Yöntem makalesi

Spesifik Olmayan Doku Floresansını En Aza İndirmek için Spektral Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Yüksek Pleks Görüntüleme

DOI:

10.3791/68644

⸱

28 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1McMaster Immunology Research Centre, Department of Medicine, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 2Schroeder Allergy and Immunology Research Institute, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 3Carl Zeiss Canada MicroImaging, 4Division of Otolaryngology, Department of Surgery, McMaster University Medical Centre, McMaster University Medical Centre

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektral Yinelemeli Ağartma Çoklamayı Genişletir (IBEX), spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için heparin blokajı ekleyerek ve otofloresansı bastırmak için hesaplamalı karıştırma ile spektral algılamadan yararlanarak temel IBEX tekniğini temel alır. Bu yaklaşım, arka plan kaynaklarını azaltırken görüntü elde etmeyi hızlandırır ve sağlam, çok yönlü, yüksek parametreli uzamsal proteomik analizlere olanak tanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek oranda çoğullanmış görüntüleme, işlevsel olarak çeşitli hücrelerin ve bunların doğal doku ortamlarındaki nişlerinin incelenmesini sağlar. Yinelemeli Ağartma Çoğullamayı Uzatır (IBEX), aynı doku kesitinde birden fazla belirtecin görüntülenmesine izin veren döngüsel bir immüno-etiketleme ve florofor inaktivasyon tekniğidir. Yakalanan görüntüler daha sonra hücre kümelerini, bunların lokalizasyonlarını ve komşu hücre tiplerini tanımlamak için tek hücreli veriler elde etmek üzere analiz edilebilir. Bu verilerin yorumlanması, gerçek işaretleyici ifadelerini floresan mikroskobuna özgü arka plan kaynaklarından ayırt etme yeteneğine dayanır. IBEX protokolünün bir uyarlaması olan spektral IBEX, spektral konfokal algılamayı hesaplamalı karıştırmayla bütünleştirir ve yüke dayalı hedef dışı bağlanmayı azaltmak için heparin engellemeyi içerir. Bu kombinasyon, sinyal-arka plan oranını iyileştirir, doku otofloresansını baskılar ve kanamayı en aza indirirken aynı zamanda geleneksel çok kanallı konfokal görüntülemeye kıyasla çekim süresini azaltır. Yüksek eozinofil içeriği ve güçlü otofloresan ile karakterize edilen bir model olan insan nazal polip dokusuna uygulama, altı görüntüleme turu boyunca yapısal, immün ve hücre durumu bölmelerinde 26 belirtecin güvenilir görüntülenmesini gösterdi. Ortaya çıkan iş akışı, karmaşık doku mimarisini ve hücresel nişleri yakalayan yüksek boyutlu, uzamsal olarak çözülmüş proteomik bilgiler üretir. Bu optimize edilmiş yaklaşım birlikte, çoğullanmış görüntüleme için sağlam ve geniş çapta uygulanabilir bir strateji sağlar, özellikle otofloresan ve spesifik olmayan boyamanın geleneksel yaklaşımları sınırladığı dokular için uygundur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokular, üç boyutlu yapılar halinde organize olan ve etkileşim yoluyla yaşam için gerekli olan biyolojik süreçleri koordine eden özel işlevlere sahip çeşitli hücrelerden oluşur. Patoloji, hücresel bileşimdeki veya doku mimarisindeki bozulmalar bu etkileşimlere müdahale ettiğinde ve doku homeostazını tehlikeye attığında ortaya çıkar1. İnsan sağlığı ve hastalıklarının altında yatan biyolojiyi anlamak için çok sayıda özel hücre tipinin dokularımızda nasıl lokalize olduğu ve etkileşime girdiği hakkında bilgi gereklidir.

Transkriptomik, epigenomik ve proteomik seviyelerde tek hücreli profilleme teknolojilerindeki ilerlemeler, olağanüstü çeşitlilikte özel hücre tiplerini ortaya çıkarmıştır. 2,3 Tek hücreli RNA dizilimi ve spektral akış sitometrisi gibi teknolojiler, bu heterojen popülasyonları karakterize etmek için gereken parametre sayısını ölçebilir. Bununla birlikte, hücrelerin doğal doku ortamlarından tek hücreli süspansiyonlara 4,5 ayrılması gerektiğinden, bu yaklaşımlar uzamsal bilgiden yoksundur. Bu nedenle, çeşitli hastalık bağlamlarıyla ilişkili hücre tipleri tanımlanmıştır, ancak bunların doku içindeki etkileşimleri ve hastalığın devam etmesine katkıları belirsizliğini korumaktadır.

Bu sınırlamalardan bazılarını ele almak için, bir doku içindeki hücresel heterojenliği yakalamak ve aynı zamanda her hücrenin konumunu korumak için çeşitli uzamsal omik teknolojiler geliştirilmiştir6. Örneğin, gen transkripsiyonu, bir doku kesiti (örneğin, Visium) boyunca rasterleştirilmiş noktalarda RNA'yı amplifiye ederek veya tek hücreli çözünürlükte (örneğin, Xenium) görüntülenen spesifik genlerden oluşan bir paneli hedefleyen RNA hibridizasyon probları kullanılarak ölçülebilir 7,8. Bu yöntemler, dokulardaki transkripsiyonel kalıpları ve düzenleyici mekanizmaları izlemek için etkilidir. Bununla birlikte, transkripsiyonel profiller genellikle bir hücrenin fonksiyonel yeteneklerini daha doğrudan yansıtan protein ekspresyonu ile zayıf bir şekilde ilişkilidir9. Protein ekspresyonu, floresan mikroskobu10,11 ile tespit edilebilen floroforlara konjuge spesifik antikorlar kullanılarak tanımlanabilir. Geleneksel floresan mikroskobunun kullanılması, bu tür altı antikor konjuge floroforun ayrı ayrı görüntülenmesine izin verebilir. Bununla birlikte, bu floroforların örtüşen uyarma ve emisyon profilleri, herhangi bir kanal12'deki floresan sinyalinin kaynağı konusunda belirsizliğe neden olur.

Yinelemeli Ağartma Ekstansiyonu Uzatır (IBEX), floresan mikroskobu 13,14,15'in bu sınırlamasının üstesinden gelmek için geliştirilmiş yüksek içerikli bir görüntüleme yöntemidir. IBEX, görüntülemeden sonra floroforları kimyasal olarak inaktive etmek için lityum borohidrit (LiBH4) kullanır ve aynı doku örneğinin yeniden görüntülemeden önce sonraki bir florofor konjuge antikor turu ile yeniden boyanmasına izin verir. IBEX, doku bütünlüğünü koruyarak, aynı doku kesiti üzerinde teorik olarak sınırsız sayıda işaretleyiciyi görselleştirmek için birçok görüntüleme turuna olanak tanır. Elde edilen görüntülerin hesaplamalı hizalanması, hücresel nişleri ortaya çıkarmak için uzamsal verileri korurken, tek hücre çözünürlüğünde omik düzeyinde karakterizasyon sağlar. Bu veriler aynı zamanda varsayılan hücresel etkileşimleri de ortaya çıkarabilir, ancak bunlar diğer teknikler kullanılarak doğrulanmalıdır16. IBEX, ticari olarak temin edilebilen floroforlarla uyumlu açık kaynaklı bir yöntemdir ve erişilebilirliği, hızlı benimsemeyi ve yüksek kaliteli veri üretimini teşvik etmek için reaktifleri doğrulayan ve verileri kamuya açık olarak paylaşan uluslararası bir araştırmacı topluluğu tarafından desteklenir17,18.

