Araştırma makalesi

Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri Mutasyonlarının Hassas Tespiti için Mikro Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu

DOI:

10.3791/68770

⸱

29 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  , 
1The 2nd Department of Thoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, G719S, L858R, L861Q ve S768I gibi diğer tümör mutasyonlarını hızlı bir şekilde tanımlamak için genişletilebilen, damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR) kullanarak EGFR T790M mutasyonlarını hassas ve spesifik olarak tespit etmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küresel ölçekte, akciğer kanseri, kansere bağlı ölümlere birincil katkıda bulunmaya devam ediyor ve prevalansı böbrek kanserinden sonra ikinci sırada yer alıyor. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), bildirilen tüm akciğer kanseri vakalarının yaklaşık %80-85'ini oluşturur. EGFR genindeki T790M mutasyonu, epidermal büyüme faktörü reseptörü tirozin kinaz inhibitörlerine (EGFR-TKI'ler) karşı edinilmiş direncin yaygın olarak tanınan bir birincil belirleyicisidir. İlerleyici hastalık yaşayanların yaklaşık% 50-60'ında bu durumun varlığı gözlenmiştir. Bu nedenle, EGFR genindeki T790M mutasyonlarını tespit etmek için hızlı ve son derece duyarlı bir yaklaşımın uygulanması, küçük hücreli dışı akciğer kanserinin hızlı bir şekilde tanımlanması için gereklidir. Mevcut çalışmada, qPCR'nin duyarlılığından (1 × 102 kopya/ μL) 10 kat daha yüksek olan 10 kopya/μL'lik bir saptama limiti ile T790M mutasyonunu tespit etmek için ddPCR kullanıldı. Simüle edilmiş 15 örnek için ddPCR, qPCR kullanılarak analiz edildiğinde düşük seviyelerde olduğu gözlemlenen EGFR genindeki T790M mutasyonlarının varlığını tespit edebildi. EGFR geni içindeki T790M mutasyonlarının hızlı bir tespit yöntemi ile saptanması, uygunluğunu belirlemek için araştırılmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer kanseri, küresel olarak kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir ve genel olarak en yaygın ikinci malignitedir. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), bildirilen tüm akciğer kanseri vakalarının yaklaşık %80 ila %85'i gibi önemli bir çoğunluğunu oluşturmaktadır 1,2,3,4. EGFR mutasyonlarını barındıran ileri KHDAK tanısı alan hastalar için, yerleşik terapötik yaklaşım, birinci, ikinci veya üçüncü nesil epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) tirozin kinaz inhibitörlerinin (TKI'ler) uygulanmasını içerir5,6,7. Bununla birlikte, birinci veya ikinci nesil EGFR-TKI'lerle tedavi edilen çoğu hasta, sonunda ilaca karşı kazanılmış direnç geliştirir. Bu direnç sıklıkla, hastalık ilerlemesi yaşayan hastaların yaklaşık %50-60'ında bulunan EGFR genindeki T790M mutasyonunun varlığına atfedilir 8,9,10,11,12.

Geleneksel olarak, doku örneklerinden alınan tümör DNA'sındaki genetik anormallikler, floresan in situ hibridizasyon (FISH) veya yeni nesil dizileme (NGS) gibi teknikler kullanılarak tanımlanır13,14. Bununla birlikte, tümöre erişilememesi, kötü hasta sağlığı veya yetersiz tümör hücresi içeriği nedeniyle doku biyopsileri zor olabilir 15,16,17. Alternatif olarak, özellikle plazmadan alınan sıvı biyopsiler, dolaşımdaki tümör DNA'sını (ctDNA) tespit ederek sürücü mutasyonları tanımlamak için daha az invaziv bir yol sunar. Tümör hücreleri DNA'yı kan dolaşımına, plevral sıvıya, tükürüğe veya dışkıya dökerek genetik analiz için değerli bir kaynak sağlar18,19. ctDNA'nın genetik profili genellikle tümörün genetik yapısını yansıtır ve tümör heterojenliğinin kapsamlı bir görünümünü sunar - doğru tanı ve kişiselleştirilmiş kanser tedavisi için çok önemli bir faktördür20,21.

