Yöntem makalesi

Orta Serebral Arter Tıkanıklığı Olan Sıçanlarda Rakip Endojen RNA Ağının lncRNA, miRNA ve mRNA Ekspresyonuna Dayalı Analizleri

666 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68876

⸱

7 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Medical Economics Management, Anhui University of Chinese Medicine, 4Xin'an Medical Research Institute, 5Key Laboratory of Xin'An Medicine, Ministry of Education, 6Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, iskemik inmede rekabetçi endojen RNA'lar (ceRNA'lar) olarak işlev gören uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA'lar) düzenleyici rollerini ve altta yatan mekanizmaları sistematik olarak araştırmak için biyoinformatik analizler ve deneysel doğrulama kullandı.

Özet

Bu çalışma, iskemik inmede ceRNA görevi gören lncRNA'ların düzenleyici rollerini ve altta yatan mekanizmaları araştırmayı amaçlamaktadır. CeRNA hipotezine dayanarak, lncRNA'lar, miRNA'lar ve mRNA'lar, inmeyle ilgili düzenleyici bir ağın bileşenleri olarak tanımlandı. Ayrıntılı analiz için ortaya çıkan alt ağdan anahtar lncRNA'lar seçildi. Gen Ontolojisi kullanılarak yapılan fonksiyonel zenginleştirme analizi ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi aracılığıyla yol haritalaması, lncRNA ile ilişkili ceRNA ağı içindeki kritik etkileşimleri ortaya çıkardı. Kalsiyum sinyali, boşluk bağlantı sinyali ve nöroaktif ligand reseptör etkileşimi dahil olmak üzere temel yollar, Western blot analizi kullanılarak daha da doğrulandı. Oluşturulan ceRNA ağı, biyolojik rollerini tahmin eden fonksiyonel zenginleştirme analizi ile 334 lncRNA, miRNA ve mRNA'dan oluşuyordu. Temsili bir ceRNA alt ağı oluşturmak için yüksek derecede merkeziliğe sahip üç lncRNA seçildi. Western blot analizi, sahte grupla karşılaştırıldığında, anahtar proteinlerin ekspresyon seviyelerinin - CaMKII, kalmodulin, CX36, PKC, CX43, GRIA3, GABRA6 ve NPY1R'nin model grubunda önemli ölçüde aşağı regüle edildiğini, CaN ekspresyonunun ise önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini ortaya koydu (P < 0.05). Bu bulgular, lncRNA'ların inme patogenezinde önemli ölçüde rol oynadığını göstermektedir. Sonuç olarak, ceRNA görevi gören lncRNA'lar, iskemik inmenin patogenezinde kritik düzenleyici roller üstlenmektedir.

Giriş

Yaygın bir nörolojik bozukluk olan iskemik inme, kalıcı beyin hasarına, uzun süreli sakatlığa veya ölüme yol açar 1,2,3,4. MikroRNA'lar (miRNA'lar veya miR), uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar) ve haberci RNA'lar (mRNA), RNA aracılı düzenleyici ağlaroluşturur 5,6,7,8. Bu moleküller, çeşitli karmaşık mekanizmalar 9,10 yoluyla hücresel fonksiyonları düzenlerve iskemik inmenin patofizyolojisine katkıda bulunanlar olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir. Bununla birlikte, durumla artan ilişkilerine rağmen, bu kodlamayan RNA'ların kesin rolleri belirsizliğini koruyor. Yeni kodlamayan RNA'ların daha fazla araştırılması, iskemik inmenin altında yatan moleküler mekanizmaların açıklığa kavuşturulması için gereklidir.

