Method Article

Stereo-seq ile Türden Bağımsız Transkriptomların Kapsamlı Uzamsal Profili

DOI:

10.3791/68619

⸱

October 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology and Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Veterinary Medicine & Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, doku mimarisini korurken çeşitli transkriptomların yüksek çözünürlüklü haritalanmasını sağlayan Stereo-seq kullanarak formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku bölümlerinden konakçı, viral, fungal ve mikrobiyom RNA'sının kapsamlı uzamsal transkriptomik profilini çıkarmak için bir protokol sunmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konakçı içindeki hücrelerin uzamsal bileşiminin yanı sıra doku içindeki bakteri veya viral yükler, hücreyi hücre tipine özgü süreçlerden geçiren hücre tiplerinin ve analitlerin etkileşimini etkileyebilir. FFPE dokuları için stereo-seq, haberci RNA'yı (mRNA) yakalamak için A'tailing kullanan veya türe özgü transkriptleri yakalamak için prob tabanlı standart uzamsal transkriptomik yöntemlerden farklı olarak, uzamsal barkodlara rastgele hazırlama kullanır. Bu yöntemler, uzun kodlamayan RNA, mitokondriyal RNA, mikroRNA veya mikrobiyal, viral ve mantar gibi diğer RNA türlerinden gelen diğer RNA türlerinin etkisi ve önemi hakkında daha güncel bilgileri kapsamaz. Burada özetlenen, formalin sabit parafine gömülü (FFPE) dokularla uyumlu rastgele bir prob metodolojisi kullanılarak RNA tespiti ile uzamsal türden bağımsız stereo-seq uygulaması için doku kesitlemeden kütüphane hazırlığına kadar adım adım bir prosedürdür. Bu Stereo-seq yöntemi, her 0.22 μm'de bir dizide yeniden meydana gelen 0.5 μm boyutunda rastgele bir yakalama boncuğuna sahiptir ve dizileme tabanlı bir teknolojiden hücre altı çözünürlüğe izin verir. Bu yöntem hem konakçı hem de konakçı olmayan RNA'yı tespit ettiğinden, protokol, toplama, koruma, kesme ve tespit işlemi sırasında doku üzerinde neyin biriktiğine karşı dokunun içinde ne olduğunun belirlenmesine izin vermek için özel hususlar gerektirir (yani, çevresel ve işleme kirleticileri). Son olarak, bu protokol, uzamsal bir bağlamda çoklu RNA türlerinin yüksek (tek hücreli) düzeyde çözünürlüğüne sahip olunmasına izin vererek, hücre tiplerinin ve patolojik türlerin intra- ve inter-aktomları hakkında fikir verir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzamsal omik teknolojileri, birden fazla hedefin, DNA (genomik), RNA (transkriptomik), metabolitlerin (metabolomik) veya proteinin (proteomik) aynı anda ölçülmesini sağlayarak doku hücresel heterojenliği çalışmasında devrim yaratmıştır1. Bu farklı tahlillerin çözünürlüğü genellikle değişir ve analitleri ölçerken, tek hücre 2,3 veya doğal uzamsal bağlam4 ölçülürken artan seyreklik ile farklı sınırlamalar sağlar. Buna karşılık, RNA dizilimi gibi toplu yöntemler, yalnızca tüm numuneler arasında ortalama gen ekspresyonu sağlar ve hücresel heterojenliği2 veya tek hücreli dizileme için doku ayrışması gerektiren tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq)2,3'ü gizler, genellikle filtreleme gerektirir. Bu nedenle, bu yöntemler büyük hücreleri ve kümeleri hariç tutarken, biyoinformatik yöntemler, tümü önyargılara neden olan parçaları ve çiftleri çıkarmaya çalışır 5,6,7. Uzamsal transkriptomik, doku mimarisini koruyarak hücresel organizasyon ve etkileşimlere ilişkin kritik bilgiler sağlar. Hedeflenmemiş uzamsal dizileme yöntemlerinin çoğu, tek hücreli çözünürlüğe sahip değildir, bu nedenle 10 ila 100 hücre içeren uzamsal yakalama alanlarının ters evrişimini gerektirir 8,9,10. Bununla birlikte, son on yılda, deneysel strateji veya yeni teknikler 1,11,12 kullanılarak çözünürlükte, daha geniş yakalama alanlarında ve çoklu omik yaklaşımların entegrasyonunda ilerlemeler olduğu için, uzamsal transkriptomik, bu yöntemlere olan ihtiyaçları geride bırakmıştır.

Uzamsal Gelişmiş Çözünürlük Omik dizileme (Stereo-seq), nano ölçekli çözünürlük (500 nm) ve santimetre ölçeğinde bir yakalama alanı sağlar, türden bağımsız tüm transkriptomik yakalama, kodlamayan, kodlamayan ve konakçı olmayan RNA13'ün yakalanmasına izin verir. Bu yöntem şu anda uzamsal transkriptomik için en yüksek çözünürlüktür ve en geniş görüş alanlarını sağlama seçeneklerine sahiptir. Ancak bu yöntemin, sıralamaya hazır kitaplıkların tamamlanması için 15 günü kapsayan, yaklaşık 4 saatlik uygulamalı zaman ve işçilik gereksinimleri de dahil olmak üzere bazı dikkate değer sınırlamaları vardır. Buna karşılık, prob tabanlı uzamsal transkriptomik, poliA-yakalama dizisi tabanlı uzamsal transkriptomik, Slide-seq ve uzamsal omik dizileme için dokuda deterministik barkodlama (DBiT-seq) gibi diğer dizileme tabanlı uzamsal transkriptomik teknolojiler, tipik olarak 2 ila 3 gün boyunca 5 ila 8 saatlik uygulamalı süre gerektirir (Tablo 1). Birçok araştırmacı için, bu ilerlemeler teknik zorluklardan daha ağır basmaktadır ve özellikle diğer teknolojilerle katmanlanmışsa, hücresel ve hücre altı seviyelerde hastalık ilerlemesini incelemek için tam transkriptomik uzamsal atlaslar oluşturmak için idealdir1.

Stereo-seq protokolü, poliadenile mRNA transkriptlerini yakalamak için poli-T problarına dayanan geleneksel mRNA transkriptomiklerinin ötesinde olanaklara sahiptir. Bu yöntemler, uzamsal ekspresyon analizi için taze dokulara14 poliadenilasyon veya hedef önceden tanımlanmış gen setleri15 için türe özgü problar eklenerek değiştirilebilir. Bunun yerine, Stereo-seq, mikrobiyal RNA'lar, mantar RNA'ları, viral RNA'lar ve güçlendirici RNA'lar, dairesel RNA'lar ve uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar) gibi poliadenile edilmemiş RNA'lar dahil olmak üzere türlerden bağımsız olarak çeşitli RNA'ları seçmek için rastgele nükleotid probları kullanır16. Teorik olarak, daha küçük RNA'ları veya küçük enterferans yapan RNA'lar (siRNA'lar), mikroRNA'lar (miRNA'lar) ve transpozonlar17 gibi onarıcı elemanları yakalamak mümkündür. Bununla birlikte, şu anda bu RNA'ların biyoinformatiği ve haritalanması zorlu olmaya devam etmektedir ve tipik olarak 30 bp kesme kullanan ilk hizalama sırasında genellikle filtrelenmektedir.

Burada, Şekil 1'de gösterilen bir Stereo-seq protokolünün daha iyi anlaşılmasını ve işlenmesini sağlamak için bir üreticinin DNA nanoballs (DNB) çipleri üzerinde rastgele nükleotid yakalamasına yönelik modifikasyonlarımızla birlikte ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir. Bu protokol, moleküler biyologlar için, daha düşük kaliteli arşivlenmiş örneklerden ve yağ dokularından daha tutarlı, daha yüksek verim elde etmek için rastgele nükleotid yakalama ile Stereo-seq üzerinde yeni FFPE dokularını test etmeye yönelik stratejiler içerir. Ana hatlarıyla belirtilen protokol, menşe türlerinden bağımsız olarak çoğu organdan alınan FFPE örnekleri için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu protokol, kemik iliği gibi dekalsifikasyon gerektiren zor dokuları işlemek için gereken mevcut modifikasyonları içermemektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem makalesinde daha önce tedavi görmemiş yüksek dereceli seröz yumurtalık karsinomu hasta örneği için herhangi bir klinik veri sağlanmamıştır. Bununla birlikte, ilgili klinik veriler, yazılı bilgilendirilmiş onam veren katılımcılardan Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi, Jinekolojik Onkoloji ve Üreme Tıbbı Anabilim Dalı'ndaki Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanan protokoller izlenerek toplandı.

