daha eksiksiz bir resmini elde etmemizi sağlar. Burada sunulan protokol, metabolitlerin, N-bağlı glikanların ve triptik peptitlerin aynı doku kesitinden 20 μm çözünürlükte sırayla kütle spektrometrisi görüntülemesini gerçekleştirme adımlarını özetlemektedir. Analit sınıflarının görüntülenme sırasının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi ve bütünlüğü sağlamak için bölümlerin dikkatli bir şekilde ele alınması, aynı bölümden birden fazla yüksek kaliteli görüntünün toplanmasına olanak tanır. Bu veriler daha sonra, aynı hücrenin bu bitişik bölümlerde analiz edilebildiği seri bölümlerden toplanan diğer uzamsal omik verilerle (transkriptomik, immünohistokimya, vb.) entegre edilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle Spektrometresi Görüntüleme (MSI), dokuda bulunan moleküller hakkında önceden bilgi sahibi olmaya gerek kalmadan, ince doku kesitlerinden yüzlerce ila binlerce biyomolekülün saptanmasına ve görselleştirilmesine olanak tanıyan güçlü bir tekniktir ve bu da onu biyobelirteç keşfi için mükemmel bir araç haline getirir1. Desorpsiyon ElektroSprey İyonizasyon (DESI)2,3, Kızılötesi Matris Destekli Lazer Desorpsiyon ElektroSprey İyonizasyon (IR-MALDESI)4 ve İkincil İyon Kütle Spektrometrisi (SIMS)5 dahil olmak üzere çeşitli MSI türleri farklı laboratuvarlar tarafından kullanılırken, Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon (MALDI) en yaygın kullanılan ve en çok yönlü olanı olmaya devam etmektedir. Çoğu biyomolekül sınıfı, dokunun yıkanması/ön işlemi, enzimatik sindirim ve kullanılan matris/çözücü dahil olmak üzere numune hazırlamanın uyarlanmasıyla MSI tarafından tespit edilebilir 6,7. MALDI MSI, metabolitlerin, lipidlerin, glikanların, proteinlerin ve proteolitik peptitlerin tespiti için kullanılmıştır.

MSI çalışmaları, diğerlerinin yanı sıra hastalık mekanizmalarını 8,9 daha iyi anlamak, kanser derecelendirmesini ve evrelemesini10,11 iyileştirmek, tedavi sonucunutahmin etmek 12, tanıyıiyileştirmek 13 ve moleküler tümör sınırlarını14 belirlemek için çeşitli klinik ve klinik öncesi çalışmalarda kullanılmıştır. Bu çalışmaların çoğu, yalnızca tek bir analit sınıfının tespitine odaklanmıştır. Bununla birlikte, aynı numuneden birden fazla biyomolekül sınıfını analiz etmek genellikle ilgi çekicidir. Geleneksel olarak bu, dokuların seri kesitleriyle gerçekleştirilir. Ancak daha yakın zamanlarda, aynı doku kesitinden birden fazla analit sınıfının sırayla analiz edilmesinin örnekleri gösterilmiştir. Örneğin, Yagnik ve ark. donmuş dokunun lipid görüntülemesini ve ardından hücre tipi sınıflandırması15 için aynı bölümden MALDI İmmünohistokimyasını göstermiştir. Clift ve ark. sırasıyla N-bağlı glikanların, hücre dışı matris proteinlerinin ve genel proteinlerin görüntülenmesi için PNGaseF, Kollajenaz ve Tripsin'in formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) doku kesitlerine sıralı uygulamasını göstermiştir16. Escobar et al. donmuş doku17'nin aynı bölümünden N-bağlı glikanların, O-GlcNAc'nin ve triptik peptitlerin sıralı analizini gösterdi. Bu tür deneyler, önce en kolay kaybolan analitleri, ardından dokuda daha kararlı olanları analiz etmek için dikkatli deneysel planlama yoluyla gerçekleştirilir. Çoğu durumda, istenmeyen molekül sınıflarını uzaklaştırmak için kullanılan yıkamalar, daha önce uygulanan matrisi ortadan kaldıran her yıkamanın aynı zamanda görüntülenecek bir sonraki analit sınıfının sinyalini arttırmaya yardımcı olduğu, yararlanılabilecek bir özellik olan diğer molekül6 sınıflarının geliştirilmesine yardımcı olur.

Son zamanlarda, FFPE yumurtalık kanseri dokusunun18 aynı bölümünden metabolitlerin, N-bağlı glikanların ve triptik peptitlerin sıralı analizi için bir iş akışı yayınladık. Burada, aynı doku kesitinden bu üç biyomolekül sınıfının analizi için ayrıntılı iş akışını sunuyoruz; protokole genel bir bakış Şekil 1'de detaylandırılmıştır. Bildiğimiz kadarıyla bu, FFPE dokusundan ardışık görüntüleme için bu iş akışını ayrıntılı olarak açıklayan ilk protokoldür. Kısaca, negatif iyon modu metabolit görüntüleme için doku kesitleri 1,5-diaminonaftalin matrisi (%50 asetonitrilde 10 mg/mL) ile kaplanmadan önce ksilen ile mumdan arındırılır. Matris daha sonra çıkarılır, bölümler rehidre edilir ve N-bağlı glikanları in situ serbest bırakmak için PNGase F (amonyum bikarbonat içinde 0.1 μg/μL) püskürtülmeden önce antijen alınır. İnkübasyondan sonra kesitler α-siyano-4-hidroksisinnamik asit (CHCA) (%70 asetonitril, %0,1 trifloroasetik asit içinde 10 mg/mL) matrisi ile kaplanır ve pozitif iyon modunda görüntülenir. Matris daha sonra tekrar çıkarılır, rehidrasyon ve antijen alımı tekrarlanır ve kesitlere tripsin (amonyum bikarbonat içinde 0.075 μg/μL) püskürtülür ve tekrar CHCA (%70 asetonitril, %0.1 trifloroasetik asit içinde 10 mg/mL) matrisi ile kaplanmadan önce inkübe edilir ve pozitif iyon modunda görüntülenir. Tüm çözeltiler kullanımdan hemen önce taze yapılmalı ve mümkünse deneyler art arda 3 gün boyunca yapılmalıdır. Gecikmelerle karşılaşılırsa, bölümler -80 °C'lik bir dondurucuda kurutma altında saklanmalıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yüksek dereceli seröz yumurtalık karsinomu için primer sitoredüktif cerrahi geçiren daha önce tedavi edilmemiş hastalardan toplanan formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) dokuları kullanır. Tüm klinik veriler, Texas Üniversitesi MD Anderson'ın Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan protokoller kapsamında Jinekolojik Onkoloji ve Üreme Tıbbı Anabilim Dalı'nın yumurtalık kanseri deposundan elde edildi. Hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam ön büro personeli tarafından alındı ve çalışmalar kabul görmüş etik kurallara uygun olarak yürütüldü.

