Yöntem makalesi

Glioblastoma hayvan modelinde interstisyel sıvının boylamasına koleksiyonu için beyin açık akışlı mikroperfüzyonun kullanımı

DOI:

10.3791/68748

⸱

23 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo, glioblastoma (GBM) gibi birçok merkezi sinir sistemi hastalığının temelini oluşturan hücreler arası iletişim, ölçülmesi ve karakterize edilmesi ile ünlüdür. Burada, GBM'nin uzunlamasına hayvan modelinde interstisyel sıvı bileşenlerini örneklemek için kullanılabilecek serebral açık akış mikroperfüzyon (cOFM) prosedürlerini açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıkları, karmaşık ve dinamik bir hücre arası iletişim ağı aracılığıyla ortaya çıkar. Glioblastoma (GBM), en yaygın ve agresif birincil beyin tümörü, bu karmaşıklığın simgesidir; hızlı ilerlemesi ve yıllar yerine aylarla ölçülen kötü prognozu vardır. GBM'nin biyolojisi, neoplastik ve stromal hücreler arasındaki karmaşık sinyal molekül değişimleriyle yönlendirilir ve bu da agresif hastalık ilerlemesini destekler. Burada, GBM fare modellerinde ayrıntılı bir beyin açık akış mikroperfüzyon (cOFM) protokolünü tanımlıyoruz; bu protokol, interstisyel sıvı (ISF) içindeki tümör mikroortam dinamiklerinin gerçek zamanlı uzunlamasına izlenmesini mümkün kılar. Yaklaşımımız, dayanıklı kılavuz kanül başlık montajlarının implantasyonunu, doğrudan kılavuz üzerinden intracerebral glioma nakleti için kullanımını ve metabolom ile proteomik LC-MS analizleri için yüksek hassasiyetli cOFM örneklerinin toplanmasını tanımlar. Önemli olarak, cOFM geleneksel mikrodiyalizin moleküler boyut sınırlamalarını aşmaktadır. GBM'nin ötesinde, cOFM metodolojisi, ilgili hayvan modellerinde etiyolojik ve tedaviye yanıtlı biyobelirteçler sağlama kapasitesiyle, nörodejeneratif, epileptik ve nöropsikiyatrik durumlar dahil olmak üzere çeşitli CNS bozukluklarına dönüştürücü içgörüler vaat ediyor.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıklarının araştırılması, interstisial sıvı (ISF) tarafından aracılık edilen karmaşık, çok modlu hücreler arası sinyal kullanımı nedeniyle ünlü bir şekilde zordur. Bu karmaşıklık özellikle glioblastoma (GBM) gibi beyin tümörlerinde belirgindir; burada hücrelerarası sinyaller hem neoplastik hem de stromal hücrelerarasında iletilir 5,6,7,8,9. Birçok durumda, metabolitler ve proteinli haberciler dahil olmak üzere çeşitli biyomoleküllerin anormal değişimi, MSS patolojilerinin temel etiyolojisine katkıda bulunur. Bu araştırma zorluku, özellikle GBM'de, ISF'nin moleküler bileşiminin zamansal olarak dinamik olması ve hastalık ilerlemesi boyunca ve girişimsel tedavilere yanıt olarak evrilmesi gerçeğiyle daha dakötüleşmektedir 10,11.

Geleneksel preklinik GBM araştırma yöntemleri arasında in vitro çalışmalar ve tek uç noktalı hayvan modelleri bulunur. Bu yaklaşımların doğası, tümör mikroçevresinin özelliklerini ve uzunlamasına zaman değişikliklerini yakalayamaları nedeniyle daha geniş klinik uygulanabilirliklerini sınırlar. 1980'lerin başında yapılan ilerlemeler, intraserebral mikrodiyaliz (cMD)12,13,14,15 geliştirilmesiyle bu bağlamsal sınırlamaları aşmıştır. 45 yıl öncesinden bu yana, cMD, yaşayan beyin içindeki interstisiyal sıvının (ISF) uzunlamasına örneklemesi için standart yöntem olarak kendinikanıtlamıştır 16. Bu, yüksek konsantrasyonlu ISF çözünürtücülerinin yarı geçirgen bir membrandan sürekli akan, düşük çözünmüş bir perfüzyone, genellikle yapay beyin-omurilik sıvısına (aCSF)17 dönüştürülmesiyle sağlanır. Bu yarı geçirgen zarlar, 20 kDa'dan 3MDa 18'e kadar yaygın moleküler ağırlıkta gözenek boyutu kesimlerine sahip çeşitli biyouyumlu polimerlerden oluşur. Bu minimal invaziv prosedür, metabolitler veya nörotransmitterler gibi küçük moleküllerden antikor gibi büyük proteinlere kadar çeşitli analitlerin boyunlamasına in situ toplanmasını sağlar. Ancak, cMD zarlarının yapısal gözenekliliği ve bileşimsel polimerlerinin adsorpsiyon yapısı, belirli biyokimyasal veya boyutsal özelliklere sahip lipidler veya antikorlar gibi analitlerin göreceli geri dönüşünü önemli ölçüde etkileyebilir(sırasıyla 19,20).

cMD zarlarının bu sınırlamasını aşmak için yapılan ilerlemeler, 2010'ların başında serebral açık akışlı mikroperfüzyon (cOFM)21'in geliştirilmesiyle başladı. cMD ile benzer genel prensipler altında çalışan cOFM, yarı geçirgen membranların getirdiği biyokimyasal sınırlamaları, yaklaşık 100 μmboyutunda düşük adsorpsiyonlu makroskopik açıklıklara sahip plastik kafes probuyla değiştirerek ortadan kaldırır. Çok sayıda rapor, peptit hormonları, nanokorlar/antikorlar, küçük lipofil tedaviler ve PEGilated lipozomlar19,22,23,24,25 gibi tespit edilebilir ISF bileşenlerinin toplanması sayesinde cOFM'nin cMD'ye göre daha iyi faydalandığını göstermiştir. cOFM rehber prob implantasyonuna fizyolojik doku reaksiyonunu inceleyen önceki raporlar, kan-beyin bariyerinin bütünlüğünün implantasyondan 15 gün sonra yeniden sağlandığını ve implantasyondan 30 gün sonra glial skarlık oluşmadığınıgöstermektedir 26. Mikrodiyaliz zarlarının makroskopik açıklıklarla değiştirilmesi nedeniyle, araştırmacılar cOFM rehber problarının immün eksikliği olan sıçanların beynine xenograftlenmiş glioma hücrelerinin enjekte edilmesini kolaylaştırma konusunda yenilikçi bir kapasite göstermiştir; böylece travmatik tümör aşılanması ve büyümesi doğrudan cOFM örneklemealanı 27 etrafında gerçekleşmektedir.

CNS patolojilerinin incelenmesinde cOFM'nin kullanımına ilişkin dikkate alınan değerlendirmeler, metodolojik sınırlamalarını hâlâ kabul etmelidir. ISF analizlerinin akan bir perfüzyona pasif difüzyon ve konveksiyonuna bağımlılığı nedeniyle, bu sınırlamalar analit konsantrasyonu ve örnekhacmi 18 etrafında şekillenir. Örneklenen ISF bileşenleri, toplanan cOFM perfüzyot içinde endogen seviyelere kıyasla seyreltilecektir; bu da birçok araştırmanın deneysel koşullar arasındaki göreceli analitoranlarını karşılaştırmasına yol açmıştır 28. Tipik akış hızları 0,1 μL/dakika ile 1,0 μL/dakika arasında değişir; bu da sadece 6 μL/s'den 60 μL/s'ye eşdeğerdir. Boru boşluğu boşluk süreleri hesaba katılırken, toplam örnekleme süresi de dikkate alınmalıdır. Bu özellikle, hayvan refahı endişelerinin dikkatle ele alınması gereken anestezi altındaki hayvanlarda cOFM toplamaları yapılırken önemlidir. Bu ve diğer hususların daha ayrıntılı bir açıklaması, cOFM geliştirme ekibinin29. önceki yöntemler raporunda mevcuttur.

