Yöntem makalesi

Akciğer Kanserinin Sinjeneik Ortotopik Fare Modelini Oluşturmak için Minimal İnvaziv Bir Yöntem

DOI:

10.3791/68676

⸱

19 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa Health Care, 2Department of Neuroscience and Pharmacology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Department of Radiation Oncology, Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 4Free Radical Radiation Biology Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Geminii, Inc., 6Interdisciplinary Graduate Program in Molecular Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa Health Care

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer kanseri için yeni tedaviler geliştirmenin en büyük zorluğu, bölgesel hastalık metastatik hastalığa ilerlerken tümör mikro çevresinin modellenmesini içerir. Burada, zaman içinde hastalığın in vivo olarak izlenmesine izin veren ortotopik bir sinjeneik akciğer kanseri modeli oluşturmanın basit bir yöntemini açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), dünya çapında hem kadınlar hem de erkekler için kansere bağlı ölümlerin bir numaralı nedeni olmaya devam etmektedir. Daha etkili tedavi yöntemleri geliştirmek için kanser hücreleri, bağışıklık sistemi, her tümör içindeki mikro çevre ve konak doku arasındaki etkileşimleri anlamak için daha fazla bilgi toplanması gerekmektedir. Burada bildirilen, fare akciğerinde kanseri indüklemek için basit, tekrarlanabilir bir yöntemdir ve erken evreden geç evre hastalığa kadar tümör büyümesinin izlenmesine izin verir. Cerrahi prosedür, deride küçük bir yüzeysel kesi ve kanser hücrelerinin interkostal kaslar yoluyla akciğere enjeksiyonunu içerir. İn vivo görüntüleme sistemleri (IVIS), lusiferazı eksprese etmek için tasarlanmış hücrelerle kombinasyon halinde, bir çalışma boyunca tümör büyümesini ve hastalığın ilerlemesini değerlendirmek için uygun bir yol sağlar. Bu teknik, çeşitli akciğer kanseri modelleri arasında kolayca aktarılabilir ve doğal tümör mikro çevresini taklit eden klinik öncesi bir akciğer kanseri modelinde yeni terapötiklerin fizibilitesini ve etkinliğini test etmek için kullanılabilir. Bu, deneysel terapötiklerle birlikte cerrahi rezeksiyon, radyasyon ve immünoterapiler dahil olmak üzere standart bakım tedavilerini kullanan hem etkinlik hem de güvenlik / toksisite çalışmalarının alaka düzeyini genişletir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer kanseri, küresel olarak erkekler ve kadınlar arasında en çok teşhis edilen kanserlerden biri ve kansere bağlı ölümlerin bir numaralı nedeni olmaya devam etmektedir 1,2,3. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), Amerika Birleşik Devletleri'ndeki tüm akciğer kanseri vakalarının yaklaşık %90'ını oluşturmaktadır ve tedavi ortamı son birkaç yılda büyük ölçüde iyileşmiş olsa da, sonuçları iyileştiren yeni tedavilerin geliştirilmesine büyük ilgi olmaya devam etmektedir4. Spesifik sürücü mutasyonlar için hedefe yönelik tedaviler ve duyarlı NSCLC alt tipleri için immünoterapiler geliştirmede birçok ilerleme kaydedilmiş olsa da, genel beş yıllık sağkalım oranı düşük olmaya devam etmekte olup, akciğer kanserinin tüm evreleri için yaklaşık %20'dir 2,5,6,7. Ayrıca, immünoterapi ilerlemiş hastalıkta sağkalımı iyileştirmede büyük adımlar atmış olsa da, bu gelişmeler iğneyi yalnızca beş yıllık genel sağkalımı %6,8'den %10,7'ye taşımış ve sağkalım süresini 7 aydan 8 aya çıkarmıştır8. Hastalığın etki mekanizmalarını anlamak ve mevcut standart bakım tedavileri ile sinerji oluşturan yeni tedaviler geliştirmek için hala büyük bir ihtiyaç vardır. NSCLC'nin doğal ilerlemesinin rol oynadığı mekanizmaları ve yeni tedavilere verilen yanıtı anlamak, güvenilir bir şekilde tekrarlanabilir, indüklenmesi kolay ve kanserin geliştiği tümör mikro ortamını kapsülleyen preklinik modeller gerektirir.