1. Metabolit görüntüleme numunesi hazırlama

NOT: Bu protokol, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku bölümlerinin (4 μm kalınlık) cam mikroskop lamlarına zaten monte edildiğini varsayar, çünkü klinik numuneler genellikle histoteknisyenler tarafından bir klinik patoloji çekirdeği içinde kesitlenmelidir. Burada sunulan çalışma, referans verilen TOF cihazında gerçekleştirildiğinden, ortogonal TOF ölçümü, MSI deneylerinde geleneksel olarak kullanılan iletken slaytlara olan ihtiyacı azaltır. Standart mikroskop slaytlarının kullanımı, klinik patoloji laboratuvarlarındaki standart iş akışlarına daha elverişli olmasının yanı sıra, halihazırda slaytlarda bulunan arşiv dokusunun kullanılmasına da olanak tanır.

  1. Bir elmas çizici kullanarak slaytın dört köşesinde referans işaretleri yapın.
  2. 3 dakika boyunca histolojik dereceli ksilene daldırarak kesitleri deparafinize edin.
    NOT: Ksilen zararlıdır ve kimyasal çeker ocakta kullanılmalıdır.
  3. Bölümleri 3 dakika taze ksilene batırın.
  4. Slaytın oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
  5. Slaytı bir Slayt Adaptörü Hedefine yerleştirin.
  6. 4.800 dpi çözünürlükte düz yataklı bir tarayıcı kullanarak slaytın optik görüntüsünü elde edin.
  7. 15 mg 1,5-diaminonaftalini (DAN) 1.5 mL %50 ACN içinde çözerek bir MALDI matrisi yapın. Tamamen eriyene kadar sonikat yapın, ~ 5 dakika. Numune döngüsüne yüklemeden önce matris çözeltisini filtreleyin.
    NOT: DAN şüpheli bir kanserojendir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla kullanılmalıdır. Matris püskürtme kimyasal çeker ocakta yapılmalıdır.
  8. Aşağıdaki parametrelere sahip bir Robotik Reaktif Püskürtücü kullanarak slayta DAN solüsyonu püskürtün: İz Hızı - 1.200 mm/s; Palet Aralığı - 3 mm; meme sıcaklığı - 60 °C; Nozul Yüksekliği - 40 mm; Akış Hızı - 100 μL/dak; Geçişler - 4; N 2 Basınç - 10 psi; Desen - CC
  9. Slayt üzerinde bilinen bir yere metanol içinde süspanse edilmiş 0,5 μL kırmızı fosfor uygulayın.