Bu makalede, nörolojik hastalıkların çalışmasında uzunlamasına cOFM örneklemesini kullanmak için GBM üzerine odaklanarak güncellenmiş bir protokol sunuyoruz. Protokol, cOFM kılavuz kanül implantasyonu, tümör hücresi enjeksiyonu ve cOFM rehberi üzerinden naklet için adımlar ile uyanık, serbest hareket eden hayvanlarda iki cOFM örnekleme konfigürasyonunu içermektedir. cOFM ile ölçülen metabolom ve proteomik ISF bileşenleri üzerindeki tedavi etkilerini, örnekleme konfigürasyonunun analit konsantrasyonları üzerindeki etkisini ve cOFM yönlendirdiği tümör hücre implantasyonunun etkinliğini gösteren temsili verileri sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol kapsamındaki tüm hayvan prosedürleri, Northwestern Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanır (protokol kimliği: IS00021383) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Yönergelerine uyar. Bu protokol, hem erkek hem kadın C57BL/6J farelerinde en az 8-10 haftalık yaşta kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Bu protokolde kullanılan fare glioma hücre hattı CT2A, Boston Üniversitesi Seyfried Laboratuvarı tarafından sağlanmış ve steril doku kültürü koşullarına uygun olarak kültürlenip hazırlanmıştır.

1. Cerrahi planlama ve hazırlık

  1. Hayvan bilgisi: cOFM deneylerinde, tam büyüme ve gelişim için en az 8-10 haftalık fareler kullanın. Sabit konumlu kranial implantlar hala gelişmekte olan kafatası ve/veya beyinde doğru büyümeyi bozabilir veya yerinden çıkabilir.
  2. Cerrahi koordinat seçimi: İlgi alanının Bregma ile ilgili ortogonal koordinatlarını bulmak için bir hayvan beyin atlası kullanın. Örneğin, glioma hücre implantasyonları genellikle striatuma uygulanarak doğal GBM mikro ortamlarını en iyi şekilde çoğaltmak ve sonraki tümör gelişiminin etkinliğini maksimize etmek için yapılır. Bu protokolde kullanılan cOFM kılavuz implantasyon koordinatları medialateral (ML) = 2,5 mm, anteroposterior (AP) = 0 mm ve dorsoventral (DV) = 3,5 mm'dir.
    NOT: Stereotaktik koordinatlar fare türleri ve yaşları arasında değişebilir. Lütfen istenen cOFM rehber yerleştirmesini sağlamak için türlere ve stürlere özgü atlas koordinatlarını kullanın.
  3. Uygun cOFM bileşen konfigürasyonlarının seçimi: Uygun cOFM konfigürasyonları için bileşenleri, 2 mm ile 22 mm arasında değişen belirli toplam uzunluklarda, açık yüzey uzunlukları 1 mm ile 2 mm arasında sıralayın.
    NOT: Hayvanlar, tımar davranışları yaparken yanlış yerleştirilmiş cOFM kılavuz başlıklarını yerinden çıkarabilirler. Bu aktivite sırasında baş-montaj üzerindeki mekanik etkisini en aza indirmek için, kılavuzların amaçlanan DV koordinat mesafesinden 2 ila 3 mm'den fazla olmamasını öneririz.
  4. Deneysel hedefler için cerrahi ve örnekleme prosedürü zaman noktalarının planlanması: İlgi duyulan hastalık ve model özelliklerine bağlı olarak, cOFM ile ilgili prosedürlerin zamanlamasını ve sırasını dikkatlice planlayarak ilgili temel biyolojiyi en iyi şekilde inceleyin.
    1. Sağlıklı beyin ve tümör mikro ortamları arasındaki ISF bileşim farklılıklarını araştırıyorsanız, aynı hayvanda tümör implantasyonundan önce ve sonra cOFM örnekleme işlemleri yapın.
    2. Klinik müdahalelerin CNS patolojileri üzerindeki etkilerini araştırıyorsanız, kontrol veya deneysel tedavi alan paralel hayvan kohortlarında uygulamadan önce ve sonra cOFM örnekleme prosedürleri uygulanın.