NOT: RNaz kontaminasyonunu önlemek için protokolün tamamı boyunca cerrahi maske ve eldiven takılması önerilir. Uzun saçlı araştırmacıların saçlarını geri çekmeleri ve hatta saç filesi takmaları önerilir. Verimi en üst düzeye çıkarmak için her zaman steril nükleaz içermeyen su (NFW) ve nükleaz içermeyen, düşük bağlayıcı DNA/RNA tüpleri kullanın. Bitki dokuları gibi memeli olmayan dokular, poli-L-lizin (PLL) ve hücre duvarları nedeniyle uzatılmış geçirgenlik sürelerini içeren adezyon optimizasyonu gerektirebilir. Moleküler yakalama teorik olarak mümkün olmaya devam ederken, bitki dokuları mevcut iş akışımızda test edilmediği için deneysel doğrulamaya ihtiyaç vardır.

1. RNA kalitesini ve RNA fragman dağılım değerini 200 puan değerlendirin

  1. 200 bp'den büyük RNA yüzdesini ölçen RNA Parça Dağılım Değeri 200'ü (DV200) kullanarak RNA kalitesini değerlendirin.
  2. Stereo-seq işleme için tasarlanmış aynı doku bloğundan iki adet 10 μm kesit kullanın.
    NOT: Anında işleme en uygunudur, ancak numuneler 4 °C'de 1 haftaya kadar, -20 °C'de 4 haftaya kadar veya -80 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
  3. RNA fragman boyutlarının dağılımının doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için Patel ve ark.18 tarafından tarif edildiği gibi boyut olmayan seçici bir RNA ekstraksiyon protokolü kullanarak RNA'yı çıkarın.
  4. DV200 puanını veya 200 bp'den uzun RNA parçalarını temsil eden eğrinin altındaki alan yüzdesini belirlemek için bir parça analizörü kullanarak RNA kalitesini aşağıdakilerden biriyle değerlendirin. İdeal olarak, doku bir DV200 skoruna (%50 >) ve konsantrasyona (> 10 ng/μL) sahip olmalıdır.

2. Çalışma alanı temizliği

  1. Tüm yüzeyleri %30 çamaşır suyu ile temizleyin. Ağartıcı ve etanol kombinasyonundan kloroform oluşumunu önlemek için yüzeylerin en az 30 dakika kurumasını bekleyin.
  2. Yüzeyleri DNA dekontaminasyon mendilleri (DDW) ile silin. Tüm yüzeylere RNaz dekontaminasyon solüsyonu (RDS) ve ardından NFW ile hazırlanan %70 etanol püskürtün.
    NOT: Çamaşır suyu veya başka bir alkolü asla karıştırmayın. Bu kombinasyon, oldukça toksik olan ve düşük maruziyetlerde bile bilinç kaybına, organ hasarına veya ölüme neden olabilen kloroform üretti.

3. Stereo-seq rastgele oligonükleotid yakalama çipi (N-çip) hazırlama

  1. Bu adımda kullanılan tüm sistemler dahil olmak üzere çalışma alanını 2.1 ve 2.2 adımlarında açıklandığı gibi temizleyin.
  2. Stereo-seq N-çipini ambalajından çıkarın, çip kimliğini kaydedin ve Stereo-seq N-çipinin kenarlarını ve cam slaytın kenarlarını çipe dokunmadan %100 etanol ile temizleyin. Tamamen kurumaya bırakın.
  3. Çipi kızağa sabitlemek için reçine uygulaması (Xylenes kullanan kullanıcılar için isteğe bağlı).
    NOT: Ksilen içermeyen temizleme maddeleri genellikle ticari satıcılar tarafından tavsiye edilse de, ksilen içermeyen temizleme maddelerinin parafin karışımına bağlı olarak daha az etkili olabileceği gözlemlenmiştir. Genellikle belirli plastikler, sentetik reçineler veya arı mumu gömülü dokularla uyumlu değildirler ve yoğun şekilde çapraz bağlı veya yüksek erime noktalı parafinleri verimli bir şekilde temizlemezler. Numuneyi gömmek için kullanılan parafin bileşiminden emin değilseniz, optimum temizleme için ksilen kullanılması önerilir. Ayrıca ksilen meme, yumurtalık, yumurta veya beyin dokusu gibi yağ dokularını daha iyi temizleyebilir.
    1. Homojen beyaz olduğundan emin olmak için reçineyi iyice çalkalayın veya karıştırın. Bir mikropipet kullanarak, Stereo-seq N-çipinin kenarına dikkatlice 10 μL UV ile kürlenebilen seramik reçine uygulayın (Şekil 2A).
      NOT: Reçine cilt ve göz tahrişine neden olabilir ve tekrarlanan maruz kalma durumunda alerjik cilt reaksiyonlarına yol açabilir. Bu reçineyi pipetlerken veya tutarken daima nitril eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü kullanın. İyi havalandırılmış bir alanda çalışın ve büyük hacimlerde veya ısıtma solüsyonu kullanırken maske takın ve cilt veya gözlerle doğrudan temasından kaçının.
    2. Sızdırmaz bir köpük çubuk kullanın, fazla reçineyi çıkarın ve talaş kenarının etrafında yalnızca ince bir çizgi bırakın. Slaytı, çip yüzeyine dokunmamaya dikkat ederek UV kürleme cihazına yerleştirin.
    3. Slaytın arkasını aydınlatmak ve 5 dakika kürlemek için reçine uygulanmış çipi 405 nm UV ışık kaynağı üzerindeki opak bir maskenin üzerine yerleştirin. Bu, Şekil 2B'de gösterilmektedir.
      NOT: Nanotoplara zararlı etkilere neden olabileceğinden, Stereo-seq N-çipini UV ışığına aşırı maruz bırakmayın ve çip yüzeyindeki reçineye dokunmayın.
    4. Sertleştikten sonra, aşağıdakilerin her birine batırılmış sızdırmaz köpük çubuklar kullanın: %100 moleküler dereceli etanol; %70 etanol; ve son olarak reçinenin yerleştirildiği kenarın etrafını temizlemek için NFW. Beyaz lekeler çıkarsa, kenarı tekrar temizleyin. Talaş yüzeyine asla dokunmayın (Şekil 2C).
    5. Sürgünün tamamen kurumasını bekleyin. İncelemeden sonra, talaşları gece boyunca 4 °C'de gerekirse bir kurutucu ile saklayın. Ancak mümkün olduğunda talaş hazırlama ve kesit alma işlemlerine hemen devam edilmesi tavsiye edilir.
      NOT: UV ışığıyla çalışırken daima UV koruyucu gözlükler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. Etanol ve reçineyi iyi havalandırılmış bir alanda, tercihen çeker ocakta kullanın. Atık malzemeleri kurumsal yönergelere göre bertaraf edin.
  4. Poli-L-lizin ile Çip Hazırlama (Yağ dokuları veya yapışma sorunu olan dokular için isteğe bağlıdır.)
    1. Bu adımda kullanılan tüm sistemler dahil olmak üzere çalışma alanını 2.1 ve 2.2 adımlarında açıklandığı gibi temizleyin.
      NOT: Kimyasalları doğrudan PCR makinesine püskürtmeyin. Tüm PCR öncesi adımlar için, mümkünse cDNA'nın önceki amplifikasyonu da dahil olmak üzere kontaminasyonu önlemek için bir PCR başlığında çalışın.
    2. 50 mL'lik konik bir tüp kullanarak çipi üç kez taze NFW'ye daldırın.
    3. Çip yüzeyinden yaklaşık 60 cm uzaklıktan çipin yüzeyi boyunca çapraz olarak (80°) giden yaklaşık 45° ila 5° açıyla basınçlı havanın tam kuvvetini kullanarak basınçlı hava kullanarak çipi kurutun (Şekil 2E). Yüzey bulanık görünüyorsa, yıkamayı taze NFW ile tekrarlayın ve tekrar kurutun (bulut yüzeyi genellikle seramiğin önceki adımlarda yeterince yıkanmadığı veya kürlenmediği anlamına gelir).
    4. Tüm talaş yüzeyini kaplamak için 150 μL PLL solüsyonu uygulayın. Oda sıcaklığında (22 °C ila 25 °C) 10 dakika inkübe edin. Bu, Şekil 2D'de gösterilmektedir.
    5. PLL solüsyonunu çıkarın ve çipi iki kez nükleaz içermeyen suyla 10-15 saniye yıkayın.
    6. İkinci yıkamadan sonra (çipe dokunmadan) sürgünün kenarlarını dikkatlice kurulayın.
    7. Çip yüzeyinden yaklaşık 60 cm uzaklıktan çipin yüzeyi boyunca çapraz olarak giden yaklaşık 45° ila 5° açıyla basınçlı havanın tam kuvvetini kullanarak basınçlı hava kullanarak çipi sıkıca kurutun (Şekil 2E).
      NOT: Çipin 30 saniye veya daha kısa sürede tamamen kuruması gerekir. Bundan daha uzun sürerse, DNB bozulacak ve bu da yakalamada artefaktlara neden olacaktır.
    8. 1 saat içinde montaja devam edin ve talaşı kuru tutun.
      NOT: Kuruduktan sonra talaş yüzeyi bulanık görünüyorsa, taze NFW ile yıkayın ve kurutma işlemini tekrarlayın. Kuruduktan sonra çipin yüzeyinde artefaktlar varsa, bu durum bu alanlarda yakalama sorunlarına neden olabilir. Doku gerektirmiyorsa yapıştırmak için PLL kullanmaktan kaçının. Çipe dokunmak, cDNA salınımından önce çiziklere ve yakalama alanlarının kaybına veya serbest bırakıldıktan sonra düzensiz yakalamaya neden olabilir. Talaş yüzeyindeki reçine, yakalama alanlarının benekli kaybına yol açar. Çipin basınçlı hava nozuluna çok yakın yerleştirilmesi, kristaller oluşturabilir ve çip yüzeyi boyunca hasarlı DBN izlerinin püskürtülmesine neden olabilir; Ancak bu nadirdir ve genellikle yalnızca nozül neredeyse çipe temas ediyorsa ve basınçlı hava şişesi çok soğuksa meydana gelir. Bu adım teknik olarak zor olduğundan, bu prosedürün değerlendirme çipleriyle birkaç kez uygulanması önerilir.