Bu çalışmada, tekniğin iki büyük zorluğunun üstesinden gelmek için değiştirilmiş bir IBEX protokolü tasarlanmıştır: doku otofloresansı ve florofor konjuge antikor problarının spesifik olmayan bağlanması (topluca arka plan olarak anılır). Otofloresan, bir dokuya endojen olan floresan moleküllerinin uyarılması, antikor konjuge floroforlardan19,20 elde edilen istenen sinyalle örtüşen ışık yaydığında ortaya çıkar. Florofor-konjuge antikorların hedef dışı veya spesifik olmayan bağlanması, hedef proteini21,22 eksprese etmeyen hücrelerden veya yapılardan floresan ile sonuçlanır. Bu artefaktlar, bir hücrenin gerçekten ifade etmediği bir belirteci ifade ettiği gibi yanlış bir sonuca varılmasıyla sonuçlanabilir, bu da hesaplamalı analizleri ve doğru hücre tipi atamasını karmaşık hale getirir. Spektral IBEX, hedef dışı sinyalin heparin bazlı yük nötralizasyonunu tam spektral edinim ve hesaplamalı karıştırma ile birleştirerek, kanamayı önemli ölçüde azaltır, sinyal-arka plan oranını (SBR) iyileştirir ve tur başına edinim süresini yarıya indirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan nazal polip dokuları, Hamilton Entegre Araştırma Etik Kurulu'nun etik onayı ile Hamilton Sağlık Bilimleri'nde sinüs cerrahisi sırasında toplanmıştır. Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Örnek toplama

  1. Kronik rinosinüzitli hastalara yapılan rutin polipektomi işlemleri sırasında örnekler alın. Cerrahi olarak çıkarıldıktan sonra, numuneleri taşıma için buz üzerinde tıbbi salin içeren bir şişeye koyun ve doku bütünlüğünü korumak için hemen görüntüleme için işleyin.

2. Reaktif hazırlama

  1. Elde edilen fiksaj ve geçirgenleştirme solüsyonunu PBS'de 1:4 oranında seyrelterek fiksasyon ve geçirgenleştirme solüsyonu hazırlayın. PBS'de %30 sükroz olarak kriyoprezervasyon solüsyonu hazırlayın. Seyreltme tamponunu PBS'de %0,1 v/v Triton X-100 olarak hazırlayın.
  2. BSA blok reaktifini seyreltme tamponunda %1 w/v Sığır serum albümini olarak hazırlayın. Heparin blok reaktifini 1 mL PBS içinde 10KU Heparin sodyum tuzu olarak hazırlayın. Heparin blok reaktifini (1:50) BSA blok reaktifinde Fc blok reaktifi (1:100) ile karıştırarak blokaj tamponunu hazırlayın.
  3. Boyama karışımını, bloke edici tamponda uygun seyreltmelerde titre edilmiş antikor olarak hazırlayın. 10 mL ultra saf suya 10 mg LiBH4 ekleyerek ağartma solüsyonu hazırlayın.

3. Doku işleme ve brütleme

  1. Dokuyu bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin (tipik olarak ~15x büyütmede, ancak bu numuneye ve mikroskoba bağlı olarak değişebilir) ve forseps ve neşter ile yağ ve kemiği çıkarın. Dokuyu en iyi şekilde korumak için temiz aletler kullanın, soğuk ve ıslak bir yüzeyde çalışın ve işlem süresini en aza indirin.
  2. Brüt dokular 0,5 cm kalınlığında bir neşter ile 4-5 mm'lik dilimler halinde> 23. Dilimleri fiksasyon ve geçirgenleştirme solüsyonuna daldırın ve 16 saat boyunca °C'de döndürün.
    NOT: Bu çözeltinin ve adım 3.3'teki diğerlerinin hacmi, uygun boyutta bir tüpte numunenin hacminin yaklaşık 20 katı olmalıdır.
  3. Dokuyu PBS'ye taşıyın ve 5 dakika durulayın. Dokuyu kriyoprezervasyon solüsyonuna daldırın ve °C'de 16 saat inkübe edin. Bu adımdan sonra yıkamayın, çünkü bu, dokuya yeniden su girmesine neden olur.

4. Doku dondurma

  1. 6 oyuklu bir plakayı her bir kuyucuğun üzerinde deney ve numune ayrıntılarıyla etiketleyin ve en az 20 dakika soğuması için -20 °C'lik bir dondurucuya koyun.
  2. Uygun boyutta bir kriyo kalıbı Optimum Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiği ile doldurun. OCT'de kabarcık oluşturmaktan kaçının. Bir iğne veya pipet ucu kullanarak büyük kabarcıkları kriyokalıbın kenarlarına sürükleyin.
    NOT: Küçük, düz tabanlı bir şişe veya tüpün etrafına sarılmış alüminyum folyo kullanılarak bir kriyokalıp yapılabilir.
  3. Dokuyu kriyoprezervasyon solüsyonundan çıkarın. Fazla sıvıyı çıkarmak için mendili tüy bırakmayan bir mendile hafifçe sürün, çünkü bu donmayı tehlikeye atabilir.
  4. 250 mL'lik bir beheri çeker ocakta yaklaşık 100-150 mL izopentan ile doldurun ve kısmen sıvı nitrojenle doldurulmuş bir köpük kutuya veya soğutucuya yerleştirin.
    NOT: İzopentan 2 saatten fazla açık bırakılırsa buharlaşır; Açtıktan hemen sonra kullanın. İzopentan, dokunun eşit ve hızlı bir şekilde donmasını kolaylaştırır. İzopentan zamanla yavaş yavaş donabilir. Katı halde donarsa, beheri sıvı nitrojenden çıkarın ve çözülmesine izin verin. İzopentan, 5 kata kadar yeniden kullanılmak üzere kapaklı bir cam şişeye dökülebilir. Beherin yüzmesini veya devrilmesini önlemek için izopentan seviyesi sıvı nitrojenden daha yüksek olmalıdır.
  5. Diseksiyon mikroskobu altında OCT içinde dokunun yönünü istediğiniz gibi ayarlayın.
    NOT: Nazal polip dokuları için, mümkün olan en büyük kesit alanını yakalayan simetrik kesitler elde etmek için numuneyi tipik olarak uzun ekseni boyunca yönlendiririz. Optimum gömme oryantasyonu için ilgilenilen doku için histoloji kılavuzlarına bakın.
  6. Kriyokalıbın altını izopentanın içine batırın. Dokunun merkezi tamamen beyaz ve opak olduğunda kriyokalıbı izopentandan çıkarın. Kriyokalıbı tamamen suya batırmaktan kaçının; blok çatlayabilir ve kesitlemeyi tehlikeye atabilir.
  7. Sırtına baskı uygulayarak bloğu kriyomoldan yavaşça çıkarın ve -20 °C'de önceden soğutulmuş 6 oyuklu plakaya yerleştirin. Tüm numuneleri dondurduktan sonra, uzun süreli saklama için plakayı -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın.
    NOT: Bu bir duraklama noktasıdır. Dokular -80 °C'de yıllarca saklanabilir.

