Yöntem makalesi

Nörofibromatozis Tip 1 Nörofibromlar için Ortotopik Siyatik Sinir Ksenogrefti

1.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68694

⸱

10 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Cochin, Inserm U1016, CNRS UMR8104, Université Paris Cité, CARPEM, 2Institut Curie, INSERM U934/CNRS UMR 3215, Paris Sciences et Lettres Research University, Sorbonne University, 3Laboratory of preclinical investigation, Translational Research Department, Institut Curie, PSL Research University, 4Faculty of Pharmaceutical and Biological Sciences, Paris Cité University, 5Genetics Department, Institut Curie, 6Department of Plastic Surgery, Hôpital Ambroise Paré, APHP (Assistance Publique-Hôpitaux de Paris), 7Université Versailles Saint Quentin en Yvelines

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Nörofibromatozis tip 1 (NF1), büyüme için spesifik bir sinir mikroçevresi gerektiren iyi huylu periferik sinir kılıfı tümörlerine (nörofibromlar) yol açar. İnsan Schwann hücrelerinin NSG farelerine intranöral enjeksiyonu kullanılarak optimize edilmiş bir ortotopik ksenograft modeli geliştirildi. Bu model, insan nörofibromlarını özetler ve terapötik stratejileri değerlendirmek için değerli bir platform sağlar.

Özet

Nörofibromatozis tip 1 (NF1), NF1 genindeki patojenik varyantların neden olduğu, nörofibromin fonksiyonunun kaybına ve nörofibromlar olarak bilinen iyi huylu periferik sinir kılıfı tümörlerinin gelişmesine yol açan genetik bir bozukluktur. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMM'ler), NF1 patofizyolojisi anlayışımızı geliştirmiş olsa da, genellikle hasta kaynaklı nörofibromların spontan tümör oluşumunu ve mikroçevresel karmaşıklığını kopyalamada başarısız olurlar. İyi huylu nörofibromların modellenmesindeki önemli bir zorluk, geleneksel ksenograft yaklaşımlarının özetlemediği sinir mikroçevresine bağımlılıklarıdır. Burada, NF1 ile ilişkili nörofibromlar için optimize edilmiş bir ortotopik ksenograft modeli geliştirilmiştir. Ölümsüzleştirilmiş nörofibromdan türetilen insan Schwann hücrelerinin NSG immün yetmezliği olan farelerin siyatik sinirine intranöral enjeksiyonunu kullanan bu model, sinire bağlı büyüme ve tümör mikroçevre etkileşimleri dahil olmak üzere insan nörofibrom biyolojisinin temel özelliklerini özetlemektedir. Bu protokol, biyolüminesans görüntüleme yoluyla tümör ilerlemesinin dinamik, gerçek zamanlı izlenmesine olanak tanır ve nörofibrom büyümesini değerlendirmek için tekrarlanabilir ve kantitatif bir yöntem sağlar. GEMM'lerden farklı olarak bu model, tümörün kontrollü başlatılmasına ve klinik öncesi terapötik stratejilerin hassas bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. Ek olarak, GEMM'ler ile hastadan türetilen ksenograft modelleri arasında bir köprü görevi görerek nörofibrom araştırmalarının translasyonel uygunluğunu artırır. Tümör-sinir etkileşimlerini incelemek için fizyolojik olarak uygun bir ortam sunan bu model, nörofibrom biyolojisini araştırmak ve potansiyel terapötik müdahaleleri değerlendirmek için değerli bir platform sağlar. Bağışıklık bileşenlerinin entegrasyonu veya gelişmiş görüntüleme teknikleri de dahil olmak üzere gelecekteki iyileştirmeler, NF1 araştırmalarına uygulanmasını daha da geliştirebilir.

Giriş

Nörofibromatozis tip 1 (NF1), NF1 genindeki patojenik varyantların neden olduğu genetik bir bozukluktur ve RAS-mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) sinyal yolu1'i aşağı regüle eden önemli bir tümör baskılayıcı olan nörofibrominin fonksiyon kaybına yol açar. NF1, sinir sistemi, deri ve iskelet sistemini ilgilendiren, öncelikle nöral krest kaynaklı dokuları etkileyen majör klinik belirtileri olan bir tümör yatkınlık sendromu2'dir . NF1'in ayırt edici özelliği, nörofibromlar olarak bilinen iyi huylu periferik sinir tümörlerinin gelişmesidir. Bu tümörler esas olarak bialelik NF1 inaktivasyonunu (NF1-/-)3 barındıran Schwann hücrelerinin yanı sıra NF1+/- fibroblastlar, perinöral hücreler, immün hücreler ve hücre dışı matriks bileşenleri4 dahil olmak üzere diğer stromal elementlerden oluşur.