2. cOFM rehberli yerleştirme ameliyatı

  1. cOFM kılavuz yerleştirme ameliyatı için cerrahi aletleri birleştirin ( Malzeme Tablosu) ve belirtilirse otoklavla sterilize edin.
  2. Cerrahi işyeri hazırlığı:
    1. Biyogüvenlik dolabını dezenfekte edin: Uygun şekilde dezenfekte edilmiş bir biyogüvenlik dolabında cerrahi işlemler yapın. Biyo-güvenlik kabini hava akışını aktive edin ve iç yüzeyleri kurumsal onaylı dezenfektan ve silme yöntemiyle temizleyin. Dolabın alt yüzeyini steril perdelerle kaplayın.
    2. Stereotaktik aletleri hazırlayın: Stereotaktik çerçeveyi dezenfektan ile temizleyin ve biyo-güvenlik kabine yerleştirin. Benzer şekilde, stereotaktik montajlı matkap ve kılavuz tutucuyu temizleyin ve dezenfekte edin ve biyo-güvenlik kabine yerleştirin.
    3. Cerrahi aşama ısıtma pedi: Stereotaktik cerrahi aşamada hayvan anestezi altındayken ek ısı sağlamak için bir ısıtma pedi kullanın. Isıtma pedinin yüzeyini temizleyin ve dezenfekte edin, ardından hayvanın yerleştirileceği stereotaktik çerçeveye yerleştirin. Isıtma pedini düşük ateşe getirin ve üstüne 1-2 steril perde koyun.
    4. Ek cerrahi aletler ve ekipmanlar yerleştirin: Biyo-güvenlik kabine aseptik olarak ek sterilize edilmiş ekipmanlar yerleştirin.
    5. Kurtarma kafesi kurulumu: Temiz bir kurtarma kafesini, mümkün olan en düşük sıcaklığa ayarlanmış bir ısıtma pedine yerleştirin. Her hayvanın tamamen iyileşene kadar bireysel bir iyileşme kafesine yerleştirilmesi gerekecek, bu nedenle toplam iyileşme kafesi sayısı ameliyat performansına ve iyileşme sürelerine bağlı olacaktır.
  3. Ameliyat öncesi hayvan preparatları ( Şekil 1A'da özetlenmiştir):
    1. Anestezi: Uygun anestezi derinliği sağlamak için kurumsal onaylı anestezi bileşikleri ve dozları uygulanır; pati sıkma refleks testi ile solunum derinliği/hızı kullanılarak yeterli anestezi sağlanır. Örneğin, ketamin - ksilazin kokteyli (100 mg/kg - 10 mg/kg, salin içinde) intraperitoneal enjeksiyonu, C57BL/6J fareleri için uygun anestezik derinliği elde etmek için yeterlidir.
    2. Analjezi: Ameliyat sonrası ve sonrası ağrı yönetiminde yardımcı olmak için kurumsal onaylı ağrı aljezik bileşikleri uygulanır. Örneğin, deri altı meloksikam enjeksiyonu (20 mg/kg, salin içinde) perioperatif ağrı yönetimi için uygundur.
    3. Tüy çıkarma (tıraş olma, depilatör krem): Elektrikli tıraş makinesi ve/veya kazıma kremi kullanarak kafatasının üstündeki ameliyat bölgesinden kılları alın. Temizleyici krem kullanıyorsanız, tahriş olmasını önlemek için ciltte çok uzun süre kalmadığından emin olun.
    4. Oftalmik merhem: Ameliyat sırasında korneanın kurumasını önlemek için her iki göze nazikçe göz merhemi sürmek için steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.
    5. Hayvanın stereotaktik çerçeveye yerleştirmesi: Hayvanı stereotaktik çerçeveye doğru şekilde yerleştirin; ısırık bloğuna kesici dişler yerleştirin, kulak çubuklarını kulak kanallarına sıkıca ama nazikçe yerleştirin ve burun kelepçesini hayvanın burun kemiğine sabitleyin ( Şekil 1B). Doğru konumlandırıldığında, hayvanın kafatası hareketsiz sıkıca sabitlenmelidir.
    6. Aseptik cerrahi alan hazırlıkları: Cerrahi bölgenin çevresindeki deriyi üç adet alternatif olarak alkol (etil veya izopropil-) ve povidon iyot ile silinerek kesi için aseptik dezenfekte edin.
  4. Kesi ve kafatası yüzeyi hazırlığı:
    NOT: Aşağıdaki tüm adımlar mümkün olduğunca aseptik şekilde yapılmalıdır. Bu amaçla, birincil hayvan cerrahı, kesiye devam etmeden önce standart laboratuvar eldivenlerinin yerine steril cerrahi eldiven giymelidir.
    1. Kesi yeri ve uzunluğu: Steril bir skalpel kullanarak kafatasının yüzeyi boyunca gözler arasından başlayarak kaudal olarak 8-10 mm uzanan sagittal orta hat kesi yapın ( Şekil 1C).
    2. Deri geri çekme: Orta hat kesisinden deriyi yan tarafa çekmek için steril forseps, pamuk uçlu aplikatörler ve/veya bisterli bıçak kullanın. Bregma ve Lambda'nın görünür olduğundan emin olun ve yoksa kesiyi uzatın.
    3. Periost kesisi: Periosteumda steril bir smace kullanarak bir kesi açın ve forsepsle dokuyu yan tarafa geri çekin.
    4. Hidrojen peroksit sürüntü: Kafatası yüzeyini, steril pamuk uçlu aplikatör ile uygulanan %1%-3 seyreltilmiş hidrojen peroksitle temizleyin ( Şekil 1D). Bu aynı zamanda sagittal, koronal ve lambdoid kranial dikişler aracılığıyla Bregma ve Lambda'nın tanımlanmasına yardımcı olur.
    5. Kendi kendine kazınan diş yapıştırıcısı: 0.3 mL ile 1.0 mL arasında bir insülin şırıngası kullanarak kafatasının yüzeyine 20-40 μL kendi kendine oyulan diş yapıştırıcısını eşit şekilde uygular ( Şekil 1D). Gravür için diş kürleme ışığı uygulayın. Kürlendikten sonra, steril pamuk uçlu aplikatörler ve tuzlu su kullanarak fazla yapışkan silinin.
      DIKKAT: Bond Force gibi kendi kendine kazıman diş yapıştırıcıları potansiyel olarak tehlikeli maddelerdir: yanıcı tehlikeler (GHS02: H225), sağlık tehlikesi (GHS07 ve GHS08: H315, H319, H317, H361fd, H336) ve çevresel tehlikeler (GHS09: H412). Tehlikeli atıkların doğru bertarafı için lütfen yerel ve kurumsal yönergelere uyun.
  5. Burr deliklerinin yerini bulma ve delinme:
    1. Mikromatkaba sterilize edilmiş 0,7 mm matkap ucu yerleştirin ve matkabı uygun tutucuyla stereotaktik çerçeveye takın.
    2. Bregma'yı sagital ve koronal dikişlerin kesişiminde bulun ve matkap ucunu oraya yerleştirmek için stereotaktik mikromanipülatörlerle bulun.
    3. Matkap ucunu cOFM kılavuz koordinatına (ML = 2.5, AP = 0.0) konumlandırın, matkapı 15.000 rpm'ye çekin ve DV mikromanipülatör kadranını ayarlayarak dikkatlice bir burr deliği açın (Şekil 1E). Sondaj sırasında kafatası kalınlığını sık sık gözlemleyerek alttaki beyne zarar vermeyi önleyin. Sondaj sırasında fizyolojik salin kullanarak kemik kalıntılarını temizleyin ve matkap ucu ile kafatası arasındaki ısıyı azaltın.
    4. Her çapa vidası koordinatı için delme prosedürünü tekrarlayın (Şekil 1E). Önerilen çapa vida konumları ML = 2.5, AP = -2.5 ve ML = -2.5, AP = -2.5'dir.
    5. Burr delikleri açıldıktan sonra, mikromatkap ve matkap tutucuyu stereotaktik çerçeveden ayırın.
    6. 30 G'lik bir iğne kullanarak cOFM kılavuz burr deliğinin altındaki dura mater'i nazikçe delin.
  6. Steril forseps ve uygun boyutta steril bir tornavida kullanarak ankraj vidalarını takın (Şekil 1F). Vida dişi perdesine bağlı olarak, vida bir ila iki dişli uzunluğu derinliğine yerleştirildiğinde sabitleme yeterlidir. Kortekse zarar vermemek için çapa vidalarını çok derin sürmemeye dikkat edin.
  7. cOFM kılavuzu ve cOFM sahte montajını kılavuz tutucuya ve stereotaktik çerçeveye monte edin. cOFM kılavuz ucunu burr deliğinin (ML = 2,5 mm, AP = 0,0mm) üzerinde Bregma'ya eşit DV yüksekliğinde konumlandırın ve cOFM kılavuzunu burr deliğinden doğru önceden belirlenmiş derinliğe 1 mm/dakika hızla yavaşça indirin ( Şekil 1F). Örneğin, cOFM kılavuz yerleştirme derinliği ve ardından tümör hücresi implantasyonu planlandığı DV = -3,5 mm'dir.
  8. Kafatasının yüzeyine çimentolama maddesi uygulayın; böylece hem cOFM kılavuzu hem de çapa vidalarının altındaki ve çevresindeki alanları ince, düzgün bir tabaka halinde kapladığından emin olun. Sonraki katmanları uygulamadan önce her bir çimentolaştırıcı maddeyi sertleştirmek için diş kürleme ışığı kullanın ( Şekil 1G). Her bileşen arasındaki kafatası yüzeyi kapalana, çapa vidaları tamamen kapalanana ve cOFM kılavuzunun altındaki oluk ve çevresine kadar olan alan kapalanana kadar çimentolama ajanı uygulamaya devam edin. Çimento ajanını kilitleme kamasının üzerine veya yakınına koymamaya dikkat edin.
    DIKKAT: Tetric EvoFlow gibi çimentolaştırıcı maddeler potansiyel olarak tehlikeli maddelerdir: sağlık tehlikesi (GHS07: H317, H319, H335, H360). Tehlikeli atıkların doğru bertarafı için lütfen yerel ve kurumsal yönergelere uyun.
  9. Kılavuz tutucuyu cOFM kılavuzundan ayırın ve mikromanipülatörün DV ayar düğmesiyle kılavuz tutucuyu yavaşça kaldırın. Mikromanipülatörü stereotaktik çerçeveden çıkarın.
  10. Önce kulak çubuklarını gevşedip çıkararak, burun kelepçesini gevşetip geri çekerek, ardından ısırık blokundan hayvanın kesici dişlerini kaldırarak hayvanı stereotaktik çerçeveden ayırın.
  11. Dikiş derisi, diş çimento ajanının üzerinde kapanarak cOFM kılavuz gövdesinin açıkta kalmasını sağlar. Poliglikolik asit (PGA) veya poliglaktin (Vicryl) gibi emilebilir 4-0 dikişler önerilir (Şekil 1H).
  12. Orijinal kesiye bitişik cilt bölgesine üçlü antibiyotik merhem uygulayın.
  13. Hayvan iyileşmesi ve desteği:
    1. Hayvanı izole bir kurtarma kafesine (her kafes başına bir hayvan) aktarın ve düşük sıcak bir ısıtma pedinden ek ısı verin.
    2. İsteğe bağlı: Hayvana iyileşmeyi hızlandırmak için anestezik bir ters ötü ver. Örneğin, fizyolojik salinle 1 mg/kg itipamezol enjeksiyonları anestezik iyileşme sürelerini yaklaşık 1 saatten yaklaşık 20 dakikaya hızlandırır.
    3. Hayvan yeterince bilinç kazanana ve sternum yatmasına kadar sürekli gözlem ve destek sağlayın. Hayvanları ameliyat ve anesteziden tamamen iyileşene kadar gözetimsiz bırakmayın.
    4. Hayvan tamamen iyileştikten sonra, diğer hayvanlarla birlikte ortak konut kafeslerine geri getirilebilir.
    5. Ameliyattan bir gün sonra, meloksikam gibi kurum tarafından onaylanmış bir analjezik uygulayarak ek ağrı aljezik desteği sağlayın (bkz. adım 2.3.2).
  14. cOFM kılavuz implantasyon ameliyatından sonra, kan-beyin bariyerinin tamamen iyileşmesi için hayvanlar üzerinde ek işlemler yapılmadan önce 14 günlük iyileşme süresi tanın.

