Method Article

Mikroakışkan Tabanlı Yüksek Verimli Dolaşımdaki Tümör Hücresi Sıralama ve Tek Hücre Dizileme Teknolojisi

DOI:

10.3791/68708

⸱

November 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Institute of Molecular Medicine, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler), kanserin ilerlemesi ve metastazının incelenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, CTC zenginleştirme ve tek CTC dizilimi için yüksek verimli, entegre bir protokol sunmakta, kontaminasyon ve dizileme maliyetlerini azaltırken yakalama verimliliğini ve CTC saflığını artırmakta, böylece hassas onkoloji araştırmalarını ve klinik uygulamaları ilerletmektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler), kanser metastazını, ilerlemesini ve nüksünü izlemek için umut verici bir biyobelirteç görevi görür. CTC tespitine odaklanan likit biyopsi teknikleri, non-invaziv yapıları ve tümör dinamiklerinin gerçek zamanlı izlenmesini sağlama yetenekleri nedeniyle önemli bir potansiyel göstermiştir. Bununla birlikte, geleneksel toplu CTC analizleri, CTC popülasyonları arasındaki içsel heterojenliği yakalamakta başarısız oluyor ve tümör biyolojisine ilişkin önemli bilgileri gizliyor. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), CTC heterojenliğinin yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunu mümkün kılarak, hassas onkoloji ve tümör ilerlemesine ilişkin mekanik çalışmalar için yeni fırsatlar sunar. Bu avantajlara rağmen, tek CTC dizilimi için mevcut metodolojiler, düşük geri kazanım oranları, emek yoğun iş akışları ve birden fazla manuel işleme adımıyla ilişkili kontaminasyon riskleri dahil olmak üzere verimsizliklerden muzdarip olma eğilimindedir. Bu sınırlamaları ele almak için, CTC zenginleştirme, saflaştırma ve tek hücre dizilimini birleşik bir iş akışında birleştiren entegre bir mikroakışkan protokol sunuyoruz. Yöntem, girdap karıştırma ve kümülatif immünomanyetik boncuk bağlamanın minimum hücre hasarıyla sağlam, yüksek verimli CTC izolasyonunu mümkün kıldığı, balıksırtı yapılı bir çip içinde dinamik olarak kontrol edilen manyetik yakalamayı kullanır. Lökosit antikoru kaplı mikroakışkan çip kullanılarak yapılan müteakip saflaştırma, hedef olmayan hücreleri etkili bir şekilde ortadan kaldırır ve negatif seçim yoluyla CTC saflığını daha da artırır. Son olarak, diferansiyel akış direnci ilkelerine göre tasarlanan yüksek hassasiyetli tek hücreli dizileme çipi, verimli tek hücreli yakalamayı ve benzersiz barkodlu mikro boncuklarla eşleştirmeyi kolaylaştırır. Bu yeni platform, Poisson dağıtımına dayalı yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden gelerek CTC kullanımını iyileştirirken mikro boncuk tüketimini ve dizileme maliyetlerini en aza indiriyor. Entegre protokolümüz, CTC yakalama verimliliğini, saflığını ve tek hücreli dizileme verimini önemli ölçüde artırarak onu klinik uygulamalar ve büyük ölçekli kanser araştırmaları için çok uygun hale getirir. CTC heterojenliğinin daha kesin ve ölçeklenebilir bir analizini mümkün kılan bu yöntem, erken kanser teşhisini, tedavi takibini ve metastazın mekanik çalışmalarını iyileştirme ve sonuçta hassas onkoloji alanını ilerletme potansiyeline sahiptir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör metastazı, primer tümör içindeki tümör hücreleri tarafından yayılma ile başlayan ve daha sonra uyku hali ve kolonizasyona uğrayan karmaşık ve çok fazlı bir süreçtir. Bu hücreler aşamalı olarak bazal membrandan daha derin dokulara istila eder ve daha sonra kan damarlarına veya lenfatiklere intravaze olur. Dolaşıma girdikten sonra, bu hücreler uzak organlara gidebilen dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler) haline gelir1. CTC'lerin ortaya çıkışı, uzak metastaz1 için tohum görevi gördükleri için metastatik kaskadda kritik bir adımdır. Son yıllarda, CTC bazlı likit biyopsi teknolojisi, prosedürün non-invaziv ve kullanışlı doğasının yanı sıra gerçek zamanlı dinamik izleme yeteneği de dahil olmak üzere yararları nedeniyle büyük ilgi görmüştür. Bu teknoloji, tümör biyolojisinin hassas, gerçek zamanlı ve kapsamlı değerlendirmesini kolaylaştırarak tedavi etkinliğinin izlenmesinde, nüksün tahmin edilmesinde ve tedavinin yönlendirilmesinde benzersiz avantajlar sunar 2,3,4. Ayrıca, çalışmalar CTC'lerin erken kanser, erken metastaz veya nüks gibi düşük tümör yükü evrelerinde bile periferik kanda bulunduğunu göstermiştir 5,6. Sonuç olarak, CTC likit biyopsisi, görüntülemeyle saptanabilen katı tümörlerle sınırlı olan geleneksel doku biyopsilerinin sınırlamalarının üstesinden gelir7. Erken kanser teşhisi, nüks ve metastaz izleme, tedavi rehberliği ve ayrıca tümör başlatma, ilerleme ve metastaz mekanizmalarını aydınlatmak için yeni bir bakış açısı ve teknolojik destek sağlar. Örneğin, periferik kandaki CTC'lerin sayısının, kanser hastalarında hem progresyonsuz sağkalımın hem de genel sağkalımın bağımsız bir belirleyicisi olarak hizmet ettiği ve daha yüksek CTC sayılarının daha kötü prognozu gösterdiği gösterilmiştir8. CTC sayılarındaki dinamik değişiklikler, tedaviyi takiben hastalığın ilerlemesi ve tümör yükü ile de yakından ilişkilidir 9,10.

Son çalışmalar, mikroakışkan bazlı teknolojilerin CTC'lerin izolasyonu için dönüştürücü araçlar olduğunu vurgulamıştır. Bu teknolojiler genel olarak fiziksel temelli ve biyolojik temelli yaklaşımlar olarak kategorize edilebilir ve her biri belirli zorluklarla karşı karşıya kalırken farklı avantajlar sunar. Fiziksel tabanlı yöntemler, CTC'leri ayırmak için boyut ve deforme olabilirlik farklılıklarına dayanır ve yüksek verimle etiketsiz ayıklamaya olanak tanır. Bununla birlikte, bu spesifik olmayan ayırma stratejisi, CTC'lerin doğal heterojenliği nedeniyle hem yakalama verimliliğini hem de saflığı tehlikeye atabilir. Örneğin, Lu ve ark. CTC zenginleştirme ve saflaştırma11 açısından çoğu geleneksel fiziksel tabanlı teknikten daha iyi performans gösteren, tuzak dizileriyle bir odak ayırma ve hız azaltma tasarımını entegre eden bir mikroakışkan çip bildirdi. Bununla birlikte, çip, klinik uygulamalar için yetersiz kalan beyaz kan hücrelerinin (WBC'ler) yalnızca 3-4 log tükenmesini sağladı. Öte yandan, immünoafinite bazlı CTC izolasyon stratejileri tipik olarak daha yüksek hedef hücre iyileşme oranı ve saflığı sunar. Bununla birlikte, yakalama molekülleri ve CTC'ler arasındaki bağlanma etkileşimi, genellikle bu tür yaklaşımların verimini sınırlar12,13. Buna göre, hem yüksek zenginleştirme verimliliğini hem de verimi dengeleyen bir izolasyon yöntemi, nadir CTC popülasyonlarına sahip klinik numunelerin etkili bir şekilde işlenmesi için gereklidir.