Hayvan modelleri, nörofibrom patofizyolojisini anlamak ve terapötik stratejileri test etmek için gereklidir. Bir Nf1 nakavt (KO) mutasyonu (Nf1-/-) için homozigot fareler rahimde öldü; Nf1+/− fareler, insan muadilleri gibi yaşayabilir, doğurgan ve kansere eğilimlidir5. Bununla birlikte, bu hayvanlar insan NF1 hastalığının ayırt edici özelliklerini geliştirmezler: Nf1+/− fareler ne pigmentasyon anormallikleri ne de nörofibromlar göstermedi. Son on yılda, koşullu KO yaklaşımları yoluyla bazı semptomları bağımsız olarak modellemek için çok çeşitli genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMM'ler) oluşturulmuştur. Bazı GEMM'ler, Schwann hücre öncülleri 6,7,8'de Nf1'i koşullu olarak inaktive ederek nörofibrom oluşumunu indüklemek için geliştirilmiştir.

Bu GEMM'ler, NF19 hakkındaki anlayışımızı önemli ölçüde ilerletmiş olsa da, fenotipik karmaşıklıkları ve heterojenlikleri, terapötik tahliller için alternatif ve tamamlayıcı fare modelleri gerektirir. Ortotopik ksenogreftler, insan hücrelerinin doğrudan doğal anatomik nişlerine implante edilmesine izin vererek değerli bir alternatif sunar ve böylece fizyolojik olarak daha alakalı bir model sunar. Bununla birlikte, ksenograft tabanlı çalışmaların çoğu, muhtemelen nörofibromlar ektopik olarak aşılanmadığından, bu nedenle iyi huylu tümörlerin modellenmesinde bir boşluk bıraktığından, malign periferik sinir kılıfı tümörlerine (MPNST'ler)10 odaklanmıştır.

Bu çalışma, ölümsüzleştirilmiş nörofibromdan türetilen insan Schwann hücrelerinin (hTERT NF1 ipNF04.4 CVCL_UI78 hücre hattı) NOD SCID gama (NSG) immün yetmezliği olan farelerin siyatik sinirine intranöral enjeksiyonuna dayanan yeni bir ortotopik NF1 nörofibrom modelini açıklamaktadır. Bu yaklaşım, biyolüminesans görüntüleme (BLI) yoluyla dinamik izlemeye izin verirken, iyi huylu tümör oluşumuna izin vererek doğal sinir mikroçevresinden tam olarak yararlanır.

Bu protokol şunları amaçlamaktadır: (1) NF1 için tekrarlanabilir bir ortotopik nörofibrom modeli oluşturmak, (2) Tümör-sinir etkileşimlerini incelemek ve yeni tedavileri değerlendirmek için sağlam bir klinik öncesi platform sağlamak ve (3) GEMM'ler11,12 ile hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX)13 arasındaki boşluğu ara, kontrollü bir deneysel sistem sunarak kapatmak. Bu model, transgenik fare çizgilerinin oluşturulmasını gerektirmeden, tipik olarak enjeksiyondan sonraki 5 gün içinde hızlı ve uygun maliyetli tümör gelişimini mümkün kılar, böylece ksenogreftlerin erişilebilirliğini ortotopik yerleştirmenin anatomik uygunluğuyla birleştirir.

Bu nörofibroma ortotopik hücre hattından türetilen tümör ksenogreft (CDX) fare modeli, alternatif yöntemlere göre çeşitli avantajlar sunar. Tümör oluşumunu yönlendirmek için genetik yatkınlıklara dayanan GEMM'lerin aksine, bu model tümörün başlaması ve ilerlemesi üzerinde doğrudan kontrole izin verir.

Malign periferik sinir kılıfı tümörlerinin (MPNST'ler)10 ortotopik engraftman protokolü, benign nörofibrom modellerine uyarlanmıştır. Bu, yeni terapötik hedeflerin belirlenmesinde ve yenilikçi tedavi stratejilerinin test edilmesinde potansiyel uygulamalarla translasyonel NF1 araştırmalarında ileriye doğru atılmış önemli bir adımı temsil etmektedir.