4. Doku kesit alma ve montaj

  1. Çalışma alanının 2.1 ve 2.2. adımlarda açıklandığı gibi temiz olduğundan emin olun. Doku kesitleme ve montaj sırasında tüm su banyoları ve buz için yeni bıçakların ve NFW'nin kullanıldığından emin olun. Çipe doğrudan dokunmayın ve çipin yalnızca %80'ini kağıt mendille kaplayın.
    NOT: Standart doku için 5 μm veya yüksek yağlı doku için 4 μm kalınlık kullanılması önerilir. Varsa, numuneler arasındaki modaliteleri eşleştirmek için bir seri kesit şeridi kullanın.
  2. Slaytları 42 °C'de 3 saat boyunca bir fırında veya bir PCR makinesinde kapak açıkken kurutun. Daha sonra slaytları aktarın veya fırında veya PCR makinesinde sıcaklığı 37 °C'ye değiştirin ve gece boyunca 12-48 saat pişirin. Yaklaşık 18 saat kullanılması tavsiye edilir.
  3. İsteğe bağlı durma noktası: Kuruduktan sonra, devam etmeden önce slaytları 4 °C'de 1 haftaya kadar kurutuculu alüminyum torbalarda kapatın.
    NOT: Daha uzun kuruma süreleri RNA bütünlüğünü azaltabilir. Çok kısa kurutma, slayta daha az doku yapışmasına neden olur. Daha yüksek bir sıcaklıkta pişirme, RNA bütünlüğünü azaltabilir. Slaytlar harici işleme (örneğin, ana bilgisayar analizi) için gönderilebilir. Ancak nakliye sırasında artan potansiyel kontaminasyon nedeniyle mikrobiyom analizi için nakliye önerilmez.

5. Slaytları parafinize edin

  1. Çalışma alanının 2.1 ve 2.2. adımlarda açıklandığı gibi temiz olduğundan emin olun.
  2. Deparafinizasyon ve Stereo-seq protokolü için reaktifler hazırlayın.
    1. Gerekli reaktifleri ayırın: 50 mL'lik konik tüplerde iki adet 30 mL Ksilen, 50 mL'lik konik tüplerde iki adet 30 mL %100 etanol.
    2. Aşağıdaki seyreltilmiş reaktifleri NFW ile hazırlayın: Çip başına %96 etanol (2 konik veya 1 mL gereklidir), çip başına %90 etanol, çip başına %80 etanol, çip başına %70 etanol, çip başına %50 etanol, çip başına %30 etanol, 20x çözeltiden 2,5 mL 5x salin-sodyum sitrat (SSC), 5 mL 0,01N HCl (0,1N HCl'yi NFW ile pH 2'ye seyreltin). Etanol seyreltmeleri için, silikon contalar kullanılıyorsa, 50 mL'lik konik tüplerde 30 mL'lik bir çözelti veya 1,5 mL'lik bir tüpte 500 μL'lik bir çözelti hazırlayın.
    3. Aşağıdaki çözeltileri hazırlayın ve buz üzerinde tutun: i) 5x çözeltiden 32,5 mL 0,1x SSC (30 mL çözeltiyi konik bir tüpte tutun ve diğer 2,5 mL'yi ileride kullanmak üzere 5 mL'lik bir tüpe koyun), ii) %5 RI ile 400 μL 0,1x SSC, buz üzerinde tutun.
    4. Aşağıdaki seyreltilmiş reaktifleri 0,1 N HCl ile hazırlayın.
      1. Ticari olarak sağlanan liyofilize reaktife 1 mL 0,1 N HCl ekleyerek 10x geçirgenleştirme reaktifi (PR) çözeltisi hazırlayın.
        NOT: Sadece 1 saat buz üzerinde tutun, ileride kullanmak üzere parçaladığınızdan emin olun ve -20 °C'de dondurun.
      2. 500 μL 1x PR çözeltisi hazırlayın (10x PR çözeltisi alikotunu 0,01 N HCl ile seyreltin, 6 saate kadar buz üzerinde tutun).
        NOT: Pepsin bazlı enzimler pH 2'de en iyi performansı gösterdiğinden, 0.01 N HCl'nin pH'ının pH 2.0'ın% 10'u içinde olması çok önemlidir.
  3. Slaytları her biri 20 dakikada 2 tur boyunca Ksilenlere (önerilir) batırarak slaytları deparafinize edin.
  4. Numuneyi hemen etanol ile yeniden sulandırın (2 tur için %100, %96, her biri 5 dakika, ardından 1 tur, 2 dakika için %90, %70, %50 ve %30). Son olarak, 1 dakika boyunca NFW ile rehidrate edin. Etanol seyreltmeleri için, mikrobiyom çalışmaları için numune hazırlıyorsanız her slayt için 50 mL'lik konik bir tüpte 30 mL çözelti kullanın veya mikrobiyom olmayan numuneler hazırlıyorsanız her iki slayt için 30 mL kullanın. Sonraki tüm seyreltmeler için, 50 mL'lik konik bir tüpte 30 mL çözelti hazırlayın veya silikon contalar kullanıyorsanız, çip alanını tamamen kaplamak için 1cm2 çip başına 500 μL çözelti kullanın.
    İSTEĞE BAĞLI: Şekil 2F-H'de gösterildiği gibi, %100 etanol adımından sonra bir sızdırmazlık oluşturmak için çipin etrafına 3 odacıklı bir çıkarma sürgüsünden bir silikon hazne yerleştirilmesi önerilir. Bu, daha küçük hacimlerde reaktiflerin kullanılmasına izin verir ve çipe zarar verme riskini azaltır. Alternatif olarak, prosedür boyunca Stereo-seq Slide'ı tamamen daldırmak için 50 mL'lik konik tüpler kullanılabilir.

6. (İsteğe bağlı) Nükleer görüntüleme ve ssDNA boyama

NOT: 6.1'de kullanmadan önce FFPE çapraz bağlama reaktifinin oda sıcaklığına (~25 °C) ulaşmasını bekleyin. Diğer boyama çözeltileri mümkündür, ancak şu anda tek hücre segmentasyonu ve transkriptomik verilerin hücre gruplaması için floresan nükleer boyama gereklidir.