Dizileme, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), dijital PCR, denatüre edici yüksek performanslı sıvı kromatografisi (DHPLC), amplifikasyona dirençli mutasyon sistemi (ARMS) ve mutantla zenginleştirilmiş PCR (ME-PCR) dahil olmak üzere periferik kandaki EGFR mutasyonlarını tanımlamak için çeşitli teknikler arasında, mikro damlacık dijital PCR (ddPCR), ctDNA mutasyon tespiti için oldukça etkili bir araç olarak ortaya çıkmıştır22,23. Üstün hassasiyeti, hassasiyeti ve düşük bolluktaki mutasyonları yüksek doğrulukla tespit etme yeteneği onu diğerlerinden ayırır. Geleneksel PCR'den farklı olarak ddPCR, numuneleri binlerce damlacığa bölerek standart eğriler olmadan hedef DNA dizilerinin mutlak miktar tayinini sağlar. Bu, onu EGFR'deki T790M mutasyonu gibi nadir mutasyonları tespit etmek için son derece uygun hale getirir. ddPCR'nin avantajlarına rağmen, yaygın klinik uygulaması, numune hazırlama, sistem optimizasyonu ve qPCR gibi yerleşik tekniklerle karşılaştırmalı performans analizindeki zorluklar nedeniyle sınırlı kalmıştır. ctDNA mutasyon tespiti için ddPCR protokollerinin optimize edilmesinde, özellikle klinik benimseme için gerekli olan duyarlılık, özgüllük ve tekrarlanabilirlik ile ilgili kritik bir boşluk vardır.

Bu çalışmada, ddPCR'nin geleneksel qPCR yöntemlerine kıyasla ctDNA'daki EGFR T790M mutasyonunu tespit etmek için üstün duyarlılık ve güvenilirlik sunduğunu varsayıyoruz. Verimliliği artırmak için nükleik asit ekstraksiyon sürecini optimize etmeye odaklandık ve ardından mutasyon tespiti için ddPCR optimizasyonunu izledik. Ek olarak, simüle edilmiş numuneler kullanarak ddPCR ve qPCR performansını duyarlılık, özgüllük ve tekrarlanabilirlik açısından karşılaştırdık. ddPCR'nin potansiyelini sistematik olarak değerlendirerek, sıvı biyopsilerde EGFR mutasyon tespiti için qPCR'ye uygun ve üstün bir alternatif olarak kurmayı amaçlıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma insan katılımcıları, insan dokularını veya canlı hayvan deneylerini içermedi; bu nedenle, resmi bir etik onay gerekli değildi. Tüm prosedürler kurumsal ve ulusal yönergelere uygun olarak yürütülmüştür. T790M mutant plazmidi ticari olarak sentezlendi. Klinik numuneleri simüle etmek için kullanılan domuz kanı, canlı hayvan katılımı olmaksızın, hayvan refahı düzenlemelerine uygun olarak sertifikalı bir tedarikçiden elde edilmiştir. Manyetik boncuklar, primerler, problar ve PCR enzimleri dahil olmak üzere diğer tüm reaktifler ticari olarak tedarik edildi ve üreticiler tarafından talimat verildiği şekilde kullanıldı.

Nükleik asit ekstraksiyonu
Nükleik asit ekstraksiyonu, bir manyetik boncuk ekstraksiyon kiti ve tam otomatik bir nükleik asit ekstraktör aleti kullanılarak gerçekleştirildi. Standart prosedür, önceden paketlenmiş derin kuyu plakasının 1. veya 7. sütununa 200 μL numune ve 20 μL Proteinaz K eklenmesini içeriyordu. Daha sonra, kit ile birlikte verilen 15 μL manyetik boncuk sütun 2 veya 8'e eklendi. Ekstraksiyon programı, manyetik manşon belirlenen konuma yerleştirilerek cihaz üzerinde başlatıldı. Ekstraksiyondan sonra, kolon 6 veya 12'den gelen sıvı, 1.5 mL'lik yeni bir nükleaz içermeyen tüpe aktarıldı ve -20 °C'de saklandı.