Ayrıca, CTC'ler arasındaki önemli heterojenlik, aşağı akış analizleri 10,14,15 için önemli bir zorluk teşkil etmektedir, çünkü geleneksel toplu CTC analizleri sıklıkla bireysel hücresel ayrımları gizlemektedir. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), CTC gen ekspresyonu heterojenliğinin kapsamlı moleküler düzeyde karakterizasyonunu kolaylaştırarak CTC'lerin sınıflandırılması, durumu ve işlevi hakkında bilgi sağlar. Bu teknoloji, hassas onkoloji için yeni yaklaşımlar sunar ve tümör başlatma, ilerleme ve metastaz mekanizmalarına yönelik araştırmaları kolaylaştırır16. Örneğin, Fan ve ark. hepatoselüler karsinom hastalarında çeşitli vasküler bölgelerden tek CTC transkriptomik atlas oluşturmuş, CTC'ler arasındaki uzamsal heterojenliği ortaya çıkarmış ve immün kaçışın anahtar aracılarını belirlemiştir17. Aynı zamanda, Miyamoto ve ark. prostat kanseri hastalarının CTC'lerinde androjen reseptör gen mutasyonlarını ve ek varyantlarını tanımladılar, böylece ilaç direncinin altında yatan mekanizmaları aydınlattılar18.

Bununla birlikte, tek CTC transkriptomik dizilemenin gelişimi yavaş ilerlemektedir. Mevcut metodolojiler, otomasyon ve entegrasyondaki eksikliklerden muzdariptir ve bu da düşük CTC geri kazanım verimliliği, karmaşık prosedürler ve düşük deneysel başarı oranları ile sonuçlanır19. Örneğin, mevcut protokoller CTC zenginleştirme, saflaştırma, tek hücre izolasyonu ve nükleik asit amplifikasyonunu içeren sıralı bir süreç gerektirir. Bu adımlar ayrı santrifüj tüplerinde gerçekleştirilir ve birden fazla pipetleme ve transfer adımı gerektirir. Emek yoğun prosedürler yalnızca verimliliği azaltmakla kalmaz, aynı zamanda CTC kaybı ve kontaminasyon riskini de artırır20. Kılcal tabanlı hücre toplama gibi geleneksel yaklaşımlar, tek hücre izolasyonu sırasında verimi ve analitik verimliliği daha da sınırlar21. Ayrıca, geleneksel yöntemler, hücrelerin rastgele kapsüllenmesini tanımlayan istatistiksel bir fenomen olan Poisson dağılımı tarafından da sınırlandırılmıştır. Bu, yüksek oranda boş damlacıklara veya damlacık başına birden fazla hücreye neden olur ve böylece yakalama verimliliğini sınırlar. Bu zorlukların üstesinden gelmek için araştırmacılar, tek hücreli CTC transkriptomik analizi için entegre mikroakışkan çipler geliştirdiler. Bu platformlar birden fazla adımı tek çipli bir iş akışında birleştirerek kontaminasyon risklerini azaltır ve analitik verimliliği artırır. Örneğin, Euisik Yoon ve ark. CTC'leri mikro odalara izole etmek ve tek tek CTC'leri benzersiz barkodlu mikro boncuklarla verimli bir şekilde eşleştirmek için akışkanlar dinamiği tabanlı boyut seçimini kullanan Hydro-Seq yöntemini geliştirdi22. Bu yaklaşım, birden fazla CTC'nin yüksek verimli, paralel tek hücreli analizini mümkün kılar.Bununla birlikte, bu yöntem boyuta dayalı CTC ayrımına dayanır ve bu da genellikle düşük CTC saflığı ve sınırlı verim (10 μL/dak) ile sonuçlanır ve bu da onu büyük hacimli klinik numunelerin işlenmesi için uygunsuz hale getirir. Bu nedenle entegre, yüksek verimli, düşük hacimli ve kirlenmeye dayanıklı tek hücreli CTC analiz sisteminin geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır.

Burada, CTC zenginleştirme ve tek hücreli dizileme için üç ana bileşenden oluşan yüksek verimli ve verimli bir protokol açıklıyoruz: CTC sıralama, saflaştırma ve tek hücreli dizileme çipi (Şekil 1). CTC ayırma mikroakışkan çipi, dinamik olarak düzenlenen manyetik yakalama kuvvetleri prensibine göre tasarlanmıştır (Şekil 2A). Balıksırtı yapısı içinde girdap karışımı yoluyla yüksek verimli CTC zenginleştirmesinin yanı sıra immünomanyetik boncuklar tarafından kümülatif yakalama sağlar. CTC'lerin tahribatsız salınımı daha sonra manyetik alanın hassas modülasyonu yoluyla elde edilir. Daha sonra, negatif seçim için lökosit antikoru kaplı mikrokanalların kullanıldığı ve yüksek oranda saflaştırılmış CTC'ler veren bir saflaştırma çipi kullanılır (Şekil 2B). Son olarak, Poisson dağılımının sınırlamalarının başarıyla üstesinden gelen ve verimli tek hücreli/kodlanmış mikroküre eşleştirme ve yakalamayı mümkün kılan, diferansiyel akış direncine dayalı yüksek verimli tek hücreli bir manipülasyon platformu kullanıldı (Şekil 3A). Mikro boncuk tüketimini ve dizileme maliyetlerini azaltırken CTC kullanımını önemli ölçüde artırır.

figure-introduction-1
Şekil 1: Mikroakışkan tabanlı CTC sıralama ve tek hücreli dizileme teknolojisinin şeması. Bu iş akışı, tümör hücrelerinin tümör lezyonlarından ayrıldığı, kan dolaşımına girdiği ve CTC'ler oluşturduğu süreci göstermektedir. CTC'leri içeren periferik kan veya lökopak örnekleri, CTC yakalama, saflaştırma ve scRNA-seq çipleri aracılığıyla sırayla işlenir ve sonuçta CTC'lerin transkriptomik dizilimi ve biyoinformatik analizi sağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Yöntem 1: Mikroakışkan bazlı CTC izolasyonu