2. Metabolit görüntüleme verilerinin toplanması

  1. Hazırlanan slaytları bir Slayt Adaptörü II'ye yerleştirin ve bir timsTOF fleX MALDI QTOF kütle spektrometresine yükleyin.
  2. Negatif iyon modu veri toplama için uygun yöntemi tims OFF ile timsControl'e yükleyin. Cihaz halihazırda negatif iyon modunda değilse, metabolitler için aşağıdaki cihaz parametreleriyle kalibrasyon ve veri toplamadan önce dengeleme için polariteyi değiştirdikten sonra en az 25 dakika bekleyin: m/z aralığı - 50 - 600; Lazer Tarama Aralığı - hem X hem de Y'de 16,0 μm; Ortaya Çıkan Alan Boyutu - hem X hem de Y'de 20.0 μm; Lazer Çekimleri - 150; Lazer Akıcılığı - ~%30; Huni 1 RF - 150.0 Vpp; Huni 2 RF - 200.0 Vpp; Çok kutuplu RF - 200.0 Vpp; Çarpışma Enerjisi - 10.0 eV; Çarpışma RF - 500.0 Vpp; Aktarım Süresi - 55.0 μs; PrePulse Depolama - 5,0 μs (Ek Şekil S1).
  3. Sample Carrier Sekmesinde bir Hedef Profili (Şimdi Oluştur düğmesine tıklayın) ve Odak Ayarı (Şimdi Ayarla düğmesine tıklayın) gerçekleştirin. Lazerin artı işaretiyle tam olarak hizalandığından emin olmak için gerekirse lazer sekmesinde lazer konumunu X ve Y olarak ayarlayın.
  4. Slayttaki noktadan en az beş set lazer atışını toplayarak bir kırmızı fosfor spektrumu toplayın.
  5. Kalibrasyon Sekmesindeki Kalibre Et düğmesine tıklayarak bir kalibrasyon gerçekleştirin. Çok düşük yoğunluklu veya yüksek ppm Hatası olan tepe noktalarını kaldırın.
    NOT: Fosfor kümeleri (P2 ve P4) bile genellikle çok zayıf bir sinyal verir. Kabul et'e tıklamadan önce kalibrasyon puanı %100 olmalıdır. Değilse, toplanan spektrumu temizleyin ve yeni bir tane edinin.
  6. flexImaging yazılımını başlatın. Görüntü alma GUI'si otomatik olarak başlayacaktır.
  7. Görüntüleme Çalıştırmasını Seç penceresinde Yeni bir görüntüleme çalıştırması ayarla'yı seçin.
  8. İş Akışı Seç penceresinde Klasik iş akışı'nı seçin.
  9. Veri Depolama Penceresinde, veriler için bir Görüntüleme Çalıştırması Adı ve Sonuç Dizini sağlayın.
    NOT: Dosya adlarında boşluk kullanılmamalıdır.
  10. Alım Ayarları penceresinde, Kullanıcı tanımlı ölçüm bölgeleri'ni seçin ve Raster Genişliği kutusuna 20 yazın. Daha önce oluşturulan timsControl yöntemini seçmek için Gözat'a tıklayın.
  11. Örnek Görüntü penceresinde, düz yataklı tarayıcı kullanılarak elde edilen optik görüntüyü seçmek için Gözat'ı tıklatın.
  12. Örneği Öğret penceresinde, optik görüntü ile slayt arasında üç noktalı hizalama gerçekleştirin; ardından numune taşıyıcıyı slayttaki ilk kazınmış referansa taşıyın ve timsControl'deki artı işaretini aşındırmadaki belirgin bir özellikle hizalayın. Resmi yakınlaştırın (%100 Yakınlaştırma önerilir), Örnek Görüntüyü Öğretme Noktalarını Ayarla olarak ayarlayın ve optik resimde aynı konuma tıklayın. Toplam üç öğretme noktası için bu işlemi 2 kat daha tekrarlayın. Öğretimi tamamlamak için İleri'ye tıklayın.
  13. Yeni Görüntüleme Çalıştırma Sihirbazı'ndan çıkmak için Tamam'ı tıklatın.
  14. Yazılımdaki Pozisyon Numune Taşıyıcı düğmesine tıklayarak öğretimin doğruluğunu kontrol edin. Yakınlaştırın ve resimdeki dördüncü (kullanılmayan) referans noktasının belirgin bir özelliğine tıklayın; numune taşıyıcı, timsControl içinde bu konuma hareket edecektir. Artı işaretinin seçilen özellikle aynı hizada olduğunu onaylayın. Sıralanmazlarsa, flexImaging'deki öğretimi temizleyin ve doğruluğu artırmak için öğretim sürecini tekrarlayın.
  15. Yazılımda, Poligon Ölçüm Bölgesi Ekle aracını seçin ve görüntülenecek doku(lar)ın ana hatlarını çizin. Farenin her tıklaması bir bağlantı noktası oluşturacaktır. Noktaları tek tek kaldırmak için klavyedeki geri al düğmesine basın. Bölge çizildikten sonra, çokgeni kapatmak için fareye çift tıklayın.
  16. Lazeri doku içinde birkaç yere ateşleyerek sinyali kontrol edin. Öğretimi kontrol etmek için Adım 2.14'teki gibi Örnek Taşıyıcıyı Konumlandır düğmesini kullanarak resimdeki bir konuma tıklayın. Spektruma m/z 157 ve 313 civarındaki matris tepe noktaları hakim olacaktır; Sırasıyla birçok küçük molekül metaboliti ve yağ asidi zirvesini göstermek için 154 ve 250-300'ün altındaki M/Z bölgesini yakınlaştırın. Optimum sinyal için lazer akıcılığını gerektiği gibi ayarlayın.
  17. timsControl yöntemini kaydedin.
  18. Yazılımdaki AutoXecute Run'ı Başlat düğmesine tıklayarak görüntüleme alımını başlatın
    NOT: DAN matrisi ile negatif iyon modunda görüntüleme, diğerlerinin yanı sıra TCA döngüsünden, amino asitlerden ve yağ asitlerinden çok sayıda metabolitin saptanmasına neden olur.