5. Slayt hazırlama ve kriyo-kesit alma

  1. Slaytların üzerine 10-1 μL krom şap jelatin yapıştırıcı pipetleyin; Eşit şekilde yayın ve 15 dakika havayla kurutun. Optimum yapışma için, odacıklı kapak camlarına 2x-3x krom şap jelatin yapıştırıcı uygulayın ve uygulama başına 5 μL ekleyin (toplam 15 μL).
  2. Kuruduktan sonra, tam kurumasını sağlamak için slaytları 80 °C'de 1 saat fırına koyun. Odacıklı bir kapak camı kullanıyorsanız, plastik 80 °C'de eriyebileceğinden, gece boyunca 37 °C'de kurumaya bırakın.
    NOT: Slaytlar kaplanıp kurutulduktan sonra, kullanılıncaya kadar günlerce oda sıcaklığında saklanabilir. Tozdan kaçınmak için örtülmelidirler.
  3. Dengelemek için dokuları -80 °C'den -20 °C'ye (veya kesme sıcaklığında kriyostatın içine) aktarın ve kesitlemeden önce 1 saat ön soğutun. Bir kriyostat24 üzerinde 10-2 μm'lik kesitler kesin.
    1. Odacıklı bir kapak camına kesit alıyorsanız, kıvrılma önleyici plakayı kaldırdıktan sonra forseps kullanarak kesiti yavaşça kaldırın. Haznenin içindeki camın üzerine düz bir şekilde yerleştirmek için bir boya fırçası kullanın. Bölümü camın üzerinde eritmek için kapak camının altındaki numunenin altındaki başparmağı bastırın.
  4. Slaytları 3 °C'de 1 saat veya oda sıcaklığında 24 saat kurutun.
    NOT: Slaytlar hemen kullanılırsa, boyamaya hazırlanırken tozdan korunmak için oda sıcaklığında bir slayt kutusunda geçici olarak saklanabilirler. Ancak hemen kullanılmayacaklarsa doku bütünlüğünü korumak için -80°C'de saklayın. Bu bir duraklama noktasıdır. Slaytlar -80 °C'de saklanıyorsa, işlem burada duraklatılabilir.

6. Engelleme ve antikor immün etiketleme

  1. Boyama veya diğer adımlar sırasında sıvıyı içeren hidrofobik bir bariyer oluşturmak için bir PAP kalemi kullanarak camın üzerine dokunun etrafına bir daire çizin. OCT çözüldüğünde hidrofobik mürekkep akıp gideceğinden OCT'nin üzerine çizim yapmayın.
    NOT: Duvarlar sıvıyı kuyuda tuttuğu için odacıklı kapak camı için bu adım gerekli değildir.
  2. Her dokuya ~100 μL PBS ekleyin ve dokuları yeniden sulandırmak ve OCT'yi yıkamak için oda sıcaklığında ~2 dakika inkübe edin. Odacıklı kapak camı için ~1 mL PBS kullanın.
    NOT: Dokunun camdan kalkmasını önlemek için, sıvıyı doğrudan numunenin üzerine pipetlemeyin.
  3. PBS'yi aspire edin ve 100 μL engelleme tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında kapalı bir nem odasında 1 saat inkübe edin. Odacıklı kapak camı için ~400 μL engelleme tamponu kullanın.
  4. Bloke edici tamponu aspire edin ve 100 μL boyama karışımı ekleyin. Gece boyunca buzdolabına (4 °C) yerleştirilmiş kapalı bir nem odasında inkübe edin. Odacıklı kapak camı için ~400 μL boyama karışımı kullanın. Floroforların spektrumunu ve dokuların otofloresansını tanımlamak için paneldeki floroforlardan sadece biri ile boyanmış kesitler ve lekesiz bir negatif kontrol hazırlayın.
    NOT: Antikor seyreltmeleri, 1:50, 1:100 ve 1:200'e titre edilerek veya gerektiğinde başka bir seyreltme yapılarak deneysel olarak optimize edilmelidir. Optimum sinyali verecek minimum antikor miktarını seçin. Spektral karıştırma etkinliğini en üst düzeye çıkarmak için paneldeki tüm antikorların yoğunluklarının kabaca eşdeğer olmasını hedefleyin. Floroforların ışıkla ağartılmasını en aza indirmek için numuneleri bu adımın ötesinde ışıktan koruyun.
  5. Boyama karışımını aspire edin ve her yıkama arasında sıvıyı aspire ederek PBS (10 μL, her biri 2 dakika) ile 3 kez yıkayın. Odacıklı kapak camı için ~1 mL PBS kullanın.
  6. Her bölüme ~10 μL montaj ortamı ekleyin. Görüntüleme sırasında optik sapmalar oluşturacak hava kabarcıklarını önlemek için yavaşça pipetleyin. Bir pipet kullanarak oluşan kabarcıkları aspire edin. Odacıklı kapak camı için, her bir kuyucuğa 1 mL montaj ortamı ekleyin.
    NOT: Odacıklı kapak camı için aşağıdaki adımlar olan 6.7 ve 6.8 gerekli değildir.
  7. 1 No'lu 22 mm x 50 mm kapak camını numunenin üzerine yavaşça yerleştirin.
    NOT: Kapak camının bir ucunu montaj ortamına sıkıca bastırarak ve camın numunenin üzerine düşmesine izin vererek ortamı eşit şekilde yayarak kabarcıklar en aza indirilebilir. Kapak camının kalınlığı, objektif merceğin özelliklerine uygun olmalıdır (örneğin, çoğu yüksek sayısal açıklıklı objektif için #1.5 lamel ). Objektif merceğin bir düzeltme bileziği varsa, doğru lamel boyutuna ayarlandığından emin olun. Yanlış kalınlık veya yaka ayarının kullanılması küresel sapmaya neden olabilir ve bulanık veya bozuk görüntülere neden olabilir.
  8. Sürgüyü ters çevirin ve fazla montaj ortamını dışarı itmek için tüy bırakmayan bir mendil üzerine hafifçe bastırın.
    NOT: Sürgü üzerinde çok fazla kuvvetle aşağı itmekten kaçının. Aşırı kuvvet dokuya zarar verebilir veya deforme edebilir, bu da görüntüleme turları arasındaki hizalamayı etkileyebilir.

7. Mikroskop kurulumu ve görüntüleme

NOT: Bu protokol özellikle ZEISS LSM980 ve diğer ZEISS sistemlerine atıfta bulunur. Bu adımlar diğer sistemlerde farklı olabilir. İki iş akışı ayrıntılıdır: bir spektral dedektör mevcut olmadığında kullanılabilen, ancak daha uzun edinim sürelerine ve bir miktar artık kanamaya sahip olan geleneksel konfokal + karıştırma (hesaplamalı spektral karıştırma sonrası ile çok kanallı edinim); ve tam spektral algılama (tek geçişli, 34 kanallı spektral edinim), en iyi SBR'yi, sıfıra yakın karışmayı ve en hızlı görüntüleme sürelerini sağladığı için tercih ettiğimiz yöntem.