LncRNA'lar, çeşitli patolojik durumların başlatılması ve ilerlemesi sırasında gen ekspresyonunun anahtar düzenleyicileri olarak görev yapar. Rakip endojen RNA'lar (ceRNA'lar) olarak hizmet eden lncRNA'lar, spesifik düzenleyici etkiler uygulamak için miRNA'lara bağlanır11. Wei et al. lncRNA AK038897'nin miR-26a-5p'yi hedefleyerek bir ceRNA görevi gördüğünü, böylece serebral iskemi-reperfüzyon hasarını şiddetlendirmek için ölümle ilişkili protein kinaz 1'i (DAPK1) modüle ettiğini bildirmektedir12. Çalışmalar, uzun kodlamayan RNA SNHG1'in (lncRNA SNHG1), miR-18a13 ile etkileşim yoluyla HIF-1α/VEGF sinyal yolunu modüle ederek serebrovasküler hastalıkları düzenlemek için bir ceRNA olarak işlev gördüğünü göstermektedir. Ek çalışmalar, uzun kodlamayan RNA'nın maternal olarak eksprese edilen gen 3'ün (lncRNA MEG3), miR-21/PDCD4 sinyal kaskadı14 yoluyla nöronal apoptozu modüle ettiğini göstermektedir. Çok sayıda lncRNA, miRNA ve mRNA, yüksek verimli dizileme veya mikrodizi analizi yoluyla tanımlanmış olsa da, bu moleküllerin inmedeki işlevleri belirsizliğini koruyor ve RNA aracılı düzenleyici ağların sistematik olarak kurulmasına acilen ihtiyaç var.

Bu nedenle, bu çalışma, daha önce toplanan verileri kullanarak ceRNA hipotezine dayalı kapsamlı bir lncRNA-miRNA-mRNA ağı oluşturmayı ve lncRNA fonksiyonlarını daha iyi anlamak için Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirmesi yoluyla seçilen ceRNA alt ağlarını analiz etmeyi amaçlamaktadır. Sonuçlar, birkaç lncRNA'nın ceRNA'lar olarak işlev gördüğünü ve potansiyel olarak spesifik miRNA'ları ve hedef mRNA'larını düzenlediğini ortaya çıkarabilir. GO zenginleştirmesi, hücresel gelişim, sinyal iletimi ve hücre döngüsü düzenlemesi gibi temel biyolojik süreçleri vurgulayabilirken, yol zenginleştirmesi, bunların felçle ilgili yollara, bağışıklık tepkilerine ve metabolizmaya katılımını ortaya çıkarabilir. Bu bulgular, lncRNA'ların çeşitli hücresel süreçler ve hastalık mekanizmalarındaki potansiyel rollerini vurgulayabilir.