Protokol

Tüm prosedürler, uluslararası yönergelere uygun olarak Institut Curie CEEA-IC #118 (Ulusal Otorite tarafından verilen Yetki #50186) etik kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır ve hayvan araştırmaları için etik yönergeler izlenerek eğitimli personel tarafından yürütülmüştür. NOD SCID gama (NSG) fareleri (NOD. Cg-Prkdc Il2rg/SzJ), başarılı insan hücresi aşılamasına izin veren ciddi immün yetmezlikleri nedeniyle bu çalışma için seçilmiştir. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hayvan modeli ve hücre hattı hazırlığı

  1. Büyük NSG fare kohortları için prosedürü kolaylaştırmak için aşılamadan bir gün önce elektrikli bir tıraş makinesi kullanarak cerrahi bölgede epilasyon gerçekleştirin.
  2. Bilateral arka bacak bozulmasını önlemek için, tüm deneylerde fare başına sadece bir siyatik sinir (sol taraf) enjekte edin. Fareleri sıkıntı, kilo kaybı ve motor eksiklikler belirtileri açısından izleyin.
  3. İşlemden sonra, yatak malzemesinin yanlışlıkla solunmasını önlemek için farelerin yataksız bir kafeste bir ısıtma yastığı üzerinde tamamen iyileşmesine izin verin. Fareler tamamen hareketli hale geldiğinde ve sersemlik belirtisi göstermediğinde, onları hayvan tesisine yeniden sokun.
  4. Ksenogreftleme için, bir NF1 hastasından14 türetilen hTERT ile ölümsüzleştirilmiş bir insan Schwann hücre hattı olan NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78) hücre hattını kullanın. Bu hücreler, ticari bir lusiferaz tahlil sistemi kullanılarak BLI yoluyla uzunlamasına izlemeye izin veren bir CMV-lusiferaz yapısı, pLenti CMV Puro LUC (w168-1) ile stabil bir şekilde transdüksiyona tabi tutuldu.
  5. %5 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 Penisilin-Streptomisin ile 37 ° C'de %5 CO2 ile desteklenmiş DMEM'deki hücreleri koruyun. Optimum büyüme koşullarını korumak için hücreleri %80 birleşmeye kadar genişletin.
  6. Aşılama gününde hücreleri tripsinize edin (37 °C'de ≤4 dakika); bunları fare başına 4 μL'de 5 × 103 hücrede sayın ve yeniden askıya alın.