3. N'ye bağlı glikan görüntüleme için numune hazırlama

  1. Numuneyi kütle spektrometresinden çıkardıktan sonra, slaytı 1 dakika boyunca %100 etanole (200 kanıt) batırarak DAN matrisini çıkarın.
  2. Slaytı Coplin kavanozlarında yeniden sulandırın: 1 dakika boyunca taze %100 etanol; 1 dakika boyunca %95 etanol; 1 dakika boyunca %70 etanol; 3 dakika su; 3 dakika tatlı su.
  3. Slaytın ~15 dakika kurumasını bekleyin.
  4. Slaytı 100 mM Tris tamponuna (6.06 g Tris Bazının 500 mL suda çözülmesiyle yapılır ve pH'ı gerektiği gibi ayarlayarak yapılır), pH 9'a, üstte gevşek bir şekilde yerleştirilmiş bir kapakla bir Coplin kavanozuna daldırarak antijen alımını gerçekleştirin ve haznede 500 mL su bulunan bir Cloaking Odasına yerleştirin. 20 dakika boyunca 95 °C'ye ısıtın.
  5. Coplin Kavanozunu Cloaking Odasından çıkarın ve 20 dakika soğuması için tezgahın üzerine koyun.
  6. Beş değişiklikte slaytı suyla tamponla değiştirin. İlk üçü için çözeltinin yarısını dökün ve suyla değiştirin. Son ikisi için, tüm çözeltiyi dökün ve suyla değiştirin.
  7. Slaytın tamamen kurumasını bekleyin.
  8. PNGaseF uygulamasından sonra lamın inkübasyonu için bir nem odası oluşturun. 100 mm çapında bir Petri kabının altını kaplamak için emici bir mendilden bir daire kesin. Petri kabının her iki tarafında yastık oluşturmak için iki laboratuvar mendilini yuvarlayın (Şekil 2). Bu mendilleri doyurmak için 8 mL su ekleyin ve kapağı Petri kabının üzerine koyun ve ön ısıtmak için en az 30 dakika 37 °C'de bir fırına koyun.
    NOT: Yemeğin içi buharlı görünmelidir.
  9. Karıştırmak için 200 μL 100 mM amonyum bikarbonat, pH 7.8 ve girdap içinde 100 μg liyofilize enzimi sulandırarak PNGaseF'yi hazırlayın. Çözeltiyi 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve suyla 1 mL'ye seyreltin.
  10. Aşağıdaki parametrelerle Robotik Reaktif Püskürtücüyü kullanarak lamı PNGaseF ile püskürtün. Düşük hacimli/düşük akış hızlı uygulamalar için şırınga pompasını kullanın: Palet Hızı - 1200 mm/s; Palet Aralığı - 3 mm; meme sıcaklığı - 45 °C; Nozul Yüksekliği - 40 mm; Akış Hızı - 25 μL / dak; Geçişler - 15; N 2 Basınç - 10 psi; Desen - CC
  11. Slaytı, bir ucu laboratuvar silme yastıklarının her birine gelecek şekilde, doku tarafı yukarı bakacak şekilde önceden ısıtılmış Petri kabına yerleştirin. Sürgüyü değiştirin ve Petri kabını yapışkan sızdırmazlık filmi ile kapatın. 37 °C'lik fırına yerleştirin ve Petri kabının üzerine 40 °C'ye ayarlanmış bir sürüngen ısıtma yastığı yerleştirin.
    NOT: Bu, kapağı yemeğin en sıcak kısmı olarak tutar ve kapakta yoğuşma oluşmasını ve görüntülerde artefaktlara neden olacak şekilde doku üzerine düşmesini önler.
  12. Sindirimin devam etmesine izin vermek için slaytı 2 saat inkübe edin.
  13. Slaytı Petri kabından çıkarın ve ~5 dakika kurumasını bekleyin.
  14. 15 mg α-siyano-4-hidroksisinnamik asidi (CHCA) 1.5 mL %70 ACN, %0.1 TFA, 10 mM amonyum fosfat içinde çözerek MALDI matrisini yapın.
    NOT: TFA yakıcıdır ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla bir başlıkta kullanılmalıdır.
  15. Tamamen eriyene kadar sonikat yapın, ~ 5 dakika.
  16. Numune döngüsüne yüklemeden önce matris çözeltisini filtreleyin.
  17. Aşağıdaki parametrelere sahip Robotik Reaktif Püskürtücüyü kullanarak slayta CHCA püskürtün: İz Hızı - 1.200 mm/s; Palet Aralığı - 3 mm; meme sıcaklığı - 75 °C; Nozul Yüksekliği - 40 mm; Akış Hızı - 120 μL/dak; Geçişler - 3; N 2 Basınç - 10 psi; Desen - SS
  18. Slayt üzerinde bilinen bir yere metanol içinde süspanse edilmiş 0,5 μL kırmızı fosfor uygulayın.

4. N-Bağlantılı glikan görüntüleme verilerinin toplanması

  1. Hazırlanan slaytları Slayt Adaptörü hedefine yerleştirin ve MALDI QTOF kütle spektrometresine yükleyin.
  2. timsControl'de pozitif iyon modu veri toplama için uygun yöntemi yükleyin. Cihaz halihazırda pozitif iyon modunda değilse, kalibrasyondan önce dengeleme için polariteyi değiştirdikten sonra en az 25 dakika bekleyin ve glikanlar için aşağıdaki cihaz parametreleriyle veri toplayın: m/z aralığı - 700-3500; Lazer Tarama Aralığı - hem X hem de Y'de 16,0 μm; Ortaya Çıkan Alan Boyutu - hem X hem de Y'de 20.0 μm; Lazer Çekimleri - 200; Lazer Akıcılığı - ~%25; Huni 1 RF - 450.0 Vpp; Huni 2 RF - 500.0 Vpp; Çok kutuplu RF - 500.0 Vpp; Çarpışma Enerjisi - 10.0 eV; Çarpışma RF - 2.700,0 Vpp; Aktarım Süresi - 140.0 μs; PrePulse Depolama - 14,0 μs (Ek Şekil S2).
  3. Numune Taşıyıcı Sekmesinde bir Hedef Profili (Şimdi Oluştur düğmesine tıklayın) ve Odak Ayarı (Şimdi Ayarla düğmesine tıklayın) gerçekleştirin. Lazerin artı işaretiyle hizalandığından emin olmak için gerekirse lazer sekmesinde lazer konumunu X ve Y olarak ayarlayın.
  4. Slayttaki noktadan en az beş set lazer atışını toplayarak bir kırmızı fosfor spektrumu toplayın.
  5. Kalibrasyon Sekmesindeki Kalibre Et düğmesine tıklayarak bir kalibrasyon gerçekleştirin. Çok düşük yoğunluklu veya yüksek ppm Hatası olan tepe noktalarını kaldırın.
    NOT: Kabul et'e tıklamadan önce kalibrasyon puanı %100 olmalıdır. Değilse, toplanan spektrumu temizleyin ve yeni bir tane edinin.
  6. Daha önce yazılımda metabolit görüntüleme için kullanılan .mis dosyasını açın.
  7. Dosyayı, glikan verisi olduğunu belirten yeni bir adla kaydedin.
  8. Altında Düzenle | Görüntüleme Çalıştırma Özellikleri, toplama yöntemini istenen glikan yöntemine değiştirin.
  9. Düzenle | Öğretme Noktalarını Temizle.
    NOT: Sürgü, sürgü adaptöründen çıkarıldıktan ve yeniden yüklendikten sonra tam olarak aynı konumda olmayacaktır.
  10. Düzenle | Öğretme Noktalarını Ayarlayın; orijinal Görüntüleme Sihirbazı'nda yapıldığı gibi 3 nokta ayarlayın (Adım 2.12).
  11. Yazılımdaki Pozisyon Numune Taşıyıcı düğmesine tıklayarak öğretimin doğruluğunu kontrol edin. Yakınlaştırın ve resimdeki dördüncü (kullanılmayan) referans noktasının belirgin bir özelliğine tıklayın. Numune taşıyıcı, timsControl içinde bu konuma hareket edecektir; Artı işaretinin seçilen özellikle aynı hizada olduğunu onaylayın.
    NOT: Artı işaretleri aynı hizada değilse, öğretimi temizleyin ve doğruluğu artırmak için öğretme işlemini tekrarlayın.
  12. Dosyayı kaydedin.
  13. Lazeri doku içinde birkaç yere ateşleyerek sinyali kontrol edin. Öğretimi kontrol etmek için Adım 4.11'deki gibi Örnek Taşıyıcıyı Konumlandır düğmesini kullanarak görüntüdeki bir konuma tıklayın. Spektrumun, tipik olarak m/z 1.663 ve 1.809'da baskın tepe noktaları olan bol miktarda glikan tepe noktasına sahip olduğunu doğrulayın. Optimum sinyal için lazer akıcılığını gerektiği gibi ayarlayın.
  14. timsControl yöntemini kaydedin.
  15. AutoXecute Çalıştırmayı Başlat düğmesine tıklayarak görüntüleme alımını başlatın.

