Biyoinformatik, sitokin ile tedavi edilen periodontit kök hücrelerinde periodontitle ilişkili aday biyobelirteçlerin tanımlanması

Özet

Mevcut çalışma, sitokin ile tedavi edilen periodontal bağ kök hücrelerinde biyoinformatik analiz yoluyla düzensiz genleri incelemeyi hedeflemektedir. Bu hücrelerde yukarı regülasyonlu ERC2-IT1 ve aşağı regülasyona EPB41L4A-AS1, periodontitle ilişkili olabilecek aday biyobelirteçler olarak tanımlanmıştır.

Özet

Mevcut çalışmanın temel amacı, sitokin kaynaklı periodontal ligament kök hücrelerinin (PDLSC) altında yatan potansiyel moleküler mekanizmayı incelemekti. GSE260558 veri setinden mikroarray verileri gen ifade omnibus (GEO) veritabanından alındı. Normalleşmeden sonra, düzensiz genler tanımlandı. Daha sonra, farklı ekspres mRNA'lar (DE-mRNA'lar) gen ontolojisi (GO) ve kyoto genler ve genom ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizlerine tabi tutuldu. Daha sonra, hub genleri protein-protein etkileşimi (PPI) ağına göre eleme yapıldı. Son olarak, hub genleri içeren rekabetçi endogen RNA (ceRNA) düzenleyici ağları ENCORI web sitesi kullanılarak oluşturuldu. R programlama dilindeki limma paketi kullanılarak toplam 739 farklı ifade edilen lncRNA (DE-lncRNA) ve 809 farklı ifade edilen mRNA (DE-mRNA) tanımlandı. Daha sonra, GO ve KEGG analizleri, DE-mRNA'ların sitokin ile tedavi edilen PDLSC'lerde iltihap ve ekstrahücre matriks oluşumuyla yakından ilişkili olduğunu gösterdi. DE-mRNA'lar için bir protein-protein etkileşimi (PPI) ağı oluşturuldu ve derecesi değerlendirilerek hub genleri elde edildi. Toplamda 12 upreregulate hub geni ve 12 downregulated hub geni tarandı. Bu yukarı regülasyon ve aşağı regülasyonlu hub genleri sırasıyla bir ceRNA düzenleyici ağı oluşturmak için kullanıldı. Bu ağlarda, periodontitte önemli lncRNA'lar olarak yukarı regüle edilmiş ERC2-IT1 ve aşağı regülasyona EPB41L4A-AS1 kabul edilmiştir. Sonuç olarak, biyoinformatik analiz, sitokin kaynaklı PDLSC'lerin ilerlemesine katılan birkaç önemli gen ve ceRNA düzenleyici ağı ortaya koydu. Bu çalışma periodontitile ilişkili birkaç aday biyobelirteç tespit etmesine rağmen, hayvan modellerinde veya klinik örneklerde daha fazla deneysel doğrulama gereklidir.

Giriş

Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, periodontit insanlar arasında en yaygın altıncı en yaygın, yaygın ve geri döndürülemez kronik iltihaplı hastalık^{olarak kabul edilmektedir 1,2}. Günümüzde ise dünya nüfusunun yaklaşık %15'ini^{etkiliyor 1,2,3}. Periodontitin yaş, cinsiyet, ağız hijyeni uygulamaları, sigara durumu, etnik köken, düşük sosyoekonomik durum ve çeşitli sistemik hastalıklar gibi çeşitli faktörlerle güçlü bir şekilde ilişkili^{olduğu bildirilmiştir} 2,3,4,5. Yaşlı yetişkinlerde belirgin şekilde yüksek yaygınlığa sahip olan periodontit, dişlere yapışan subgingival mikrobiyotadaki disbiyotik değişikliklerle patolojik olarak^{tetiklenir 6,7}. Tedavi edilmezse, bu durum nihayetinde kemik yok oluşuna, diş hareketine ve talihsiz diş^{kaybına yol açar.} Bu nedenle, periodontitisin altında yatan moleküler mekanizmaların kapsamlı bir şekilde anlaşılması ve hastalığın tanısal belirteçlerinin belirlenmesi acil olarak gereklidir.