İlgili çalışmalarla yapılan karşılaştırmalarla desteklendiği üzere, iskemik inme araştırmalarında mevcut ceRNA ağ analiz yöntemlerine göre birkaç önemli iyileştirme sunulmaktadır: ilk olarak, ağ yapısını işlevsel yol doğrulaması ile birleştirerek çok katmanlı doğrulamayı entegre edin; Li ve ark.15'in aksine, öncelikle genel transkriptom verilerini kullanarak bağışıklıkla ilişkili ceRNA ağlarının biyoinformatik profiline odaklanarak, 334 lncRNA, miRNA ve mRNA'dan oluşan bir ceRNA ağı oluşturur ve Western blot analizi yoluyla kritik sinyal yollarını (kalsiyum sinyali, boşluk bağlantı sinyali ve nöroaktif ligand-reseptör etkileşimi) doğrular ve Fan ve ark.16'da görüldüğü gibi in silico tahminlere aşırı güvenme sınırlamasını ele alır, sirkRNA ile ilişkili bir ceRNA ağı oluşturan, ancak aşağı akış yollarının deneysel doğrulamasından yoksun olan ve hem model hem de sahte grupta protein ekspresyonunu (örneğin, CaMKII, CX36, GRIA3) ölçerek tahmin edilen ağın işlevsel uygunluğunu doğrulayan; bulguların özgüllüğünü artırarak yüksek topolojik öneme sahip çekirdek lncRNA'lara odaklanmak; 3 lncRNA, 2 miRNA ve 24 mRNA ile bir lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA ağı oluşturan ancak anahtar düzenleyicilere öncelik vermeyen Cheng ve ark.17'nin aksine, temsili bir alt ağ oluşturmak için yüksek derecede merkeziliğe sahip 3 lncRNA tanımlar, mekanik içgörülerin en etkili düğümlere sabitlenmesini sağlar ve Li ve ark.18'de açıklananlar gibi daha geniş, daha az odaklanmış ağlara kıyasla yorumlanabilirliği artırır62 lncRNA içeren ancak hedeflenen alt ağ analizinden yoksun; tekrarlanabilirliği artırmak için ayrıntılı deneysel parametreler sağlayın: kütüphane hazırlığı için beyin dokularından ekstrakte edilen 500 ng-1 μg toplam RNA kullanın (grup başına 6 sıçan: 20 MCAO modeli ve 20 sahte kontrollü kontrol), kaliteyi sağlamak için RNA bütünlük numarası (RIN) > 8.0, Wang ve ark.19'da belirtilmeyen, sirkRNA biyobelirteçlerini doğrulayan ancak RNA giriş spesifikasyonlarını atlayan bir ayrıntı; yaygın olarak kullanılan bir model olan MCAO ile erkek SPF SD sıçanları (220 ± 30 g) kullanın, ancak sınırlamalarına açıkça dikkat edin, Li ve ark. -- ve enfarktüs şiddetini standartlaştırmak için sıçanları nörolojik skorlara (1-3) göre sınıflandırarak bunu hafifletin; çalışma sınırlamalarını kabul edin: ceRNA ağı, translasyon sonrası modifikasyonları yakalayamayabilir ve Western blot doğrulaması için örneklem büyüklüğü (n = grup başına 6), bu boşlukları gidermek için daha büyük kohortları ve proteomik analizleri içerecek gelecekteki çalışmalarla genişletilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan deneyleri, Anhui Çin Tıbbı Üniversitesi Deneysel Etik Kurulu tarafından onaylandı (lisans numarası: AHUCM-rats-2024006) ve kurumsal yönergelere ve JoVE'nin hayvan kullanım standartlarına uygun olarak yürütüldü. Bu çalışmada kırk erkek SPF dereceli SD sıçan (220 g ± 30 g) kullanıldı. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Deney hayvanları

  1. Hayvanları standart deney koşulları altında Hayvan Deney Merkezi'nde barındırın. 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsünü koruyun, yatak takımlarını her gün değiştirin ve yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlayın.
  2. Derin bir anestezik duruma neden olmak için intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 150 mg / kg sodyum pentobarbital uygulayarak deneyin sonunda hayvanlara ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Pençe sıkışmasına refleksif yanıt vermeyerek derin anesteziyi doğrulayın, yaşamsal belirtilerin tamamen kaybolduğundan emin olmak için solunumu izleyin ve ardından dekapitasyona devam edin.