Son birkaç on yılda, kemirgenlerde akciğer kanserinin ortotopik modellerini değerlendirmek için birçok farklı prosedür geliştirilmiştir. Prosedürler, göğüs boşluğunu açan intrapulmoner implantasyon veya nakil prosedürleri gibi yüksek düzeyde uzmanlık gerektiren çok invazivarasında değişir 9,10,11,12,13; intratrakeal ve orotrakeal prosedürler gibi orta derecede invaziv 14,15,16,17; perkütan enjeksiyonlar, kuyruk damarı veya intranazal indüksiyon gibi minimal invaziv prosedürlere 18,19,20,21. Tüm prosedürler farklı riskler ve faydalar sunar - daha fazla hassasiyet sağlayan ancak potansiyel olarak daha yüksek yıpranma oranlarına izin veren daha invaziv teknikler ve daha iyi sağkalıma izin veren ancak tümör implantasyon bölgelerinin daha fazla değişkenliğine izin veren daha az invaziv teknikler. Bu çeşitli protokollerden bazıları, tümör büyümesini in vivo olarak izlememeyi ve yalnızca ex vivotümörlerin değerlendirmelerini tamamlamayı tercih eder 9,11,12,16. Zaman içinde tümör büyümesini izleyen protokollerden, daha önceki protokoller bilgisayarlı tomografi (BT)14,19, pozisyon emisyon tomografisi (PET)18 ve manyetik rezonans görüntüleme (MRI)17 gibi sistemlere daha fazla dayanırken, daha sonraki protokoller, biyolüminesans görüntüleme (BLI) sistemleri ve genetik olarak değiştirilmiş hücreler daha kolay erişilebilir hale geldikten sonra, BLI20 ile zaman içinde tümör büyümesini izlemeyi tercih eder, 21.

Bu protokolün geliştirilmesinin amacı, bu diğer prosedürlerden öğrenilenleri almak ve tümörün akciğerle sınırlı olduğu erken hastalıktan başlayarak NSCLC'nin ilerlemesini incelemek için tek bir akciğer tümörünü indüklemek için basit ama güvenilir bir yöntem oluşturmaktı. Bu makalenin genel amacı, in vivo görüntüleme kullanılarak izlenebilen ve araştırmacıların hastalığın ortaya çıktığı organdaki akciğer kanserini incelemelerini sağlayabilecek güvenilir ve minimal invaziv bir sinjeneik ortotopik akciğer kanseri modeli oluşturma yöntemlerini tanımlamaktır. Bu yöntem, hem insan akciğer kanseri hücre hatlarını kullanan ksenogreft ortotopik fare modellerini hem de sağlam bağışıklık sistemine sahip farelerde fare akciğer kanseri hücre hatlarını kullanan sinjeneik ortotopik fare modellerini oluşturmak için etkilidir ve hem insan kanser türlerini hem de bağışıklık sistemi ile NSCLC'nin karmaşık etkileşimini incelemek için yönteme çok yönlülük kazandırır.

Bu model, araştırmacıların kemoterapi, radyasyon tedavisi, immünoterapi ve diğer hedefe yönelik tedaviler gibi güncel tedaviler olsun ya da olmasın, bağışıklık sistemi yanıtını daha iyi anlamalarını sağladığından, bağışıklığı yetkin NSCLC fare modeli olan Lewis Akciğer Karsinomu'nda (LLC) bu protokolü optimize etmeye odaklandık 22,23,24,25 . Protokol, tümör genellikle akciğer parankimini aşacağı ve diğer dokuları tohumlayacağı için, aşılamada erken evre hastalığı (akciğer parankimindeki tümör) ve çalışmaların sonuna doğru metastazı temsil eden bir model oluşturur.

Ortotopik modelleri incelemenin önemli bir yönü, tümör büyümesini tekrar tekrar, hayvana minimum stresle ve hızlı bir şekilde izleme yeteneğidir, böylece bir çalışmadaki her hayvan tek bir zaman noktasında değerlendirilebilir. MRI veya BT gibi görüntüleme teknikleri tümörün daha iyi çözünürleşmesine izin verirken, bu görüntüleme yöntemleri pahalıdır, zaman alıcıdır ve fareler gibi küçük hayvan modellerinde erken tümör büyümesini izlemede zorluk çeker 26,27,28,29,30,31. Bu nedenle, lusiferaz ile tasarlanmış kanser hücrelerini kullanarak biyolüminesans yoluyla tümör büyümesini izlemeyi tercih ettik. Bu protokolde, ateşböceği lusiferaz (LLC-luc) ile tasarlanmış 25.000-50.000 LLC hücresi enjekte ettik ve ertesi gün BLI ile tümörleri tespit ettik. Lusiferin-lusiferaz reaksiyonu, spektral görüntüleme cihazları kullanarak in vivo tümör büyümesini izlemek için yararlı bir araçtır. Bu görüntüleme sistemlerinin ışık fotonlarını izleme konusundaki hassasiyeti nedeniyle, lusiferaz eksprese eden kanser hücreleri, in vivo erken, genellikle tümörler bir fare modelinde MRI veya BT ile tespit edilmeden önce ve sıklıkla 26,32,33,34.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilir ve onaylanır. C57BL6 / N fareleri (4-6 haftalık) ameliyatlardan en az 1 hafta önce satın alınır ve alıştırılır. Tüm hayvanlar 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsündedir. Hayvanlar kafes başına 4 adet barındırılır ve anestezi zamanına kadar yiyecek ve suya tam erişime sahiptir.