5. Triptik peptit görüntüleme için numune hazırlama

  1. Slaytı ~1 dakika boyunca %100 etanole (200 kanıt) batırarak CHCA matrisini çıkarın
  2. Slaytı Coplin kavanozlarında aşağıdaki gibi yeniden sulandırın: 1 dakika boyunca taze %100 etanol; 1 dakika boyunca %95 etanol; 1 dakika boyunca %70 etanol; 3 dakika su; 3 dakika tatlı su.
  3. Slaytın ~15 dakika kurumasını bekleyin.
  4. Slaytı, haznede 500 mL su ile bir Cloaking Odasına yerleştirilen, üstüne gevşek bir şekilde yerleştirilmiş bir kapağı olan bir Coplin kavanozuna 100 mM Tris tamponuna, pH 9'a daldırarak antijen alımını gerçekleştirin. 20 dakika boyunca 95 °C'ye ısıtın.
    NOT: Bu ikinci antijen alımı, tripsinin bölünme bölgelerine daha verimli erişimi için proteinleri denatüre etmek için gereklidir.
  5. Coplin Kavanozunu Cloaking Odasından çıkarın ve 20 dakika soğuması için tezgahın üzerine koyun.
  6. Beş değişiklikte slaytı suyla tamponla değiştirin. İlk üçü için çözeltinin yarısını dökün ve suyla değiştirin. Son ikisi için, tüm çözeltiyi dökün ve suyla değiştirin.
  7. Slaytın tamamen kurumasını bekleyin.
  8. 100 μg liyofilize enzimi 200 μL 100 mM asetik asit içinde sulandırarak tripsin hazırlayın ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Deney için uygun boyutlara (tipik olarak 40 μL) ayırın ve -20 °C'de saklayın.
  9. 350 μL 100 mM amonyum bikarbonat, pH 7.8 ve 39 μL ACN ekleyerek 40 μL'lik bir tripsin alikot hazırlayın. İyice karıştırın.
    NOT: Asetonitril (%10 ACN), sulu çözeltiye kıyasla tripsin aktivitesini arttırır ve püskürtme19 için çözeltinin yüzey gerilimini azaltır.
  10. Aşağıdaki parametrelere sahip bir Robotik Reaktif Püskürtücü kullanarak slayta Tripsin püskürtün. Düşük hacimli/düşük akış hızlı uygulamalar için şırınga pompasını kullanın: Palet Hızı - 750 mm/s; Palet Aralığı - 3 mm; meme sıcaklığı - 30 °C; Nozul Yüksekliği - 40 mm; Akış Hızı - 10 μL/dak; Geçişler - 12; N 2 Basınç - 10 psi; Desen - SS
  11. 100 mm çapında bir Petri kabının dibine bir kare emici mendil yerleştirin; köşelerin tabağın kenarına değdiğinden emin olun ve mendilin üzerine 1 mL su dağıtın.
  12. Slaytı mendilin üstüne, mendil tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin, kapağı Petri kabının üzerine yerleştirin ve Petri kabını yapışkan sızdırmazlık filmiyle kapatın.
  13. Sindirimin devam etmesine izin vermek için slaytı 37 °C'de 4 saat inkübe edin.
  14. Slaytı Petri kabından çıkarın ve ~5 dakika kurumasını bekleyin.
  15. 15 mg α-siyano-4-hidroksisinnamik asidi (CHCA) 1.5 mL %70 ACN, %0.1 TFA, 10 mM amonyum fosfat içinde çözerek MALDI matrisi yapın.
  16. Tamamen eriyene kadar sonikat yapın, ~ 5 dakika.
  17. Numune döngüsüne yüklemeden önce matris çözeltisini filtreleyin.
  18. Aşağıdaki parametrelere sahip bir Robotik Reaktif Püskürtücü kullanarak slayta CHCA püskürtün: İz Hızı - 1200 mm/s; Palet Aralığı - 3 mm; meme sıcaklığı - 75 °C; Nozul Yüksekliği - 40 mm; Akış Hızı - 120 μL/dak; Geçişler - 4; N 2 Basınç - 10 psi; Desen - SS
  19. Slayt üzerinde bilinen bir yere metanol içinde süspanse edilmiş 0,5 μL kırmızı fosfor uygulayın.