2. Ortotopik ksenogreftleme için cerrahi prosedür

  1. Ameliyat öncesi hazırlık
    1. Çalışma alanını iyice dezenfekte ederek anestezi indüksiyonundan önce cerrahi istasyonu hazırlayın. Cerrahi mikroskop ve aydınlatma sisteminin tüm temas yüzeylerini steril şeffaf film ile kaplayın ve tüm cerrahi aletlerin daha önce otoklavlanarak sterilize edildiğinden emin olun.
    2. Yeterli başlangıç analjezisini sağlamak için ameliyattan 30 dakika önce farelere preoperatif analjezi ile deri altı buprenorfin (0.1 mg/kg) ön muamelesi uygulayın.
    3. Steril salin içinde taze hazırlanmış ve vücut ağırlığına göre ayarlanmış (kurumsal olarak onaylanmış protokollere göre) intraperitoneal ketamin (80 mg/kg) ve ksilazin (15 mg/kg) enjeksiyonu yoluyla anesteziyi indükleyin ve sürdürün. Devam etmeden önce anestezi derinliğini ayak parmağı kıstırma refleksi ile onaylayın.
    4. Anestezi, greftleme ve iyileşme dahil olmak üzere tüm prosedür boyunca bir ısıtma yastığı kullanarak vücut ısısını koruyun.
    5. Korneanın kurumasını önlemek için gözlere kayganlaştırıcı damlalar uygulayın.
  2. Enjeksiyon prosedürü
    1. Fareyi sağ tarafına, arka ayakları yavaşça birbirinden ayrılacak şekilde yerleştirin. Kesiye başlamadan önce ameliyat bölgesini steril bir örtü ile örtün.
    2. Povidon-iyot kullanarak steril bir cerrahi alan hazırlayın.
    3. Kesi ve diseksiyon: İnce makas kullanarak femura paralel küçük bir cilt kesisi (~5 mm) yapın. Siyatik siniri ortaya çıkarmak için alttaki kası dikkatlice ayırın: kan damarlarına zarar vermemeye dikkat ederek kas katmanlarını nazikçe ayırmak için ince forseps ve mikro makas kullanın. Siyatik siniri, femurun medialinde bulunan beyaz, kordon benzeri bir yapı olarak tanımlayın.
    4. Hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir tüpte saklayın ve yerleşmiş hücreleri yeniden süspanse etmek için hafifçe hafifçe vurun. 4 μL hücre süspansiyonunu 33 G iğneli 10 μL'lik bir Hamilton şırıngasına yükleyin (bu, yüksek hücre canlılığını korurken sinir travmasını en aza indirmek için seçilmiştir).
      1. İğneyi siyatik sinir eksenine paralel olarak (perforasyonu önlemek için) ~2 mm derinliğe kadar sokun. Sinir ile periferik kılıf arasında basınç ve boşluk oluşturmak için yavaşça enjekte etmeye başlayın. İğneyi yavaşça 4 ila 5 mm daha ilerletin. Ardından iğneyi sinirden çekerken süspansiyonu yavaşça enjekte edin. Sinirin herhangi bir gerginliğinden veya hareketinden kaçının.
      2. Herhangi bir hasarı önlemek için işlemi siyatik siniri germeden gerçekleştirin ve klemp kullanmayın. Reflüyü en aza indirmek için iğneyi yavaşça geri çekmeden önce 10-15 saniye bekleyin.
    5. Enjeksiyondan sonra, siyatik sinirin enjeksiyon bölgesinde sızıntı veya renk değişikliği olmadan hafifçe şişmiş göründüğünden emin olun. Başarılı enjeksiyon, ekstravazasyon olmaksızın stabil bir sinir görünümü ile gösterilir.
    6. Cerrahi bölgede iltihaplanmayı önlemek için emilmeyen materyalle (3-0, 30 mm, 3/8 c) 3 ila 4 basit kesintili dikiş kullanarak cerrahi kesiyi kapatın. Ameliyat 10 dakikadan uzun sürerse, 1 mL Ringer laktat (s.c.) uygulayın. Günün sonunda Meloksikam (5 mg/kg, deri altına) uygulayın.
    7. Ameliyattan hemen sonra ve anesteziden kurtulmadan önce bir kulak zımbası veya etiketi kullanarak benzersiz tanımlama için her fareyi etiketleyin.
    8. Farelerin sıcaklık kontrollü bir ortamda iyileşmesine izin verin ve ameliyat sonrası komplikasyonları izleyin.

3. Aşılama ve tümör büyümesinin izlenmesi için biyolüminesans görüntüleme

  1. Başarılı aşılama ve tümör ilerlemesini değerlendirmek için BLI'yi birden fazla zaman noktasında gerçekleştirin. İn vivo izleme için, tümör hücreleri tarafından eksprese edilen ateş böceği lusiferaz ile substratı D-Luciferin arasındaki enzimatik reaksiyondan yayılan ışığı yakalamak için bir in vivo görüntüleme sistemi kullanın. Bu yaklaşım, tümör aktivitesini görselleştirmek ve ölçmek için doğru bir yöntem sağladı ve zaman içinde tümör dinamikleri hakkında değerli bilgiler sundu.
  2. Aşılama sonrası 5, 12, 19, 26, 30 ve 33. günler dahil olmak üzere aşılama sonrası belirli zaman noktalarında biyolüminesans sinyallerini ölçün (Şekil 1). Tipik olarak, süreci kolaylaştırmak ve ölçümler arasında tutarlılığı korumak için beş fareyi aynı anda görüntüleyin.

4. Görüntüleme kurulumu

  1. Görüntü elde etme sırasında fareleri %2 izofluran ile uyuşturun ve IVIS görüntüleyiciye entegre edilmiş bir ısıtma yastığı kullanın.
  2. Fareleri tutarlı bir şekilde aynı yönde konumlandırın ve 10 μL/g vücut ağırlığı dozunda intraperitoneal D-Luciferin enjeksiyonundan 10 dakika sonra görüntüleyin (stok konsantrasyonu: PBS'de 15 mg/mL, taze hazırlanmış ve filtrelenmiş).
  3. Veri toplama yazılımını kullanarak 1 dakika boyunca görüntü elde edin ve işlem sırasında hiçbir pikselin doygun olmadığından emin olun.
  4. Biyolüminesans sinyal yoğunluğunu bağıl foton sayıları/sn'leri olarak ölçün. Görüntüleme sistemini aşağıdaki ayarlarla kullanın: Pozlama süresi: Otomatik; Gruplama: Orta; F/Durdurma: 1.2; Görüş alanı: 12,5 cm; Yazılım: Living Image Yazılımı v4.7.3.
  5. Özel yazılım kullanarak, saniyede bağıl foton sayısı olarak bildirilen tümör bölgelerinden gelen ışık emisyonunu ölçün. Aynı anda çekilen siyah beyaz görüntülerin üzerine bindirilen sözde renk ölçeklendirmesini kullanarak biyolüminesans yoğunluğunu görselleştirin.