1. Enjeksiyon için hücrelerin seçimi ve büyümesi

  1. 35'te açıklandığı gibi bir hücre hattı seçmek için bir lusiferaz testi yapın.
    1. 37 ° C'de yüksek nem ile% 5 CO2 inkübatörinde% 10 fetal sığır serumu (FBS), L-glutamin ve penisilin / streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'unda (DMEM) LLC-luc hücrelerini büyütün. Hücreler% 50 -% 100 birleştiğinde testi gerçekleştirin.
    2. Testi gerçekleştirmeden önce, hücreleri 1x PBS ile yıkayın.
    3. 6 oyuklu bir plakaya 200 μL lizis tamponu/kuyusu (25 mM Tris/fosfat, 4 mM EGTA, %1 Triton X-100, %10 gliserol) ekleyin. Hücreleri kuyudan kazıyın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 16.000 × g'da döndürün. Tüpün dibinde kompakt bir hücre peletinin oluştuğunu onaylayın ve süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın.
    4. Hücre ekstraktının yarısını yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve protein miktar tayini için tasarruf edin. Kalan yarısına 2 mM ditiyotreitol ekleyin ve iyice karıştırın.
    5. 2 mM ditiyotreitol içeren 8 μL hücre ekstraktını 42 μL tahlil tamponu (25 mM Tris/fosfat, 20 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 2 mM ATP, 1 mM ditiyotreitol) ile birleştirin. 50 μL 0.5-1 mM lusiferin ekleyin.
    6. Bağıl ışık birimleri (RLU) olarak rapor edilen tepe lüminesansını ölçün ve lüminesansı mg protein (RLU/mg) başına RLU olarak bildirmek için tercih edilen bir protein kantitasyon yöntemiyle protein içeriğini değerlendirin.
  2. 8.000-15.000 RLU/mg arasında lüminesansı olan bir hücre hattı seçin.
    NOT: BLI cihazını doyurabileceğinden daha yüksek bir lusiferaz ifadesi (>15.000 RLU / mg) seçmekten kaçının.

2. Hücre hazırlığı

  1. Kullanmadan önce en az 1 hafta boyunca yüksek nem ile 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörinde% 10 FBS, L-glutamin ve penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM'de LLC-luc hücrelerini büyütün.
    NOT: Birleşmeyi %70-80 ile sınırlamak için büyümeyi izleyin ve daha önce açıklandığı gibi enjeksiyonlar için istenen miktara ulaşmak için gerektiği gibi %0.25 tripsin-EDTA kullanarak bölün36.

3. Ameliyat öncesi hazırlık

  1. Kürklü fareler için ameliyattan 1 gün önce tıraş olun.
  2. İzofluran kullanarak anestezi yapmak için fareyi bir indüksiyon odasına yerleştirin. Oksijen akış hızını 2.0 L/dk'ya ve buharlaştırıcıyı %2 izoflurana ayarlayın; Bunu, indüklenen farenin boyutuna göre ayarlayın.
  3. Farelerin solunumunu izleyin ve uygun anesteziyi doğrulamak için bir pedal çekme refleksi kullanın.
  4. Fareyi, IACUC onaylı bir ısıtma cihazı üzerinde yüzüstü konumda bir burun konisine yerleştirin. Devam etmeden önce pedal çekme refleksi kullanılarak farenin uygun şekilde uyuşturulduğundan emin olmak için kontrol edin.
  5. Her iki göze de oftalmik merhem sürün.
  6. Fare uygun şekilde uyuşturulduğunda, farenin sol sırt kısmındaki geniş dikdörtgen alanı (2 cm x 3 cm) çıkarmak için elektrikli makas kullanın. Omurgayı mediale, masayı yanal olarak kürk görünmeyene kadar, son kaburga (13.) daha aşağıda ve kürek kemiğinin üst kenarını başa doğru tıraş edin.
  7. Fareyi IACUC onaylı bir ısıtma cihazı üzerindeki boş bir kafese yerleştirin ve fare uyanık ve uyanık olana kadar farenin nefes alışını gözlemleyin. Bu sırada, ameliyata kadar fareyi ev kafesine geri koyun.

4. Enjeksiyon için hücre süspansiyonunun hazırlanması

  1. Hücre toplama gününde (adım 2.2), ölü ve ayrılmış hücreleri çıkarmak için toplamadan 3-4 saat önce 50 mg / mL gentamisin içeren taze ortam ekleyin.
  2. Ortamı aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile yıkayın. Tripsin-EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 1-2 dakika inkübe edin.
  3. Hücreleri dağıtın ve Tripsin'i nötralize etmek için ortam ekleyin. Hücreleri 50 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
  4. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1.200 × g'da döndürün. Tüpün dibinde kompakt bir hücre peletinin oluştuğunu onaylayın, süpernatanı aspire edin ve peleti 1x PBS ile yıkayın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
  5. Hücre peletini sayım için yaklaşık 1-2 milyon hücre / mL'de 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Saymadan önce 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
  6. 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL Tripan Mavisi ile birleştirin ve bir hemositometre kullanarak sayın. Bir hücre süspansiyonu 2x yapın ve hücre sayımlarını doğrulamak için her ikisini de sayın. Toplam hücre sayısını ve canlılığını hesaplayın.
  7. Son enjeksiyon hacminde yeniden süspansiyon için hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1.200 × g'da döndürün. PBS'yi aspire edin.
  8. Hücreleri 1x PBS'de 0.5 mg / mL Matrigel içinde 50 μL'lik bir hacimde enjeksiyon başına istenen hücre sayısına yeniden süspanse edin. Katılaşmayı önlemek için son hücre süspansiyonunu prosedür boyunca buz üzerinde tutun.
    NOT: Bu protokol LLC-luc hücrelerini kullanır. Fare başına 50 μL hacimde 25.000-50.000 hücreye enjekte edin.