  1. Tek sarmallı DNA (ssDNA) boyası kullanılarak floresan boyama
    1. Qubit ssDNA reaktifini 1 ila 2 çip başına 1:1 seyreltmede 5x SSC tamponu ile seyrelterek SSC tamponunda 2 μL ssDNA boyama çözeltisi hazırlayın.
      NOT: ssDNA seyreltmesi, görüntüleme sırasında kullanılan mikroskoba bağlı olarak değişebilir.  Bu nedenle, en iyi dinamik aralığı belirlemek için yeni mikroskoplar, değerlendirme çipi ve test dokusu kullanılarak bir ssDNA boya seyreltme seti ile test edilmelidir.
    2. 1:20 RNaz İnhibitörü (RI) seyreltmesi, ssDNA seyreltmesinin 1:200 seyreltmesi ve kalan 5x SSC kullanarak boyama çözeltisinin (çip başına 200 μL) bir ana karışımını oluşturun.
    3. Boyama solüsyonu (çip başına 150 μL) ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Bir pipet kullanarak boyama solüsyonunu çipin köşesinden yavaşça çıkarın.
      NOT: Çıkarılabilir silikon hazne kullanılıyorsa, çipi ssDNA boya karışımıyla boyamadan önce çıkarın.
    4. Çipi 10-15 saniye boyunca 0,1x SSC (her seferinde çip başına 150 μL) ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra (çipe dokunmadan) slaytın kenarlarını lens kağıdı ile dikkatlice kurulayın.
    5. Yonca kaymasını monte etmek için ~3-5 μL gliserol ekleyin (ters mikroskop için daha az kullanın) (kabarcıklara dikkat edin).
      NOT: Slayt alanına doğru hacimde gliserol uygulandığından emin olun, tipik olarak 1cm2'lik bir çip için yaklaşık 4 μL. Çok fazla gliserol kullanılması, slayt dikey olarak tutulduğunda lamel kaymasına neden olabilir. Çok az gliserol kullanılması, lamel çıkarıldığında doku hasarı riskini artırır ve görüntüleme ve tek hücre segmentasyon sonuçlarını olumsuz etkileyebilecek kabarcıklara neden olabilir.
    6. Lameli yaklaşık 1 cm yükseklikten çipin üzerine bırakın. Müdahale edilmiş bir mikroskop kullanıyorsanız, dikey olarak tutulduğunda lamel kaymadığından emin olun. Daha fazla gliserol eklemeden yeniden monte ederse.
    7. Görüntü döşemeleri arasında %10 örtüşme ile geniş alan mikroskobu ile ssDNA boyalı dokunun floresan görüntülerini yakalayın.
      NOT: 10x objektif kullanarak geniş alan mikroskobu ile 9-13 noktalı manuel odak haritası yapılması önerilir. Konfokal mikroskop kullanılabilir, ancak doku ve çip boyunca odak değişikliklerine çok daha duyarlıdır.
    8. ImageJ gibi görüntü işleme yazılımlarında, her bir döşemenin yaklaşık konumunu oluşturmak için teorik örtüşmeyi kullanarak birleştirin ve ardından görüntü döşemesine ince ayar yapmak için piksel eşleştirme hesaplamalı örtüşme gerçekleştirin
    9. Görüntüleri StereoMap yazılımında işleyin ve devam etmeden önce Image QC'nin geçtiğinden emin olun.
    10. Stereo-seq slaytı, lamel ayrılana kadar 30 mL 0.1x SSC'ye daldırın.

7. Çapraz bağlama işlemi

NOT: Bu adım sırasında çipe dokunmaktan veya eğmekten kaçının ve yavaşça pipetleyin.

  1. FFPE çapraz bağlama reaktifinin ılık oda sıcaklığında (~25 °C) olduğundan emin olun ve çözeltiyi bulanıklaştıran parçacıkların olmadığından emin olun. Parçacıklar görünüyorsa, kullanmadan önce 55 °C'ye ısıtın ve 30 °C'ye soğutun.
  2. Termocycler'ı aşağıdaki ayarlarla açın: Dengeleme için 30 °C (85 °C'lik ısıtmalı bir kapak); 30 dakikalık bir inkübasyon için 95 °C; 4 °C sonsuz bekletme süresi.
  3. Kaset contasını monte edin, ardından Stereo-seq yonga sürgüsünü kasete yerleştirin.
  4. Çipi içeren kasetin kuyusuna FFPE çapraz bağlama reaktifi (çip başına 400 μL) ekleyin. Kasete sızdırmazlık bandı uygulayın ve sıkıca kapatıldığından emin olun.
  5. Adım 7.2'den itibaren 95 °C'de 30 dakikalık inkübasyona başlayın. 10 dakika geçtikten sonra, -20 °C'lik bir dondurucuya 15 mL'lik bir kaba (slayt başına yaklaşık 1 mL gerekecektir) 10 mL metanol koyun.
  6. Çipi termocycler'dan dikkatlice çıkarın, kaseti tezgaha aktarın ve sızdırmazlık bandını soyun.
  7. FFPE çapraz bağlama reaktifini bir pipet kullanarak çıkarın ve atın. Tüm çapraz bağlama reaktifleri çıkarıldıktan sonra, kaseti ve contayı ayırın ve atın.
  8. Stereo-seq slaytını ~23 °C oda sıcaklığına dengeleyin. Steril bir çeker ocak altında, slaytın kenarını kurulayın ve yeni bir silikon hazne (varsa) uygulayın. -20 °C'lik dondurucudan 500 μL soğutulmuş metanol ekleyin ve tüm bölümün 20 dakika boyunca tamamen suya daldırıldığından emin olun.
    NOT: Alternatif olarak, tüm Stereo-seq slayt, 30 mL soğutulmuş metanol ile doldurulmuş 50 mL'lik konik bir tüpe daldırılabilir.
  9. Metanol fiksasyonunun bitiminden yaklaşık 5 dakika önce kullanmadan önce 1x PR çözeltisini 37 °C'lik kuru bir blok üzerinde 10 dakika önceden ısıtın (adım 7.8).
  10. Sabitleme tamamlandıktan sonra, slaytı steril bir çeker ocak içine alın. Slayttaki fazla metanolü silin ve çip üzerinde kalan metanolün buharlaşmasını bekleyin (~5 dakika). Yeni bir kaset ve conta takın. Metanol tamamen buharlaştığında, Stereo-seq çip slaytını kasete yerleştirin.

8. Geçirgenleştirme ve ters transkripsiyon

NOT: 8.1-8.11 adımları için yavaşça pipetleyin ve çipe dokunmayın. Aşırı basınç, DNB'lerde difüzyona veya izlere neden olur.

  1. Çipe 200 μL geçirgenleştirme reaktifi ekleyin. Stereo-seq slayt kasetine sızdırmazlık bandı uygulayın ve sıkıca kapatıldığından emin olun.
  2. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  3. Her slayt için 380 μL 0.1x SSC ve 20 μL RI (RNA İnhibitörü) ekleyerek yıkama tamponunu hazırlayın. Slayt başına 400 μL yapın ve kullanılana kadar buz üzerinde tutun.
  4. FFPE ters transkripsiyon (FFPE RT) için reaktifleri çıkarın, ardından aşağıdakilerin tümünü döndürün ve enzim karışımını, oligoları ve dimerleri buz üzerinde tutun. FFPE RT tamponunu oda sıcaklığına (~23 °C) ısıtın.
  5. Geçirgenleştirmenin bitiminden 5 dakika önce, FFPE RT karışımı çipi başına 200 μL hazırlayın. FFPE RT tamponu (158 μL), FFPE RT enzim karışımı (30 μL), FFPE RT oligo (10 μL) ve FFPE dimer (2 μL) ekleyin. Bunu yavaşça karıştırın ve buz üzerinde tutun.
  6. Çipi termocycler üzerinde tutarak inkübasyon sıcaklığını oda sıcaklığına (~23 °C) değiştirin. Contayı çıkarın ve 1x PR solüsyonunu yavaşça atın.
  7. Çipi 1 cm2 çip başına 200 μL 0,1x SSC (%5 RI ile) ile çok nazikçe yıkayın.
  8. Çipin köşesinden 0,1x SSC (%5 RI ile) yıkamayı çıkarın.
  9. Çipin köşesine 200 μL FFPE RT çözeltisi ekleyin.
  10. Stereo-seq slayt kasetine sızdırmazlık bandı uygulayın ve sıkıca kapatıldığından emin olun; aksi takdirde buharlaşma verimi düşürür.
  11. FFPE RT inkübasyon izotermal reaksiyonunu 42 °C'de 45 °C ısıtmalı kapakla (5 ila 24 saat) başlatın.
    NOT: 12 ila 16 saat inkübe edilmesi ve deneyler arasında tutarlı olması önerilir.