5. Aşılama başarısı için kriterler

  1. Saptanabilir biyolüminesans göstermezlerse veya sinyal zamanla azalırsa fareleri hariç tutun.
  2. Yalnızca 5. ve 12. günler arasında lüminesansında ilerleyici bir artış olan fareleri dahil edin.
  3. Temsili Sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi biyolüminesans görüntüleme kullanarak tümör izlemeye devam edin.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan prosedür kullanılarak, ölümsüzleştirilmiş nörofibrom türevli hücrelere (ipNF04.4) sahip NSG farelerinde ortotopik bir siyatik sinir tümörü modeli başarıyla oluşturuldu. D-lusiferin ile biyolüminesans görüntüleme, zaman içinde üstel büyüme kanıtlarıyla birlikte, 5. gün gibi erken bir tarihte siyatik sinirdeki tümörün net bir lokalizasyonunu ortaya çıkardı. Aşılama, enjekte edilen farelerin %90'ında (37/41) başarılı oldu. Tümör progresyonu 5, 12, 19, 26, 30 ve 33. günlerde izlendi (Şekil 1A) ve izleme süresi boyunca spesifik olmayan sinyaller gözlenmedi. Farelere, kurumsal yönergelere uygun olarak, ilk sıkıntı veya aşırı tümör yükü belirtisinde 33. günde ötenazi yapıldı. Diseksiyon sonrasında, tümör iyi gelişmiş ve siyatik sinirle bütünleşmiş olarak göründü ve apse oluşumu belirtisi yoktu (Şekil 1B). Özellikle, fareler anesteziden kurtulduktan hemen sonra normal ambulasyon sergilediler.

figure-results-1
Şekil 1: NSG farelerinde ortotopik siyatik sinir ksenogreftlerinin biyolüminesans görüntüleme ve makroskopik analizi. (A) Sol siyatik sinire ipNF04.4 hücreleri ile intranöral olarak enjekte edilen iki NSG faresinin uzunlamasına biyolüminesans görüntülemesi (BLI). Enjeksiyondan sonraki 5, 12, 19, 26, 30 ve 33. günlerde görüntüler yakalandı ve aynı iki farede zaman içinde ilerleyici tümör büyümesini gösterdi. Biyolüminesans sinyal yoğunluğundaki artış, sinir mikroçevresinde başarılı aşılama ve tümör genişlemesini yansıtır. (B) Greftlemeden sonraki 33. günde siyatik sinirin makroskopik görünümü, apse oluşumu belirtileri olmayan iyi gelişmiş, entegre bir tümörü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Bu fareden alınan greft bölgesinin tümör büyümesini ve fokal invazyonu gösteren fotomikrografı. Hematoxylin ve eosin (H&E) ile boyanmış parafine gömülü doku bölümleri. Üç fareden alınan tipik tümör örnekleri gösterilmiştir. Ölçek çubukları: 2000 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Ksenograft deneyi boyunca NSG farelerinin (n=15) temsili vücut ağırlığı evrimi. Önemli bir kilo kaybı gözlenmedi. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

NSG farelerinde ortotopik nörofibrom hücre hattından türetilen ksenograft (CDX) modelinin başarılı bir şekilde kurulması, NF1 araştırmalarında önemli bir ilerlemeyi temsil etmekte ve mevcut modellerin temel sınırlamalarını ele almaktadır. Protokol, insan ölümsüzleştirilmiş NF1 ile ilişkili Schwann hücrelerinin (ipNF04.4)14,15,16'nın, immün yetmezliği olan farelerin siyatik sinirine verimli bir şekilde aşılanabileceğini ve fizyolojik olarak ilgili bir mikro çevre içinde tekrarlanabilir tümör gelişimine yol açabileceğini doğrulamaktadır. Schwann hücre hatlarının ortotopik ksenogreftlerinden, insan Schwann hücre hatlarını14,15 oluşturan orijinal çalışmalarda bahsedilmiştir ve burada ayrıntılı bir protokol verilmiştir.