5. Cerrahi hazırlık

  1. Prosedürü aseptik prosedürler için IACUC onaylı bir cerrahi odada gerçekleştirin. Ameliyat masasını veteriner onaylı bir dezenfektan ile temizleyin.
  2. Cerrahi alana dezenfekte edilmiş IACUC onaylı bir ısıtma yastığı yerleştirin. Isıtma yastığının üzerine steril bir cerrahi örtü serin.

6. Cerrahi anestezi

  1. İzofluran kullanarak anestezi yapmak için fareyi bir indüksiyon odasına yerleştirin. Oksijen akış hızını 2.0 L/dk'ya ve buharlaştırıcıyı %2 izoflurana ayarlayın.
    NOT: İzofluran konsantrasyonu, farenin boyutuna göre ayarlanabilir.
  2. Farenin solunumunu izleyin ve uygun anesteziyi doğrulamak için bir pedal çekme refleksi kullanın.
  3. Fareyi, steril cerrahi örtü üzerinde sağ yanal yaslanmış pozisyonda bir burun konisine yerleştirin. Devam etmeden önce pedal çekme refleksi kullanılarak farenin uygun şekilde uyuşturulduğundan emin olmak için kontrol edin.
  4. Ameliyat öncesi analjezik, deri altına meloksikam (2 mg/kg ağırlıkta) ve her iki göze oftalmik merhem verin.

7. Ortotopik akciğer enjeksiyonu

  1. Steril gazlı bez kullanarak% 70 etanol ve betadin arasında geçiş yaparak cerrahi bölgeyi 3 kez temizleyin. Farenin üzerine 3 cm x 4 cm açıklıkla sterilize edilmiş fenestre bir cerrahi örtü yerleştirin. Otoklavlanmış sterilize edilmiş aletleri cerrahi örtünün üzerine yerleştirin.
  2. Forseps kullanarak kürek kemiğinin kraniyal kenarını ve torasik göğüs kafesinin kaudal kenarını bularak insizyonun nerede yapılacağını belirleyin. Cerrahın başparmağını ve işaret parmağını kullanarak cildin gergin olduğundan emin olun ve 10 numara bıçakla sadece kürek kemiğinin hemen altındaki deriden yüzeysel 5 mm'lik bir kesi yapın.
    NOT: Cerrah steril eldiven giymelidir.
  3. Kaburgalardan ve interkostal kaslardan deri altı yağını köreltmek için 115 mm düz makas kullanın. İnterkostal kasları kesmeyin.
    NOT: Kürek kemiğinin yakınında bulunan torakodorsal artere ve transvers servikal arterin derin dalına zarar vermemeye dikkat edin. Deri içindeki kılcal damarların kesilmesi ve cilt altı yağına bağlı olarak hafif kanama olabilir. Sterilize edilmiş pamuk uçlu bir aplikatör ile hafif basınç uygulayarak kanamayı durdurun.
  4. Kesiği açık tutmak için Micro-Adson forseps kullanın. Yedinci gerçek kaburgadan başlayarak, dördüncü ve beşinci kaburgaları tanımlamak için yukarı doğru saymak için kavisli orta nokta forseps kullanın. Enjeksiyon için bu alana dikkat edin.
  5. Hücre süspansiyonunu hafifçe 3-4 kez ters çevirerek karıştırın. Enjeksiyondan hemen önce, 50 μL hücre süspansiyonunu çekmek için steril bir 300 μL 31 G 8 mm insülin şırıngası kullanın ve kabarcık olmadığından emin olun.
  6. İğneye sterilize edilmiş 4 mm kalınlığında bir metal bant şeridi ekleyin, tıpa görevi görmesi için şırıngaya aynı hizada tutun. Bu, iğnenin akciğerin sadece 4 mm derinliğine inmesini sağlar.
  7. 50 μL hücre süspansiyonunu, akciğere dik 90°'lik bir açıyla dört ve beş kaburga arasındaki interkostal boşluktaki dördüncü kaburgaya doğrudan enjekte edin. Hücre süspansiyonunu enjekte ettikten sonra, Matrigel'in sertleşmesini sağlamak ve hücrelerin enjeksiyon bölgesinden çıkmasını önlemek için iğneyi 2-3 saniye yerinde tutun.
  8. İğneyi aynı açıyla yavaşça çıkarın ve keskin bir kaba atın.
  9. Cildi 2-3 dikiş kullanarak, kare düğümlerle kapatarak dikin ve yaranın yeterince kapalı olduğundan emin olmak için veteriner cerrahi yapıştırıcı ekleyin.