  1. Geleneksel konfokal mikroskopi
    1. Görüntülemeden yaklaşık 30 dakika önce mikroskop sistemini (lazerler, dedektörler ve bilgisayar dahil) açın.
    2. Mikroskop > Objektifler öğesine tıklanarak ulaşılan mikroskop kontrol ekranında, uygun objektif merceğini seçin (örneğin, 20x 0,8 NA) ve gerekirse mercek güvenli bir silme ile temizleyin.
    3. Numuneyi sahneye güvenli bir şekilde monte edin. Ardışık turların XY hizalamasını kolaylaştırmak için cam veya kapak camı haznesini slayt tutucunun aynı köşesine/ucuna hizalamaya çalışın. Bu, takılı tutucuya bağlı olacaktır.
    4. GFP, YFP veya RFP aydınlatmasındaki göz merceklerini kullanarak örneğe odaklanın, ardından bilgisayar ekranındaki Edinme sekmesine geçin.
      NOT: DAPI lekesini UV ışığına maruz bırakmak (DAPI filtre küpünü kullanarak) yeşil floresan bir moleküle dönüşmesine neden olacağından, numuneyi göz merceklerini kullanarak odaklarken DAPI filtresini kullanmayın (Ek Şekil 1A).
    5. Örtüşmeyi ve çapraz lazer uyarımını en aza indiren görüntüleme izlerini yapılandırın (Ek Tablo 1, Ek Tablo 2 , burada gösterilen geleneksel konfokal mikroskopi deneyleri için edinim ayarlarını bildirir).
      NOT: İdeal kombinasyonlar, AF594, AF647 veya AF700 ile birlikte DAPI veya AF488 gibi farklı uyarma ve emisyon tepe noktalarını içerir.
      1. Her iz için en uygun uyarma lazerlerini atayın. Optimum optik kesit için iğne deliği boyutunu her iz için 1 AU veya Airy Unit olarak ayarlayın.
      2. Raydaki her ayarlanabilir dedektör için alım dalga boyu aralığını, iz için floroforlara göre ayrı ayrı ayarlayın.
      3. SBR'yi en üst düzeye çıkarmak için lazer gücü ve dedektör kazancı ayarlarını yapın. Varsa, çok az pikselin maksimum yoğunluğa ulaştığından emin olun.
        NOT: Dedektörlerin ışıkla ağartılmasını ve/veya aşırı pozlanmasını önlemek için lazer gücünü mümkün olduğunca düşük tutun. Arka planın üzerinde güçlü bir sinyal algılanacak şekilde antikor seyreltmelerini optimize edin.
    6. Numuneyi önizlemek ve tarama parametrelerini (gerekirse tarama hızı, çözünürlük ve ortalama) ayarlamak için Sürekli tarama modu düğmesine basın.
      NOT: Küçük karolar için ve arka planı en aza indirmek için, 1-2 ortalama tur ile 0,2-0,3 μs arasında bir bekleme süresi önerilir. Segmentasyonu ve tek hücre çözünürlüğünü korurken hızı en üst düzeye çıkarmak için, ortalama almadan en yüksek tarama hızını ve 0,2-0 piksel boyutunu kullanın. μm/piksel. Örneğin, 20x/0,80 NA objektifle döşeme başına 2048 x 2048 pikselde görüntüleme, 424,26 x 424,2 μm2'lik bir alanda 0,20 μm/piksel verir.
    7. Karışma veya kanama olup olmadığını kontrol etmek için her iz için test taramaları yapın.
      1. Tüm işaretleyicilerle boyanmış slaytta, Sürekli tarama modunda, her lazeri düşük güçte başlatın ve yalnızca işaretleyici doygunluk olmadan açıkça görünene kadar kaldırın (LUT/doygunluk göstergesini kullanın).
        NOT: Mümkünse, deney örneğini görüntülemeden önce mikroskop ayarlarını optimize etmek için bir kopya örnek veya istenmeyen bir bölge kullanılması önerilir. Bu, özellikle DAPI (fotokonversiyon riskinden kaçınmak için) veya hızlı bir şekilde ışıkla ağartılan floroforlar (örneğin, PE) ile boyama yaparken önemlidir.
      2. Bu florofor için tek lekeli kontrole geçin. Lazer gücünü ve dedektör kazancını, sinyalin parlak ve doymamış olması için ayarlayın.
      3. Aynı tek lekeli slaytta diğer tüm algılama kanallarını tarayın. Kanal dışı yoğunluk arka planı aşarsa, algılama penceresini daraltın ve/veya uyarımı/kazancı azaltın.
      4. Her florofor için 7.1.7.1-7.1.7.2'yi tekrarlayın. Herhangi bir ayarlamadan sonra, özellikle birlikte lokalize olan işaretleyiciler için yoğunlukları karşılaştırılabilir tutmak için önceden optimize edilmiş lekeleri kısaca kontrol edin.
    8. Kutucuklar özelliğini etkinleştirin ve bir kutucuk alma bölgesi tanımlayın.
      1. Dokunun merkezindeki karo toplama bölgesi için odağı optimize edin. Sonraki turlarda hizalama için referans olarak benzersiz bir özellik (belirli bir düzenlemedeki bir hücre kümesi) bulun.
    9. Z-yığını özelliğini etkinleştirin ve Z-yığını sekmesine gidin. Merkez sekmesine gidin. Z yığınındaki dilim sayısını, dilimler arasında en az 1 μm aralıklarla en az 6 olarak ayarlayın. Ardından, geçerli odak noktasını (adım 6.1.8.1'de belirlenir) yığının orta dilimi olarak konumlandırmak için Orta düğmesini tıklatın.
    10. Görüntüleri almaya başlamak için Denemeyi başlat düğmesini tıklayın. Görüntü küçük resmine sağ tıklayıp Farklı Kaydet'i seçerek edinme ayarlarını kaydedin ve görüntü verilerini yedekleyin. Ardından dosya konumunu seçin ve görsele bir ad verin.
    11. Döşenmiş bölgenin edinilmesinden aynı optimize edilmiş ayarları kullanarak görüntüyü karıştırın, gerçek sinyal spektrumunu elde etmek için her tek lekeli kontrolden ve Adım 6.4'te hazırlanan arka plan/otofloresansı yakalamak için boyanmamış kontrolden bir Snap yakalayın.
      1. Bu görüntüler spektral karıştırmayı gidermek için kullanılır; Çoğullanmış örneklerden gerçek sinyali seçmeyin. Önce yoğunluğun/morfolojinin bulunmadığından veya boyanmamış kontrolde arka plana eşdeğer olduğundan emin olarak ve ardından işaretleyicinin beklenen lokalizasyonunu eşleştirerek (örneğin, membran vs nükleer, sitoplazmik vs salgılanan modeller) seçilen bölgenin sinyali gerçekten temsil ettiğini doğrulayın.
      2. Snap görüntüsünü açın. Karıştırma sekmesine tıklayın. Pozitif sinyalin etrafında bir yatırım getirisi çizmek için Unmix araçları sekmesi altındaki bölge seçim araçlarından birini kullanın (o bölgenin bir spektrumu görünecektir). Karıştırmayı çözmek için referans spektrumları oluşturmak için her bir floroforun her anlık görüntüsü için bunu tekrarlayın.
        1. Seçilen bölgenin gerçek sinyali temsil ettiğinden emin olmak için bu spektrumu floroforun teorik spektrumuyla karşılaştırın. Spektrumu her florofora göre adlandırın ve spektral veritabanına kaydedin.
          NOT: Otofloresan için bir spektrum, diğer sinyallerden karıştırmak için ayrı bir florofor olarak tanımlanabilir ve işlenebilir. Panel optimizasyonunun tamamlanmasının ardından, aynı protokol ve doku tipi kullanıldığı sürece aynı ayarlar yeniden kullanılabileceğinden yeni referansların alınmasına gerek yoktur.
      3. Döşenmiş görüntüyü yükleyin ve Karıştırma aracına gidin. Kullan + Her florofor için referans spektrumlarını karıştırma listesine eklemek için düğmesine basın, ardından Doğrusal karıştırma düğmesine tıklayın.
    12. Karıştırılmamış görüntüyü daha sonra analiz etmek üzere kaydedin.
      NOT: Çıktı, her işaretçi için bir kanala sahip çok döşemeli bir görüntüdür. Devam etmeden önce deney burada duraklatılabilir.
    13. Gölgelendirme referans görüntüsünü alma
      1. Numuneyi görüntülemek için kullanılan aynı ayarı kullanarak, bir DAPI kalibrasyon slaytının görüntüsünü elde edin. Görüntüyü kaydedin, ardından gölgelendirme referansı olarak hizmet etmek için yalnızca DAPI kanalını çıkarın. Çıktı düz bir alan görüntüsüdür (Ek Şekil 1B).
        NOT: Her numune için bir referans görüntü alınması gerekmez. Aynı ayarlara sahip aynı enstrüman kullanıldığı sürece referans aynı olmalıdır. Ek Şekil 1C'de gösterildiği gibi, elde edilen görüntülerde gölgeleme artefaktları yoksa bu referansa gerek yoktur.
  2. Spektral konfokal mikroskopi
    1. Mikroskop sistemini açın (lazerler, dedektörler ve bilgisayar dahil). Uygun objektif lensi seçin (örn. 20x 0.8 NA veya başka bir objektif) ve gerekirse temizleyin.
    2. Numuneyi sahneye güvenli bir şekilde monte edin. Lamelin hedefe baktığından emin olun.
    3. Parlak alan veya DIC kullanarak örneğe odaklanın, ardından floresan moduna geçin. Spektral edinimi yapılandırın. Ek Tablo 3 , burada gösterilen spektral konfokal mikroskopi deneyleri için edinim ayarlarını bildirmektedir.
      1. Doğru lazerleri atayın.
        NOT: Bazı lazerler birden fazla floroforu uyarabilir. Bu nedenle, her florofor için benzersiz bir lazere sahip olmak gerekli olmayabilir.
      2. Kullanılan lazer çizgilerine uygun bir ışın ayırıcı seçin. Tüm dedektörlerin spektrumun mümkün olduğunca çoğunu yakalamasını sağlayın. Optimum optik kesit için iğne deliği boyutunu 1 AU'ya ayarlayın.
    4. Lazer ayarını optimize edin
      1. Tüm işaretleyicilerle boyanmış bir bölüm kullanarak, düşük güçte lazerlerle Sürekli tarama modunu başlatın. İşaretleyiciler iyi bir SBR'de tanımlanana kadar her lazerin yoğunluğunu ayarlayın.
        NOT: Bu, spektral olarak örtüşen floroforlar için hassas ayarlamaya izin vermeyecek olsa da, tek boyalı slaytların mikroskoba geçirilmesi gereken sayıyı en aza indirmeye yardımcı olacaktır.
      2. Her florofor için lazer yoğunluklarına ince ayar yapmak için tek lekeli bölümler kullanın. Her bir işaretleyicinin sinyali aşırı doygunluk olmadan görselleştirilene kadar tek lekeli bölümlerden tüm işaretleyicilerin bulunduğu bölüme yinelemeli olarak geçiş yapın.
        NOT: Bir lazer yoğunluğu veya kazanç ayarı her ayarlandığında, sinyalin optimum kalmasını sağlamak için önceden optimize edilmiş tek lekeli slaytları tekrar ziyaret edin. En uygun karıştırmayı gidermek için, sinyal yoğunluğu seviyeleri, işaretleyiciler arasında, özellikle de birlikte lokalize olan işaretleyiciler arasında mümkün olduğunca benzer olmalıdır. Mümkünse, deney örneğini görüntülemeden önce mikroskop ayarlarını optimize etmek için bir kopya örnek veya istenmeyen bir bölge kullanılması önerilir. Bu, özellikle DAPI (fotokonversiyon riskinden kaçınmak için) veya hızlı bir şekilde ışıkla ağartılan floroforlar (örneğin, PE) ile boyama yaparken önemlidir.
    5. 7.1.8 - 7.1.14 adımlarını gerçekleştirin.