  1. Balıksırtı çip (HB-çip) imalatı
    1. Ana kalıp hazırlama
      1. Temiz bir silikon gofret hazırlayın ve nemi gidermek için gece boyunca 135 derecede pişirin. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, yüzeyi etkinleştirmek için gofret 150 W'ta 1 dakika boyunca bir oksijen plazma temizleyici kullanarak işlemden geçirin.
      2. SU-8 fotorezist kullanarak bir destek sütunu dizisi (akış yönü boyunca #1'den #28'e kadar numaralandırılmış 28 sütun × 7 satır) oluşturmak için çipin ilk katmanını modelleyin. Sıkma kaplayıcıyı 10 sn boyunca 500 rpm'de, 55 sn için 2350 rpm'de ve 10 sn için 500 rpm'de sırayla çalışacak şekilde ayarlayın. Bu katmanın yüksekliğinin 50 μm olduğundan emin olun.
      3. Çözücüyü buharlaştırmak için ilk katmanı 65 °C'de 1 dakika, ardından 95 °C'de 20 dakika yumuşak pişirin. Oda sıcaklığına soğutun.
      4. İlk katmanı, ilgili destek sütunu tasarımına sahip bir fotoğraf maskesi kullanarak ortaya çıkarın. Maruz kalma dozunu 130 mJ/cm2 olarak ayarlayın.
      5. Pozlama sonrası pişirme işlemini 65 °C'de 1 dakika, ardından 95 °C'de 6 dakika gerçekleştirin.
      6. Soğuduktan sonra, çapraz bağlanmamış fotorezisti çıkarmak ve alt tabakayı elde etmek için SU-8 geliştiriciyi gofret yüzeyine dağıtın. 30 saniye boyunca su birikintisi yapmasına izin verin, ardından deiyonize su ile durulayın.
      7. İkinci SU-8 katmanını, adım 1.1.1.2'deki ile aynı sıkma parametrelerini kullanarak birinci katmanın üzerine döndürerek kaplayın. İkinci katmanı, kanal duvarına 45° açıyla, 100 μm oluk genişliği, 200 μm aralık ve döngü başına altı çıkıntı ile balıksırtı yapıları oluşturacak şekilde desenleyin. Bu katmanın yüksekliğinin de 50 μm olduğundan emin olun.
        NOT: Mikro yapı özelliklerinin (destek sütunu dizisi ve balıksırtı olukları dahil) ilgili tüm boyutlarını gösteren şematik bir diyagram Ek Şekil 1'de verilmiştir.
      8. Çözücüyü buharlaştırmak için ilk katmanı 65 °C'de 1 dakika, ardından 95 °C'de 20 dakika yumuşak pişirin. Oda sıcaklığına soğutun.
      9. Balıksırtı tasarımlı bir fotoğraf maskesi kullanarak ikinci katmanı ortaya çıkarın. Maruz kalma dozunu 130 mJ/cm2 olarak ayarlayın.
      10. Pozlama sonrası pişirme işlemini 65 °C'de 1 dakika, ardından 95 °C'de 6 dakika gerçekleştirin.
      11. Soğuduktan sonra, çapraz bağlanmamış bölgeleri çıkarmak ve iki katmanlı mikro yapının tamamını ortaya çıkarmak için SU-8 geliştiricisini kullanın.
    2. PDMS replika hazırlama
      1. Prepolimer ve çapraz bağlayıcıyı 10:1 ağırlık oranında birleştirerek PDMS karışımını formüle edin. Tek bir çip için karışımdan 10-15 mL hazırlayın.
      2. Karışımı ana kalıba dökün ve gazdan arındırarak sıkışan havayı ortadan kaldırın. Kalıbı 95 °C'de 30 dakika fırına koyarak PDMS'yi kürleyin.
      3. Kürlenmiş PDMS kopyasını kalıptan çıkarın. 1 mm çapında bir PDMS zımba kullanarak bir giriş ve bir çıkış oluşturun.
    3. HB çip düzeneği
      1. Oksijen plazma temizleyiciyi 3 dakika boyunca 150 W güce ayarlayın. Hem PDMS replikasını hem de önceden yapıştırılmış PDMS katmanını temiz bir cam slayt üzerinde işleyerek yüzeyleri etkinleştirin.
        NOT: PDMS polimer zincirlerinde Si-O bağlarının bolluğu nedeniyle, plazma aktivasyonu, PDMS ile cam, silikon gibi substratlar arasında kovalent bağlanmayı sağlar ve böylece talaş sızdırmazlığını kolaylaştırır.
      2. İşlenmiş PDMS yapılarını hizalayın ve sıkıca birbirine bağlayın. HB çipini sonlandırmak için destek sütunu dizisinin ve balıksırtı özelliklerinin cam alt tabaka ile tamamen entegre olduğunu onaylayın.
  2. İmmünomanyetik boncukların (IMB'ler) hazırlanması
    1. 25 μL yıkanmış ve yeniden süspanse edilmiş streptavidin ile modifiye edilmiş manyetik boncukları (SA-MB'ler) (1 μm) (mL başına ≈4 × 108 boncuk) 1 μg biyotinlenmiş EpCAM (Epitel Hücre Yapışma Molekülü) antikoru ile oda sıcaklığında 20 rpm'de döndürerek inkübe edin IMB'leri hazırlamak için 40 dakika.
    2. Manyetik bir rafta manyetik ayırmadan sonra, süpernatanı çıkarın ve boncukları 25 μL İzolasyon Tamponunda (%1 BSA, 2 mM EDTA, D-PBS) yeniden süspanse edin.
  3. İzolasyon çipi çalışması
    1. Manyetik boncuk süspansiyonunun 20 μL'sini 1-2 saniye içinde pipetleyin ve hava kabarcığı oluşmadığından emin olun.
    2. Çipi hemen bir mıknatısın üzerine dikey olarak yerleştirin ve boncukların rahatsız edilmeden 5 dakika dinlenmesine izin verin.
    3. Kan örneğini (periferik kan veya deneysel lökopak örnekleri) toplayın ve hemen bir şırıngaya 4 mL çekin, hava kabarcıklarının giderildiğinden emin olun. Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için çipin giriş ve çıkışını sıvıyla kapatın. Numune giriş ve çıkış tüplerini çipin içine yerleştirin.
      NOT: Biyolojik numuneleri işlerken temel kişisel koruyucu önlemlerin alındığından emin olun.
    4. Numuneyi 1,5 mL/saat akış hızına sahip şırınga pompasıyla enjekte edin.
    5. Numune yüklemesinden sonra, bağlanmamış hücreleri yıkamak için HB-çipine 0,2 mL/saat akış hızında 60 μL D-PBS enjekte edin.
    6. Mıknatısı çıkarın ve çipi yıkamak ve yakalanan tümör hücrelerini HB-çipinden serbest bırakmak için manuel olarak 1.5 mL BSA (D-PBS'de %5 w/v) enjekte edin.

2. Yöntem 2: Mikroakışkan bazlı CTC saflaştırması

  1. HB çip modifikasyonu
    1. Etanol içinde hacim fraksiyonu (v/h) %10 olan bir (3-Merkaptopropil) trimetoksisilan (MPTS) çözeltisi hazırlayın. HB-çipine hemen 20 μL MPTS çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    2. Susuz etanol ile bir kez durulayın ve 100 °C'de 1 saat kurutun.
    3. 0.5 mg/mL konsantrasyonda etanol içinde bir N-γ-maleimidobütiril-oksisüksinimid ester (GMBS) çözeltisi hazırlayın. Çipi 37 °C'ye soğutun, GMBS çözeltisini ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
      NOT: MPTS ve GMBS kullanırken daima eldiven, laboratuvar önlüğü ve maske takın. Bu reaktifler toksik ve mukozal tahriş edici özelliklere sahiptir ve iyi havalandırılmış bir alanda dikkatle kullanılmalıdır.
    4. ddH2O ile iki kez durulayın, ardından D-PBS ile iki durulama yapın.
    5. Hemen 15 μg/mL streptavidin (SA) ekleyin, oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    6. D-PBS ile iki kez durulayın.
    7. CD45 antikor tamponunu hazırlayın: %0.2 (a/h) BSA ve 20 μg/mL biyotinlenmiş CD45 antikoru, D-PBS ile hacme seyreltilir.
    8. Beyaz kan hücrelerinin negatif seçimi için HB-çipine 20 μL CD45 antikor tamponu enjekte edin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin, ardından D-PBS ile durulayın.
    9. %3 (a/h) BSA ve %0.05 (a/h) Tween-20 içeren bir bloke edici çözelti ekleyin, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Numune yüklemeden önce D-PBS ile durulayın.
  2. Örnek yükleme
    1. Numuneyi bir şırınga kullanarak aspire edin ve hava kabarcıklarının giderildiğinden emin olun. Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için çipin giriş ve çıkışını sıvıyla kapatın. Numune giriş ve çıkış tüplerini çipin içine yerleştirin.
    2. Numuneyi şırınga pompasıyla enjekte edin ve akış hızını 0,6 mL/saat'e ayarlayın.
    3. Sayım ve tek hücre dizilimi için saflaştırılmış tümör hücrelerini çıkıştan toplayın.