9. cDNA salınımı ve saflaştırılması

NOT: 9.6-9.7 adımları için yavaşça pipetleyin ve çipe dokunmayın. Aşırı basınç, DNB'lerde difüzyona veya izlere neden olur.

  1. Oluşmuş olabilecek herhangi bir çökeltiyi çözmek için cDNA salım tamponunu 55 °C'de ısıtarak 400 μL cDNA salım tamponu hazırlayın.
  2. cDNA salım tamponunu ılık bir oda sıcaklığına (25 °C) dengeleyin. Buz koymayın.
  3. Kullanmadan önce cDNA salım tamponunu ve cDNA salım enzimini bir masa üstü santrifüjde 100 x g'da döndürün.
  4. 380 μL cDNA salım tamponuna 20 μL salım enzimi ekleyerek cDNA tamponunu hazırlayın.
  5. Çipi termocycler üzerinde tutarak inkübasyon sıcaklığını oda sıcaklığına (~23 °C) değiştirin. Contayı çıkarın ve FFPE RT solüsyonunu yavaşça çıkarıp atın.
  6. Çipi bir kez, inanılmaz derecede nazikçe, çip başına 0,1x SSC (200 μL) ile yıkayın.
  7. Çok dikkatli bir şekilde pipetleyerek çipin köşesinden 0,1x SSC'yi çıkarın.
  8. Her çipe hazırlanan cDNA salım çözeltisinden 400 μL ekleyin.
  9. Stereo-seqs slayt kasetini kasete sızdırmazlık bandı (veya PCR kapağı) uygulayarak kapatın. Herhangi bir buharlaşmayı, sızıntıyı veya kirlenmeyi önlemek için kasetin sıkıca kapatıldığından emin olun.
  10. Kapak 60 °C'ye ısıtılmış olarak 55 °C'de ≥ 5 saat (en az 5 saat ila 24 saat) inkübe edin.
    NOT: 5 ila 7 saat inkübe edilmesi veya 2 saatlik deneyler arasında tutarlı olması önerilir.

10. cDNA salınım karışımını toplayın

  1. NFW'yi 37 °C'ye önceden ısıtın (1cm2'lik çip başına en az 500 μL).
  2. Contayı ve pipeti her bir köşesinden ve çipin ortasından mendilin üzerine kuvvetlice çıkarın, ancak mendili kazımayın veya dokunmayın. Çipteki tüm cDNA Salım Karışımını toplayın ve 1,5 veya 2,0 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Her tüpe çip tanımlama (çip kimliği) numaralarını kaydedin.
  3. Doğrudan çip yüzeyine 350 μL önceden ısıtılmış NFW ekleyin. Ve bir kez daha daha küçük bir pipetle (P100 veya P200) kuvvetlice pipetleyin, daha fazla kesme kuvveti uygulamak için ucu eğin, ancak dokuya dokunmayın veya çipi kazımayın.
  4. Adım 10.3'teki (350 μL) yıkamayı, adım 10.2'deki (400 μL) cDNA Salım Karışımı ile birleştirin. Yalnızca tek bir çipteki örnekleri birleştirdiğinizden emin olun.
  5. Çipin üzerine 100 μL NFW yerleştirin, Stereo-seq çip slaytını kasete kapatın ve protokolün sonuna kadar buzdolabında saklayın.
    NOT: Düşük verim durumlarında, cDNA'yı yeniden serbest bırakmayı düşünün. Çip üzerindeki DNA'nın varlığı, bir ssDNA boyası kullanılarak ve lamel ile veya lamel olmadan yeniden görüntüleme kullanılarak değerlendirilebilir.

11. cDNA boncuk temizliğini toplayın

  1. Adım 10.4'ten itibaren cDNA'yı eşit hacimde Katı Faz Tersinir İmmobilizasyon (SPRI) boncukları ile yeniden süspanse edin. ~100 bp'nin üzerindeki DNA parçalarını seçmek için boncuklar çözelti boyunca eşit olarak dağılana kadar karıştırın.
  2. 27 °C ila 37 °C (30 ° C önerilir) arasındaki bir sıcaklıkta 10 dakika inkübe edin.
    1. Kuluçka sırasında. İşlenen her 2 çip için NFW'de 5 mL %80 taze etanol hazırlayın.
  3. İnkübe edilmiş boncuk karışımı ile tüpleri alın ve bir masa üstü santrifüjde 100 x g'da kısa bir süre döndürün.
  4. Tüpleri manyetik bir ayırma rafına yerleştirin ve en az 5 dakika (sıvı berraklaşana kadar) inkübe edin.
  5. Boncukları rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın ve temiz etiketli bir tüpte saklayın. cDNA salınımını çip kimliği ve tarihi ile etiketleyin.
  6. Boncukları bozmadan tüplere 1.5 mL %80 etanol ekleyin ve etanolü çıkarmadan önce 30 saniye inkübe edin.
  7. Adım 11.6'yı bir kez daha tekrarlayın, bu sefer boncukları rahatsız etmeden küçük bir pipet ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla etanol çıkarın.
  8. Boncukları tüplerde artık yansıtıcı olmayana kadar havayla kurutun. Süre değişecektir, bu nedenle düşük verime neden olacak aşırı kurumayı (çatlakları) önlemek için düzenli olarak kontrol edin.
    NOT: Odanın nemini ve sıcaklığını ölçün. Yüksek sıcaklıklarda (27 °C) ve düşük nemde (%20'den az) boncuklar çok çabuk kurur (3 ila 5 dakika). Düşük sıcaklıklarda (23 °C) ve yüksek nemde (%40'tan fazla) boncuklar çok daha yavaş kurur (7 ila 15 dakika).
  9. Boncuk tüplerini mıknatıs rafından çıkarın, 22 μL NFW ekleyin ve vorteksleyerek karıştırın.
  10. Kuru bir banyoda veya PCR makinesinde 27 °C'de 5 ila 15 dakika inkübe edin.
  11. Kısa bir süre santrifüjleyin ve sıvı berraklaşana kadar (2 ila 5 dakika) tüpü manyetik ayırma rafına geri yerleştirin.
  12. cDNA içeren 21 μL süpernatantı boncukları bozmadan numune etiketli 0.2 mL PCR tüpüne aktarın.
  13. Her tüp için 11.9 ila 11.12 arasındaki adımları tekrarlayın ve toplam 42 μL cDNA toplayın. Doğrudan cDNA'nın amplifikasyonuna devam edin (12.1 ila 12.8. adımlar).
    NOT: Amplifikasyonun başlatılmasındaki gecikme, verimin azalmasına, kısa okumaların artmasına ve tek sarmallı DNA şablonunun bozulmasına neden olacaktır.