6. Triptik peptit görüntüleme verilerinin toplanması

  1. Hazırlanan slaytları bir Slayt Adaptörüne yerleştirin ve bir timsTOF MALDI QTOF kütle spektrometresine yükleyin.
  2. timsControl'de pozitif iyon modu veri toplama için uygun yöntemi yükleyin. Cihaz halihazırda pozitif iyon modunda değilse, peptitler için aşağıdaki cihaz parametrelerini kullanarak kalibrasyon ve veri toplamadan önce dengeleme için polariteyi değiştirdikten sonra en az 25 dakika bekleyin: m/z aralığı - 600-4500; Lazer Tarama Aralığı - hem X hem de Y'de 16,0 μm; Ortaya Çıkan Alan Boyutu - hem X hem de Y'de 20.0 μm; Lazer Çekimleri - 200; Lazer Akıcılığı - ~%25; Huni 1 RF - 450.0 Vpp; Huni 2 RF - 500.0 Vpp; Çok kutuplu RF - 600.0 Vpp; Çarpışma Enerjisi - 10.0 eV; Çarpışma RF - 3400.0 Vpp; Aktarım Süresi - 180.0 μs; PrePulse Depolama - 18,0 μs (Ek Şekil S3).
  3. Sample Carrier Sekmesinde bir Hedef Profili (Şimdi Oluştur düğmesine tıklayın) ve Odak Ayarı (Şimdi Ayarla düğmesine tıklayın) gerçekleştirin. Lazerin artı işaretiyle hizalandığından emin olmak için gerekirse lazer tırnağında lazer konumunu X ve Y olarak ayarlayın.
  4. Slayttaki noktadan en az beş set lazer atışını toplayarak bir kırmızı fosfor spektrumu toplayın.
  5. Kalibrasyon Sekmesindeki Kalibre Et düğmesine tıklayarak bir kalibrasyon gerçekleştirin. Çok düşük yoğunluklu veya yüksek ppm Hatası olan tepe noktalarını kaldırın. Kabul et'i tıklamadan önce kalibrasyon puanının %100 olduğunu onaylayın. Değilse, toplanan spektrumu temizleyin ve yeni bir tane edinin.
  6. Daha önce glikan görüntüleme için kullanılan .mis dosyasını açın.
  7. Dosyayı, peptit verisi olduğunu belirten yeni bir adla kaydedin.
  8. Altında Düzenle | Görüntüleme Çalıştırma Özellikleri, edinme yöntemini istenen peptit yöntemine değiştirin.
  9. Düzenle | Öğretme Noktalarını Temizle.
    NOT: Sürgü, sürgü adaptöründen çıkarıldıktan ve yeniden yüklendikten sonra tam olarak aynı konumda olmayacaktır.
  10. Düzenle | Öğretme Noktalarını Ayarlayın; orijinal Görüntüleme Sihirbazı'nda (Adım 2.12) yapıldığı gibi üç nokta belirleyin.
  11. Pozisyon Örneği Taşıyıcı düğmesine tıklayarak öğretimin doğruluğunu kontrol edin. Yakınlaştırın ve resimdeki dördüncü (kullanılmayan) referans noktasının belirgin bir özelliğine tıklayın. Numune taşıyıcı, timsControl içinde bu konuma hareket edecektir; Artı işaretinin seçilen özellikle aynı hizada olduğunu onaylayın.
    NOT: Artı işaretleri aynı hizada değilse, öğretimi temizleyin ve doğruluğu artırmak için öğretme işlemini tekrarlayın.
  12. Dosyayı kaydedin.
  13. Lazeri doku içinde birkaç yere ateşleyerek sinyali kontrol edin. Öğretimi kontrol etmek için Adım 6.11'deki gibi Örnek Taşıyıcıyı Konumlandır düğmesini kullanarak görüntüdeki bir konuma tıklayın. Spektrumun, tipik olarak m/z 944, 1.105 ve 1.198'de baskın tepe noktaları ile bol miktarda peptit tepe noktasına sahip olduğunu doğrulayın. Optimum sinyal için lazer akıcılığını gerektiği gibi ayarlayın.
  14. timsControl yöntemini kaydedin.
  15. AutoXecute Çalıştırmayı Başlat düğmesine tıklayarak görüntüleme alımını başlatın.

7. Histolojik boyama

NOT: Hematoksilen ve eozin için çeşitli yöntemler mevcuttur. Burada, bu laboratuvarda sıklıkla kullanılan değiştirilmiş bir Carazzi Yöntemi sunulmaktadır.

  1. Slaytı 1 dakika boyunca %100 etanole batırarak CHCA matrisini çıkarın.
  2. Slaytı şu şekilde boyayın: 30 saniye boyunca %95 etanol; 30 saniye boyunca %70 etanol; 30 saniye su; 2 dakika hematoksilin; 30 saniye su; 30 saniye boyunca %70 etanol; 30 saniye boyunca %95 etanol; 1 dakika boyunca eozin; 30 saniye boyunca %95 etanol; 30 saniye boyunca %100 etanol; 2,5 dakika ksilen; Montaj ortamı ile lamel .
  3. Slaytın >1 saat kurumasını bekleyin ve lamel üzerine hafifçe bastırarak kabarcıkları giderin.
  4. Dijital slayt tarayıcı ile dijitalleştirin.

8. Veri görselleştirme

NOT: SCiLS Lab ile bu protokolün kapsamı dışında yapılabilecek kapsamlı analizler vardır. Burada, temel dosya oluşturma, veri görselleştirme ve varsayılan tanımlama için veritabanlarına karşı tepe noktalarının aranmasını açıklayacağız.