Düşük konsantrasyonlu hedef nükleik asitlerin ekstraksiyonunu optimize etmek için optimizasyon deneyleri yapılmıştır. Önerilen ekstraksiyon parametreleri şunlardı: lizis sıcaklığı 70 °C, lizis süresi 10 dakika, üç yıkama çözeltisinin her biri için 1 dakika, 2 dakika kurutma ve 56 ° C'de 3 dakika elüsyon. En etkili parametreler sistematik olarak optimize edildi: lizis sıcaklığı (62 °C, 66 °C, 70 °C, 74 °C ve 78 °C), lizis süresi (1, 3, 5, 7 ve 9 dakika) ve manyetik boncuk boyutu (100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm ve 1000 nm). Bu optimizasyonlar, 1 × 105 kopya/μL'de T790M mutant plazmidi kullanılarak gerçekleştirildi. 100 nm manyetik boncuklar ekstraksiyon kiti ile birlikte verilirken, diğer partikül boyutları bir biyoteknoloji şirketinden elde edildi. Her bir ekstraksiyon koşulunun verimliliği, ekstrakte edilen numunelerin qPCR amplifikasyon eğrileri ve Ct değerleri analiz edilerek değerlendirildi. Bu sonuçların istatistiksel analizi, istatistik yazılımı kullanılarak yapılmıştır.

Standart plazmit DNA
EGFR geninin T790M mutant plazmidi, bir biyoteknoloji şirketi tarafından özel olarak sentezlendi. Dört mikrogram kuru plazmit tozu, 100 μL 1x TE Tamponu içinde yeniden süspanse edildi. Plazmit konsantrasyonu bir spektrofotometre kullanılarak belirlendi. Mikrolitre başına kopya sayısı aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı: Kopya sayısı/μL = [(6.02 × 1023) × (DNA konsantrasyonu (ng/μL) × 10-9)] / (660 × baz çiftlerinde DNA uzunluğu). Sentezlenen parçanın konsantrasyonu 1.26 × 109 kopya / μL idi. Bu stok plazmidi daha sonra 1 × 108 kopya / μL'lik bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için 126 kat seyreltildi.

Astar tasarımı ve sentezi
EGFR T790M mutasyonu için primerler ve bir TaqMan probu, standart primer tasarım ilkelerine dayalı olarak Primer 6 kullanılarak tasarlanmıştır. Yukarı akış astarı: 5'-CCTCACCTCCACCGTGC-3'; Aşağı akış astarı24: 5'-AGGCAGCCGAAGGGCA-3'; Prob: 5 "-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3". Tüm primerler ve problar, ticari bir oligonükleotid sentez servisi ile sentezlendi.

ddPCR ve TaqMan floresan kantitatif tespit sisteminin kurulması ve optimizasyonu
1 × 108 kopya/μL'lik bir T790M plazmit stoğu, ddPCR × qPCR sistem optimizasyon deneylerinde kullanılmak üzere 1× TE Tamponu kullanılarak 1 106 kopya/μL'ye seyreltildi.

ddPCR sisteminin optimizasyonu: ddPCR sistemi, enzim üreticisinin tavsiyelerine göre optimize edildi. İlk önerilen sistem şunları içeriyordu: 7.5 μL 4x PCR karışımı, 1.2-3 μL yukarı akış primeri (10 μM), 1.2-3 μL aşağı akış primeri (10 μM), 0.3-1.8 μL prob (10 μM), 1-15 μL DNA şablonu ve 30 μL'lik nihai hacme kadar nükleaz içermeyen su. Önerilen amplifikasyon döngüsü, 95 ° C'de ilk 10 dakika, ardından 94 ° C'de 30 sn ve 55-65 ° C'de 60 s'lik 40 döngü içeriyordu. Tavlama sıcaklığı (55-61.8 °C), primer konsantrasyonu (1-3 μL), prob konsantrasyonu (0.75-1.75 μL) ve şablon konsantrasyonu (3-15 μL) sistematik olarak optimize edildi. Optimizasyon sonuçları istatistik yazılımı kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi.

qPCR sisteminin optimizasyonu: qPCR sistemi, enzim üreticisinin tavsiyelerine göre optimize edildi. İlk önerilen sistem şunları içeriyordu: 5 μL Taq polimeraz, 0.45 μL 250 mM MgCl2, 0.5-2.5 μL ileri primer (10 μM), 0.5-2.5 μL ters primer (10 μM), 0.5-2.5 μL prob (10 μM), 5 μL DNA örneği ve 25 μL'lik nihai hacme kadar nükleaz içermeyen su. Önerilen amplifikasyon programı 95 ° C'de 5 dakika idi; ardından 95 ° C'de 15 s'lik ve 56-64 ° C'de 30 s'lik 45 döngü, 56-64 ° C'de floresan toplama ile. Tavlama sıcaklığı (56-64 °C), primer konsantrasyonu (1-3 μL), prob konsantrasyonu (0.5-2.5 μL) ve şablon konsantrasyonu (1-5 μL) optimize edildi. Bu sonuçların istatistiksel analizi, istatistik yazılımı kullanılarak yapılmıştır.