Periodontal dokunun yapısal ve etkileşimli karmaşıklığı, periodontal rejenerasyon sürecinde karşılaşılan önemli zorluklara katkıda bulunan önemli faktörlerden^{biri olarak yaygın olarak kabul edilir 9,10}. Periodontal yenilenme amacıyla kullanılan çeşitli mezenkimal kök hücreler (MSC) arasında, periodontal bağ kök hücreleri (PDLSC) in vivo ortamda yeni çimento benzeri yapıların oluşumunda son derece güvenilir bir kaynak olduğu kapsamlı şekilde^{kanıtlanmış 11,12}. Son dönemde yapılan preklinik çalışmalarda, PDLSC'lere dayalı tedavi, doku yenilenmesi alanında son derece umut verici sonuçlar^{göstermiştir 13,14}. Hasta diş dokusuna kıyasla, PDLSC'lerin transkriptomik analizi daha güçlü fonksiyonel yönelim ve terapötik dönüşüm potansiyeli^{gösterdi 13,14}.

Biyoinformatik teknoloji ve biyoinformatik analiz yöntemleri, araştırmacılara potansiyel biyolojik süreçleri ve proteomik, genomik ve metabolom istatistiklerle ilişkilendirilebilecek ilişkileri belirleme^{gücü verir 15,16}. Ayrıca, biyoinformatik teknolojisinin yüksek verimliliği araştırmacıların, yeni nesil dizileme ve mikroarray deneylerinden üretilenler gibi büyük ölçekli biyolojik veri setlerini^{analiz etmesini de sağlar 17,18}. Bu yetenek, hastalık tanısı ve prognozu için potansiyel biyobelirteçlerin^{tanımlanmasına olanak tanır 19,20}. Örneğin, bir disintegrin ve metalloproteinaz 28 (ADAM28) ile trombospondin tip I motifler (ADAMTSL3) içeren disintegrin benzeri ve metalloproteaz bölgesi, biyoinformatik teknolojiye dayalı kapsamlı bir analizle periodontit hastalarının diş eti dokularında yeni biyobelirteçler olarak^{tanımlanmıştır 21}. Ayrıca, nükleer reseptör koaktivatörü 4 (NCOA4), çözünen taşıyıcı taşıyıcı 1A5 (SLC1A5) ve ısı şoku proteini B1 (HSPB1) gibi ferroptozla ilişkili birkaç genin periodontitis^22'de daha iyi tanısal değere sahip olduğu bildirildi. Ancak, periodontitisin moleküler mekanizması daha fazla araştırılmayı hak etmektedir. Bu çalışmada, araştırmacılar biyoinformatik teknolojiyi kullanarak sitokin kaynaklı PDLSC'lerde hub genlerini incelemeyi ve periodontitle bağlantılı potansiyel biyolojik süreçleri ve yolları tespit etmeyi amaçlamaktadır. Sitokin ile tedavi edilen PDLSC'lerin biyoinformatik analizi, PDLSC disfonksiyonu ile periodontit arasındaki boşluğu kapatan PDLSC disfonksiyonuyla ilgili iltihap odaklı transkripsiyon programlarını yakalar. Sitokin kaynaklı PDLSC'lerdeki bu temel genler ve yollar, periodontitisin altında yatan birleşik mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sunar.

Protokol

1. Veri seti

Bu analiz, kamuya açık verileri kullandı ve kurumsal ve JoVE etik yönergelerine uygun olarak insan veya hayvan denekleri içermemiştir. Kullanılan platformlarla ilgili tüm bilgiler Materyaller Tablosu'nda mevcuttur.