8. Ameliyat sonrası işlemler

  1. Fareyi IACUC onaylı bir ısıtma cihazındaki boş bir kafese yerleştirin. Fareyi anesteziden tamamen iyileşene kadar izleyin, bu 1-2 dakika sürmelidir.
  2. Fare uyanık ve hareket ettiğinde, onu yeni yatak takımlarıyla dolu bir kafese koyun. Herhangi bir ağrı veya enfeksiyon belirtisi için fareyi ilk 24 saat içinde sık sık gözlemleyin.
  3. Ameliyattan sonraki 2 gün boyunca deri altı enjeksiyon yoluyla NSAID analjezik, meloksikam (2 mg / kg ağırlıkta) verin.

9. İn vivo BLI ile tümör büyümesinin izlenmesi

  1. Ameliyattan sonraki gün kadar erken ve günde bir kez sıklıkta BLI kullanarak akciğerdeki tümör büyümesini izleyin.
  2. Bir in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) kullanarak in vivo görüntüleme gerçekleştirin.
    1. Magnezyum veya kalsiyum olmadan 1x PBS'de 15 mg / mL'de lusiferin oluşturun. 20 g'lık bir fare için bu, 15 mg / mL lusiferin çözeltisinin 200 μL'sinin enjekte edilmesine eşittir.
      NOT: Hazırlanan lusiferin solüsyonunu, ışığa duyarlı olduğu için kullanılmadığı zamanlarda alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun.
    2. Biyolüminesan Görüntüleme için yazılımı açın ve parametreleri ayarlayın. Pozlama süresini Otomatik olarak ayarlayın. Gruplama faktörünü 4 olarak ayarlayın.
    3. Farelere intraperitoneal olarak kg ağırlık başına 150 mg lusiferin enjekte edin.
    4. Yeni bir kanser hücresi modelini ilk kez görüntülerken, lüminesansın platoya başlamadan önce zirveye ulaştığı zaman ile gösterilen optimal lusiferin alım süresini belirlemek için bir kinetik eğri gerçekleştirin.
      1. Farelere lusiferin enjekte edin. Luciferin'in alınması için 3 dakika bekleyin.
      2. 60 dakika boyunca her 5-10 dakikada bir görüntü fareleri.
        NOT: Farklı hücre hatları için optimum alım süresi tipik olarak 5-15 dakika arasında değişir.
    5. Sonraki tüm görüntüleme seansları için en uygun lusiferin alım süresini kullanın. Bu süre zarfında görüntülemeye hazırlanırken fareleri uyuşturun. Fareleri, 2.0 L/dk akış hızına sahip% 2 izofluranlı bir indüksiyon odasına yerleştirin.
    6. Alım tamamlandıktan sonra, Al'ı seçerek iki resim çekin.
      1. İlk olarak, farenin sağ yanal yaslanmış pozisyonda yattığını görün. Bu, kameranın, farenin sol yan kısmında bulunan enjeksiyon bölgesini yakalamasını sağlar. Tümör büyümesini ölçmek için bu görünümü kullanın. Bu konumda çekilen görüntüler buradan itibaren sol yanal görünüm olarak gösterilecektir.
      2. İlk görüntü tamamlandıktan hemen sonra, farenin sırtüstü pozisyonda ikinci bir görüntüsünü çekin. Bu, kameranın göğüs boşluğundaki tümörden yayılan fotonları ventral görünümden yakalamasını sağlar. Kanserin göğüs boşluğu içindeki yerini tahmin etmek için bu görünümü (burada ventral görünüm olarak belirtilmiştir) kullanın.
  3. Görüntüleri analiz etmek için birimleri Sayımlar'dan Parlaklık'a değiştirin.
  4. Araç Paleti'ni açın. Image Adjust'a gidin, Manual (Manuel) öğesini seçin. Çekilen görüntülere en uygun renk çubuğu için bir minimum ve maksimum değer seçin.
  5. ROI Araçları'nı açın. Görüntüye bir ilgi bölgesi (ROI) dairesi eklemek için daire açılır menüsünü seçin. Sol lateral görünüm için daireyi insizyonun üzerinden ve ventral görünüm için göğsün merkezinin üzerine hareket ettirin.
  6. ROI'leri Ölç'ü seçin.

10. Dahil etme ve hariç tutma kriterlerinin değerlendirilmesi

  1. İlk olarak, sol lateral görünüm görüntüsünü gözlemleyerek akciğerde tümör lüminesansının varlığını doğrulayın.
  2. Daha sonra, ventral görünüm görüntüsünde sol göğüs boşluğunda tümör lüminesansının varlığını onaylayın. Ardından, ventral görünüm görüntüsünden yalnızca tek bir lüminesans bölgesi olduğunu onaylayın.
  3. Bu iki kriter (adım 10.1, 10.2) karşılanırsa, ventral görünüm görüntüsünde lüminesansın göğüs boşluğunda orta çizgiyi geçmediğinden emin olarak dışlama kriterlerini değerlendirin. Ameliyattan sonraki 4 gün boyunca art arda iki IVIS görüntüsünden sonra sol yanal görünüm görüntüsünde lüminesans tespit edilemezse, kanser hücreleri muhtemelen almadığı için bu fareyi daha sonraki çalışmalardan hariç tutun.