Bu protokolün başarısının anahtarı, hem hücresel bileşenlerin hem de konakçı hayvanların titizlikle hazırlanması ve izlenmesiydi. İşlem sırasında anestezi dikkatli bir şekilde yönetildi ve farelerin önemli bir stres olmadan uygun bir anestezi durumunda tutulması sağlandı. Olası hasarı en aza indirmek için siyatik sinir klemp veya forseps ile gerilmedi ve dokular üzerinde mekanik stres oluşmasını önlemek için büyük özen gösterildi. Lusiferaz bazlı BLI kullanımı, tümör büyümesinin non-invaziv, uzunlamasına izlenmesine izin vererek nicel ve tekrarlanabilir veriler sağladı. Bu görüntüleme stratejisi sadece greft canlılığını doğrulamakla kalmadı, aynı zamanda tümör dinamiklerindeki erken sapmaların tanımlanmasına da izin verdi. Farelerde önemli kilo kaybı (Ek Şekil 1), motor fonksiyon bozukluğu veya diğer sıkıntı belirtilerinin olmaması, bu protokolün hayvan refahı ve 3R (Değiştirme, Azaltma, İyileştirme) etik ilkeleri ile uyumluluğunu vurgulamaktadır.

Koşullu Nf1 inaktivasyonuna 6,7,9 dayanan GEMM'lerle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım birkaç farklı avantaj sunar. GEMM'ler spesifik genetik modifikasyonlar gerektirir, ancak insan nörofibromlarındagözlenen karmaşık tümör-stroma etkileşimlerini tam olarak kopyalayamayabilirler 1,17. Bu model, hücre dışsalfaktörleri 4 koruyarak, insan Schwann hücrelerinin doğal sinir nişlerinde doğrudan incelenmesine izin verir. Tümörlerin zaman içinde öngörülemeyen bir şekilde geliştiği GEMM'lerin aksine, ksenograft modeli, tümör oluşumu üzerinde hassas uzay-zamansal kontrole izin verir. Bu model, tümör ilerlemesinin ve tedavi yanıtının gerçek zamanlı izlenmesine olanak tanıyan BLI ile aday tedavileri test etmek için hızlı ve tekrarlanabilir bir platform sağlar.

Ayrıca, bu bulgular, ortotopik ksenogreftlemenin tümör modellerininaslına uygunluğunu arttırdığının gösterildiği MPNST'ler üzerine yapılan önceki çalışmalarla uyumludur 5. Bununla birlikte, iyi huylu nörofibromlar, büyümeleri büyük ölçüde geleneksel deri altı greftleme yöntemlerinin özetlemekte başarısız olduğu spesifik sinir etkileşimlerine bağlı olduğundan, benzersiz zorluklar ortaya çıkarmaktadır6. Sonuçlar, intranöral enjeksiyonun sürekli nörofibrom gelişimi için optimal bir ortam sağladığını doğrulamaktadır.

Bu nedenle, bu in vivo model, klinik öncesi terapötik testler için GEMM'lere uygun bir tamamlayıcı alternatif olarak düşünülebilir. Ancak, modelin sınırlamaları vardır. Nörofibromlardan türetilen insan Schwann hücreleri ölümsüzleştirilmiştir ve yoğun hücre proliferasyonu ile pleksiform nörofibromdan daha agresif sayılabilecek bir tümör fenotipi sergilemektedir (Şekil 2). Hayvanlarda uzak yayılma kanıtı gözlenmemiştir ve tam malign dönüşüm gösterilmemiştir. Hücre fenotipinin, bilinmeyen biyolojik potansiyele sahip atipik nörofibromatöz neoplazmalar (ANNUBP)18 gibi atipik nörofibromu anımsatan "ara" fenotipe karşılık gelip gelemeyeceğini göstermek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Modelin bir diğer kritik sınırlaması, bağışıklık yetmezliği olan farelere bağımlılığında yatmaktadır. NSG farelerinde adaptif bir bağışıklık sisteminin olmaması, nörofibrom biyolojisine 7,19,20,21 önemli katkıda bulunanlar olarak giderek daha fazla kabul edilen bağışıklık-tümör etkileşimlerinin incelenmesini sınırlamaktadır. Gelecekteki iyileştirmeler, hastalığın immünolojik yönlerini daha iyi yakalamak için insanlaştırılmış fare modellerini veya alternatif stratejileri içerebilir. Ek olarak, tümör izleme için lusiferaz ekspresyonuna güvenmek, oldukça etkili olmakla birlikte, bu protokolün BLI ekipmanına erişimi olmayan deney düzeneklerine uygulanabilirliğini sınırlayabilir. BLI hassas ve non-invaziv bir yöntem olsa da, histopatolojik değişiklikler hakkında doğrudan bilgi sağlamaz. MRI veya ileri histoloji gibi tamamlayıcı analizler, nörofibrom ilerlemesinin karakterizasyonunu daha da iyileştirebilir.