3. Yöntem 3: Mikro kuyu tabanlı tek hücreli barkodlama ve dizileme teknolojisi

  1. Reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması
    1. Talaş ön işlemi
      1. Çip girişine 200 μL 1x D-PBS ve %0.5 F-68 solüsyonu ekleyin.
      2. Çipi tutarken su banyosu sonikasyonu yapın. Tüm mikro gözenekli bölge boyunca kabarcıklar göründüğünde, çift kuyucuklardan kabarcıkları çıkarmak için 30 saniye boyunca sonikasyona devam edin.
    2. Barkodlu boncuk hazırlama
      1. Barkodlu manyetik boncukların stok çözeltisini iyice karıştırın ve 200 μL'yi bir santrifüj tüpüne aktarın. Çözelti berraklaşana kadar manyetik ayırma uygulayın ve süpernatanı atın.
      2. Barkodlu boncukları 500 μL TE-TW (10 mM Tris-HCl pH = 8.0, 1 mM EDTA, %0.01 Tween-20) ile iki kez yıkayın.
      3. Barkodlu boncukları 200 μL 20x TE (10 mM Tris-HCl pH = 7.5, 1 mM EDTA) ve 50 mM DTT çözeltisinde yıkayın ve yeniden süspanse edin, ardından buz üzerine yerleştirin.
    3. Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması
      1. Saflaştırılmış tümör hücrelerini 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin. Peleti 1 mL 1x D-PBS içinde yıkayın ve yeniden süspanse edin.
      2. Hücre sayımı yapın ve tek hücreli süspansiyonu buna göre hazırlayın. Numune yükleme hacmi, toplam 80.000 hücre (400 hücre/μL) ile 200 μL olmalıdır.
    4. 1x Salin Sodyum Sitrat (SSC), 0.5 M LiCl, %0.6 Triton X-100, 10 mM EDTA, 5 mM DTT ve 1 U/μL RNaz inhibitörü içeren hücre lizis tamponunu hazırlayın.
  2. Mikroakışkan çip çalışması
    1. Hücre Yakalama
      1. Tümör hücresi süspansiyonunun 200 μL'sini çipe (60000 çift kuyucuk) enjekte edin, ardından hücrelerin yerçekimi ile yakalama kuyucuklarına yerleşmesini sağlamak için renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde 10 rpm'de 5 dakika çalkalayın.
      2. Çipteki hücre süspansiyonunu iki kez yukarı ve aşağı yavaşça pipetleyin. Ardından, yakalanmayan hücreleri yeniden süspanse etmek ve tekrar yerleşmelerini sağlamak için çipi 5 dakika boyunca 10 rpm'de bir renk giderici çalkalayıcıya yerleştirin.
      3. Girişten 200 μL 1x D-PBS ve %0,5 F-68 solüsyonu ekleyin ve solüsyonu çıkıştan aspire edin. Çipin toplam üç yıkaması için iki kez tekrarlayın.
    2. Barkodlu boncuk yakalama
      1. Barkodlu boncuk süspansiyonunu yeniden süspanse edin, ardından 200 μL süspansiyonu hemen girişten çipe enjekte edin. 10 sn boyunca 20 rpm'de sallayın.
      2. Boncuk süspansiyonunu iki kez yavaşça pipetleyin, ardından 10 rpm'de 20 saniye çalkalayın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
      3. Barkodlu boncuk süspansiyonunu çıkıştan çekin, 200 μL 20x TE (pH = 7,5) ve 50 mM DTT çözeltisi ekleyin, ardından sıvıyı çıkıştan çekin. Toplam üç yıkama için bu adımı iki kez tekrarlayın.
    3. Hücre lizizi ve mRNA yakalama
      1. Girişten çipe yavaşça 200 μL hücre lizis tamponu ekleyin. Hemen ardından, ikili kuyucukları kapatmak için yavaşça 200 μL mineral yağ ekleyin.
        NOT: Kontaminasyonu önlemek için sızdırmazlık hemen yapılmalıdır.
      2. Talaş çıkışından atık haznesine akan çözeltiyi çıkarın. Çipi yatay olarak yerleştirin ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
    4. Barkodlu boncuk kurtarma
      1. Lizisten sonra, girişten yavaşça 200 μL 6x SSC ekleyin, atık sıvıyı çıkarın ve kalan çözeltiyi talaş çıkışından aspire edin.
      2. Çipi doldurmak için yavaşça 200 μL 6x SSC ekleyin. Bir mıknatısı çipin yüzeyine yakın tutun ve yakalama kuyularından barkodlu boncukları toplamak için yavaşça girişten çıkışa doğru hareket ettirin. Ardından, çözeltiyi ve barkodlu boncukları çipten 6x SSC ile önceden yüklenmiş bir santrifüj tüpüne hızlı bir şekilde aspire edin.
      3. 200 μL 6x SSC ile üç kez, ardından 1x RT tamponu ile bir kez yıkayın ( bkz.
  3. Ters transkripsiyon (RT), eksonükleaz I tedavisi ve PCR
    1. RT
      1. Barkodlu boncukları, 1 RT tamponu, 1 mM GTP, 1 mM dNTP,% 5 PEG 8000×, 2.5 μM Şablon Anahtar Oligo ( Malzeme Tablosuna bakınız), 1 U / μL RNaz İnhibitörü ve 10 U / μL ters transkriptaz içeren 100 μL ters transkripsiyon reaksiyon karışımında yeniden süspanse edin. Çözeltiyi 42 °C'de 120 dakika inkübe edin.
    2. Eksonükleaz tedavisi
      1. Ters transkripsiyondan sonra, boncukları bir kez 200 μL 1x TE-SDS (10 mM Tris-HCl pH = 8.0, 1 mM EDTA, %0.5 SDS), bir kez 200 μL 1x TE-TW ve bir kez 200 μL 10 mM Tris-HCl (pH = 8.0) ile yıkayın.
      2. Boncukları, 1x Eksonükleaz I Tamponu ve 1 U/μL Eksonükleaz I içeren 100 μL eksonükleaz karışımında yeniden süspanse edin ve 37 °C'de 45 dakika inkübe edin.
    3. İkinci iplik sentezi
      1. Boncukları bir kez 200 μL 1x TE-SDS ile yıkayın. Boncukları 200 μL 0.1 M NaOH içinde yeniden süspanse edin ve mRNA-cDNA hibrit ürününü denatüre etmek için oda sıcaklığında 30 rpm'de döndürülerek 5 dakika inkübe edin. Daha sonra boncukları bir kez 200 μL 1x TE-TW ve bir kez 200 μL 10 mM Tris-HCl (pH = 8.0) ile yıkayın.
      2. Boncukları, 1x RT tamponu, 1 mM dNTP,% 5 PEG 8000, 0.5 μM ikinci iplik sentez primeri (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 0.125 U/μL Klenow Fragmanı içeren 100 μL reaksiyon karışımında yeniden süspanse edin. Çözeltiyi 37 °C'de 60 dakika inkübe edin.
    4. cDNA amplifikasyonu
      1. Boncukları bir kez 200 μL 1x TE-SDS ile, bir kez 200 μL 1x TE-TW ile ve bir kez 200 μL 10 mM Tris-HCl (pH = 8.0) ile yıkayın.
      2. Boncukları, 1x PCR Reaksiyon Karışımı ve 0.8 μM ISPCR oligo dahil olmak üzere 150 μL PCR karışımında yeniden süspanse edin (bkz. PCR programını şu şekilde ayarlayın: 95 °C'de 3 dakika; 20 saniye boyunca 98 °C, 30 saniye boyunca 65 °C ve 3 dakika boyunca 72 °C'lik dört döngü; 20 saniye boyunca 98 °C, 20 saniye boyunca 67 °C ve 3 dakika boyunca 72 °C'lik sekiz döngü; 72 °C'de 5 dk.
      3. PCR ürününü, üreticinin talimatlarına göre DNA saflaştırması için 0,6x Katı Faz Tersinir İmmobilizasyon (SPRI) manyetik boncuklarla iki kez saflaştırın ve 20,5 μLH2O'da ayrıştırın. Floresan bazlı bir DNA niceleme testi kullanarak saflaştırılmış PCR ürününün konsantrasyonunu ölçün.
      4. 1x PCR reaksiyon karışımı ve 0.8 μM ISPCR oligo içeren bir PCR karışımı kullanarak saflaştırılmış PCR ürününün ikinci bir amplifikasyonunu gerçekleştirin ( bkz. PCR programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 3 dakika boyunca 98 °C; 20 saniye boyunca 98 °C, 20 saniye boyunca 67 °C ve 3 dakika boyunca 72 °C'lik beş döngü; 72 °C'de 5 dk.
      5. PCR ürününü, üreticinin talimatlarına göre DNA saflaştırması için 0,6x SPRI manyetik boncuklarla iki kez saflaştırın ve 20,5 μLH2O içinde ayrıştırın. Floresan bazlı bir DNA miktar tayini23 kullanarak saflaştırılmış PCR ürününün konsantrasyonunu ölçün.
    5. cDNA kitaplığı oluşturma
      1. Kitaplığı, üreticinin talimatlarına göre standart bir DNA kitaplığı hazırlama kiti ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile oluşturun.
      2. Kitaplığı N70X / P5 primer çifti kullanarak PCR ile büyütün ( bkz. PCR programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 3 dakika boyunca 72 °C; 30 saniye boyunca 98 °C; 98 °C'de 15 sn, 58 °C'de 30 sn ve 72 °C'de 3 dakika olmak üzere on iki döngü; 72 °C'de 5 dk.
      3. Üreticinin talimatlarına göre DNA saflaştırması için kitaplığı 0,6x SPRI manyetik boncuklarla saflaştırın ve 20 μLH2O içinde ayrıştırın. Floresan bazlı bir DNA niceleme testi kullanarak saflaştırılmış PCR ürününün konsantrasyonunu ölçün.
        NOT: Genel olarak, ≥ 2 ng / μL'lik bir nihai DNA kütüphanesi konsantrasyonu ve toplam ≥ 50 ng miktarı kabul edilebilir olarak kabul edilir24.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CTC yakalama arayüzünün montajı ve serbest bırakılması mikroskopi ile değerlendirilebilir. HB çipinin altındaki manyetik boncukların (MB'ler) manyetik alan altında düzgün bir şekilde dağıtılması başarılı montajı gösterirken, minimum veya hiç artık MB olmaması başarılı salınımı onaylar (Şekil 2C). Bu adım, yakalanan CTC'lerin verimini ve saflığını belirlemek için kritik öneme sahiptir. CTC izolasyon çipinin yakalama verimliliğini doğrulamak için bir ani artış deneyi gerçekleştirdik. Yüksek EpCAM ekspresyonuna (PC3 veya LNCaP) sahip az sayıda tümör hücresi, dolaşımda bol miktarda kan hücresinin varlığını simüle eden, düşük EpCAM ekspresyonu sergileyen büyük bir Jurkat hücresi popülasyonu içeren PBS'ye eklendi. CTC izolasyon çipi, hem 1 mL hem de 10 mL'lik numunelerden tümör hücrelerini verimli bir şekilde yakalayarak yüksek verimli ve verimli CTC sıralama yeteneğini gösterdi (Şekil 2D). IMB tabanlı yakalamanın özgüllüğünü değerlendirmek için, EpCAM antikor konjugasyonu olmayan SA-MB'lerle modifiye edilmiş bir kontrol çipi kullandık. Önemli tümör hücresi yakalamasının olmaması, IMB aracılı CTC izolasyonunun özgüllüğünü doğruladı (Şekil 2D).