11. Çalışmaların sonunda tümörlerin değerlendirilmesi

  1. Tümör lüminesansının toplam akısı 1 × 108 foton/sn (p/s) veya daha fazlasına ulaştığında, son nokta değerlendirmeleri için fareleri hasat edin.
  2. Daha önce tarif edildiği gibi akciğerin anestezitizasyonu ve perfüzyonu için aşağıdaki adımları uygulayarak tümörü brüt anatomik analiz veya histoloji için toplayın37.
    1. İzofluran kullanarak anestezi yapmak için fareyi bir indüksiyon odasına yerleştirin. Oksijen akış hızını 2.0 L/dk'ya ve buharlaştırıcıyı %2 izoflurana ayarlayın. Farenin solunumunu izleyin ve uygun anesteziyi doğrulamak için bir pedal çekme refleksi kullanın.
      NOT: İzofluran konsantrasyonu, farenin boyutuna göre ayarlanabilir.
    2. Fareyi sırtüstü pozisyonda bir burun konisine yerleştirin. Devam etmeden önce pedal çekme refleksi kullanılarak farenin uygun şekilde uyuşturulduğundan emin olmak için kontrol edin.
    3. Diyaframın arkasındaki akciğerleri ve kalbi görselleştirmek için farenin göğüs boşluğunu açın.
    4. Farenin orta çizgisi boyunca aşağıdan aşağıya doğru uzun bir dikey kesim yapın. Sol renal arteri görselleştirmek için bağırsakları hareket ettirin.
    5. Kalbi görselleştirmek için diyaframı kesin.
    6. Sol renal arteri kesin.
    7. Kalbin sağ ventrikülünden yaklaşık 5 mL / dk hızında yaklaşık 5-10 mL 1x PBS enjekte edin.
    8. Boyun boyunca bir kesi yapın. Trakeanın üzerinde bulunan deri altı yağlarını temizleyin. Soluk borusunu kesmemeye dikkat edin.
    9. Akciğerleri şişirmek ve sabitlemek için% 10 formalini doğrudan trakeaya enjekte etmek için trakeayı bir iğne ile paralel olarak delin.
    10. Trakeayı akciğerin tepesinin üzerinden keserek göğüs boşluğundan temin edin ve akciğeri göğüs boşluğuna bağlayan akciğer zarı ve bağları kesin.
    11. Sabitlemek için% 10 formalin içine yerleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, C57BL6 / N farelerine sunulan protokole göre enjekte edildi (Şekil 1). Lusiferazı (LLC-luc) eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış LLC hücreleri kullanıldı. Ek olarak, sahte bir fareye kanser hücreleri olmadan Matrigel enjekte edildi. IVIS üzerinde BLI, ameliyattan 1 gün sonra başlatılabilir. Bu LLC-luc çalışması, erken evre akciğer kanserini değerlendirmek için BLI üzerinde optimize edilmiştir. Bu yazıda kullanılan BLI sistemi, üretici...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, daha önce tarif edilen cerrahi olarak yoğun yöntemlerden farklı olarak, hızlı iyileşme sürelerine ve neredeyse anında tümör izlemeye izin veren optimize edilmiş, minimal invaziv bir prosedürü tanımlar 10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C.H. ve C.S.C., Geminii, Inc.'in kurucularıdır. Bu düzenlemenin şartları, Iowa Üniversitesi Araştırma Çıkar Çatışması Ofisi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Diğer tüm yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Carter ve Sheffield laboratuvarlarının