Başarılı tümör engraftmanını sağlamak için birkaç prosedür adımı optimizasyon gerektirebilir. Enjeksiyon başarısızlığı, iğnenin yanlış konumlandırılmasından veya hücre süspansiyonunun aşırı sızıntısından kaynaklanabilir. Bunu azaltmak için iğne siyatik sinire paralel olarak dikkatlice sokulmalı ve enjeksiyondan sonra yavaşça geri çekilmelidir. Biyolüminesans sinyallerindeki değişkenlik, tutarsız lusiferin dozundan veya görüntüleme sırasındaki yanlış hizalamadan kaynaklanabilir. Lusiferin enjeksiyonu sonrası zamanlamanın (10 dakika) standartlaştırılması ve tüm hayvanlarda aynı görüntüleme ayarlarının sürdürülmesi önerilir. Tümör büyümesindeki değişkenlik yüksek kalırsa, enjeksiyondan önce hücre canlılığını doğrulayın ve kullanım sırasında hayvan stresini en aza indirin.

Sonuç olarak, bu çalışma, NF1 ile ilişkili iyi huylu tümörleri incelemek için etkili bir klinik öncesi platform sunan yeni ve tekrarlanabilir bir ortotopik nörofibroma ksenograft modeli oluşturmaktadır. İnsan Schwann hücrelerini doğal sinir mikro ortamlarında kullanan bu model, gerçek zamanlı tümör izleme ve kontrollü terapötik müdahalelere olanak tanırken insan nörofibrom biyolojisini yakından taklit eder. Bu model, GEMM'ler ile hastadan türetilmiş modeller (PDX'ler) arasında önemli bir adımı temsil etmekte ve nörofibrom araştırma ve tedavisine klinik olarak daha uygun yaklaşımların önünü açmaktadır.

Gelecekteki iyileştirmeler, tümör mikroçevresinin rolünü incelemek için insanlaştırılmış fare modelleri gibi bağışıklık bileşenlerini entegre etmeyi amaçlamalıdır6. MRI veya PET taramaları da dahil olmak üzere görüntüleme yöntemlerinin genişletilmesi, BLI'yi yapısal ve metabolik içgörülerle tamamlayabilir22. Uzun vadeli nörofibrom gelişimini ve potansiyel malign transformasyon risklerini araştırmak için deneysel zaman çizelgelerinin uzatılması gerekli olacaktır. Bu platform, GEMM'ler ve PDX modelleri arasındaki boşluğu doldurarak NF1'deki translasyonel araştırmaları geliştirerek iyi huylu periferik sinir kılıfı tümörlerinde terapötik yenilikler için yeni fırsatlar sunuyor.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir finansal çıkar beyan etmemektedir

Teşekkürler

Bu çalışma Institut national du cancer (Inca_18828) tarafından desteklenmiştir. HistIM platformuna (Maryline Favier tarafından yönetilen) ve Institut Cochin'deki Pierre Sohier'e teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BuprenorfinBuprecareAmeliyat öncesi analjezi için
Isıtma matlarıANIPHYVI-653246Fare ameliyatı sırasında normotermiyi korumak için
hTERT NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78) hücre hattı Uygulamalı Biyolojik MalzemelerT0194Ölümsüzleştirilmiş insan NF1-null Schwann hücre hattı
İzofluranIso-VetBiyolüminesans görüntüleme sırasında fare anestezisi için
IVIS Lumina Serisi IIIRevvityBiyolüminesans görüntüleme için
KetaminKetamin 1000 VirbacFarelerde cerrahi anestezi için
Yaşayan İmaj YazılımıRevvityIVIS ile birlikteGörüntü alımı ve nicelik için
Luciferase Assay SistemiPromegaE1500BLI tespiti için
MeloksikamMETACAMSteroid olmayan anti-inflamatuar ilaç (NSAID)
Monofilament emilmeyen dikişETHILONF2419HKesiyi dikmek için
Şırınga için iğneHamiltonÖzel Yapıga33/12,7mm/PST4-12&DERECE;
NOD SCID gama (NSG) fareleri Charles Nehri614NSG
pLenti CMV Puro LUC (w168-1)Addgene17477Ateşböceği lusiferazının ifadesi için
Povidone iodé e dermique 10%Viatris330200775Cilt dezenfeksiyonu için topikal antiseptik
Bistüri bıçağıFST10015-00Ameliyat sırasında cilt kesisi için
Stereo Mikroskop L125LeicaSiyatik sinirdeki hücre enjeksiyon bölgesinin görselleştirilmesi için
Şırınga 10 & mikro; lHamilton1701RNsiyatik sinirin içine hücre enjeksiyonu için
XilazineRompun %2Farelerde cerrahi anestezi için