Yakalama verimliliğine ek olarak saflık, CTC izolasyon platformlarını değerlendirmek için bir diğer kritik parametredir. Yakalama çipi veya tek başına saflaştırma çipi kullanılarak izole edilen tümör hücrelerinin saflığını ve ayrıca sıralı pozitif ve negatif seçim yoluyla elde edilen saflığı karşılaştırdık (Şekil 2E). Her iki çip de kontrol grubuna kıyasla tümör hücresi saflığını önemli ölçüde iyileştirdi ve CTC'leri izole etmedeki etkinliklerini gösterdi. Daha da önemlisi, hem pozitif hem de negatif seçimin birlikte kullanılması, tek bir yöntemin kullanılmasına kıyasla tümör hücrelerinin saflığını ve verimini daha da arttırdı.

CTC yakalama ve ayırma çiplerinin klinik ortamlardaki performansını daha fazla değerlendirmek için altı sağlıklı donörden periferik kan (PB) örnekleri topladık ve ani artış deneyleri yaptık. Klinik örneklerde CTC'lerin son derece düşük bolluğu göz önüne alındığında, her 10 mL PB örneğine yaklaşık 500-1000 LNCaP hücresi eklenmiştir. Toplanan tüm PB numunelerindeki WBC sayıları normal aralıktaydı (4-10 × 106 hücre/mL). Sonuçlar, CTC ayıklama sisteminin, klinik numuneleri işlerken bile tümör hücrelerinin yüksek yakalama verimliliğini ve saflığını koruduğunu göstermiştir (Şekil 2F-G ve Ek Şekil 2).

figure-results-1
Şekil 2: Balıksırtı yapılı CTC yakalama ve saflaştırma platformu. (A) CTC izolasyon çipinin iş akışı. İlk olarak, kararlı bir manyetik alan ve EpCAM antikor konjuge IMB'ler, yakalama arayüzünü birleştirir. Daha sonra, HB-çipi içindeki girdap karıştırma, CTC'ler ve IMB'ler arasındaki kütle aktarım verimliliğini artırarak birikmiş yakalamayı kolaylaştırır. Son olarak, manyetik alanın kaldırılmasıyla CTC'lerin nazikçe serbest bırakılması sağlanır. (B) CTC saflaştırma çipinin iş akışı. HB-çipi, negatif seçim antikorları ile modifiye edilir ve girdap karıştırma, lökosit-antikor etkileşimlerini daha da kolaylaştırır ve sonuçta yüksek oranda saflaştırılmış CTC'ler verir. Ölçek çubuğu, 100 μm. (C) Mikroskobik görüntüleme, yakalama çipinin başarılı bir şekilde monte edildiğini ve serbest bırakıldığını gösterir. (D) Çubuk grafikleri, kontrol olarak işlevselleştirilmemiş SA-MB'leri kullanarak farklı numune hacimlerinde izolasyon platformunun CTC yakalama verimliliğini karşılaştırır. Hata çubukları, ortalama ± SD, n = 3. (E) Çubuk grafikleri, yalnızca tek bir HB-çipi kullanılarak elde edilen CTC'lerin saflığını, sıralı yakalama ve saflaştırmaya tabi tutulanlarla karşılaştırır. Kontrol grubu, işlenmemiş CTC saflığını temsil eder. Hata çubukları, ortalama ± SD, n=3. (F) CTC izolasyon çipinde hücre tanımlaması. LNCaP hücreleri Hoechst ve Calcein ile boyanırken, kan hücreleri sadece Hoechst ile boyandı. Ölçek çubuğu, 100 μm. (G) 1 mL veya 10 mL periferik kan kullanılarak yapılan ani artış deneylerinde tümör hücresi saflığı ve yakalama verimliliği. Hata çubukları, ortalama ± SD, n = 3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İzole edilen tümör hücreleri daha sonra yüksek verimli tek hücre dizilimine tabi tutuldu. Protokolümüz, 60.000 iç içe geçmiş mikro kuyudan oluşan tek hücreli bir barkodlama sistemi içerir (Şekil 3A-B). Alttaki kare şeklindeki mikro kuyucuklar tek tek hücreleri yakalamaya yararken, üst mikro kuyucuklar boncuk yükleme için tasarlanmıştır. Her bir alt mikro kuyu, çoğu hücre tipi için uygun olan uzunluk, genişlik ve yükseklik olarak 25 μm ölçer. Üst altıgen kuyular, tipik olarak 30 ila 50 μm arasında değişen boncukları barındırmak için yazılı bir daire çapına ve 50 μm yüksekliğe sahiptir. Sistem, boyut dışlama mikro kuyucukları aracılığıyla hücre çiftleşmelerini önlerken, kümülatif yakalamaya dayalı hücre yakalama verimliliğini artırır. Hücre yükleme protokolünü optimize etmek için, farklı hücre giriş koşulları altında hücre yakalama verimliliğini ve mikro kuyu doluluk oranını araştırdık (Şekil 3C). Sonuçlar, hücre girdisinin arttırılmasının yakalama verimliliğini azaltmadığını gösterdi; daha ziyade doluluk oranını önemli ölçüde artırdı. 60.000 kuyucuklu yakalama çipi için, hücre girişi 80.000'e ulaştığında mikro kuyu doluluk oranı sabit kaldı ve ek girdiyle daha fazla artış göstermedi. Aşırı hücre yüklemesi nedeniyle çiftlerin oluşumunu en aza indirmek için en uygun girdi olarak 80.000 hücreyi seçtik. Şekil 3D'de gösterildiği gibi, tek hücreli barkodlama çipi %85,6 hücre ve %95,7 barkodlu boncuk doluluk oranına ulaşarak %81,9'luk bir eşleştirme oranı elde etti. Ek olarak, protokole göre birden fazla yerleştirme gerçekleştirildi, bu da kümülatif yakalama etkisi yoluyla yakalama verimliliğini ve eşleştirme oranını önemli ölçüde artırdı (Şekil 3D). Özellikle, hücreler ve boncuklar arasındaki doluluk oranlarında gözlemlenen fark, boncukların hücrelere kıyasla daha fazla yoğunluğuna ve kütlesine atfedilir, bu da onların yerçekimi altında mikro kuyucuklara daha verimli bir şekilde yerleşmelerini sağlar. Bu nedenle, optimize edilmiş yükleme koşulları altında, yaklaşık %80'lik bir eşleştirme doluluk oranı genellikle ideal kabul edilir.