üyelerine, Susan Walsh, Bryan Allen ve Kranti Mapuskar'a değerli tartışmalar için teşekkür ederiz. Hayvan Kaynakları Ofisi'nde kıdemli klinik veteriner olan Samantha Eckley'e rehberliği ve tavsiyesi için de teşekkür ederiz. IVIS Lumina S5 Görüntüleme Sisteminin, Iowa Üniversitesi Radyoloji Bölümü tarafından desteklenen temel bir kaynak olan Küçük Hayvan Görüntüleme Çekirdek Tesisinde kullanıldığını kabul etmek isteriz. Biorender (https://biorender.com) kullanılarak oluşturulan şekillerden grafik çizimler. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri NCI R21CA256301 (C.S.C., V.C.S.), Serbest Radikal Radyasyon Biyolojisi Programı NCI T32CA078586 (SCH), 1S10OD026835'te satın alınan IVIS Lumina S5 Görüntüleme Sistemi tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,25 Tripsin-EDTA (1 kat)Gibco25200-056
%10 Nötr Tamponlu FormalinVWR16004-112
100 mm x 20 mm doku kültürü işlenmiş tabaklarDot Scientific Inc.667621
190 Proof Saf EtanolDecon Labs2801
3/10 mL İnsülin Şırınga, BD Ultra-Fine iğneyle 31 G x 5/16 inç.Beckton Dickinson328438
3M Vetbond3M1469SB
ATPSigmaA5394
Betadine Çözeltisi %10 Povidon-iyot AntiseptikArvio Health L.P.67618-150-04
C57BL6/N FareCharles River Laboratuvarları
Hücre Süzcü 40um naylon Doğan352340
Kompakt Anestezi MakinesiVetamac Anestezi 
Kontrol Cihazlı Uzak Kızılötesi Isıtma PediKent Scientific Corporation 
Geleneksel Cerrahi Bıçak Kollu, Beden 3Brad-Parker371030
Kavisli Orta Noktalı Genel Amaçlı PensFisherbrand16-100-110
DitiothreitolResearch Products InternationalD11000
D-Luciferin (sodyum tuzu)Cayman Chemical14682
Perde, Cerrahi 18" x 26" Fenestrat Olmayan, SterilAnlaşma783410
Dulbecco' s Modifiye Kartal Orta (1x)Gibco11965-092
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Çay (PBS) 1xGibco14190-144
EGTASigmaE3389
Fetal Sığır SerumuGibcoA5670402
FL150 Fiber Optik Mikroskop Işık KaynağıMeiji 
Gentamisin Sülfat ÇözeltisiIBI ScientificIB02030
GliserolResearch Products InternationalG22025
İzofluranPrimal Pharma Limited66794-013-25
IVIS Lumina S5PerkinElmer 
Yaşayan İmaj YazılımıPerkinElmer 
LL/2 (LLC1)ATCCCRL-1642Çalışmanın ihtiyaçlarına en uygun kanser hücre hattını kullanın 
Magnezyum SülfatFisher ScientificM63
Matrigel Bazal Zar MatrisiCorning354234
Mayo-Hegar İğne Tutucu, 6", Dişli ÇeneMiltex8-44TC
Micro-Adson ForsepsGüzel Bilim Araçları10018-12
Çift Bıçaklı N5 Köpek Pati KesiciOneisall 
Steril Olmayan, 12 Kat Gazlı Bez SüngerleriNDCP157112
Optixcare Göz KayganlaştırıcısıAventix5914304
Penisilin StreptomisinGibco15140-122
Perma-Hand İpek Dikiş 6-0 1 x 18"Ethicon K802H
Fosforik Asit %85Fisher ScientificA242
Skalpel Bıçağı Boyutu 10, Paslanmaz Çelik, SterilCincinnati Cerrahi110
Vida Kapağı Tüpü Konik 50 mLSarstedt62.547.100
Doku Makas 4.5" Staight PremiumOnsungSCT115
Triton X-100SigmaT6878
Trizma ÜssüSigmaT1503
Trypan Blue Lekesi (%0,4)Gibco15250-061
Astarlı Utility Alüminyum Folyo BantIPGALF150L
Ahşap Gövdeli Pamuk Uçlu ApplikatörlerNDC76200