Kaynaklar

  1. Brems, H., Beert, E., De Ravel, T., Legius, E. Mechanisms in the pathogenesis of malignant tumours in neurofibromatosis type 1. Lancet Oncol. 10 (5), 508-515 (2009).
  2. Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
  3. Gutmann, D. H., et al. Neurofibromatosis type 1. Nat Rev Dis Primers. 3 (1), 17004(2017).
  4. Mazuelas, H., et al. Modeling iPSC-derived human neurofibroma-like tumors in mice uncovers the heterogeneity of Schwann cells within plexiform neurofibromas. Cell Rep. 38 (7), 110385(2022).
  5. Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nat Genet. 7 (3), 353-361 (1994).
  6. Radomska, K. J., et al. Cellular origin, tumor progression, and pathogenic mechanisms of cutaneous neurofibromas revealed by mice with Nf1 knockout in boundary cap cells. Cancer Discov. 9 (1), 130-147 (2019).
  7. Chen, Z., et al. Spatiotemporal loss of NF1 in Schwann cell lineage leads to different types of cutaneous neurofibroma susceptible to modification by the Hippo pathway. Cancer Discov. 9 (1), 114-129 (2019).
  8. Wu, J., et al. Plexiform and dermal neurofibromas and pigmentation are caused by Nf1 loss in desert hedgehog-expressing cells. Cancer Cell. 13 (2), 105-116 (2008).
  9. Li, S., Chen, Z., Le, L. Q. New insights into the neurofibroma tumor cells of origin. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i13-i22 (2020).
  10. Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. J Vis Exp. (49), e2558(2011).
  11. Jessen, W. J., et al. MEK inhibition exhibits efficacy in human and mouse neurofibromatosis tumors. J Clin Invest. 123 (1), 340-347 (2013).
  12. Jousma, E., et al. Preclinical assessments of the MEK inhibitor PD-0325901 in a mouse model of neurofibromatosis type 1: MEK inhibition in neurofibroma. Pediatr Blood Cancer. 62 (10), 1709-1716 (2015).
  13. Blanchard, Z., Brown, E. A., Ghazaryan, A., Welm, A. L. PDX models for functional precision oncology and discovery science. Nat Rev Cancer. 25, 153-166 (2024).
  14. Li, H., Chang, L. J., Neubauer, D. R., Muir, D. F., Wallace, M. R. Immortalization of human normal and NF1 neurofibroma Schwann cells. Lab Invest. 96 (10), 1105-1115 (2016).
  15. Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells. Am J Pathol. 158 (2), 501-513 (2001).
  16. Wu, M., Wallace, M. R., Muir, D. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient Schwann cells in culture and as syngrafts in Nf1 knockout mice. J Neurosci Res. 82 (3), 357-367 (2005).
  17. Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
  18. Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1: A consensus overview. Hum Pathol. 67, 1-10 (2017).
  19. Pundavela, J., et al. Stimulator of interferon gene facilitates recruitment of effector CD8 T cells that drive neurofibromatosis type 1 nerve tumor initiation and maintenance. Sci Adv. 10 (42), eado6342(2024).
  20. Fletcher, J. S., Pundavela, J., Ratner, N. After Nf1 loss in Schwann cells, inflammation drives neurofibroma formation. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i23-i32 (2020).
  21. Le, L. Q., Parada, L. F. Tumor microenvironment and neurofibromatosis type I: Connecting the GAPs. Oncogene. 26 (32), 4609-4616 (2007).
  22. Wu, J. C., Sundaresan, G., Iyer, M., Gambhir, S. S. Non-invasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice. Mol Ther. 4 (4), 297-306 (2001).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Nörofibroma ModeliOrtotopik Ksenogreftİnsan Schwann HücreleriTümör MikroçevresiBiyolüminesans GörüntülemePeriferik Sinir TümörüPreklinik Fare ModeliTümör Tutunması
Nörofibromatozis Tip 1 Nörofibromlar için Ortotopik Siyatik Sinir Ksenogrefti
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.