1. Biyoinformatik analiz için GSE260558 veri setinden (National Center of Biotechnology Information Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE260558) toplam 6 örnek (GSM8119437, GSM8119438, GSM8119439, GSM8119440, GSM8119441 ve GSM8119442) seçin.
2. Bu örneklerde, normal ortamda veya inflamatuar sitokinler içeren ortamda periodontal ligament kök hücreleri (PDLSC) 7 gün boyunca kültürlenmiştir.
3. PDLSC'lerden toplam RNA'yı çıkarıp yüksek verimlilikli^{dizileme 23'e} tabi tutun. Biyoinformatik analiz süreci Şekil 1'de gösterilmiştir.

2. DEG'lerin Tanımlanması

1. Daha önce açıklandığı gibi limma yazılımı (sürüm: 3.46.0) kullanarak lncRNA ve mRNA'nın ifade profillerini analiz^edin.
2. Sitokinler ile normal gruplar arasında çift karşılaştırmalar yapın.
3. Yanlış keşif oranı (FDR) düzeltmesini standart bir kesme sınırı ile 0,05 < kullanarak önemli ölçüde farklı şekilde ifade edilen genleri tespit edin. İstatistiksel olarak anlamlı sonuçlar arasında yanlış pozitiflerin oranını kontrol etmek için düzeltilmiş p-değerleri (FDR) kullanın.
4. Önemli ölçüde disregulasyonlu lncRNA'ları veya mRNA'ları belirlemek için ayarlanmış bir P-değeri < 0.05 ve katlama değişim eşiği > 1 kullanabilirsiniz.
5. R yazılımı (sürüm 4.0.4) kullanılarak oluşturulan volkan grafiklerinde (ggplot2: sürüm 3.4.1) diferansiyel gen ifadesini sunmak.
6. Tablolarda en iyi 10 düzensiz lncRNA ve mRNA'yı listeleyin.

3. Fonksiyonel zenginleştirme analizi

1. DAVID çevrimiçi veritabanını (Annotation, Visualization and Integrated Discovery için Veritabanı, https://david.ncifcrf.gov/) kullanarak DE-mRNA'ların GO zenginleştirme analizini gerçekleştirin.
   1. Düzensiz genleri web sitesine gönderin ve moleküler fonksiyon (MF), biyolojik süreçler (BP) ve hücresel bileşenler (CC) gibi GO terimlerini seçerek GO analizini yapın.
   2. Düzensiz genleri Cytoscape (sürüm: 3.8.2) eklentisi ClueGO [16]+ ve Cluepedia uygulamasına gönderin.
   3. Birden fazla karşılaştırma için Benjamini-Hochberg düzeltmesini uygulayın ve anlamlılık eşiğini ayarlanmış bir P-değeri < 0,05 olarak belirleyin.
   4. Sonuçları Cytoscape'ten indirin. Zenginleştirmeleri P-değerine göre azalan sırayla sıralayın ve her kategoride en iyi 5 zenginleştirmeyi gösterin.
2. Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG), biyolojik sistemlerin (http://www.genome.jp/kegg/) yüksek düzey işlevlerini ve etkilerini anlamak için değerli bir veritabanı kaynağıdır.
   1. KEGG analizini benzer şekilde web sitesinde KEGG-PATHWAY seçerek gerçekleştirin.
   2. Anlamlılık eşiğini ayarlanmış bir P-değeri < 0.05. olarak belirleyin ve bu çalışmada en iyi 10 zenginleştirmeyi sunun. Bu zenginleştirme analizlerini rapor edilen ^{çalışmalara göre yapın 25,26}.

4. PPI ağı

1. Etkileşimli genlerin geri alınması için arama aracı (STRING, sürüm 12.0) kullanarak protein-protein etkileşimleri (PPI) ağını tahmin edin ve oluşturun.
2. PPI ağını oluşturmak için STRING web sitesine 318 veya 465 aşağıya regüle mRNA gönderin.
3. PPI ağından etkileşim verilerini dışa aktarın ve verileri Cytoscape yazılımına gönderin.
4. PPI ağında bireysel düğümü gizleyin. Bu çalışmada bulunan PPI ağını indirin.
5. Cytoscape'in eklentisi olan CentiScaPe uygulamasını kullanarak ağın topolojik özelliklerini, derece dağılımı da dahil olmak üzere hesaplayın.
6. Her genin yerel topolojisini, bitişik genlerin sayısını toplayarak niceliklendirin ve verilen düğüm için etkileşimleri sayın.
7. PPI ağındaki tüm genleri, bağlantı derecelerine göre azalan sırayla sıralayın.
8. Bu sıralamalı listeden en iyi 12 yukarı regülasyon ve en aşağı regülasyona sahip 12 geni hub genleri olarak seçin.