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  2. Luo, G., et al. Estimated worldwide variation and trends in incidence of lung cancer by histological subtype in 2022 and over time: a population-based study. Lancet Respir Med. 13 (4), 348-363 (2025).
  3. Zhou, J., et al. Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Cancer Epidemiol. 93, 102693(2024).
  4. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. ACancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  5. Friedlaender, A., et al. Oncogenic alterations in advanced NSCLC: a molecular super-highway. Biomark Res. 12 (1), 24(2024).
  6. Li, S., et al. Emerging targeted therapies in advanced non-small-cell lung cancer. Cancers Basel. 15 (11), 2899(2023).
  7. Chavan, P. R., et al. Unravelling key signaling pathways for the therapeutic targeting of non-small cell lung cancer. Eur J Pharmacol. 998, 177494(2025).
  8. Wang, Y., et al. Survival trends among patients with metastatic non-small cell lung cancer before and after the approval of immunotherapy in the United States: a SEER database-based study. Cancer. 131 (1), e35476(2025).
  9. Doki, Y., et al. Mediastinal lymph node metastasis model by orthotopic intrapulmonary implantation of Lewis lung carcinoma cells in mice. Br J Cancer. 79 (7-8), 1121-1126 (1999).
  10. Wilson, A. N., et al. A method for orthotopic transplantation of lung cancer in mice. Methods Mol Biol. 2374, 231-242 (2022).
  11. Poczobutt, J. M., et al. Eicosanoid profiling in an orthotopic model of lung cancer progression by mass spectrometry demonstrates selective production of leukotrienes by inflammatory cells of the microenvironment. PLoS One. 8 (11), e79633(2013).
  12. Giannou, A. D., et al. Protocol for orthotopic single-lung transplantation in mice as a tool for lung metastasis studies. STAR Protoc. 4 (4), 102701(2023).
  13. Gan, W., et al. Establishment of an orthotopic model of lung cancer by transthoracic lung puncture using tumor fragments. J Thorac Dis. 15 (4), 2012-2021 (2023).
  14. Nakajima, T., et al. Orthotopic lung cancer murine model by nonoperative transbronchial approach. Ann Thorac Surg. 97 (5), 1771-1775 (2014).
  15. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101(2019).
  16. Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Sci. 97 (10), 996-1001 (2006).
  17. Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Lab Anim. 48 (2), 124-131 (2014).
  18. McDonald, J. A., et al. On target: an intrapulmonary transplantation method for modelling lung tumor development in its native microenvironment. Methods Mol Biol. 2691, 31-41 (2023).
  19. Liu, X., et al. Establishment of an orthotopic lung cancer model in nude mice and its evaluation by spiral CT. J Thorac Dis. 4 (2), 141-145 (2012).
  20. Liu, P., et al. In vivo imaging of orthotopic lung cancer models in mice. Methods Mol Biol. 2279, 199-212 (2021).
  21. Yamada-Hara, M., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor progression in the Lewis lung carcinoma orthotopic mouse model: a comparison between the tail vein injection and intranasal instillation methods. Curr Protoc. 4 (12), e70071(2024).
  22. Xu, H., et al. Unraveling the immune mechanisms and therapeutic targets in lung adenosquamous transformation. Front Immunol. 16, 1542526(2025).
  23. Ghasemi, K. Tiragolumab and TIGIT: pioneering the next era of cancer immunotherapy. Front Pharmacol. 16, 1568664(2025).
  24. Fortich, S., et al. Surgical management of oligometastatic non-small cell lung cancer. Cancers Basel. 17 (12), 2040(2025).
  25. Al-Showbaki, L., et al. Anti-programmed cell death-1 versus anti-programmed death-ligand 1 in PD-L1-negative advanced non-small cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis. World J Oncol. 16 (3), 299-310 (2025).
  26. Close, D. M., et al. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors Basel. 11 (1), 180-206 (2011).
  27. Driehuys, B., et al. Small animal imaging with magnetic resonance microscopy. ILAR J. 49 (1), 35-53 (2008).
  28. Jelicks, L. A., et al. Imaging of small-animal models of infectious diseases. Am J Pathol. 182 (2), 296-304 (2013).
  29. Klaunberg, B. A., Lizak, M. J. Considerations for setting up a small-animal imaging facility. Lab Anim. 33 (3), 28-34 (2004).
  30. Puaux, A. L., et al. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. Int J Mol Imaging. 2011, 321538(2011).
  31. Yitbarek, D., Dagnaw, G. G. Application of advanced imaging modalities in veterinary medicine: a review. Vet Med Auckl. 13, 117-130 (2022).
  32. Saito-Moriya, R., et al. How to select firefly luciferin analogues for in vivo imaging. Int J Mol Sci. 22 (4), 1848(2021).
  33. Ramos-Gonzalez, M. R., et al. Establishment of translational luciferase-based cancer models to evaluate antitumoral therapies. Int J Mol Sci. 25 (19), 10418(2024).
  34. Young, M. R., et al. Monitoring tumor promotion and progression in a mouse model of inflammation-induced colon cancer with magnetic resonance colonography. Neoplasia. 11 (3), 237-246 (2009).
  35. Takeuchi, K., et al. Molecular structure and transcriptional function of the rat vascular AT1a angiotensin receptor gene. Circ Res. 73 (4), 612-621 (1993).
  36. Christian, S. L. Overview of the maintenance of authentic cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 1-7 (2022).
  37. Davenport, M. L., et al. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. (162), e2020(2020).
  38. Helms, M. N., et al. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. (42), e2010(2010).
  39. Kee, J. Y., et al. Antitumor immune activity by chemokine CX3CL1 in an orthotopic implantation of lung cancer model. Mol Clin Oncol. 1 (1), 35-40 (2013).
  40. Li, H. Y., et al. The tumor microenvironment regulates sensitivity of murine lung tumors to PD-1/PD-L1 antibody blockade. Cancer Immunol Res. 5 (9), 767-777 (2017).
  41. Morgan, K. M., et al. Patient-derived xenograft models of non-small cell lung cancer and their potential utility in personalized medicine. Front Oncol. 7, 2(2017).
  42. Oser, M. G., et al. Genetically-engineered mouse models of small cell lung cancer: the next generation. Oncogene. 43 (7), 457-469 (2024).
  43. Spiro, J. E., et al. Monitoring treatment effects in lung cancer-bearing mice: clinical CT and clinical MRI compared to micro-CT. Eur Radiol Exp. 4 (1), 31(2020).
  44. Weiss, I. D., et al. In the hunt for therapeutic targets: mimicking the growth, metastasis, and stromal associations of early-stage lung cancer using a novel orthotopic animal model. J Thorac Oncol. 10 (1), 46-58 (2015).
  45. Zhu, S., et al. Metabolomics study of ribavirin in the treatment of orthotopic lung cancer based on UPLC-Q-TOF/MS. Chem Biol Interact. 370, 110305(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Akci er Kanseri ModeliSinerjenik Fare ModeliMinimal nvaziv CerrahiT m r Mikro evresiBiyol minesans G r nt lemeT m r mplantasyonuH cre S spansiyonu EnjeksiyonuPreklinik Kanser ModeliErken Evre Akci er Kanseri

İlgili makaleler