12. cDNA amplifikasyonu

  1. cDNA amplifikasyon karışımını ve FFPE cDNA primerlerini dondurucudan çıkarın ve çözülmesi için ıslak buzun üzerine koyun.
  2. cDNA amplifikasyon karışımını ve FFPE cDNA primerlerini ~100 x g'da bir masa üstü santrifüj üzerinde döndürün.
  3. (Adım 11.13)'ten itibaren 42 μL'den itibaren her cDNA tüpüne 50 μL cDNA amplifikasyon solüsyonu ve 8 μL FFPE cDNA primeri ekleyin ve tüp deformasyonunu önlemek için düz kapaklı adaptörlü bir termocycler'a yerleştirin.
  4. cDNA amplifikasyonu için termocycler programını çalıştırın: ilk denatürasyon: 5 dakika boyunca 95 °C; döngü: [20 saniye boyunca 98 °C, 20 saniye boyunca 58 °C, 3 dakika boyunca 72 °C] × 15 döngü; son uzatma: 5 dakika boyunca 72 °C; tutma sıcaklığı: 12 °C (hemen işleniyorsa) / 4°C (gece boyunca tutulursa).
  5. Boncuk temizliği öncesi ve sonrası 1 μL cDNA'nın DNA konsantrasyonunu ölçün.
    NOT: Temizlemeden önce cDNA ürünü miktarı, her 1 cm² çip için 1 μg'ı aşacak şekilde hesaplanmalıdır. Temizleme sonrası konsantrasyon en az 10 ng/μL olmalıdır. Daha düşük verimler tipik olarak kütüphane çeşitliliğinin azalmasıyla ilişkilidir. Bu aşamadaki önemli numune kaybı, DV200 puanları ile ilişkilidir; ancak DV200, sonuçların mükemmel bir göstergesi değildir.
  6. Adım 12.4'teki PCR ürününü kullanarak adım 11'den (boncuk temizleme) cDNA boncuk temizlemeyi üç değişiklikle tekrarlayın: daha küçük PCR manyetik rafı kullanın, adım 11.6'da sadece 200 μL %80 etanol ekleyin ve adım 11.9'da 22 μL Tris-EDTA (TE) tamponu (pH 8) içinde yeniden süspanse edin.
  7. Boncukları, numune adları, barkod, tarih ve çip kimliği ile etiketlenmiş 20 μL NFW içeren bir tüpte saklayın.
  8. Bir fragman analizörü kullanarak cDNA fragman dağılımını ölçün. Parça boyutu aralığı 250-400 bp arasında olmalıdır. Parçalar çok küçükse, boncuk temizlemeyi tekrarlayın ancak 27 °C yerine oda sıcaklığını (~25 °C) kullanın.
    İSTEĞE BAĞLI DURMA NOKTASI: CDNA ÖLÇÜMÜ YAPıLDıKTAN SONRA -20 °C'de 1 aya kadar, -80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. Boncuklar NFW'de 4 °C'de 1 hafta saklanabilir. Boncukları dondurmayın.

13. Kütüphane hazırlığı (4.Gün)

  1. Amplifikasyon Reaksiyon Karışımı Hazırlama
    1. Kitaplık PCR amplifikasyon çözümünü, kitaplık barkod setlerini, cDNA ürününü ve NFW'yi çıkarın. cDNA'yı ve reaktifleri oda sıcaklığında buz ve su üzerinde çözün ve 10 saniye boyunca 100 x g'da döndürün.
  2. Her 25 μL PCR barkod primer karışımı için kitaplık barkod stratejisini belirleyin.
    NOT: Bu sıralayıcı için, tüm tabanlar bir barkod setindeki her konumda eşit olarak temsil edilmelidir. Bu nedenle, bununla uyumlu çoğu ticari kit, önceden tanımlanmış barkod tetradları (dörtlü setler) ile tasarlanmıştır. Bu tetradlar, bir dizileme şeridine bölünürken tek tek numunelere uygulanabilir veya şerit başına bir numune dizilenirken tek bir numune için bir araya toplanabilirler. Dengesiz barkodlar sıralayıcı tarafından üretilen kullanılabilir veri miktarını azaltacağından, dengeli barkodların korunması zorunludur.
  3. 20 ng için cDNA hacmini belirleyin (örneğin, 10 ng/μL, 2 μL'ye ihtiyaç duyacaktır). Bunu kullanarak, seyreltilmiş cDNA'nın bir NFW (25 μL) çözeltisini yapın (~1 ng/μL'ye seyreltin).
  4. Kütüphane amplifikasyon karışımını (50 μL) NFW (25 μL) içinde seyreltilmiş cDNA ve PCR barkod primer karışımı (25 μL) ile 0.2 mL PCR tüpüne birleştirin.
  5. Kuyuyu pipetleyerek karıştırın ve 10 saniye boyunca 100 x g'da döndürün.
  6. 0.2 mL'lik PCR tüplerini termocycler'a yerleştirin ve tüplerin ezilmesini önlemek için bir ek parçaya sahip olduğunuzdan emin olun.
  7. cDNA amplifikasyonu için termocycler programını çalıştırın: ilk denatürasyon: 5 dakika boyunca 95 °C; döngü: [20 saniye boyunca 98 °C, 20 saniye boyunca 58 °C, 3 dakika boyunca 72 °C] × 8 döngü; son uzatma: 5 dakika boyunca 72 °C; bekletme sıcaklığı: 12 °C (hemen işleniyorsa) / gece boyunca tutulursa 4 °C.
    NOT: Kütüphaneyi hazırlamak için değişen miktarlarda girdi cDNA'sı kullanmak mümkündür. Bununla birlikte, kullanılan miktar, amplifikasyon için gereken PCR döngülerinin sayısını etkileyecektir. Örneğin, satıcı 20 ng girdi DNA'sı ve 8 döngü kullanımını önerir. 7 devir ile 40 ng veya 6 devir ile 80 ng kullanmak da mümkündür. 20 ng'den az veya 80 ng'den fazla giriş cDNA'sı kullanılması önerilmez.

14. Kütüphane amplifikasyon boncuğu temizliği

  1. Ham Kitaplık Ürününü adım 12.5'te yapıldığı gibi ölçün.
  2. Adım 13.7'deki ham kitaplık ürününü kullanarak adım 11'den (boncuk temizleme) boncuk temizlemeyi üç değişiklikle tekrarlayın: 0.8:1 oranında boncuk/ürün kullanın, daha küçük PCR manyetik raf kullanın, adım 11.7'ye kıyasla yalnızca 200 μL %80 etanol kullanın ve adım 11.9'da 22 μL TE tamponunda (pH 8) yeniden süspanse edin. İki adet 1 cm80 cips başına yaklaşık 1 mL taze %2 etanol hazırlayın.
  3. OPSİYONEL DURMA NOKTASI: Kütüphane ölçümü yapıldıktan sonra -20 °C'de 1 aya kadar, -80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. Boncuklar NFW'de 1 hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir. Boncukları dondurmayın.

15. Stereo-Seq Rastgele Oligonükleotid Astarlı DNB'leri sıralamak için DNBSEQ-T7RS sistemi

  1. DNBSEQ-T7RS sisteminde bir PE75 kiti kullanarak, döngüleri Okuma 1 için 25 ve Okuma 2 (PE25+62) için 62 olarak tahsis edin ve ardından 10 bp'lik bir indeks elde edin:
    1. İlk okuma (25 döngünün 1'ini okuma), çip tabanlı barkodlardan uzamsal Çip Kimliğini (CID) veya konuma özgü bilgileri yakalar.
    2. İkinci okuma (62 döngünün 2'sini okuyun), fazlama düzeltmesi ve barkod ofset kalibrasyonu için kullanılan 3 ek karanlık döngü ile doğrudan gen eklerine bağlı rastgele 6 bp'lik bir dizi olan Moleküler Tanımlayıcıyı (MID) yakalar. Bunu, bilinen genomlara veya transkriptomlara eşlenerek tanımlanan, okuma 2'den 30-59 bp'lik bir gen eki izler.
      NOT: Daha uzun gen ekleri mümkündür, ancak farklı eşleştirilmiş uç kitleri ve haritalama iş akışında değişiklik gerektirir.
    3. Çoğullama çözme için indeks döngüsü, adım 13.2'de toplanan sıralama barkodlarına dayalı olarak 10 bps'yi kapsar.
      NOT: 75 PE akış hücresi için yaklaşık 10-12 saatlik tipik dizileme süresi. Dizileme, bir DNBSEQ-T7RS veya benzer bir dizileme cihazı gerektirdiğinden, çoğu laboratuvar için şirket içi bir süreç değil, çoğunlukla bir dizileme çekirdeğinde veya ticari tesiste yapılır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki veriler, SAW boru hattını kullanarak tek hücreli segmentasyon gerçekleştirme ve bir FFPE bölümünden tRNA (TRDMT1) gibi poli adenile edilmemiş RNA'lara eşleme yeteneğini göstermektedir. Stereo-seq'ten elde edilen tarafsız veriler, yalnızca mRNA'ların değil, aynı zamanda tRNA'ların, rRNA'ların ve konakçı olmayan RNA'ların (uygunsa) öneminin incelenmesine izin verir. SAW boru hattından16 gelen doğrudan çıktıyı ve

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stereo-seq protokolü son derece ayrıntılıdır ve özellikle mikrobiyom veya belirli önlemler gerektirebilecek konakçı olmayan profillemede başarıyı garantilemek için hassasiyet, zamanlama ve temiz bir ortam gerektiren birkaç kritik adım içerir.