figure-results-2
Şekil 3: Mikro kuyu tabanlı, yüksek verimli tek hücreli barkodlama ve dizileme teknolojisi. (A) Tek CTC dizileme protokolünün iş akışı. (B) Mikrokopi, mikroakışkan tek hücreli/barkodlu boncuk yakalama kuyusu yapılarını gösterir. Hücre yakalama, boncuk yakalama ve boncuk kurtarma işlemleri soldan sağa gösterilir. Ölçek çubuğu 30 μm. (C) Çizgi grafikleri, farklı hücre giriş koşulları altında tek hücreli barkodlama çipinin (60000 çift kuyu) hücre yakalama verimliliğini ve mikro kuyu doluluk oranını gösterir. (D) Optimize edilmiş hücre giriş koşulları altında hücrelerin ve barkodlu boncukların doluluk oranları ve karşılık gelen hücre-boncuk eşleştirme oranı. Sol ve sağ paneller, sırasıyla birden fazla yerleşme denemesi ve yalnızca tek yerleşme kullanan yakalama yaklaşımını gösterir. Hata çubukları, ortalama ± SD, n = 3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Son olarak, CTC sıralama ve scRNA-seq için entegre protokolü doğrulamak için PC3, LNCaP ve Jurkat hücrelerini tahmini 1:3:4000 oranında karıştırdık ve bunları tümör hücresi yakalama, saflaştırma ve tek hücre dizilimi için mikroakışkan çiplere yükledik. Verimli tümör hücresi izolasyon platformu sayesinde, oldukça saf EpCAM-pozitif tümör hücreleri elde ettik (Şekil 4B). Aynı zamanda, mikroakışkan tabanlı scRNA-seq çipi, t-Dağıtılmış Stokastik Komşu Gömme (t-SNE) analizi ile görselleştirilen sonuçlarla hassas hücre tipi profil oluşturma yeteneği gösterdi (Şekil 4A). Her biri benzersiz belirteçlerle ayırt edilebilen üç farklı hücre popülasyonunu başarıyla tanımladık (Şekil 4C). Ek olarak, nihai çıktıdaki hücrelerin oranları, saflaştırılmış girdininkilerle yakından eşleşti ve tek hücreli barkodlama işleminin tarafsız ve kontaminasyonsuz olduğunu doğruladı (Şekil 4B). Bir küme, TRBC1, IGLL1, CD1E ve CD3D'nin spesifik ekspresyonuna dayalı olarak Jurkat hücreleri olarak tanımlandı (Şekil 4D). Yol zenginleştirme analizi, bu sınıflandırmanın sağlamlığını daha da doğruladı (Şekil 4E). Ayrıca, iki prostat kanseri hücre hattı, diferansiyel olarak eksprese edilen genlere (DEG'ler) göre ayrı kümelere belirgin bir şekilde ayrıldı (Şekil 4F-G). PC3 kümesi, PC3 tarafından salgılanan mikroprotein olarak da bilinen mikroseminoproteinin (MSMP) yüksek ekspresyonu ile karakterize edildi. Öte yandan, LNCaP kümesi, NEDD4, CTNNA1 (α-katenin 1) ve RBBP7 gibi hücre yapışması, proliferasyonu ve pluripotensi ile ilgili belirteçleri benzersiz bir şekilde ifade etti.

figure-results-3
Şekil 4: Bir spike-in deneyi kullanılarak CTC sıralama ve tek hücre dizilemesinin doğrulanması. (A) Yakalanan ve saflaştırılmış hücrelerin hücre tipi profilini gösteren t-SNE grafiği. (B) Üç hücre tipinin oranlarını üç aşamada gösteren çubuk grafiği: ilk giriş, saflaştırma sonrası ve son dizileme çıkışı. (C) Farklı hücre kümeleri arasında benzersiz işaretleyici genlerin ekspresyonunu gösteren nokta grafiği. (D) Tüm hücrelerde TRBC1, IGLL1, CD1E ve CD3D ekspresyon seviyeleri. (E) Jurkat kümesinde diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin (DEG'ler) GO ve KEGG yolu zenginleştirme analizi. (F) Tüm hücrelerde NEDD4 ve MSMP'nin ekspresyon paternleri. (G) PC3 ve LNCaP kümeleri arasındaki DEG'leri gösteren yanardağ grafiği. Kırmızı noktalar, PC3'te yukarı regüle edilmiş genleri temsil eder; mavi noktalar, LNCaP'de yukarı regüle edilenleri temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ana karışımReaktifSon seyreltmeTampon türü
%0.5 F-68F-68 Serisi0.50%DEPC Arıtılmış Su
PBS1×
TE-TWTris-HCl (pH=8.0)10 milyon dakikaDEPC Arıtılmış Su
EDTA1 milyon
Ara-200.01%
×20 TE (pH=7,5)Tris-HCl (pH=7.5)200 milyonDEPC Arıtılmış Su
EDTA20 milyon
TE-SDSTris-HCl (pH=8.0)10 milyon dakikaDEPC Arıtılmış Su
EDTA1 milyon
SDS0.50%

Tablo 1: Tek CTC dizileme hazırlığı için reaktif karışımının bileşimi. Hızlı ve sorunsuz bir işlem sağlamak için çip işleminden önce hazırlanabilen scRNA-seq için gerekli reaktiflerin parçaları gösterilmektedir.

Ek Şekil 1: HB çipi için tasarım. (A) İki katmanlı mikroakışkan yapının şematik diyagramı. Üst: Balıksırtı yapısına sahip üst katman. Büyütülmüş bir ek, kanal duvarına göre 45°'lik bir açıyla yönlendirilmiş, 100 μm'lik bir oluk genişliği ve 200 μm'lik bir aralık ile balıksırtının ayrıntılı geometrisini gösterir. Alt: Akış yönü boyunca #1'den #28'e kadar numaralandırılmış bir destek sütunu dizisinden (28 sütun × 7 sıra) oluşan alt katman. (B) Balıksırtı çipinin yandan görünümü. Balıksırtı olukları 100 μm genişliğe sahiptir. Hem balıksırtı yapılarının hem de destek direklerinin yükseklikleri 50 μm'dir. (C) Balıksırtı çipinin üstten görünümü. Her bir destek direği 500 μm genişliğinde ve 1150 μm uzunluğundadır ve bitişik sütunlar arasında 550 μm boşluk vardır. (D) Fabrikasyon HB çipinin fotoğrafi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: CTC izolasyon çipinin çıkışından toplanan atık sıvıda bulunan floresan boyalı tümör hücrelerini ve kan hücrelerini gösteren temsili görüntü. LNCaP hücreleri Hoechst ve Calcein ile boyanırken, kan hücreleri sadece Hoechst ile boyandı. Ölçek çubuğu 100 μm. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo: Ters transkripsiyon ve kütüphane hazırlığında kullanılan oligonükleotid dizileri Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CTC'ler, kanser teşhisi, tedavi rehberliği ve tümör başlangıcı, ilerlemesi ve metastazı ile ilgili çalışmalar için değerli biyobelirteçler olarak hizmet eder25. Bununla birlikte, mevcut CTC izolasyon yöntemleri hem yüksek verimlilik hem de yüksek verim elde etmekte başarısız olmaktadır26. Ek olarak, CTC'lerin düşük salım verimliliği genellikle düşük saflık ve yüksek hücre hasarı ile sonuçlanır ve bu da aşağı akış analizleriyle uyumluluklarını sınırlar27. Burada, yüksek verimli CTC sıralama ve tek CTC dizilimi için üç ana prosedürden oluşan entegre bir protokol önerdik: CTC yakalama, saflaştırma ve scRNA-seq.

Bu mikroakışkan tabanlı platform esneklik ve ölçeklenebilirlik sunar. HB çiplerindeki paralel kanalların sayısı ve barkodlama çipindeki yakalama kuyuları, farklı numune gereksinimlerine göre ayarlanabilir, böylece yüksek verim talepleri karşılanabilir. CTC yakalama çipinde IMB'ler spesifik kanser türüne göre optimize edilebilir. Örneğin, prostat kanseri hastalarından alınan örneklerde IMB'ler, yakalama verimliliğini artırmak için EpCAM ve PSMA antikorlarından oluşan bir kokteylle işlevselleştirilebilir. Ayrıca, yalnızca EpCAM tabanlı yakalamaya güvenmek, epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) geçirmiş mezenkimal CTC'lerin kaybına neden olabilir. Bu sorunu çözmek için, farklı EMT aşamalarında CTC'leri yakalamak için ısı şoku proteini 70'e (HSP-70) veya hücre yüzeyi vimentinine (CSV) karşı ek antikorlar dahil edilebilir.