8. Lamelin çıkarılması (odacıklı kapak camı için değil, yalnızca slaytlar için geçerlidir)

  1. Slaytı PBS'ye batırın ve lamel ayrılmasına izin verin. Lameli zorla çıkarmaya çalışmayın, çünkü bu dokuyu deforme edebilir, sonraki görüntüleme turlarında hizalama sorunlarına veya slayttan tamamen ayrılmaya neden olabilir. Slayta sığacak kadar büyük bir kap kullanın ve tamamen PBS'ye daldırılabildiğinden emin olun.

9. Florofor ağartma ve döngü

  1. Yalnızca odacıklı kapak camı için: Dokuya zarar vermemeye dikkat ederek bir pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla montaj ortamını aspire edin.
    NOT: Hazneyi yana yatırmak aspirasyonu kolaylaştırabilir.
  2. Montaj ortamı tamamen çıkana kadar ~1 mL (odacıklı kapak camı) veya ~100 μL (slaytlar) PBS ile 2 kez yıkayın.
  3. Çeker ocakta ağartma solüsyonunu hazırlayın. 10 mg LiBH4'ü bir mikro spatula kullanarak doğrudan kuru bir behere tartın. 10 mL ultra saf suyu doğrudan LiBH4 içeren behere dikkatlice ekleyin ve ağartma solüsyonunu yapmak için tamamen eriyene kadar karıştırın.
    NOT: Maksimum reaktivite için kullanmadan hemen önce hazırlayın.
    DİKKAT: LiBH4 son derece yanıcıdır, bu nedenle bu adım çok dikkatli olmayı gerektirir - çeker ocak doğru kullanıldığından emin olun (yani, uygun yükseklikte kanat, uygun KKD, vb.) ve bir seferde yalnızca <10 mg LiBH4 ile çalışın. LiBH4 eklemeden önce beherin tamamen kuru olduğundan emin olun - bunun yapılmaması yangına neden olabilir.
  4. Her doku kesitine bir cam Pasteur pipeti kullanarak ~100 μL ağartma solüsyonu ekleyin ve çeker ocakta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hazne slaytları için 2 mL ağartma solüsyonu kullanın.
  5. BV boyaları ağartılıyorsa (örneğin, BV421, BV510, vb.), kuyuyu dikkatlice bir epifloresan mikroskoba taşıyın. DAPI filtresini seçin, numuneyi odaklayın ve tam güçte aydınlatın.
    1. Daha geniş bir aydınlatma alanı için 5x objektifi kullanın. Hedeflere ve muhafazaya zarar vermemek için sahneyi mümkün olduğunca alçaltın.
  6. LiBH4 çözeltisini bir cam Pasteur pipet kullanarak kuyudan boşaltın ve tekrar LiBH4 çözeltisinin kabına ekleyin.
    NOT: Bu artık atık LiBH4'tür; Çözelti ileride kullanılmak üzere saklanamaz.
  7. Slaytları 3x Seyreltme Tamponu ile yıkayın ve ~3 dakika inkübe edin. Hazne slaytları için toplam hacim 2 mL'dir.
  8. Antikor karışımı ekleyin ve normal protokole göre boyayın (Adım 6.3 - 6.8).
  9. Çeker ocaktaki atık LiBH4'e damla damla 2N H2SO4 ekleyin, düzenli olarak karıştırın.
    DİKKAT: LiBH4 agresif bir şekilde kabaracaktır. Bu kabarcıklar, LiBH4'ten salınan H2 gazıdır; H2 çok yanıcıdır, bu nedenle bu adımda çok dikkatli olun ve H2SO4 'ü çok yavaş ekleyin.
  10. Çözelti artık köpürmediğinde emici bir alt ped içine dökün. Beheri ultra saf suyla durulayın ve emici alt pede dökün.
    DİKKAT: Emici altlığı bir kimyasal/biyolojik tehlike torbasına koyun, sabitleyin ve yerel kimyasal tehlike yönergelerine göre atın.