3. cOFM rehberiyle intrakraniyal tümör hücre implantasyonu

  1. Hücre kültürü ve hazırlığı:
    1. Hücreleri hücre tipine özgü protokollere göre kültürleyin ve genişletin. Örneğin, CT2A gibi sinjenik fare glioma hücreleri, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin takviyeleriyle birlikte 10 cm kaplarda veya DMEM içeren T-75 şişelerinde yetiştirilebilir.
    2. Kültürlenmiş hücreleri hücre tipine özgü protokollere göre implantasyon için hazırlayın.
      1. Örneğin, sinjenik CT2A glioma hücrelerinde büyüme ortamını çıkarır, kısa süreliğine PBS ile yıkar ve hücreleri %0,05 Tripsin (0,53 mM EDTA ile) ile 37 °C'de 5 dakika kuluçka altına alın.
      2. Tripsini, %1 FBS içeren DMEM hacmiyle nötralize edin, hücreleri 15 mL konik bir tüpe aktarın ve 300 x g hassasiyetinde 5 dakika boyunca 4 °C'de pelet hücrelerine santrifüj yapın.
      3. Süpernatantı çıkarın ve hücre pelletini 1 mL PBS (veya fizyolojik salin) içinde yeniden süzülür. Manuel veya otomatik hemositometre ile mL başına toplam hücre sayısını belirleyin. Hücre süspansiyonunu tekrar 300 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve uygun miktarda PBS (veya salin) hacminde tekrar süspansiyona alın, böylece μL'de 50.000 hücre elde edin. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde yerleştirin ve implantasyona hazır hale getirilin (adım 3.5.2).
  2. Kraniyal tümör hücre implantasyonu ameliyatı için cerrahi aletleri bir araya getirin (Materyal Tablosu) ve belirtilirse otoklavla sterilize edilin.
  3. Cerrahi çalışma alanı hazırlığı
    1. Dezenfekte Edici Biyogüvenlik Dolabı: Bkz. Adım 2.2.1.
    2. Stereotaktik aletleri hazırlayın: Stereotaktik çerçeveyi dezenfektanlarla temizleyin ve biyo-güvenlik kabine yerleştirin. Benzer şekilde, stereotaktik şırınga tutucusunu temizleyin ve dezenfekte edin ve stereotaktik çerçeveye takın.
    3. 2.2.3.-2.2.5 adımlarını gerçekleştirin. kalan hazırlık adımları için.
  4. Ameliyat öncesi hayvan preparatları:
    1. 2.3.1., 2.3.2., 2.3.4. ve 2.3.5. adımları gerçekleştirin. hayvan hazırlığı için.
  5. Tümör hücresi implantasyonu:
    1. Şırınga ve infüzyon insert montajı ( Şekil 2'de özetlenmiştir)
      1. Flanşlı boru konnektörlerini en az 5 dakika %70 etanolde bekletin.
      2. Sterilize edilmiş 10 μL veya 25 μL gaz geçirmez cam şırtinganın ucunu, flanşlı boru konnektörünün bir ucuna yerleştirin.
      3. cOFM infüzyon girişini boru konnektörünün diğer ucuna yerleştirin.
      4. Şırınga-infüzyon yerleştirme montajını stereotaktik montajlı şırınge tutucuya sabitleyin.
    2. Şırınga-infüzyon insert montajına uygun miktarda hücre süspansiyonu yükleyin. Örneğin, 50.000 hücre/μL ile 3 μL hücre süspansiyonu yükleyerek hayvan başına toplam 150.000 hücre enjeksiyonu elde edilir.
    3. Dummy insert yerine infüzyon inserti ile değiştiriliyor:
      1. Kilitleme kamasını cOFM kılavuzundan ve dummy montajından çıkarmak için forseps kullanın, sonra cOFM mankeni kılavuzdan nazikçe kaldırın.
      2. Mikromanipülatörün ML ve AP ayar düğmelerini kullanarak şırınga-infüzyon insert montajını cOFM kılavuzunun üstüne yönlendirin. DV ayar düğmesini kullanarak infüzyon girişini dikkatlice cOFM kılavuzuna indirin ve kilitleme kamasını forsepsle sıkıca tekrar takarak yerine sabitleyin.
    4. Şırıngadan 1 μL/dakika hızında 3 μL hücre süspansiyonu enjekte edin. cOFM kılavuzu ve infüzyon girişinin çevresini dikkatlice inceleyin; böylece hücre süspansiyonu mekanizmasından dışarı çıkmadığından emin olun. Tüm hacim enjekte edildikten sonra, intrakraniyal basıncın dengelenmesi için ek 1 dakika bekleyin.
    5. İnfuzyon insertini sahte insert ile değiştirin.
      1. Kilitleme kamasını cOFM kılavuzundan ve infüzyon insert montajından çıkarmak için forseps kullanın, ardından mikromanipülatörün DV ayar düğmesini nazikçe ayarlayarak cOFM infüzyon insertini kılavuzdan kaldırın.
      2. cOFM mankenini kılavuza yerleştirin ve kilitleme kamasını forsepsle yeniden takarak yerine sabitleyin.
  6. Önce kulak çubuklarını gevşedip çıkararak, burun kelepçesini gevşetip geri çekerek, ardından ısırık blokundan hayvanın kesici dişlerini kaldırarak hayvanı stereotaktik çerçeveden ayırın.
  7. Hayvan iyileşmesi ve desteği:
    1. Hayvanı izole bir kurtarma kafesine (her kafes başına bir hayvan) aktarın ve düşük sıcak bir ısıtma pedinden ek ısı verin.
    2. İsteğe bağlı: Hayvana iyileşme süresini hızlandırmak için anestezik bir ters etkisi (örneğin atipamezol) verin, bkz. adım 2.13.2.
    3. Hayvan yeterince bilinç kazanana ve sternum yatmasına kadar sürekli gözlem ve destek sağlayın. Hayvanları ameliyat ve anesteziden tamamen iyileşene kadar gözetimsiz bırakmayın.
    4. Hayvan tamamen iyileştikten sonra, diğer hayvanlarla birlikte ortak konut kafeslerine geri getirilebilir.
    5. Ameliyattan sonraki gün, meloksikam gibi kurum tarafından onaylanmış bir analjezik uygulayarak ek ağrı aljezik destek verin (bkz. adım 2.3.2).
      NOT: Lusiferaz pozitif hücre hatları kullanılırsa, hücre implantasyonundan 1-2 hafta sonra tümör nakletinin başarısını doğrulamak için biyolüminesans görüntüleme (BLI) yapılabilir. Hayvan kürkü veya baş montajı gibi fiziksel özellikler tespit edilen lüminesansı engelleyebilirken, tümör varlığını veya yokluğunu kabaca tahmin etmek için kullanılabilir. Alternatif olarak, cOFM kılavuz yerleştirmesinde kullanılan çapa vidaları ferromanyetik olmayan ve MRI uyumlu ise, MRI yapılabilir.