Tüm adımlar sırasında nükleaz içermeyen su kullanılması gereklidir ve yakalama çipine numune ve reaktifler dışında herhangi bir şeyle dokunulmamalıdır. Kaset düzeneğini kullanırken son derece dikkatli olun ve alıştırma çi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmanın Complete Genomics tarafından finanse edilmediğini beyan eder. Ancak Complete Genomics, bu makalenin yayınlanma maliyetlerini desteklemektedir.  Onlara gelişmiş bir kopya verilmedi veya içerikle ilgili girdi verilmedi.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma kısmen Yumurtalık Kanseri Araştırma İttifakı (OCRA 811621 ve 891490), Sie Vakfı ve Stephanie C. Stelter Bağış Fonu tarafından finanse edildi. Bu araştırma, M. D. Anderson'ın Kanser Merkezi Destek Hibe P30 CA016672 ve Jared Burks'un NCI'nin Araştırma Uzmanı 1 R50 CA243707-01A1 aracılığıyla kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen Akış Sitometrisi ve Hücresel Görüntüleme Çekirdek Tesisi, Veterinerlik ve Cerrahi Bölümü ve İleri Genomik Teknoloji Çekirdeği ile işbirliği içinde gerçekleştirildi.

Ayrıca Compete Genomics'e, özellikle teknik eğitim ve sorun giderme için Brandon Vanderbush ve Tanzeen Yusuff'a, ayrıca Jia "Jackie" Zhao, Yongfu Wong ve Erin Petrilli'ye teşekkür ederiz. Yazar(lar), Complete Genomics'ten indirimli bir fiyata bir dizi FFPE OMNI ve dizileme reaktifinin yanı sıra T7 Erken Erişim Programına erişim aldı. Ayrıca bu çalışmada kullanılmak üzere bazı reaktifler ücretsiz olarak sağlanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL santrifüj tüpleri düzenli DNAse/RNAseThermo Fisher Scientific / Invitrogen3456Reaktifleri karıştırmak için (diğer bantlar sorun yok) 
%100 etanolSigma-AldrichE7023Moleküler derecesi
15mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj TüpleriThermo Fisher Scientific / Invitrogen339650Aliquots  için kullanılır;
20x Konsantre & nbsp; Tuzlu Sodyum Sitrat (SSC) TamponuSigma-AldrichS6639-1LLekeleme için 5 kat SSC, yıkama basamakları ve örtü çıkarma için 1 kez SSC yapıyordum.
2100 Biyoanalizör cihazıÇevikİndirimliEnstitür: Biyoanalizör
3 Kuyu Odası, çıkarılabilirİbidi80381Rehidrasyon ve metanol fiksasyonu sırasında hacimleri azaltmak için silikon odası.
405nm UV Işık KaynağıÇeşitliYokUV reçinesinin kürlenmesi için
50mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj TüpleriThermo Fisher Scientific / Invitrogen339652Aliquotlar ve deparafinizasyon için kullanılır 
%70 Steril İzopropanol AlkolTexwipe TX3270Yüzey dekontaminasyonu ve nbsp için;
Agilent Yüksek Duyarlılık DNA KitiÇevik5067-4626cDNA ve kütüphanelerin biyoanalizör karakterizasyonu için
Agilent RNA 6000 Pico KitiÇevik5067-1513RNA'nın Biyoanalizör karakterizasyonu için
Alüminyum folyoÇeşitliYokSsDNA boyama sırasında kaydırmayı kapatmak için.
Beckman Coulter SPRIselectBeckman Coulter Yaşam Bilimleri B23317/B23318/B23319SPRI Boncuklar cDNA ve Kütüphane Temizliği
Çamaşır suyuÇeşitliYokÇalışma istasyonunu temizlemek, mikrobiyom kontaminasyonunu temizlemek
CONSTIX Mühürlü Köpük SürüntüleriContec19161023Hassas reçine temizliği için
Kapak KayışıSigma-AldrichBR470045-2000EA
Kurutucu PaketlerÇeşitliYokRNase içermeyen, tozsuz kurutucu paketler.
Tek Kullanımlık Yüz MaskesiThermo Fisher Scientific / Invitrogen12-888-001Koruma, RNA kontaminasyonu ve & sterillik 
DNA Silme Silme SüpürgeleriSigma-AldrichL9060-250EAYüzeyleri silerek dekontaminasyon (ıslak mendiller)
DNA LoBind Tüpleri 1.5mLEppendorf 22431021cDNA toplama ve kütüphane amplifikasyon sonrası için kullanılır.
DNA LoBind Tüpleri 2mLEppendorf 22431048Amplifikasyondan önce cDNA toplamak için kullanılır.
DNBSEQ OneStep DNB Üretim Reaktif KitiTam Genomik940-001891-00DNA nanotopu (DNB) hazırlama ve amplifikasyonu için reaktifler
DNBSEQ-T7RS Temizlik Reaktüsü KitiTam Genomik940-001903-00Dizeleme tamamlandıktan sonra yıkama kartuşu
DNBSEQ-T7RS DNB Yük Reaktif KitiTam Genomik940-001894-00DNB'leri akış hücresine yüklemek için reaktifler ve plaka
DNBSEQ-T7RS Dizileme Akış HücresiTam Genomik940-001902-001 şerit/akış hücresi
DNBSEQ-T7RS Stereo-seq görselleştirme reaktif kitiTam Genomik940-001893-00Dizileme için kartuş ve reaktifler.
DNBSEQ-T7RS sistemiTam GenomikBu stereo-seq görselleştirme seti, DNBSEQ teknolojisini kullanır. Bir dizileme çalışması, bir DNA çapının hibridizasyonuyla başlar, ardından bir floresan prob DNA Nanotopuna (DNB) kombinatoryal prob ankraj dizileme (cPAS) kimyası kullanılarak bağlanır. Son olarak, yüksek çözünürlüklü görüntüleme sistemi floresan sinyali yakalar. Optik sinyalin dijital işlenmesinden sonra, sequencer yüksek kaliteli ve doğru dizileme bilgisi üretir.
Tozdan Temizlenen Sıkıştırılmış HavaMatinM-6318Bu markayı veya benzer itici yakıta sahip birini kullanmak önemlidir;
Edge-Rite Mikrotom BıçaklarıThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280LHistoloji - Örnekler kesitlenirken kullanılır
Patlamaya dayanıklı DondurucuÇeşitliYokMetanolü metanol fiksasyon aşamasından önce ve sırasında soğutmak için.
Histoloji FırçalarıÇeşitliYokHistoloji - Örnekler kesitlenirken kullanılır
Hidroklorik asitSigma-Aldrich2104-50MLPremuliablizasyon enzimini 0.01 N HCl (pH 2) içinde seyreltmek için. HCl çözeltisi için standart stok konsantrasyonu 0.1 N'dir.
Görüntüleme SistemiçeşitliYokGC Stomics İmajlayıcısı, Lecia, Evo Revolution
Invitrogen RNaseZap RNase Dekontamminasyon ÇözeltisiThermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9780Çalışma istasyonunun temizlenmesi, RNA kontaminasyonunun giderilmesi
Kimtech Hassas Görev Silecekler Kimtech34155Kuru banklar, ekipmanlar, pipetler vb.
Labrak önlüğüÇeşitliYokKişisel Koruma Ekipmanı (PPE)
Lens KağıdıThermo Fisher Scientific / Invitrogen11-997Slaytları başlamadan kurutmak için çeşitli çalışmalar
Lookout DNA Silme MendilleriSigma-AldrichL9060Çalışma istasyonunun temizlenmesi, PCR kontaminasyonunun giderilmesi
Magentik Ayırma Rafı 5uL - 0.2 Permagen LabwareMSRLV08PCR tüplerinde boncuk ayrılması için
Magjet Rafı 12x1.5 mLThermo Fisher Scientific / InvitrogenMR021.5 mL tüplerde boncuk ayrımı için
Manuel Döner MikrotomLeicaRM2235Histoloji - Örnekler kesitlenirken kullanılır
Metanal ≥ %99,9 immünofloresans ve HPLC için uygundurSigma-Aldrich34860Fiksasyon için (HPLC derecesinde olmalı)
Mikro-diseksiyon pensepleriSigma-AldrichF4142-1EAHistoloji - Örnekler kesitlenirken kullanılır
MikropipetÇeşitliYok
Moleküler Derece Nukleazsız Su, DPEC Arındırılmış SuÇeşitliYokBoncukların seyreltilmesi ve elüasyonu
Nitril EldivenlerÇeşitliYokPPE
FırınÇeşitliYokCips pişirmek
PCR 0.2 mL tüpler ve bağlı kapaklarÇeşitliYokPCR uygulamaları için
PCR örtüleri ÇeşitliYokVerilen kapakta yapıştırıcı zayıfsa değiştirme