10. Görüntü alım sonrası işleme

  1. Referans görüntüyü (7.1.14. adımdan itibaren) Zen yazılımında Dosya > Aç > Referans görüntüyü seç'e tıklayarak açın.
    NOT: Alım sonrası görüntü işleme adımları alternatif olarak açık kaynaklı yazılım paketlerinde gerçekleştirilebilir. (örneğin, ImageJ).
  2. Dinamik aralığı en iyi duruma getirmek için Yoğunluk > İşleniyor'> Kontrast Uzatma > Otomatik > Uygula'yı tıklatarak parlaklığı ve kontrastı ayarlayın.
  3. Görüntü İşleniyor> > Piksel Türünü 32 - bit (Float) > Dönüştür'ü tıklayarak piksel türünü 32 bit olarak değiştirin.
  4. Uygula > Uygula > Yoğunluk > Normalleştir (Doygun Piksel = %0) öğesine tıklayarak referans görüntüyü normalleştirin.
  5. İşleme > Gauss Düzgünleştir'> tıklayarak referans görüntüyü düzgünleştirin > yarıçapı girin (örneğin, 2-5 piksel) > Uygula (Ek Şekil 1B).
    NOT: Farklı değerler deneyerek Gauss bulanıklık yarıçapını optimize edin. Doğru değeri bilmek için, ham referans görüntüyü işlenen görüntüye bölün (İşlem > Görüntü hesaplayıcı) ve ortaya çıkan görüntü tek tip yoğunluğa sahip olmalıdır (tüm pikseller yaklaşık olarak aynı değerde).
  6. Dosya'ya tıklayarak düzeltilecek çok döşemeli görüntüyü açın > Aç > çok döşemeli görüntüyü seçin.
  7. Aşağıdaki parametrelerle İşleniyor > Birleştirme'yi tıklatarak işlenen referansı kullanarak birleştirme ve gölgelendirme düzeltmesi uygulayın.
    1. Karışım kutusunu işaretleyin. Doğru gölgeleme kutusunu işaretleyin ve açılır menüden işlenmiş referans görüntüyü seçin (adım 10.5). Diğer tüm parametreleri aynı tutun.
      NOT: En iyi sonuçları elde etmek için parametrelerin ayarlanması gerekebilir.
    2. Giriş/Çıkış menüsünde, giriş olarak çok döşemeli görüntüyü ve referans olarak gölgelendirme referansını seçin.
    3. Üstteki Uygula düğmesine basın, dikiş ve gölgeleme düzeltilmiş yeni bir görüntü oluşturulacaktır (Ek Şekil 1D).
      NOT: Dikiş düzeltmesi (Ek Şekil 1I-J), işlemin ilerleyen aşamalarında görüntü hizalamasının doğruluğunu sağlamak için gereklidir.
    4. Dosya'ya tıklayarak düzeltilen görüntüyü kaydedin > Kaydet > Klasör Seç'i seçin.

11. Görüntü hizalama

  1. Imaris File Converter aracını kullanarak işlenen görüntüleri hangi formatta olursa olsun (.czs, .tif vb.) Imaris formatına dönüştürün.
    NOT: Araç, bu web sitesindeki (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter) talimatlar izlenerek indirilebilir ve kurulabilir.
  2. Tüm turlardaki görüntüleri tüm kanallarla tek bir görüntüye kaydetmek (hizalamak) için Imaris uzantıları kayıt aracını başlatın.
    NOT: Aracı yüklemek ve görüntüleri başarıyla hizalamak için aşağıdaki web sitesindeki talimatları izleyin (https://github.com/niaid/imaris_extensions).
  3. Imaris Uzantıları düğmesini tıklayın. SimpleITK Utilities'i seçin > Kanal ayarlarını CSV'ye aktarın.
  4. Gözat'ı tıklatın, bir .ims görüntüsüne gidin (turlardan birinden), görüntüyü seçin ve Aç'ı tıklatın.
  5. Dışa Aktar'a tıklayın ve CSV dosyasını kaydetmek için bir konum seçin. Bir ad girin ve Kaydet'e tıklayın.
  6. Kaydedilen CSV dosyasını açın ve kanal adlarının doğru olduğunu doğrulayın. Gerekirse düzenleyin.
  7. Düzenlemeler yapılırsa, Kanal Ayarlarını Toplu Yapılandırma > SimpleITK Utilities > Imaris Extensions'a gidin.
    NOT: Önceki adımda herhangi bir düzenleme yapılmadıysa bu adım gerekli değildir.
  8. Gözat'a tıklayın, CSV dosyasına gidin, dosyayı seçin ve Aç'a tıklayın. İleri'ye tıklayın, ardından aynı .ims görüntüsünü seçmek için tekrar Gözat'a tıklayın ve Aç'a tıklayın.
  9. Değişiklikleri uygulamak için Yapılandır'a tıklayın. Farklı turlardan tüm görüntüler için Adım 11.3-11.8'i tekrarlayın.
  10. Kanallar doğru bir şekilde adlandırıldıktan sonra, Ortak Bir Kanal Kullanarak Z-Yığınlarının Afin Kaydı > SimpleITK Algoritmaları > Imaris Uzantıları'na gidin.
  11. Gözat'ı tıklatın, tüm turları içeren klasöre gidin, tüm görüntüleri seçin ve Aç'ı tıklatın.
  12. İleri'ye tıklayın, kayıt kanalını (referans kanalı) seçin. Bu protokol için DAPI kanalı kullanıldı. Ardından sabit görüntüyü seçin.
    NOT: Turlar boyunca sabit kalan ve kimyasal veya ışıkla ağartmaya (örneğin, DAPI gibi nükleer boyalar) dayanıklı bir kanal/işaretleyici seçin. Ardından sabit görüntüyü seçin.
  13. Gelişmiş Kayıt Ayarları'na tıklayın, Otomatik Maske dışındaki tüm kutuları işaretleyin ve Gauss yumuşatma sigmasını 5.0 olarak ayarlayın.
  14. Hizalamayı gerçekleştirmek için Bitti'yi ve ardından Kaydet'i tıklatın. Kayıt tamamlandıktan sonra, Yeniden Örnekle ve Birleştirilmiş Görüntüyü Kaydet'e tıklayın.
  15. Yeniden örneklemeden sonra, referans kanalını seçin ve Korelasyonu Hesapla'yı tıklatın. Çıktı dosyaları, hizalanmış bir output.ims görüntüsü, kayıttan önce ve sonra hizalama kalitesini gösteren iki PDF, kayıt için kullanılan ayarları içeren bir JSON dosyası ve tüm sürecin günlüğünü içeren bir TXT dosyası içerir.

12. Görüntü hizalama

  1. CellPose (v2.5)25 kullanarak hücreleri/nesneleri segmentlere ayırın
  2. Her tek lekeli veri kümesi için, işaretleyicinin kendi algılama kanalından bir segmentasyon maskesi oluşturun (Örnek: CD20 tek lekesi için, maskeyi AF488 algılama kanalından (CD20 için amaçlanan kanal) oluşturun).
  3. 2. adımdaki segmentasyon maskesini aynı veri kümesindeki her kanala uygulayın (CD20 örneğinde, AF488'den türetilen maske, gerçek sinyali ölçmek için AF488'e ve taşmayı ölçmek için diğer tüm algılama kanallarına uygulanır).
  4. scikit-image (regionprops_table) ve NumPy kullanarak Python'da nesne başına yoğunlukları ve alanları ayıklayın.
  5. Sinyal-arka plan oranı (SBR)
    1. İşaretçinin amaçlanan algılama kanalındaki tüm segmentlere ayrılmış yatırım getirilerinde ortalama nesne yoğunluğunu hesaplayın.
    2. Arka plan yoğunluğunu, sıfır değerli dolgu veya sınır dışı pikseller hariç olmak üzere, aynı görüş alanındaki ROI'lerin dışındaki tüm piksellerin ortalama yoğunluğu olarak tanımlayın.
      SBR'yi şu şekilde hesaplayın:
      figure-protocol-1
    3. SBR dağılımlarını keman grafikleriyle görselleştirin, nesne başına değerleri nokta olarak (veya belirtildiği yerde alan başına değerler) gösterin.
  6. Kanama ölçümü
    1. İstenmeyen her kanal için, adım 12.2'deki maskeden aynı ROI'leri kullanarak taşma payı (%) hesaplayın:
      figure-protocol-2
    2. NOT: diyagonal girişler %100'e eşittir, çünkü tek lekeli bir görüntünün amaçlanan kanalında pay ve payda aynıdır (kendi kanalında ölçülen gerçek işaret sinyali).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmünofloresan görüntüleme tekniklerinin karşılaştığı iki temel zorluk, florofor-konjuge antikor problarının spesifik olmayan bağlanması ve doku otofloresansıdır. Bu protokol, çoğullanmış immünofloresan tekniklerini optimize etmek için gerçek bir sinyali arka plandan ayırt etmeye yardımcı olmak için tasarlanmıştır.