4. Beyin interstisyel sıvının cOFM örneği

NOT: Pasif analit difüzyona bağımlılığı nedeniyle, cOFM örnekleri endogen ISF ortamına kıyasla seyreltilmiş analit konsantrasyonlarına sahiptir. Bu nedenle, örnek ölçümlerini yerinde 18 daha iyi yansıtacak şekilde kalibre etmek için daha önce birkaç yöntem önerilmiştir. Bu bölüm, iki farklı örnekleme modalitesini tanımlar. Adım 4.1. Üretici tarafından önerilen (buradan itibaren fraksiyonlu olarak adlandırılır) ve daha yüksek zamansal hassasiyet sunan, ancak analit konsantrasyonu pahasına konfigürasyon modunu tanımlar. Adım 4.2. Geliştirdiğimiz alternatif bir konfigürasyon modunu (buradan itibaren yeniden dolaşım olarak adlandırılır) ve zamansal çözünürlüğün azalması pahasına daha yüksek analit konsantrasyonu elde edebilen bir yöntemi detaylandırıyor.

  1. Fraksiyonlu cOFM örneklemesi ( Şekil 3A'da özetlenmiştir):
    1. Flaşlı boru konnektörlerini en az 5 dakika boyunca %70 etanolle bekletmek için boru ve örnekleme insertlerine tutmayı kolaylaştırın.
    2. Perfüzyon torbasını yeterli aCSF perfüzyörle doldurun. Örneğin, 680 μL hem 10 μL/dakika ile 20 dakikalık çizgi yıkaması hem de 1 μL/dakika ile 8 saat örnekleme için minimum yeterlidir. Ancak, perfüzyon torbasının çökmesini ve arızasını önlemek için minimum 2 mL hacmi önerilir.
    3. Hem itme hem de çekme boru hatlarını gaz geçirmez cam şırıngalarla uygun hacimde aCSF ile önceden doldurun. Örneğin, Evrensel İtme-Çekme Düşük Bağlı Boru Ünitesinin iç çapı 0,25 mm, bireysel boru uzunluğu ise 100 cm'dir. Bu, yaklaşık 1 μL/2 cm denktir ve dolayısıyla itici boru için yaklaşık 55 μL ve çekme borusunda 100 μL demektir.
    4. Borunun peristaltik bölümünü mikroperfüzyon pompasının pompa başlığına doğru şekilde takın, Şekil 3A'da gösterildiği gibi.
      NOT: Gerekirse ek talimatlar için BASi kullanım kılavuzuna bakınız.
    5. Perfüzyon torbasını Luer kilit konnektörünü kullanarak borunun itme bölümüne bağlayın (Şekil 3A, bileşen i).
    6. Örnekleme insertini flanşlı boru konnektörleriyle boru hatlarına bağlayın. Örnekleme girişi (daha uzun mil uzunluğu), perfüzyon torbası boru hattının karşısındaki itme borusunun çıkış ucuna bağlanmalıdır (Şekil 3A, sol üst). Örnekleme girişi çıkışı (daha kısa şaft), çekme borusunun giriş ucuna, perfüzyon torbası boru hattına paralel olarak bağlanmalıdır (Şekil 3A, sağ üst). Bağlı örnekleme insertini, sistem yıkama için 750 μL aCSF içeren steril bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
    7. Fraksiyon toplayıcı iğnesini flanşlı boru konnektörünle çekme boru çıkış hattına (örnekleme girişinin karşı ucu) bağlayın.
    8. Boru sistemindeki gaz kabarcıklarını çıkarmak için 20 dakika boyunca 10 μL/dakika ile bir tüp sistemi yıkaması yapın.
    9. Fraksiyon toplayıcı kurulumu:
      1. Fraksiyon toplama tüplerini etiketleyin ve tartın, her ağırlığı daha sonra karşılaştırmak ve toplanan örnek hacminin doğrulanması için nota edin. Tüpleri fraksiyon toplayıcı karuselinin ilgili yuvalarına yerleştirin.
      2. Kesirlik toplayıcıyı açın ve ayarları istenen değerlere ayarlayın. Örnek ayarlar arasında # örnekler, örnekleme süresi (m), gecikme (saatler), refrig soğutma ve _cannula modu bulunur.
        NOT: Ortotopik ISF ile hiç temas etmemiş çekme tüpündeki ölü alan sıvı hacminin atılması, yaklaşık olarak i) boru uzunluğu ve hacmi (OFM-PP2-100-LB için yaklaşık 2 cm/μL), ii) akış hızı ve iii) gecikme (saatler) ile hesaplanır. Bu parametreler, doğru kesirlik toplama için toplama sistemi kurarken dikkatlice dikkate alınmalıdır.
  2. Yeniden dolaştırılmış cOFM örnekleme ( Şekil 3B'de özetlenmiştir):
    1. Flaşlı boru konnektörlerini %70 etanolla ıslatarak boru ve örnekleme eklerine tutmayı kolaylaştırın.
    2. Gaz geçirmez cam şırıngalarla uygun hacimde aCSF ile çekilme boru hattını önceden doldurun.
    3. Borunun peristaltik bölümünü mikroperfüzyon pompasının pompa başlığına doğru şekilde takın.
    4. Örnekleme insertini flanşlı boru konnektörleriyle boru hatlarına bağlayın. Örnekleme girişi (daha uzun mil uzunluğu) çekme borusunun çıkış ucuna bağlanmalıdır. Örnekleme insert çıkışı (daha kısa şaft) çekme borusunun giriş ucuna bağlanmalıdır. Bağlı örnekleme insertini, sistem yıkama için 750 μL aCSF içeren steril bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
    5. Boru sistemindeki gaz kabarcıklarını çıkarmak için 20 dakika boyunca 10 μL/dakika ile bir tüp sistemi yıkaması yapın.
  3. Döner kafes sistemi kurulumu:
    NOT: Raturn Sistemi gibi dönen hayvan kafes sistemleri, itme ve çekme borusunun aşırı dolanmasını ve dolaşmasını önleyerek uyanık hayvan cOFM örneklemesini kolaylaştırır. Bu ayrıca, uyanık cOFM toplama oturumları sırasında tüplerin manuel çözülmesine gerek kalmayarak cOFM örneklemenin otomasyonuna da yardımcı olabilir.
    1. Temiz kafes yataklarını döner kafes zeminine eşit şekilde yerleştirin ve kafesi kolayca erişilebilen yiyecek ve su kaynaklarıyla donatın.
    2. Kafes döner kontrolörünü açın ve askı halatı döndürerek etkinliğini test edin. Kafes, tether'a verilen dönme yönüne göre ters dönmelidir. Dönme kontrolcüsünü, hayvan bağlamaya bağlanana kadar bekleme rejimine ayarlayın.