  1. SCiLS Lab 2025b'yi başlatın ve Yeni'yi seçin.
  2. Yazılıma yüklenecek veri dosyalarını seçin.
    NOT: SCiLS Lab Pro ile, aynı parametrelerle toplanan birden fazla veri dosyası, birbirine normalleştirme için birlikte yüklenebilir ve aynı anda görselleştirilebilir.
  3. Örnekleri tercih edilen düzende düzenleyin. Sol tıklayıp sürükleyerek örnekleri taşıyın. Sağ tıklayıp sürükleyerek örnekleri döndürün. İleri'yi seçin.
  4. İçinde Kütle Ekseni Ayarları penceresinde gerekli ayarlamaları yapın. Varsayılan değerler genellikle timsTOF verileri için iyi çalışır. Sonrakine tıkla.
  5. Özellik Bulma penceresinde, içe aktarma sırasında otomatik tepe çekme için uygun değerleri ayarlayın. Sonrakine tıkla.
    NOT: Bu, FFPE dokusundan alınan metabolit verileri için iyi çalışmaz ve atlanmalıdır.
  6. İçe aktarma ayarları Özeti İçe Aktar penceresinde görselleştirilecektir. İçe aktar'ı tıklayın.
  7. SCiLS dosyasını kaydetmek için bir dosya adı ve konum sağlayın.
    NOT: Dosyanın boyutuna bağlı olarak, içe aktarılması birkaç dakika ila birkaç saat sürebilir.
  8. Tamamlandığında, bir özet penceresi görünecektir. SCiLS dosyasıyla etkileşim kurmak için İçe Aktarılan Veri Kümesini Aç'ı tıklatın.
  9. Yazılımın sağ üst köşesinde, Normalleştirme'nin yanındaki açılır menüyü tıklayın ve Ortalama Karekök'ü seçin.
    NOT: Bu, içe aktarılan centroid verilerinin seyrekliği göz önüne alındığında timsTOF verileri için en uygun yöntemdir ve en iyi görselleştirmeyi sağlayacaktır.
  10. Dosya Altında | Dosya Özellikleri, aralık genişliğini uygun bir değere, tipik olarak timsTOF verileri için 10 - 15 ppm olarak ayarlayın. Ortalama spektrumdaki bir tepe noktasının genişliğini kapsayıp kapsamadığını değerlendirerek değerin uygun olduğunu onaylayın.
  11. Fare tekerleğini tıklayıp sürükleyerek veya ileri doğru yuvarlayarak yazılımın altındaki ortalama spektrumu yakınlaştırın.
  12. Artı işaretini tepeye konumlandırarak ve fare tekerleğine sol tıklayarak görselleştirmek için bir tepe noktası seçin.
  13. Control + boşluk çubuğuna basarak ilgilendiğiniz iyonları etkin İyon Görüntüleri listesine ekleyin.
  14. Seçilen özellik listesini tıklayarak kaydedin Özellik Listesi Olarak Kaydet Yazılımın sağ tarafındaki iyon görüntüleri penceresinin altındaki düğme.
  15. Dosya | Özellik Tablosu ve MetaboScape aynı ağda kurulu ve yapılandırılmışsa, varsayılan metabolit veya glikan kimlikleri için MetaboScape kullanarak arama yapın. Alternatif olarak, varsayılan tanımlama için SCiLS dosyalarını METASPACE'e (https://metaspace2020.org/) aktarmak üzere .imzML dosyalarına dönüştürün.
    NOT: SCiLS Lab'ın yeteneklerinin tam açıklaması, Yardım menüsü seçeneği altındaki Kullanım Kılavuzunda bulunabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün tamamlanması, aynı doku bölümünden üç sağlam MSI veri kümesi ile sonuçlanmalıdır. Metabolit verilerinin tam spektrumunun görselleştirilmesinde, spektruma m/z 157 ve 315'teki matris tepe noktaları ağırlıklı olarak hakim olacaktır. Bu FFPE dokusu için normaldir. Birçok metabolit ve yağ asidi sinyali, m/z <155 ve 250 ile 300 arasındaki aralıklara yakınlaştırılarak gözlemlenecektir. Şekil 3 , dokudan elde edilen karmaşık metabolit spektrumlarını vurgulayan tam spektrum ve yakınl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek bir doku kesitinden sıralı MSI verilerinin toplanması, ayrıntılara dikkat edilmesini gerektirir. Yüksek kaliteli veriler elde etmek için kesinlikle çok önemli olan birkaç adım vardır. Öncelikle aynı anda birden fazla slayt hazırlanıyorsa dikkatli olunmalıdır. Slaytları Coplin kavanozlarına yerleştirirken veya aralarında hareket ederken, iki slaytları kavanozda aynı konuma yerleştirmemeye dikkat edin. Bu, doku yüzeyinin yetersiz solvente maruz kalmasına neden olur veya bir lam dokuyu ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EHS ve Austin'deki Texas Üniversitesi Kütle Spektrometresi Görüntüleme Tesisi, Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü Ödülü (RP240559) tarafından desteklenmektedir. Bu araştırma kısmen Yumurtalık Kanseri Araştırma İttifakı (OCRA 811621 ve 891490), Sie Vakfı ve Stephanie C. Stelter Bağış Fonu tarafından finanse edildi. Bu araştırma, kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından MD Anderson'ın Kanser Merkezi Destek Hibesi P30 CA016672 ve Jared Burks'un NCI'nin Araştırma Uzmanı 1 R50 CA243707-01A1 aracılığıyla desteklenen Akış Sitometrisi ve Hücresel Görüntüleme Çekirdek Tesisi ile işbirliği içinde gerçekleştirildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5-diaminonaftalinFisher BilimselD010125GMetabolit görüntüleme için MALDI Matrisi
AsetonitrilFisher BilimselA955-4 SerisiMatris hazırlama için kullanılan LC-MS sınıfı çözücü
&alfa;-siyano-4-hidroksisinnamik asitSigma-Aldrich70990-1G-FGlikan ve peptit görüntüleme için MALDI matrisi
Amonyum BikarbonatFisher BilimselA643-500 Cep TelefonuEnzimler için tampon
Amonyum fosfatSigma-Aldrich467782-50GGörüntüleme sırasında matris kümelerini azaltmak için katkı maddesi
Gizleme Odası NxGenBiocare MedikalYOKDokunun antijen alımı için kullanılır
EtanolFisher Bilimsel04-355-223Matris hazırlama ve boyama için kullanılan LC-MS sınıfı çözücü