ddPCR ve Taqman floresan kantitatif PCR duyarlılık testi
ddPCR'nin qPCR'ye karşı duyarlılığını değerlendirmek için, 1 × 108 kopya/μL T790M plazmidi, 106 ila 101 kopya/μL arasında değişen bir konsantrasyon gradyanı oluşturmak için 1x TE Tamponu kullanılarak 10 kat seri olarak 10 kat seyreltildi. ddPCR için, optimize edilmiş ddPCR sistemine göre, negatif kontrol de dahil olmak üzere her konsantrasyon için bir tane olmak üzere yedi reaksiyon çözeltisi hazırlandı. Numuneler bir mikro damlacık jeneratör çipine yüklendi ve mikro damlacıklar oluşturmak için bir damlacık oluşturma cihazı ile işlendi. Bu damlacıklar daha sonra bir PCR termal döngüleyici kullanılarak amplifiye edildi ve ardından bir dijital PCR tespit cihazı ile analiz edildi. Aynı zamanda, optimize edilmiş qPCR sistemine dayalı olarak, aynı şablonlarla yedi reaksiyon çözümü hazırlandı. Bunlar, iki yaklaşımın ilgili duyarlılıklarını değerlendirmek için gerçek zamanlı bir PCR cihazında çalıştırıldı (n = 3).

ddPCR tekrarlanabilirlik testleri
Tekrarlanabilirliği değerlendirmek için, 1 × 108 kopya/μL'de standart T790M plazmit DNA'sı, yüksek (1 × 106 kopya/μL), orta (1 × 104 kopya/μL) ve düşük (1 × 102 kopya/μL) konsantrasyon standartları oluşturmak üzere seyreltildi. Optimize edilmiş ddPCR sistemine göre altı reaksiyon çözeltisi hazırlandı. Numuneler bir mikro damlacık jeneratör çipine yüklendi ve mikro damlacıklar oluşturmak için bir damlacık oluşturma aracı ile işlendi. Mikro damlacıklar daha sonra bir termal döngüleyici kullanılarak amplifiye edildi ve bir dijital PCR tespit cihazı ile analiz edildi. Negatif bir kontrol dahil edildi. Deney üç nüsha halinde gerçekleştirilmiştir. Tekrarlanabilirlik, amplifikasyon profilleri karşılaştırılarak ve üç deneysel tekrardan varyasyon katsayısı (CV) değerleri hesaplanarak değerlendirildi.

Analog numune testi
T790M mutasyon ddPCR ve qPCR sistemlerinin güvenilirliğini test etmek için, sırasıyla yüksek ve düşük konsantrasyonlarda T790M mutasyon standart plazmitleri ile rastgele karıştırılmış domuz kanı kullanıldı ve negatif örnekler olarak karışık standart plazmitler içermeyen domuz kanı kullanıldı ve 15 simüle edilmiş örnek rastgele hazırlandı ve simüle edilmiş örneklerden nükleik asit ekstrakte edildi, ve sırasıyla ddPCR ve qPCR yöntemleri kullanılarak tespit edilmiştir.

İstatistiksel analiz
Tüm deneyler en az üç teknik kopya halinde gerçekleştirildi. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. İstatistiksel analizler GraphPad Prism 10 programı kullanılarak yapılmıştır. Gruplar arasındaki farklılıklar Student t-testi veya tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak analiz edildi. P değerinin 0.05'ten küçük olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nükleik asit ekstraksiyonunun optimizasyonu
EGFR T790M mutasyonunu tespit etmek için ddPCR tabanlı iş akışı, Şekil 1'de şematik olarak özetlenmiştir. İlk olarak, en uygun lizis sıcaklığını belirledik. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, 66 °C'lik bir bölünme sıcaklığı, en verimli bölünmeyi gösteren en küçük ortalama Ct değerini vermiştir. Bu nedenle, sonraki deneyler için 66 °C seçildi. Daha sonra, belirlenen 66 ° C'lik optimum sıcaklıkta lizis sü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dünya çapında kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedeni olan akciğer kanseri, tıbbi araştırmalarda her zaman odak noktası olmuştur. Bu çalışmada, akciğer kanserinin tanısı, tedavisi ve prognozu hakkında daha derin bilgiler sağlamayı amaçlayan birçok kritik yönünü araştırıyoruz. Akciğer kanseri için kesin tanı ve tedavinin temel taşı doğru genetik testlerdir. Zhao ve ark.25 tarafından gösterildiği gibi, geleneksel genetik testler büyük ölçüde yüksek kaliteli doku ö...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yunnan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı ve Kunming Tıp Üniversitesi uygulamalı temel araştırma ortak özel projesi, 202101AY070001-134