  4. Hayvanı cOFM sistemine bağlamak:
    NOT: Hayvanların cOFM sistemine bağlanması ve ayrılması, hayvan geçici izofluran anestezi altındayken en kolay şekilde gerçekleştirilir. Doğru şekilde yapılırsa, bu süreç hayvan başına 5 dakikadan fazla sürmez; Ancak, oftalmik merhem kullanımı şiddetle tavsiye edilir.
    1. Hayvan anestezisi: Hayvanı izofloran anestezi indüksiyon odasına yerleştirin. Anestezi 2 L/dakika oksijen akışı ve izofluran %3'e ayarlanarak başlayın. Hayvanı uygun anestezi seviyesine (hareketsiz, yaklaşık 1 nefes alma hızı ile ulaşana kadar gözlemleyin). Hayvanı indüksiyon odasından anestezi maskesine, 2 L/dakika oksijen akışı ve %3 izofluran ile ayarlanmış şekilde aktarın.
    2. Hayvan ceketi: Hayvanı uygun boyutta bir ceket içine yerleştirin, ön uzuvları kol deliklerinden tamamen geçirin ve ceketi hayvanın sırtına sıkıca sabitleyin ( Şekil 3C'de gösterilmiştir).
    3. Dummy insert'i örnekleme insertiyle değiştirmek: Kılavuz ve dummy mekanizmasından kilitleme kamasını bir çift forseps kullanarak çıkar ve mankeni dikkatlice kılavuzdan çıkar. Numuneyi nazikçe takın, kılavuza yerleştirin, sonra kilitleme kamasını tekrar takın.
    4. Hayvanı anesteziden çıkarıp döner kafes sistemine yerleştirin. Kafes trafını hayvan ceketine takın ve döner kafes sistemini aktive edin.
  5. cOFM örneklemesi yapılması:
    1. Mikroperfüzyon pompalarını 5 μL/da'ya ayarlayın ve cOFM örnekleme inserti kurulumundan kaynaklanabilecek mikro baloncukları çıkarmak için 2 dakikalık bir yıkama işlemi yapın.
    2. Mikroperfüzyon pompa ayarlarını pompa modu için doğru istenen akış hızına (örneğin, 1 μL/dakika) değiştirin.
    3. Pompa modunu etkinleştir. Fraksiyonlu cOFM örnekleme yapıyorsanız, fraksiyon toplayıcısını aktive edin.
    4. cOFM örneklemesinin ilk aşamalarında, gaz kabarcıklarının olmadığından emin olmak için itme ve çekme borusunu yakından gözlemleyin; çünkü bunlar makinenin düzgün işleyişini ve örnek toplama sürecini bozabilir ve hayvanı tehlikeye atabilir. Gaz kabarcıkları gözlemlenirse, sistem bileşenlerini durdurun, hayvanı cOFM sisteminden ayırın ve gaz kabarcıklarını borudan aCSF ile uzaklaştırın.
    5. cOFM örnekleme süreci boyunca, cOFM tüpleri ve hayvan davranışları hakkında ek sık gözlemler yapın. Hayvan davranışı ani sağlık değişiklikleri gösterirse, sistem bileşenlerini hemen durdurun ve hayvan sağlığı sorununu ele alın. Gerekirse kurum veteriner personeline danışın.
  6. Bir hayvanı cOFM sisteminden ayırmak:
    1. Dönen kafes sistemini devre dışı bırakın ve kafes bağını hayvan ceketinden ayırın.
    2. Hayvanı, örnekleme girişi ve cOFM tüpü hâlâ bağlı olarak izofloran anestezi indüksiyon odasına transfer edin. Anestezi 2 L/dakika oksijen akışı ve izofluran %3'e ayarlanarak başlayın. Hayvanı uygun anestezi seviyesine (hareketsiz, yaklaşık 1 nefes alma hızı ile ulaşana kadar gözlemleyin). Hayvanı indüksiyon odasından anestezi maskesine, 2 L/dakika oksijen akışı ve %3 izofluran ile ayarlanmış şekilde aktarın.
    3. Örnekleme insertini sahte insert ile değiştirin: Kılavuz ve örnekleme insert montajından kilitleme kamasını çıkarmak için bir çift forseps kullanın ve örnekleme insertini dikkatlice kılavuzdan çıkarın. Dummy insert'i nazikçe kılavuza geri takın, sonra kilitli kamayı tekrar takın.
    4. Kaplama çıkarma: Hayvan ceketinin arka tarafından bağlantı elemanlarını çıkarın ve ceketi hayvandan nazikçe çıkarın.
    5. Hayvan iyileşme ve gözlemi: Hayvanı izofloran anestezisinden çıkarıp temiz bir kurtarma kafesine yerleştirin; böylece hayvan tam olarak bilinç kazanana ve göğsü yatmasına kadar sürekli gözlem sağlanır. Hayvan tamamen iyileştikten sonra bir ev kafesine yeniden yerleştirilin.
  7. Örnek toplama ve depolama:
    1. Fraksiyonlu örnekleme:
      1. Fraksiyon toplama tüplerini fraksiyon toplayıcısından çıkarıp kısa süreli taşıma için buzun üzerine koyun.
      2. Her toplama tüpünü tartın ve numune hacmini doğrulamak için ön toplama ağırlığıyla karşılaştırın.
      3. cOFM örneklerinin aşağı akış analizlerine geçin veya uzun süreli depolama için -80 °C dondurucuya yerleştirin.
    2. Yeniden dolaştırılmış örnekleme:
      1. Çekme tüpünü cOFM örnekleme insert çıkışına (daha kısa şaft) bağlı bırakarak, kurulumun geri kalanından ayırın ve tüp ile örnekleme insertini yeni, temiz bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
      2. 1 mL ile 5 mL arasında steril bir şırıngaya steril 18G iğne takın ve hava ile doldurun.
      3. İğneyi, çekme tüpünün giriş ucundaki flanşlı boru konnektörüne dikkatlice yerleştirin.
      4. cOFM örnekleme insertinin mikrosantrifüj tüpünde kaldığından emin olarak, şırınga pistonuna bastırarak tekrar sirküle cOFM numune hacmini çekme tüpünden hava ile dışarı çıkarın. Tüm cOFM örneğinin çekme tüpünden mikrosantrifüj tüpüne atıldığından emin olun, şırıngayı ayırın ve gerekirse hava ile doldurun.
      5. Geri dolaştırılan cOFM örneğini kısa süreli taşıma için buz üzerine yerleştirin.
      6. Aşağı akış analizlerine geçin veya uzun süreli depolama için -80 °C dondurucuya koyun.
  8. cOFM numunesi aynı hayvanda tekrarlanırsa cOFM malzemelerinin saklanması:
    NOT: cOFM tek kullanımlık ürünlerin, örneğin örnekleme insertleri ve giriş/çıkış borusu gibi yeniden kullanımı üretici tarafından tavsiye edilmemektedir.
    1. cOFM push-pull borusunu yaklaşık 500 μL steril aCSF veya tuzlu suyla 10 μL/dakikadan fazla olmayan hızda yıkayın. Bunu %70 etanol içeren benzer 1-2 mL yıkama ile takip edin. Son olarak, 18G iğne ve flanşlı boru konnektörlü 5 veya 10 mL bir şırınga kullanarak boruyu hava ile temizleyin.
    2. cOFM örnekleme insertinin giriş ve çıkış tüplerini, gaz geçirmez cam şırınga, flanşlı boru konnektörle donatılmış gaz geçirmez cam şırınga ile 50 μL steril aCSF veya tuzlu su ile yıkamak. Bunun ardından %70 etanol içeren 50 μL ekleyin. cOFM örnekleme insertini boru konnektöründen ayırın ve %70 etanol içeren bir şişede tekrar kullanıma hazır olana kadar saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel başarıyı belirlemek için çeşitli değerlendirme önlemleri, temel patolojinin ve araştırma hayvan modelinin özel niteliğine bağlı olarak, ara veya doruk deneysel aşamalarda gerçekleşebilir. GBM biyolojisi incelemeleri için, biyolüminesans görüntüleme (BLI), cOFM rehber aracılı tümör hücre nakletinin etkinliği için ara değerlendirme ölçütü olarak kullanılabilir (Şekil 4A). Ancak, implante edilmiş baş-montajların fiziksel özellikleri, hayvanlar arasında...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde tanımlanan cOFM prosedürleri, patolojik dokunun ISF'nin endojen bileşenlerini uzunlamasına örnekleme yetenekleriyle CNS hastalıklarının incelenmesinde devrim niteliğinde değişiklik yapma potansiyeline sahiptir. Ancak, bu metodolojinin kullanımının araştırma başarısı, birkaç kritik adımın doğru şekilde uygulanmasına bağlıdır. Bunlardan en önemlilerinden biri cOFM kılavuz kanülünün doğru ve güvenli şekilde yerleştirilmesidir. Yanlış cerrahi işlemler veya yapışma stratejileri,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü 1R01NS096376, 1R01NS112856 ve P50CA221747 SPORE for Translatasyonel Yaklaşımlar için Beyin Kanseri (A.U.A.) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.7 mm Matkap ucuGüzel Bilim Araçları19008-07Burr deliği sondajı
1 ila 5 ml şırıngaBD#309646Yeniden dolaşımlı perfüzyon örnek retreival
18 G iğneBD#305195Yeniden dolaşımlı perfüzyon örnek retreival
30G iğneBD Ultra-Fine328438Delme durası
4-0 vicryl dikişleriDynarex9130Cerrahi kapanma
Alkollü mendillerFisherBrand22-363-750Cerrahi bölge cilt dezenfeksiyonu
Çapa vidalarıBASiMD-1310cOFM kafa montaj yerleşimi
Yapay beyin omuriliği sıvısı (aCSF)BASi (Joanneum)MD-2400ISF örnekleme
cOFM sahte insertBASi (Joanneum)cOFM-D- #cOFM kafa montaj yerleşimi
cOFM rehberiBASi (Joanneum)cOFM-GD-#- #cOFM kafa montaj yerleşimi
cOFM kılavuz tutucuBASi (Joanneum)OFM-STM-1cOFM kafa montaj yerleşimi
cOFM infüzyon insertiBASi (Joanneum)cOFM-I- #Hücre enjeksiyonu
cOFM kilitli kamaBASi (Joanneum)cOFM-LOCKcOFM kafa montaj yerleşimi
cOFM örnekleme eklemesiBASi (Joanneum)cOFM-S-XISF örnekleme
Pamuk uçlu aplikatörlerFisherBrane22363160Hidrojen peroksit uygulanarak sıvı emilimi
CT2A fare glioma hücre hattıSeyfried Laboratuvarı - Boston ÜniversitesiNAAşılanmış tümör hücreleri
Diş çimentolama ajanıIvoClar595953UScOFM kafa montaj yerleşimi
Diş kürleme ışığıHenry Schein5700253cOFM kafa montaj yerleşimi
Yıkıcı kremVeet3116875Cerrahi bölge tüy alma
Elektrikli tıraş makinesiWahl Clipper Corp. 8841Cerrahi bölge tüy alma
İnce uçlu forsepsGüzel Bilim Araçları5SFKesi, çapa vidasının yerleşimi
Flanşlı boru konnektörleriBASi (Joanneum)MD-1510Hücre enjeksiyonu
Fraksiyon toplama şişeleriBASi (Joanneum)MF-5281Fraksiyonlu örnek depolama
Gaz geçirmez cam şırınga (25 μ L)Hamilton80465Hücre enjeksiyonu
Hidrojen peroksit (%1-3)WalgreensNDC: 0363-0268-32Kafatası yüzey temizliği
İnsülin şırıngaları (0.3 ila 1.0 mL) ve 31G iğnelerleBD Ultra-Fine328438Anestezik ve ağrı aljezik uygulaması
Mikrosantrifüj tüpleriBasix02-682-002Yeniden dolaşımlı perfüzyon örnek retreival
Mikromatkap ve stereotaktik tutucuHarvard Aparatı75-1874Burr deliği sondajı
Fare ceketiLomirMJ 02Hayvanların döner kafes sistemine bağlantısı
OFM düşük bağlı boruBASi (Joanneum)OFM-PP2-100-LBISF örnekleme
OFM-Pump - Mikroperfüzyon pompasıBASi (Joanneum)MPP102-PCISF örnekleme
Oftalmik MerhemDechra211-38Peri-sugrical göz yağlanması
Pasifize metal örnekleme iğnesiBASi (Joanneum)MW-2310Fraksiyonlu örnek depolama
Perfusate poşetiBASi (Joanneum)OFM-BAGISF örnekleme
Fizyolojik tuzlu çözeltiICU Medical 0990-7983-03Kafatası yüzey temizliği, burr deliği deldirmesine yardımcı
Povidon-iyot sürüntleriPDI SağlıkSKU B40600Cerrahi bölge cilt dezenfeksiyonu
Prob tutucuStoelting51633
Soğutmalı fraksiyon toplayıcıBASi (Joanneum)MD-1201Fraksiyonlu örnek depolama
Döner kafes sistemiBASi (Joanneum)AMD-R RaturnUyanık cOFM örnekleme için otomatik muhafaza
Nesçer bıçakları ve saplarıFisher Scientific 22079693Kesim
TornavidacOFM kafa montaj yerleşimi
Kendi kendine kazınan diş yapıştırıcısı TokuyamaÇimentolaştırma ajanı için kafatası yüzeyi astarlama
Toplama şişeleri için silikon itmeli kapağıBASi (Joanneum)MF-5283Fraksiyonlu örnek depolama
Sterotaktik çerçeveStoelting51725