Heparin blokajı, sinyali korurken spesifik olmayan florofor bağlanmasını ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IBEX protokolünün bir uyarlaması olan spektral IBEX, immünofloresan görüntülemedeki iki temel sorunu başarıyla ele alır: spesifik olmayan bağlanma ve otofloresan. Yüksek derecede eozinofilik dokuların heparin ile tedavi edilmesi ve otofloresan ve kanallar arasındaki spektral örtüşmeyi ortadan kaldırmak için spektral karıştırmanın kullanılması, arka planın üzerinde gerçek sinyalin saptanmasını önemli ölçüde artırdı. Tüm işaretleyicileri tek bir geçişte yakalamak, edinme süresini azaltır v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JFEK, MJ, ALK Abello A/S'den fon alıyor. JFEK, Merida Biosciences'tan danışmanlık ücreti alıyor.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Andrea Radtke ve Ziv Yaniv'e IBEX'i işe alırken ve yinelerken verdikleri destek için. Dr. João Bronze de Firmino ve Mouhanad Babi'ye mikroskopi desteği ve sorun giderme için ve McMaster'daki Gelişmiş Işık Mikroskobu Merkezi'ne mikroskoplarına erişim için teşekkür ederiz. Teknik destek için Tina Walker, Jianping Wen ve Rangana Talpe Guruge'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma, CIHR Enfeksiyon ve Bağışıklık Enstitüsü (CIHR-III), CIHR Dolaşım ve Solunum Sağlığı Enstitüsü (CIHR-ICRH) ve Kanada Alerji, Astım ve İmmünoloji Vakfı (CAAIF) tarafından ortaklaşa finanse edilen hakemli bir Gıda Alerjisi Araştırma Bursu tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (PJT-198169; JFEK), J.P. Bickell Vakfı Tıbbi Araştırma Bursu (JFEK), Kanada Alerji Astım ve İmmünoloji Vakfı (JFEK, MJ), Kanada Alerji ve Klinik İmmünoloji Derneği (VO, MJ), Schroeder Vakfı (JFEK, SW, MJ), Kanada Gıda Alerjisi (JFEK, SW, MJ), ALK Abello A/S (JFEK, MJ), Zych Ailesi (SW, MJ), Buckrell Ailesi (JFEK), Ontario Yüksek Lisans Bursu (SD) ve McMaster Üniversitesi'nde (VO) Sağlık Bilimleri Lisans Programı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2N sülfürik asit (H2SO4) çözeltisiYokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
500 mL beğenYokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
6-kuyu plakasıYokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
BCL-6 - Alexa Fluor 647BD Biosciences561525Sulandırma faktörü 1:100
BD Cytofix/Cytoperm Fiksasyon/Permeabilizasyon KitiBD Biosciences554722
Tezgah üstü diseksiyon mikroskobuYokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
Sığır Serum Albümini (BSA)SIGMA-ALDRICHA4503
CD11c - Alexa Fluor 700BD Biosciences561352Sulandırma faktörü 1:100
CD138/Syndecan-1 - PEBioLegend356503Sulandırma faktörü 1:200
CD20 - Alexa Fluor 488Invitrogen53020282Sulandırma faktörü 1:100
CD21 - Alexa Fluor 532NovusBioNBP2-60733AF532Sulandırma faktörü 1:100
CD23 - PEBioLegend338507Sulandırma faktörü 1:200
CD3 - iFluor 594AAT Bioquest100320C0Sulandırma faktörü 1:100
CD31 - Alexa Fluor 700BioLegend303134Sulandırma faktörü 1:100
CD34 - iFluor 594AAT Bioquest103400C0Sulandırma faktörü 1:100
CD38 - Alexa Fluor 700BioLegend303523Sulandırma faktörü 1:100
CD4 - Alexa Fluor 647BioLegend300520Sulandırma faktörü 1:100
CD45 - Alexa Fluor 532ThermoFisher Scientific58045942Sulandırma faktörü 1:100
CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647BioLegend353113Sulandırma faktörü 1:100
Krom Alum-Jelatin YapıştırıcıYeni Gelen Tedarik1033A
KriyomodFisher Scientific NC9511236Ayrıca, daha büyük örnekler için Katalog No.50-465-347
DAPI kalibrasyon slaytıAgar ScientificAG2273
DAPI çözeltisi, 1 mg/mLThermoFisher Scientific62248Sulandırma faktörü 1:3000
E-cadherin/CD324 - Alexa Fluor 647BioLegend147307Sulandırma faktörü 1:100
EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594BioLegend324228Sulandırma faktörü 1:100
Eppendorf/falcon tüpleriYokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
ForsepsYokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
FoxP3 - eFluor 660ThermoFisher Scientific50577382Sulandırma faktörü 1:100
Buzlu uçlu mikroskop slaytlarıKimya BilimiGEW45-2575-W
GL7 - Alexa Fluor 488ThermoFisher Scientific53590282Sulandırma faktörü 1:100
Heparin sodyum tuzuSIGMA-ALDRICHH339310KU
HLA-DR - PENovusBioNB100-77855PESulandırma faktörü 1:200
İnsan TruStain FcX (Fc Reseptör Bloke Edici Çözeltisi)BioLegend422302Sulandırma faktörü 1:100
Nem odasıYokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
Kapaklı buz kovasıYokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
IgD - Alexa Fluor 488BioLegend348215Sulandırma faktörü 1:100
IL4Ra/CD124 - PEBioLegend144803Sulandırma faktörü 1:200
Imaris Dosya DönüştürücüOXFORD enstrümanlarıYokHerhangi bir resim dosya formatını .ims formatına kapsa (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)
İzopentan (2-Metilbütan)YokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
Ki-67 - Alexa Fluor 488BD Biosciences558616Sulandırma faktörü 1:100
Kimberly-Clark Profesyonel Kimtech Science Kimwipe Hassas Görev Silecekleri, 1 KatlıKimtech Bilimi06-666
Büyük (yani 25 cm uzunluğunda) penslerYokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
Sıvı AzotYokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
Lityum borohidrit (LiBH4)SIGMA-ALDRICH222356
MECA-79 - Alexa Fluor 488Invitrogen53603680Sulandırma faktörü 1:100
Mikroskop Slayt Kapağı Cam No.1 22x50 mmFisher Scientific 12-542A
Milli-Q suYokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
MUC2 - Alexa Fluor 488NovusBioNB120-11197AF488Sulandırma faktörü 1:100
Nunc Lab-Tek Odalı Kapak CamThermoFisher Scientific155380
PAP kalemiabcamAB2601
Fosfat tamponlu tuzlu (PBS) çözeltisiYokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
SkalpelYokYokLaboratuvarda mevcut olan/kullanılan her şey
SimpleITK Imaris UzantılarıYokYokFarklı turlardan görüntüleri hizalamak için kullanılan yazılım (https://github.com/niaid/imaris_extensions)
SucroseSIGMA-ALDRICHS0389
Tissue-Tek O.C.T. BileşimiSakura Finetek USA4583
Triton X-100SIGMA-ALDRICHX100
Zeiss LSM 980ZEISS MikroskopisiYokBu çalışmada kullanılan görüntüleme sistemi
Zen BlueZEISS MikroskopisiYokAlım sonrası görüntü işleme için kullanılan yazılım