YAZAR KATKISI
Youming Lei ve Guoli Lv bu çalışmaya eşit derecede katkıda bulundular ve ilk yazarlardır. Youming Lei ve Guoli Lv çalışmayı tasarladı ve tasarladı. Qingmei Yang, veri toplama ve analizine katkıda bulundu. Jin Duan ve Yunfei Shi, veri analizini ve yorumlamasını denetledi, el yazmasını revize etti ve yayınlanacak son versiyonu onayladı. Tüm yazarlar son makaleyi okumuş ve onaylamıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1&kez; TE TamponuSangon BiotechB548144DNA seyreltme için kullanılan Tris-EDTA tamponu
4 kez; Unimix-U enzim karışımıTargetingOne BioUNIMIXU-4XddPCR enzim karışımı
A300 Hızlı Termal DöngüleyiciLongGeneA300PCR amplifikasyonu
Biyoçip analizörüSEED BioDigitalPCR-DijitalPCR için Biyoçip Tespit sistemi
Damla İşaretleyici Numune HazırlamaXinyi BiyoteknolojiDijital PCR Platformu TD-2Mikro damlacıkların hazırlanması
Manyetik Boncuk Nükleik Asit EkstraksiyonKiti LemnisCare TeknolojisiMXP-1005Nükleik Asit Ekstraksiyonu Mikro
damlacık jeneratör çipiTargetingOne BiotechMG-Chip-01ddPCR için mikro damlacıklar oluşturmak için kullanılır
NanoDropAllshengNC-500Numune ekstraksiyonundan sonra nükleik asit konsantrasyonu ölçümü
NanoDrop ND-500 spektrofotometreAllsheng AletlerND-500Spektrofotometre
PCR cihazı A300 Hızlı Termal DöngüleyiciLongGeneA300PCR amplifikasyonu için termal döngüleyici
Primerler ve TaqMan probuSangon BiotechT790M tespiti için özel sentezlenmiş Primerler ve TaqMan
probu qPCR cihazı Gentier miniTianlong TeknolojisiGentier miniGerçek zamanlı PCR enstrüman
T790M mutasyon plazmidTsingke biyolojiT790MStandart Eğri ve Tespit Limiti Testi
Cihazı DNA miktar tayini için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boustany, Y., et al. Advanced non-small cell lung cancer: EGFR mutation analysis using pyrosequencing and the fully automated qPCR-based IdyllaTM system. Cancer Control. 30, 10732748231177538(2023).
  2. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  3. Harkati, I., Hilali, M. K., Oumghar, N., Khouchani, M., Loukid, M. Lifestyle and sociodemographic and economic characteristics of patients with lung cancer in Morocco. Can Respir J. 2020 (1), 8031541(2020).
  4. Zhang, X., Zhao, Y., Wang, M., Yap, W. S., Chang, A. Y. -c Detection and comparison of epidermal growth factor receptor mutations in cells and fluid of malignant pleural effusion in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 60 (2), 175-182 (2008).
  5. Hackner, K., et al. Detection of EGFR activating and resistance mutations by droplet digital PCR in sputum of EGFR-mutated NSCLC patients. Clin Med Insights Oncol. 15, 1179554921993072(2021).
  6. Hanna, N., et al. Systemic therapy for stage IV non-small-cell lung cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (30), 3484-3515 (2017).
  7. Soria, J. -C., et al. Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 378 (2), 113-125 (2018).
  8. Rosell, R., Bivona, T. G., Karachaliou, N. Genetics and biomarkers in personalisation of lung cancer treatment. Lancet. 382 (9893), 720-731 (2013).
  9. Ohashi, K., Maruvka, Y. E., Michor, F., Pao, W. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistant disease. J Clin Oncol. 31 (8), 1070-1080 (2013).
  10. Simarro, J., et al. Technical validation and clinical implications of ultrasensitive PCR approaches for EGFR-Thr790Met mutation detection in pretreatment FFPE samples and in liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Int J Mol Sci. 23 (15), 8526(2022).
  11. Yu, H. A., et al. Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers. Clin Cancer Res. 19 (8), 2240-2247 (2013).