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shetty, A. K., Zanirati, G. The interstitial system of the brain in health and disease. Aging Dis. 11 (1), 200-211 (2020).
  2. Taoka, T., et al. Interstitial fluidopathy of the central nervous system: An umbrella term for disorders with impaired neurofluid dynamics. Magn Reson Med Sci. 23 (1), 1-13 (2024).
  3. Matsumae, M., et al. Research into the physiology of cerebrospinal fluid reaches a new horizon: Intimate exchange between cerebrospinal fluid and interstitial fluid may contribute to maintenance of homeostasis in the central nervous system. Neurol Med Chir (Tokyo). 56 (7), 416-441 (2016).
  4. Filannino, F. M., Panaro, M. A., Benameur, T., Pizzolorusso, I., Porro, C. Extracellular vesicles in the central nervous system: A novel mechanism of neuronal cell communication. Int J Mol Sci. 25 (3), 1629(2024).
  5. Marcus, H. J., Carpenter, K. L., Price, S. J., Hutchinson, P. J. In vivo assessment of high-grade glioma biochemistry using microdialysis: A study of energy-related molecules, growth factors and cytokines. J Neurooncol. 97 (1), 11-23 (2010).
  6. De Ruiter Swain, J., Michalopoulou, E., Noch, E. K., Lukey, M. J., Van Aelst, L. Metabolic partitioning in the brain and its hijacking by glioblastoma. Genes Dev. 37 (15-16), 681-702 (2023).
  7. Teer, L., Yaddanapudi, K., Chen, J. Biophysical control of the glioblastoma immunosuppressive microenvironment: Opportunities for immunotherapy. Bioengineering (Basel). 11 (1), 93(2024).
  8. De Boeck, A., et al. Glioma-derived il-33 orchestrates an inflammatory brain tumor microenvironment that accelerates glioma progression. Nat Commun. 11 (1), 4997(2020).
  9. Yeo, E. C. F., Brown, M. P., Gargett, T., Ebert, L. M. The role of cytokines and chemokines in shaping the immune microenvironment of glioblastoma: Implications for immunotherapy. Cells. 10 (3), 607(2021).
  10. Riviere-Cazaux, C., et al. Longitudinal glioma monitoring via cerebrospinal fluid cell-free DNA. Clin Cancer Res. 31 (5), 881-889 (2025).
  11. Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
  12. Lehmann, A., Isacsson, H., Hamberger, A. Effects of in vivo administration of kainic acid on the extracellular amino acid pool in the rabbit hippocampus. J Neurochem. 40 (5), 1314-1320 (1983).
  13. Sandberg, M., Lindstrom, S. Amino acids in the dorsal lateral geniculate nucleus of the cat--collection in vivo. J Neurosci Methods. 9 (1), 65-74 (1983).
  14. Tossman, U., et al. Brain amino acids measured by intracerebral dialysis in portacaval shunted rats. J Neurochem. 41 (4), 1046-1051 (1983).
  15. Zetterstrom, T., et al. Purine levels in the intact rat brain. Studies with an implanted perfused hollow fibre. Neurosci Lett. 29 (2), 111-115 (1982).
  16. Bourne, J. A. Intracerebral microdialysis: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  17. Darvesh, A. S., et al. In vivo brain microdialysis: Advances in neuropsychopharmacology and drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 6 (2), 109-127 (2011).
  18. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. Chapter 7 (Unit7), 1(2009).
  19. Altendorfer-Kroath, T., et al. Comparison of cerebral open flow microperfusion and microdialysis when sampling small lipophilic and small hydrophilic substances. J Neurosci Methods. 311, 394-401 (2019).
  20. Custers, M. L., et al. Applicability of cerebral open flow microperfusion and microdialysis to quantify a brain-penetrating nanobody in mice. Anal Chim Acta. 1178, 338803(2021).
  21. Birngruber, T., et al. Cerebral open flow microperfusion: A new in vivo technique for continuous measurement of substance transport across the intact blood-brain barrier. Clin Exp Pharmacol Physiol. 40 (12), 864-871 (2013).
  22. Kleinert, M., et al. Time-resolved hypothalamic open flow micro-perfusion reveals normal leptin transport across the blood-brain barrier in leptin resistant mice. Mol Metab. 13, 77-82 (2018).
  23. Le Prieult, F., Barini, E., Laplanche, L., Schlegel, K., Mezler, M. Collecting antibodies and large molecule biomarkers in mouse interstitial brain fluid: A comparison of microdialysis and cerebral open flow microperfusion. MAbs. 13 (1), 1918819(2021).
  24. Altendorfer-Kroath, T., et al. Quantification of the therapeutic antibody ocrelizumab in mouse brain interstitial fluid using cerebral open flow microperfusion and simultaneous monitoring of the blood-brain barrier integrity. Pharmaceutics. 15 (7), 1880(2023).
  25. Birngruber, T., et al. Enhanced doxorubicin delivery to the brain administered through glutathione pegylated liposomal doxorubicin (2b3-101) as compared with generic caelyx,((r))/doxil((r))--a cerebral open flow microperfusion pilot study. J Pharm Sci. 103 (7), 1945-1948 (2014).
  26. Birngruber, T., et al. Long-term implanted cOFM probe causes minimal tissue reaction in the brain. PLoS One. 9 (3), e90221(2014).
  27. Altendorfer-Kroath, T., et al. Atraumatic access to human glioblastoma in a xenograft animal model by cerebral open flow microperfusion. J Neurosci Methods. 393, 109893(2023).
  28. Stangler, L. A., et al. Microdialysis and microperfusion electrodes in neurologic disease monitoring. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 52(2021).
  29. Hummer, J., Altendorfer-Kroath, T., Birngruber, T. Cerebral open flow microperfusion to monitor drug transport across the blood-brain barrier. Curr Protoc Pharmacol. 85 (1), e60(2019).
  30. Sundheimer, J. K., et al. Experimental insights and recommendations for successfully performing cerebral microdialysis with hydrophobic drug candidates. Clin Transl Sci. 18 (5), e70226(2025).
  31. Altendorfer-Kroath, T., Hummer, J., Birngruber, T. In vivo monitoring of brain pharmacokinetics and pharmacodynamics with cerebral open flow microperfusion. Biopharm Drug Dispos. 44 (1), 84-93 (2023).
  32. Kreß, S., et al. Innovative platform for the advanced online monitoring of three-dimensional cells and tissue cultures. Cells. 11 (3), 412(2022).
  33. Bjorkli, C., et al. In vivo microdialysis in mice captures changes in alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers consistent with developing pathology. J Alzheimers Dis. 84 (4), 1781-1794 (2021).
  34. Gorska, A. M., et al. Evaluation of cerebrospinal fluid (csf) and interstitial fluid (isf) mouse proteomes for the validation and description of alzheimer's disease biomarkers. J Neurosci Methods. 411, 110239(2024).
  35. Pemmari, T., et al. Screening of homing and tissue-penetrating peptides by microdialysis and in vivo phage display. Life Sci Alliance. 8 (5), e202201490(2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Glioblastoma Fare Modelinterstisyel S v ToplamaT m r Mikro evresiBeyin T m r NakliBoylamsal rneklemeMetabolomik AnalizProteomik AnalizMikroperf zyon PompasBiyol minesans G r nt leme

İlgili makaleler