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagios, C., Lochter, A., Bissell, M. J. Tissue architecture: The ultimate regulator of epithelial function. Philosoph Trans Royal Soc B: Biol Sci. 353 (1370), (1998).
  2. Mincarelli, L., Lister, A., Lipscombe, J., Macaulay, I. C. Defining Cell Identity with Single-Cell Omics. Proteomics. 18 (18), (2018).
  3. Macaulay, I. C., Voet, T. Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives. PLoS Genet. 10 (1), (2014).
  4. de Vries, N. L., Mahfouz, A., Koning, F., de Miranda, N. F. C. C. Unraveling the Complexity of the Cancer Microenvironment With Multidimensional Genomic and Cytometric Technologies. Front Oncol. , 10(2020).
  5. van Dam, S., Baars, M. J. D., Vercoulen, Y. Multiplex Tissue Imaging: Spatial Revelations in the Tumor Microenvironment. Cancers. 14 (13), (2022).
  6. Bressan, D., Battistoni, G., Hannon, G. J. The dawn of spatial omics. Science. 381 (6657), (2023).
  7. Williams, C. G., Lee, H. J., Asatsuma, T., Vento-Tormo, R., Haque, A. An introduction to spatial transcriptomics for biomedical research. Gen Med. 14 (1), (2022).
  8. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), (2016).
  9. Pascal, L. E., et al. Correlation of mRNA and protein levels: Cell type-specific gene expression of cluster designation antigens in the prostate. BMC Genom. 9, (2008).
  10. Patel, S. S., Rodig, S. J. Overview of Tissue Imaging Methods. Methods Mol Biol. 2055, (2020).
  11. Ohno, M., Karagiannis, P., Taniguchi, Y. Protein expression analyses at the single cell level. Molecules. 19 (9), (2014).
  12. Zimmermann, T., Marrison, J., Hogg, K., O’Toole, P. Clearing up the signal: Spectral imaging and linear unmixing in fluorescence microscopy. Methods Mol Biol. , 1075(2014).
  13. Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), (2022).
  14. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Aca Sci U S A. 117 (52), (2020).
  15. Kothurkar, A. A., et al. ’Iterative Bleaching Extends Multiplexity’ facilitates simultaneous identification of all major retinal cell types. J Cell Sci. 137 (23), (2024).
  16. Cohn, D. E., et al. Delineating spatial cell-cell interactions in the solid tumour microenvironment through the lens of highly multiplexed imaging. Front Immunol. 14, (2023).
  17. Radtke, A. J., et al. IBEX: An open and extensible method for high content multiplex imaging of diverse tissues. arXiv. , (2021).
  18. Radtke, A. J., et al. The IBEX Knowledge-Base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).
  19. Croce, A. C. Light and Autofluorescence, Multitasking Features in Living Organisms. Photochem. 1 (2), (2021).
  20. Wizenty, J., et al. Autofluorescence: A potential pitfall in immunofluorescence-based inflammation grading. J Immunol Methods. 456, (2018).
  21. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Curr Protoc Cell Biol. 69 (1), 4.3.1-4.3.7 (2015).
  22. Sicherre, E., Favier, A. L., Riccobono, D., Nikovics, K. Non-specific binding, a limitation of the immunofluorescence method to study macrophages in situ. Genes. 12 (5), (2021).
  23. Monique Hartlen Histotechnology Lab Manual. , NSCC. (2022).
  24. Stephen Peters Frozen Section Technique. , Pathology Innovations, LLC. https://pathology-innovations.squarespace.com/frozen-section-technique (2023).
  25. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nat Methods. 18 (1), (2021).
  26. Mayeno, A. N., Hamann, K. J., Gleich, G. J. Granule-associated flavin adenine dinucleotide (FAD) is responsible for eosinophil autofluorescence. J Leukocyte Biol. 51 (2), (1992).
  27. Jenvey, C. J., Stabel, J. R. Autofluorescence and Nonspecific Immunofluorescent Labeling in Frozen Bovine Intestinal Tissue Sections: Solutions for Multicolor Immunofluorescence Experiments. J Histochem Cytochem. 65 (9), (2017).
  28. Vlaminck, S., et al. The importance of local eosinophilia in the surgical outcome of chronic rhinosinusitis: A 3-year prospective observational study. Am J Rhinol Allergy. 28 (3), (2014).
  29. Skinner, B. M., Johnson, E. E. P. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), (2017).
  30. Duhamel, R. C., Johnson, D. A. Use of nonfat dry milk to block nonspecific nuclear and membrane staining by avidin conjugates. J Histochem Cytochem. 33 (7), (1985).
  31. Valnes, K., Brandtzaeg, P. Selective inhibition of nonspecific eosinophil staining or identification of eosinophilic granulocytes by paired counterstaining in immunofluorescence studies. J Histochem Cytochem. 29 (5), (1981).
  32. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47 (9), (1999).
  33. Bystrom, J., Amin, K., Bishop-Bailey, D. Analysing the eosinophil cationic protein - a clue to the function of the eosinophil granulocyte. Respiratory Res. , 12(2011).
  34. Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cyt Part A. 89 (6), (2016).
  35. Saitou, T., et al. Tissue intrinsic fluorescence spectra-based digital pathology of liver fibrosis by marker-controlled segmentation. Front Med. 5 (DEC), (2018).
  36. Acuña-Rodriguez, J. P., Mena-Vega, J. P., Argüello-Miranda, O. Live-cell fluorescence spectral imaging as a data science challenge. Biophys Rev. 14 (2), (2022).
  37. Constantinou, P., Dacosta, R. S., Wilson, B. C. Extending immunofluorescence detection limits in whole paraffin-embedded formalin fixed tissues using hyperspectral confocal fluorescence imaging. J Microscopy. 234 (2), (2009).
  38. Enninful, A., Baysoy, A., Fan, R. Unmixing for ultra-high-plex fluorescence imaging. Nat Comm. 13 (1), (2022).
  39. Chang, Q., et al. Imaging Mass Cytometry. Cyt Part A. 91 (2), (2017).
  40. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nat Med. 20 (4), (2014).
  41. Baharlou, H., Canete, N. P., Cunningham, A. L., Harman, A. N., Patrick, E. Mass Cytometry Imaging for the Study of Human Diseases—Applications and Data Analysis Strategies. Front Immunol. 10, (2019).
  42. Goltsev, Y., Nolan, G. CODEX multiplexed tissue imaging. Nat Rev Immunol. 23 (10), 613-613 (2023).
  43. Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nat Protoc. 16 (8), (2021).
  44. Vorobjev, I. A., Kussanova, A., Barteneva, N. S. Development of Spectral Imaging Cytometry. Methods Mol Biol. 2635, (2023).
  45. Hernandez, S., et al. Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification for Immune Cell Profiling of Paraffin-Embedded Tumor Tissues. Front Mol Biosci. 8, (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

teratif A artmaSpektral Ayr t rmaHeparin BloklamaDoku OtofloresansMultiple mm n aretlemeSinyal Arka Plan Orannsan Nazal PolibiUzamsal Proteomik

İlgili makaleler