  12. Wang, W., Song, Z., Zhang, Y. A Comparison of ddPCR and ARMS for detecting EGFR T790M status in ctDNA from advanced NSCLC patients with acquired EGFR-TKI resistance. Cancer Med. 6 (1), 154-162 (2017).
  13. Hendriks, L. E., et al. Lung cancer in the Netherlands. J Thorac Oncol. 16 (3), 355-365 (2021).
  14. Visser, E., et al. Up-front mutation detection in circulating tumor DNA by droplet digital PCR has added diagnostic value in lung cancer. Transl Oncol. 27, 101589(2023).
  15. Ilié, M., Hofman, P. Pros: Can tissue biopsy be replaced by liquid biopsy. Transl Lung Cancer Res. 5 (4), 420(2016).
  16. Cheng, M. L., et al. Circulating tumor DNA in advanced solid tumors: clinical relevance and future directions. CA Cancer J Clin. 71 (2), 176-190 (2021).
  17. Weber, B., et al. Detection of EGFR mutations in plasma and biopsies from non-small cell lung cancer patients by allele-specific PCR assays. BMC Cancer. 14, 1-6 (2014).
  18. Sozzi, G., et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).
  19. Bruhn, N., et al. Detection of microsatellite alterations in the DNA isolated from tumor cells and from plasma DNA of patients with lung cancer. Ann N Y Acad Sci. 906 (1), 72-82 (2000).
  20. Kohsaka, S., Petronczki, M., Solca, F., Maemondo, M. Tumor clonality and resistance mechanisms in EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer: implications for therapeutic sequencing. Future Oncol. 15 (6), 637-652 (2018).
  21. Takeda, M., et al. Impact of coexisting gene mutations in EGFR-mutated non-small cell lung cancer before treatment on EGFR T790M mutation status after EGFR-TKIs. Lung Cancer. 139, 28-34 (2020).
  22. Demuth, C., et al. Measuring KRAS mutations in circulating tumor DNA by droplet digital PCR and next-generation sequencing. Transl Oncol. 11 (5), 1220-1224 (2018).
  23. Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Rev Mol Diagn. 18 (1), 7-17 (2018).
  24. Yu, Q., et al. Multiplex picoliter-droplet digital PCR for quantitative assessment of EGFR mutations in circulating cell-free DNA derived from advanced non-small cell lung cancer patients. Mol Med Rep. 16 (2), 1157-1166 (2017).
  25. Zhao, Y., et al. Deep learning using histological images for gene mutation prediction in lung cancer: a multicentre retrospective study. Lancet Oncol. 26 (1), 136-146 (2025).
  26. Williamson, D. F., et al. Detection of EGFR mutations in non-small cell lung cancer by droplet digital PCR. PLoS One. 17 (2), e0264201(2022).
  27. Tang, C., et al. Establishment and validation of a novel droplet digital PCR assay for ultrasensitive detection and dynamic monitoring of EGFR mutations in peripheral blood samples of non-small-cell lung cancer patients. Clin Chim Acta. 510, 88-96 (2020).
  28. Xu, S., et al. Exploring the impact of egfr T790m neighboring snps on arms-based t790m mutation assay. Oncol Lett. 12 (5), 4238-4244 (2016).
  29. Merker, J. D., et al. Circulating tumor DNA analysis in patients with cancer: American Society of Clinical Oncology and College of American Pathologists joint review. J Clin Oncol. 36 (16), 1631-1641 (2018).
  30. Oxnard, G. R., et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA. Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).
  31. Newman, A., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat Med. 20 (5), 548-554 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dijital PCRMikrodamlac k PCREGFR MutasyonuT790M MutasyonuMutasyon TespitiqPCR Duyarl lEGFR TKI DirenciAkci er Kanseri Biyobelirte leriHassas Onkoloji
Video yakında

İlgili makaleler