M5 Robotik Reaktif PüskürtücüHTX GörüntülemeYOKEnzimlerin ve matrislerin dokuya uygulanması için kullanılır
MetanolFisher BilimselA456-4 SerisiKırmızı fosfor süspansiyonu yapmak için LC-MS sınıfı çözücü
MS Sınıfı TripsinFisher BilimselPI90058Protein sindirimi için enzim
MTP Slayt Adaptörü IIBruker Daltoniği8235380Mikroskop slaytlarını kütle spektrometresine yerleştirmek için adaptör
NanoZoomer SQ Dijital Slayt TarayıcıHamamatsu ŞirketiYOKLekeli dokunun dijital mikroskopi görüntülerini oluşturmak için kullanılır
Perfection V600 Düz Yataklı Barkod OkuyucuEpson'unYOKMSI veri toplama için slaydın optik görüntüsünü oluşturmak için kullanılır
Petri mührüFisher Bilimsel50-212-518Enzimatik sindirim sırasında petri kabını kapatmak için
PNGaseFBulldog BiyografisiNZPP550LYN-bağlı glikanların proteinlerden bölünmesi için enzim
Kırmızı FosforSigma-Aldrich04004-250GHem pozitif hem de negatif iyon modu için MALDI kalibrant
SCiLS Laboratuvarı (2025b)Bruker DaltoniğiYOKMSI veri görselleştirme yazılımı
timsTOF fleX QTOF Kütle SpektrometresiBruker DaltoniğiYOKKütle spektrometresi veri toplama için kullanılır
Triflorasetik asitFisher Bilimsel85183Pozitif iyon modu görüntüleme için pH'ı düşürmek için matris katkı maddesi
Tris TabanıFisher BilimselBP152-500 SerisiAntijen alımı için tampon
SuFisher BilimselW64Matrisler, enzimler ve boyama için kullanılan LC-MS sınıfı çözücü
WypAll X60Fisher Bilimsel19-413-113Nemlendirilmiş enzim inkübasyonu için emici mendil
KsilenFisher BilimselX3P-1GALBoyama için temizleme maddesi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Dehoog, R. J., et al. Preoperative metabolic classification of thyroid nodules using mass spectrometry imaging of fine-needle aspiration biopsies. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21401-21408 (2019).
  3. Eberlin, L. S., et al. Pancreatic cancer surgical resection margins: Molecular assessment by mass spectrometry imaging. PLoS Med. 13 (8), e1002108(2016).
  4. Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by UV-MALDI and IR-MALDESI mass spectrometry imaging coupled to FT-ICR-MS. Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).
  5. Fletcher, J. S., Vickerman, J. C., Winograd, N. Label free biochemical 2D and 3D imaging using secondary ion mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 733-740 (2011).
  6. Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections. J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).
  7. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  8. Ščupáková, K., et al. Spatial systems lipidomics reveals nonalcoholic fatty liver disease heterogeneity. Anal Chem. 90 (8), 5130-5138 (2018).
  9. Goncalves, J. P. L., et al. MALDI-MSI: A powerful approach to understand primary pancreatic ductal adenocarcinoma and metastases. Molecules. 27 (15), 4811(2022).
  10. Janssen, C., et al. Robust subtyping of non-small cell lung cancer whole sections through MALDI mass spectrometry imaging. Proteomics Clin Appl. 16 (4), e2100068(2022).
  11. Oezdemir, R. F., et al. Proteomic tissue profiling for the improvement of grading of noninvasive papillary urothelial neoplasia. Clin Biochem. 45 (1-2), 7-11 (2012).
  12. Bauer, J. A., et al. Identification of markers of taxane sensitivity using proteomic and genomic analyses of breast tumors from patients receiving neoadjuvant paclitaxel and radiation. Clin Cancer Res. 16 (2), 681-690 (2010).
  13. Lazova, R., et al. Histopathology-guided mass spectrometry differentiates benign nevi from malignant melanoma. J Cutan Pathol. 47 (3), 226-240 (2020).
  14. Oppenheimer, S. R., Mi, D., Sanders, M. E., Caprioli, R. M. Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal carcinoma. J Proteome Res. 9 (5), 2182-2190 (2010).
  15. Yagnik, G., Liu, Z., Rothschild, K. J., Lim, M. J. Highly multiplexed immunohistochemical MALDI-MS imaging of biomarkers in tissues. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 977-988 (2021).
  16. Clift, C. L., Drake, R. R., Mehta, A., Angel, P. M. Multiplexed imaging mass spectrometry of the extracellular matrix using serial enzyme digests from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Anal Bioanal Chem. 413 (10), 2709-2719 (2021).
  17. Escobar, E. E., Seeley, E. H., Serrano-Negron, J. E., Vocadlo, D. J., Brodbelt, J. S. In situ imaging of O-linked beta-N-acetylglucosamine using on-tissue hydrolysis and MALDI mass spectrometry. Cancers (Basel). 15 (4), 1224(2023).
  18. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3d targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers. 16 (5), 846(2024).
  19. Wall, M. J., Crowell, A. M. J., Simms, G. A., Liu, F., Doucette, A. A. Implications of partial tryptic digestion in organic-aqueous solvent systems for bottom-up proteome analysis. Analytica Chimica Acta. 703 (2), 194-203 (2011).
  20. Goncalves, J. P. L., Bollwein, C., Schwamborn, K. Mass spectrometry imaging spatial tissue analysis toward personalized medicine. Life (Basel). 12 (7), 1037(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass Spectrometry ImagingFormalin Fixed SamplesParaffin Embedded TissueSequential Biomolecule DetectionSpatial OmicsMetabolite ImagingGlycan ImagingTryptic Peptide ImagingTissue Section AnalysisMolecular Interactions

Related Articles