PCR Hood & Hood İş IstasyonuMystaireMY-PCR24-010Pre-PCR (RNA'dan cDNA'ya) adımları için
pH ÖlçerÇeşitliYokHCl pH'ı doğrulamak için pH Metre.
Poli-L-Lizin çözümüSigma-AldrichA005-CDoku yapışmasını çipe artırmak için isteğe bağlı
Qubit 4 FluorometreThermo Fisher Scientific / InvitrogenQ33226Uyarı; DNA nicelik ölçümü
Kubit dsDNA Niceliklendirme Testi KitleriThermo Fisher Scientific / InvitrogenQ32851cDNA ve kütüphane niceliklerini ölçmek için
Kubit ssDNA Analiz KitiThermo Fisher Scientific / InvitrogenQ10212ssDNA boyama (Sadece kullanılan boya kullanıldı)
RNAs-sız Buz BloğuÇeşitliYokHistoloji - Örnekler bölümlenirken, blokları hidratlamak için kullanılır
RNaseZap RNase Dekontekromasyon ÇözeltisiThermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9782RNAları yok eden yüzey dekontaminasyon çözümü
RNeasy FFPE KitiQiagen73504 & 19093RNA Çıkarımı & İçin DV200 ölçümü 
Ultra Beyaz Reçine HeykelSiraya TechYokYüksek sıcaklığa dayanıklı UV kürlenebilir reçine
Stereo-seq 16 Barkod Kütüphanesi Hazırlık KitiSTOmics / Tam Genomik111KL160Stereo-seq OMNI FFPE Kütüphanesi oluşturmak için
Stereo-seq FFPE Aksesuar KitiSTOmics / Tam Genomik310AK002211SN114 kitinin uzamsal OMNI aksesuar parçaları
Stereo-seq N-chip Slide (1cm x 1cm)STOmics / Tam Genomik210CN114211SN114 kitinin uzaylı OMNI çipi parçası
Stereo-seq PCR Adaptörü STOmics / Tam Genomik301AUX001PCR hibridizasyon adımları için PCRmax Situ Hibridizasyon Adaptörüne benzer üç uyacak şekilde değiştirilmiş
Stereo-seq Transkriptomika N KitSTOmics / Tam Genomik211KN114211SN114 kitinin uzamsal OMNI regent parçası
Cerrahi Tasarım Genel Amaçlı Endüstriyel JiletThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236Histoloji - Örnekler kesitlenirken kullanılır
TE Tampon Çözeltisi pH 8.0Sigma-Aldrich8890cDNA ve kütüphanelerin elütasyonu için
Termal DöngüleyicilerBioRad / çeşitli1861096 /12015392 / çeşitliManuel kapaklı veya derin kuyu seçenekleri olan PCR makinesi (T100 Termal Döngücü / PTC Tempo, Derin Kuyu Termal Döngücü vb.)
Thermo Scientific Orion All-in-One pH Tampon KitleriThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-624-500
Doku Flotasyon Banyosu - Dijital XH-1003PrömiyerNC0779538Histoloji - Örnekler kesitlenirken kullanılır
UV koruyucu gözlüklerÇeşitliYokUV kürleme sırasında güvenlik için
KsilenSigma-Aldrich247642Deparafinizasyon için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  2. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  3. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 1-12 (2025).
  4. Fang, S., et al. Computational approaches and challenges in spatial transcriptomics. Genomics Proteomics Bioinformatics. 21 (1), 24-47 (2023).
  5. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-seq technologies and related computational data analysis. Front Genet. 10, 317(2019).
  6. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 882114(2022).
  7. Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
  8. Ma, Y., Zhou, X. Spatially informed cell-type deconvolution for spatial transcriptomics. Nat Biotechnol. 40 (9), 1349-1359 (2022).
  9. Zhou, Z., Zhong, Y., Zhang, Z., Ren, X. Spatial transcriptomics deconvolution at single-cell resolution using Redeconve. Nat Commun. 14 (1), 428(2023).
  10. Wei, R., et al. Spatial charting of single-cell transcriptomes in tissues. Nat Biotechnol. 40 (8), 1190-1199 (2022).
  11. Cheng, M., et al. Spatially resolved transcriptomics: a comprehensive review of their technological advances, applications, and challenges. J Genet Genomics. 50 (9), 625-640 (2023).
  12. To, A., Yu, Z., Sugimura, R. Recent advancement in the spatial immuno-oncology. Semin Cell Dev Biol. 166, 22-28 (2025).
  13. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  14. McKellar, D. W., et al. Spatial mapping of the total transcriptome by in situ polyadenylation. Nat Biotechnol. 41 (4), 513-520 (2023).
  15. Kuemmerle, L. B., et al. Probe set selection for targeted spatial transcriptomics. Nat Methods. 21 (12), 2260-2270 (2024).
  16. Gong, C., et al. an efficient and accurate data analysis workflow for stereo-seq spatial transcriptomics. Gigabyte. 2024, 1-12 (2024).
  17. Zhou, Y., Jia, E., Pan, M., Zhao, X., Ge, Q. Encoding method of single-cell spatial transcriptomics sequencing. Int J Biol Sci. 16 (14), 2663-2674 (2020).
  18. Patel, P. G., et al. Reliability and performance of commercial RNA and DNA extraction kits for FFPE tissue cores. PLoS One. 12 (6), e0179732(2017).
  19. Zhao, Y., et al. Stereo-seq V2: Spatial mapping of total RNA on FFPE sections with high resolution. Cell. , (2025).
  20. Russell, A. J. C., et al. Slide-tags enables single-nucleus barcoding for multimodal spatial genomics. Nature. 625 (7993), 101-109 (2024).
  21. Stenbeck, L., Taborsak-Lines, F., Giacomello, S. Enabling automated and reproducible spatially resolved transcriptomics at scale. Heliyon. 8 (6), e09651(2022).
  22. Vol. Rev A. , 10X Genomics. Pleasanton, CA. (2022).
  23. Su, G., et al. Spatial multi-omics sequencing for fixed tissue via DBiT-seq. STAR Protoc. 2 (2), 100532(2021).
  24. Stickels, R. R., et al. Highly sensitive spatial transcriptomics at near-cellular resolution with Slide-seqV2. Nat Biotechnol. 39 (3), 313-319 (2021).
  25. Groelz, D., Viertler, C., Pabst, D., Dettmann, N., Zatloukal, K. Impact of storage conditions on the quality of nucleic acids in paraffin embedded tissues. PLoS One. 13 (9), e0203608(2018).
  26. Yi, Q. Q., et al. Effect of preservation time of formalin-fixed paraffin-embedded tissues on extractable DNA and RNA quantity. J Int Med Res. 48 (6), 030006052093125(2020).
  27. Eccher, A., et al. Pathology laboratory archives: Conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 14 (4), 333(2024).
  28. Chen, T. Y., You, L., Hardillo, J. A. U., Chien, M. P. Spatial transcriptomic technologies. Cells. 12 (16), 2042(2023).
  29. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  30. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nat Biotechnol. 38 (5), 586-599 (2020).
  31. Janesick, A., et al. High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun. 14 (1), 3602(2023).
  32. You, Y., et al. Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods. Nat Methods. 21 (9), 1743-1754 (2024).
  33. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
  34. Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), eaat5691(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsStereo seqFFPE TissueSpecies Agnostic ProfilingSpatial RNA DetectionSingle Cell SegmentationMicrobiome ProfilingNon Polyadenylated RNATumor MicroenvironmentSpatial Barcoding

Related Articles