CTC yakalama ve saflaştırmaya yönelik HB çipleri mikroakışkan bazlı olduğundan, deneyler sırasında dikkatli kullanım önemlidir. Reaktifleri çip girişine sokmadan önce, tüm hava kabarcıkları giderilmelidir ve sıkışan havayı ortadan kaldırmak için hem giriş hem de çıkış kapatılabilir. Ek olarak, sıkışan hava kabarcıkları IMB'lerin ve hücrelerin geçişini engelleyerek yakalama verimliliğini ve saflığını önemli ölçüde azaltabileceğinden, reaktifler hızlı bir şekilde (1-2 saniye içinde) verilmelidir. Ayrıca, daha önce de belirtildiği gibi, IMB'lerin tekdüze dağılımı, başarılı CTC yakalama için kritik öneme sahiptir. IMB'ler yüklendikten sonra, manyetik alandaki değişikliklerin IMB dağılımını bozmasını önlemek için çip mıknatıs üzerine dikey olarak yerleştirilmeli ve en az beş dakika boyunca yerinde sabitlenmelidir. Özellikle protokolde belirtilen hücre yükleme akış hızının farklı numune türlerine göre optimize edilmesi gerekir. Örneğin, lökopak numuneleri yüksek seviyelerde lökosit konsantrasyonu ve viskozitesi sergiler. Akış hızı çok hızlıysa, CTC'ler ve IMB'ler arasındaki verimli etkileşimleri engelleyebilir, birikmiş manyetik yakalamayı önleyebilir ve dolayısıyla CTC saflığını azaltabilir. CTC izolasyon ve saflaştırma platformumuzun klinik kan numunelerinin işlenmesindeki performansını değerlendirmek için birkaç sağlıklı donörden PB topladık ve numunelere az sayıda LNCaP hücresi (mL başına yaklaşık 50-100 hücre) ekledik. Özellikle, platform PB örneklerinde tümör hücreleri için yüksek yakalama verimliliği ve saflık sergilemesine rağmen, performansı PBS tabanlı hücre örneklerinde gözlemlenenden biraz daha düşüktü (Şekil 2D, Şekil 2E ve Şekil 2G). Bu tutarsızlığın, PBS'ye kıyasla kanın daha yüksek viskozitesinden ve bol miktarda kırmızı kan hücresi ve trombositin varlığından kaynaklandığını düşünüyoruz. Bu nedenle, klinik kan örneklerini işlerken, performansı artırmak için kırmızı kan hücresi lizizi veya PBMC ekstraksiyonu gibi ön tedavi adımları düşünülebilir.

HB çiplerine benzer şekilde, mikroakışkan tabanlı tek hücreli barkodlama çipi, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkatli kullanım gerektirir. İlgili reaktiflerin çeşitliliği göz önüne alındığında, bazı reaktifler çip işlemlerine başlamadan önce önceden hazırlanabilir (Tablo 1). Hücreleri ve boncukları yüklerken, hücreler daha düşük yoğunluğa sahipken barkodlu boncuklar daha yoğun olduğundan, eşit dağılımı sağlamak için enjeksiyon hızının dikkatli bir şekilde kontrol edilmesi gerekir. Tipik olarak, hücre süspansiyonu 3~5 saniye boyunca yavaşça eklenmeli, ardından boncuk süspansiyonu 1~2 saniye içinde hızlı bir şekilde eklenmelidir. Hücreleri ve boncukları yükledikten sonra, iki tur aspirasyon ve dağıtım gerçekleştirin, ardından kümülatif yakalama işlemini tamamlamak için çipi bir çalkalayıcıya yerleştirin. Bu adım, doluluk oranını ve eşleştirme oranını iyileştirmek için kritik öneme sahiptir. Hücre lizizi sırasında, mikro kuyu yüzeylerini izole etmek ve kuyucuklar arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için bir yağ sızdırmazlık yöntemi kullanılır. Özellikle, mineral yağ, lizisten hemen sonra gecikmeden eklenmelidir. Lizis işleminden sonra, yüksek boncuk geri kazanım oranı sağlamak için mıknatısın girişten çıkışa yavaşça hareket ettirilmesiyle barkodlu boncuk geri kazanımı gerçekleştirilir. Gerekirse, bu adım birden çok kez tekrarlanabilir. Son olarak, santrifüj tüpünde kurtarılan manyetik boncuklar RT, ikinci sarmal sentezi, PCR amplifikasyonu ve kütüphane yapımına tabi tutulur ve ardından yeni nesil dizileme (NGS) yapılır.

Bu entegre mikroakışkan platform, klinik uygulamalar için önemli bir potansiyele sahiptir. CTC izolasyonunun verimliliğini ve verimini artırarak, düşük tümör yükü aşamalarında CTC tespitini arttırır ve CTC sayısını tümör evrelemesine bağlayan bir sınıflandırma modelinin oluşturulmasını sağlar. Bu ilerleme, kanser teşhisi, tedavi takibi, prognoz değerlendirmesi ve nüks tahmini için yeni bir yaklaşım sağlar. Ek olarak, CTC'lerin tek hücreli transkriptomik analizi, temel gen yolları, etkileşim ağları ve biyobelirteç genleri dahil olmak üzere temel moleküler özelliklerin tanımlanmasını sağlar. Bu analiz, erken kanser metastazını yönlendiren kritik faktörler hakkında bilgi sağlar ve metastatik lezyon oluşumunun altında yatan moleküler mekanizmaları ortaya çıkararak tekrarlayan veya metastatik kanserli hastalar için potansiyel terapötik hedefler sunar. Ayrıca, bu platform oldukça ölçeklenebilirdir. Belirli analitik gereksinimleri karşılayacak şekilde uyarlanabilir ve transkriptomik ve genomik dahil olmak üzere çoklu omik analizleri destekleyecek şekilde genişletilebilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 82227801) tarafından desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Merkaptopropil) trimetoksisilan Sigma Aldrich175617-100GMPTS çözümü
20& kez; SSC BufferSangon BiyoteknolojiB548109-0200
5& kez; RT BufferSangon BiyoteknolojiB610020-0500
Biyotinile CD45 monoklonal antikoreBioscience13-0459-822° derecede depolama C'den 8&Grad'a; C 
Biyotinile EpCAM monoklonal antikoreBioscience13-9326-822° derecede depolama C'den 8&Grad'a; C 
Sığır serum albümini (BSA)Sangon BiyoteknolojiA600332-01002° derecede depolama C'den 8&Grad'a; C 
DEKODER Karuş çipiDinamik Biyosistemler22031062° derecede depolama C'den 8&Grad'a; C 
DEKODER Karuş Reaktif KitleriDinamik Biyosistemler22032062° derecede depolama C'den 8&Grad'a; C 
DEPC Arıtılmış SuSangon BiyoteknolojiB501005-0500
D-PBSSangon BiyoteknolojiE607009-0500İçerisi: NaCl 136.89mM; KCL 2.67 mM; Na2HPO4 8.10 mM; KH2PO4 1.47 mM. pH=7.2-7.4 
DTTTermo BilimselR08612° derecede depolama C'den 8&Grad'a; C 
Dynabeads MyOne SA T1Invitrogen65602SA-MB'ler, 1 μ m
EDTASangon BiyoteknolojiB540625-05000,5 M, pH=8,0
KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKK26012&Times; PCR Reaksiyon Karışımı
Lityum klorür çökeltmesi Soln.InvitrogenAM94800.2 & mikro; m filtrelenmiş
N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide esterTermo Bilimsel22309GMBS çözümü
Plüronik F-68Sangon BiyoteknolojiA600749-0025
Qubit 1× dsDNA HS Test KitiTermo BilimselQ33231
SDS ÇözümüSangon BiyoteknolojiB648118-0100%10 SDS
StreptavidinSigma Aldrich1897302° derecede depolama C'den 8&Grad'a; C 
SU-8 fotorezistMicroChemSU-8 3050
SYLGARD 184 Silikon Elastomer KitiDow Corning4019862
Tris-HCl (pH 7.5)LEAGENENR00721 mol/L, pH=7.5, RNase serbest
Tris-HCl (pH 8.0)LEAGENENR00731 mol/L, pH=8.0, Rnase serbest
Triton X-100Sangon BiyoteknolojiA600198-0500
Trueprep DNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti V2 for Illumina VazymeTD502DNA kütüphanesi hazırlık kiti
Tween-20Sangon BiyoteknolojiA600560-0500
VAHTS DNA Temiz BoncuklarVazymeN411DNA arıtması için Katı Faz Geri Dönebilir İmmobilizasyon (SPRI) manyetik boncukları