5. miRNA-mRNA düzenleyici ağı

NOT: ENCORI veritabanı (sürüm 12.0, https://rnasysu.com/encori/) mikroRNA'lar (miRNA'lar) ile DE-lncRNA'lar (veya hub genler) arasındaki düzenleyici ilişkileri tahmin etmek için kullanıldı.

1. Yukarı regülasyon edilen veya aşağı regulasyona sahip hub genlerini ENCORI'ye gönderin ve ENCORI'de tahmin analizi için toplam altı programda PITA, RNA22, miRmap, miRmap, miRanda, PicTar ve TargetScan dahil olmak üzere kesim kriterini ≥5 olarak belirleyin.
2. Tahmin edilen miRNA'ları indirip potansiyel lncRNA'lar elde etmek için ENCORI'ye gönderin.
3. Tahmin edilen lncRA'ları indirin ve 5.2. ile Şekil 2 arasında örtüşen lncRNA'ları belirleyin.
4. Hub genlerini, bölüm 5.1'de elde edilen miRNA'ları ve 5.3. adımda elde edilen lncRNA'ları ceRNA ağını oluşturmak için Cytoscape yazılımına (sürüm 3.4.0) gönderin.

Sonuçlar

DEG'lerin Tanımlanması
Limma R yazılımı, lncRNA'lar ve mRNA'ların diferansiyel ifade profillerini analiz etmek için kullanıldı. İki grup arasındaki farklar, eşleştirilmeyen bir t-testi ile belirlendi. Volkan diyagramında (Şekil 2) gösterildiği gibi, toplam 739 farklı ifade edilen lncRNA (DE-lncRNAs, p değeri<0.05, |log2FC|>1) tanımlanmıştır. Bu DE-lncRNA'lar arasında, sitokinler grubunda normal gruba kıyasla 340 yukarı regülasyon...

Tartışma

Periodontal bağ kök hücreleri (PDLSC), periodontitin hem ilerleme hem iyileşme aşamalarında periodontal hasarı bastırmada kritik rol oynayan kilit hücreler^{olarak kabul edilir 32,33}. Önemli miktarda kanıt, inflamatuar bir durumda kuluçka yapmanın PDLSC'lerin yaşlanmasını önemli ölçüde hızlandırma^{potansiyeline sahip olduğunu açıkça göstermiştir 34,35}. Ancak, inflamatuar kul...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
R	R İstatistiksel Hesaplama Vakfı	4.0.4	İstatistiksel hesaplama için çekirdek açık kaynak ortamı. Tüm sonraki analizlerin temelini oluşturur. Genellikle RStudio ile kullanılır.
Limma	Biyoconductor Topluluğu (Baş Geliştirici: Walter & Eliza Hall Enstitüsü)	3.46.0	Mikrodizilerin ve RNA-dizisinin diferansiyel ifade analizi için özel paket;
Sitoscape	Sitoscape Konsorsiyumu	3.8.2	Ağ görselleştirmesi için açık kaynaklı platform. Ayrı kurulum gerektirir; App Store üzerinden ClueGO ve cytoHubba gibi eklentileri destekler.
STRING	Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı	12	Tahmin edilen ve bilinen protein-protein etkileşimleri (PPI) için dünyanın en büyük veritabanı. Web veya Cytoscape eklentisi üzerinden erişilir; güven puanları sağlar.
ENCORI	Sun Yat-sen Üniversitesi	3	ceRNA ağlarına odaklanan kamu veri tabanı (miRNA-mRNA-lncRNA).