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Metastasis. Cell. 186 (8), 1564-1579 (2023).">Gerstberger, S., Jiang, Q., Ganesh, K. Metastasis. Cell. 186 (8), 1564-1579 (2023).
  2. Circulating tumor cell number as a response measure of prolonged survival for metastatic castration-resistant prostate cancer: A comparison with prostate-specific antigen across five randomized phase iii clinical trials. J Clin Oncol. 36 (6), 572-580 (2018).">Heller, G., et al. Circulating tumor cell number as a response measure of prolonged survival for metastatic castration-resistant prostate cancer: A comparison with prostate-specific antigen across five randomized phase iii clinical trials. J Clin Oncol. 36 (6), 572-580 (2018).
  3. Digital circulating tumor cell analyses for prostate cancer precision oncology. Cancer Discov. 8 (3), 269-271 (2018).">Heitzer, E., Speicher, M. R. Digital circulating tumor cell analyses for prostate cancer precision oncology. Cancer Discov. 8 (3), 269-271 (2018).
  4. Efficacy of circulating tumor cell count-driven vs clinician-driven first-line therapy choice in hormone receptor-positive, erbb2-negative metastatic breast cancer: The stic ctc randomized clinical trial. JAMA Oncol. 7 (1), 34-41 (2021).">Bidard, F. C., et al. Efficacy of circulating tumor cell count-driven vs clinician-driven first-line therapy choice in hormone receptor-positive, erbb2-negative metastatic breast cancer: The stic ctc randomized clinical trial. JAMA Oncol. 7 (1), 34-41 (2021).
  5. Combination of circulating tumor cell enumeration and tumor marker detection in predicting prognosis and treatment effect in metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 6 (39), 41825-41836 (2015).">Chang, K., et al. Combination of circulating tumor cell enumeration and tumor marker detection in predicting prognosis and treatment effect in metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 6 (39), 41825-41836 (2015).
  6. Analysis of circulating tumor cells in prostate cancer patients at psa recurrence and review of the literature. Anticancer Res. 36 (6), 2975-2981 (2016).">Grisanti, S., et al. Analysis of circulating tumor cells in prostate cancer patients at psa recurrence and review of the literature. Anticancer Res. 36 (6), 2975-2981 (2016).
  7. Liquid biopsy for cancer: Review and implications for the radiologist. Radiology. 294 (1), 5-17 (2020).">Underwood, J. J., et al. Liquid biopsy for cancer: Review and implications for the radiologist. Radiology. 294 (1), 5-17 (2020).
  8. Circulating tumor cells (ctc) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett. 253 (2), 180-204 (2007).">Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (ctc) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett. 253 (2), 180-204 (2007).
  9. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).">De Bono, J. S., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  10. Characterising the phenotypic evolution of circulating tumour cells during treatment. Nat Commun. 9 (1), 1482(2018).">Tsao, S. C., et al. Characterising the phenotypic evolution of circulating tumour cells during treatment. Nat Commun. 9 (1), 1482(2018).
  11. A novel microfluidic device integrating focus-separation speed reduction design and trap arrays for high-throughput capture of circulating tumor cells. Lab Chip. 20 (22), 4094-4105 (2020).">Lu, C., et al. A novel microfluidic device integrating focus-separation speed reduction design and trap arrays for high-throughput capture of circulating tumor cells. Lab Chip. 20 (22), 4094-4105 (2020).
  12. Microfluidic-based technologies for ctc isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy. Int J Mol Sci. 23 (4), (2022).">Descamps, L., Le Roy, D., Deman, A. L. Microfluidic-based technologies for ctc isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy. Int J Mol Sci. 23 (4), (2022).
  13. All-in-one microfluidic chip for online labeling, separating, and focusing rare circulating tumor cells from blood samples followed by inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Anal Chem. 95 (37), 14061-14067 (2023).">Xu, Y., Chen, B., He, M., Cui, Z., Hu, B. All-in-one microfluidic chip for online labeling, separating, and focusing rare circulating tumor cells from blood samples followed by inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Anal Chem. 95 (37), 14061-14067 (2023).
  14. In situ single cell proteomics reveals circulating tumor cell heterogeneity during treatment. ACS Nano. 15 (7), 11231-11243 (2021).">Reza, K. K., et al. In situ single cell proteomics reveals circulating tumor cell heterogeneity during treatment. ACS Nano. 15 (7), 11231-11243 (2021).
  15. Nanoparticle-mediated binning and profiling of heterogeneous circulating tumor cell subpopulations. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 139-143 (2015).">Mohamadi, R. M., et al. Nanoparticle-mediated binning and profiling of heterogeneous circulating tumor cell subpopulations. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 139-143 (2015).
  16. Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity. Trends Cancer. 4 (4), 264-268 (2018).">Levitin, H. M., Yuan, J., Sims, P. A. Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity. Trends Cancer. 4 (4), 264-268 (2018).
  17. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of ctcs by single-cell rna-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).">Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of ctcs by single-cell rna-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  18. RNA-seq of single prostate ctcs implicates noncanonical wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).">Miyamoto, D. T., et al. RNA-seq of single prostate ctcs implicates noncanonical wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).
  19. Single-cell DNA and RNA sequencing of circulating tumor cells. Sci Rep. 11 (1), 22864(2021).">Kojima, M., et al. Single-cell DNA and RNA sequencing of circulating tumor cells. Sci Rep. 11 (1), 22864(2021).
  20. A facs-based novel isolation technique identifies heterogeneous ctcs in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 14, 1269211(2024).">Chauhan, A., et al. A facs-based novel isolation technique identifies heterogeneous ctcs in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 14, 1269211(2024).
  21. New method for counting and picking out single circulating tumor cells from microliter-volume samples for tumor progression surveillance and single-cell heterogeneity analysis. Anal Chem. 95 (12), 5232-5239 (2023).">Yu, H., Yang, C., Tai, Q., Gao, M., Zhang, X. New method for counting and picking out single circulating tumor cells from microliter-volume samples for tumor progression surveillance and single-cell heterogeneity analysis. Anal Chem. 95 (12), 5232-5239 (2023).
  22. Hydro-seq enables contamination-free high-throughput single-cell rna-sequencing for circulating tumor cells. Nat Commun. 10 (1), 2163(2019).">Cheng, Y. H., et al. Hydro-seq enables contamination-free high-throughput single-cell rna-sequencing for circulating tumor cells. Nat Commun. 10 (1), 2163(2019).
  23. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).">Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  24. Protocol for high-quality single-cell rna-seq from tissue sections with draql. STAR Protoc. 5 (2), 103050(2024).">Ikeda, H., et al. Protocol for high-quality single-cell rna-seq from tissue sections with draql. STAR Protoc. 5 (2), 103050(2024).
  25. Circulating tumor cells from enumeration to analysis: Current challenges and future opportunities. Cancers (Basel). 13 (11), (2021).">Yang, Y. P., Giret, T. M., Cote, R. J. Circulating tumor cells from enumeration to analysis: Current challenges and future opportunities. Cancers (Basel). 13 (11), (2021).
  26. Circulating tumor cell isolation for cancer diagnosis and prognosis. EBioMedicine. 83, 104237(2022).">Deng, Z., Wu, S., Wang, Y., Shi, D. Circulating tumor cell isolation for cancer diagnosis and prognosis. EBioMedicine. 83, 104237(2022).
  27. Aptamer-based detection of circulating targets for precision medicine. Chem Rev. 121 (19), 12035-12105 (2021).">Wu, L., et al. Aptamer-based detection of circulating targets for precision medicine. Chem Rev. 121 (19), 12035-12105 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circulating Tumor CellsMicrofluidic CTC IsolationSingle Cell SequencingLiquid BiopsyImmunomagnetic BeadsTumor Cell PurificationBarcoded MicrobeadsNegative SelectionHerringbone ChipPrecision Oncology

Related Articles