2. Sıçanlarda orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modelinin indüksiyonu

  1. 40 mg/kg20 dozunda (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) intraperitoneal %1 pentobarbital sodyum enjeksiyonu uygulayarak anesteziyi indükleyin. Ayak parmağı tutamını ve kornea reflekslerini kullanarak anestezi derinliğini değerlendirin.
    1. İşlem boyunca solunum ve kalp atış hızını sürekli izleyin. Göz koruması için anestezi indüksiyonundan hemen sonra steril mineral yağ bazlı göz merhemi uygulayın21.
  2. Tamamen uyuşturulduktan sonra, orta hat boyun kesisi yapın ve sağ ana karotid arteri (CCA), iç karotis arteri (ICA) ve dış karotis arteri (ECA) dikkatlice ortaya çıkarın. Doğrudan görselleştirme altında, çevredeki bağ dokusunu nazikçe ayırmak ve her bir arteri tamamen ortaya çıkarmak için uygun mikrocerrahi aletler (örn. forseps ve makas) kullanın.
    1. Arterleri açığa çıkardıktan sonra, cerrahi dikişler kullanarak ECA ve CCA'yı bağlayın. Kan akışını tıkamak ve sonraki prosedürler sırasında kanamayı en aza indirmek için güvenli cerrahi düğümler atın. Dikiş yerleştirme için sabit bir alan oluşturmak için uygun gerginliği sağlayın.
    2. Dikiş yerleştirmeye hazırlanmak için oftalmik makas kullanarak ECA ve ICA'nın çatallanmasında küçük bir kesi yapın. Yuvarlatılmış (top şeklindeki) ucun ucundan 0,25 mm çapında ve 18 mm uzunluğunda bir naylon sütür seçin. Dikişi ECA-ICA birleşimindeki kesi bölgesinden geçirin ve orta serebral arteri tıkamak ± fokal serebral iskemiyi indüklemek için ICA boyunca yaklaşık 18,5 mm 0,5 mm derinliğe kadar yavaşça ilerletin.
    3. Yerleştirilen naylon dikişi, yer değiştirmeyi önlemek için cerrahi dikişler kullanarak çevredeki dokuya veya kan damarlarına sabitleyin. MCAO'yu 2 saat koruduktan sonra iskemi/reperfüzyon hasarına neden olun. Naylon sütürü nazikçe kavramak için ince cerrahi forseps kullanın ve serebral kan akışını kısmen eski haline getirmek ve reperfüzyon hasarını indüklemek için yavaşça yaklaşık 5 mm geri çekin. Sahte grupta, iplik embolisi22 yerleştirmeden sadece karotis arteri bağlayın.
  3. MCAO modelinin başarılı bir şekilde kurulmasından bir hafta sonra, sıçanları derinlemesine uyuşturun. Pençe çimdiklemeye yanıt olmadığında, beyinleri hızla başını kesin ve hasat edin. Beyin dokularını normal tuzlu su ile durulayın, ardından kriyoprezervasyon için -80 °C'lik bir buzdolabında saklayın23.
  4. Nörolojik fonksiyon skoru
    1. MCAO modelinin başarısını belirlemek için Longa puanlama yöntemini kullanarak nörolojik işlevi değerlendirin24. Reperfüzyondan 24 saat sonra, her sıçandaki nörolojik fonksiyonu değerlendirin ve aşağıdaki kriterlere göre bir puan atayın: Puan 0: gözlemlenebilir nörolojik defisit yok; Skor 1: kuyruk süspansiyonu sırasında sol ön ayağın fleksiyonu, ön ayak tam olarak uzatılmamış; Skor 2: düz bir yüzeye yerleştirildiğinde etkilenen (sol) tarafta belirgin şekilde azaltılmış dirençle kuyruk süspansiyonu sırasında sol ön ayağın fleksiyonu; Puan 3: Puan 2 ile aynı, emeklerken ek daire çizme veya istemsiz dönme hareketleri ile; Puan 4: 24 saat içinde bilinç kaybı veya ölüm.
      NOT: Daha yüksek bir puan, daha şiddetli bir davranış bozukluğunu ve daha büyük nörolojik bozukluğu gösterir.
  5. 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) boyaması kullanarak serebral enfarktüs hacmini hesaplayın
    1. Her bir ex vivo sıçan beynini koronal düzlem boyunca eşit kalınlıkta beş dilime ayırın. Her dilimin tam olarak 2,0 mm ± 0,1 mm kalınlığında olduğundan emin olun. Bölümleri taze hazırlanmış %2 (a/h) TTC boyama solüsyonuna tamamen daldırın.
      1. Çözeltiyi ışıktan korumak için boyama kabını alüminyum folyoya sarın ve numuneleri sabit sıcaklıktaki bir inkübatörde 37 °C ± 0,5 °C'de 30 dakika inkübe edin. Boyamadan sonra, normal beyin dokusunda gül kırmızısı lekelenme gözlenirken, iskemik enfarktüslü alanlar dehidrojenaz aktivitesinin kaybı nedeniyle lekesiz (beyaz) kalır.
    2. TTC ile boyanmış beyin dilimlerini %4 (a/h) paraformaldehit çözeltisine aktarın ve doku morfolojisini korumak için 24 saat boyunca 4 °C'de sabitleyin. Fiksasyondan sonra, yüksek çözünürlüklü bir görüntüleme sistemi kullanarak dilimlerin dijital görüntülerini yakalayın. Sabitlemeden 24 saat sonra verileri kaydedin ve arşivleyin.
    3. TTC boyamasını takiben her sıçan grubu için enfarktüs hacmini ve toplam beyin dokusu hacmini ölçmek için ImageJ yazılımını kullanın. Aşağıdaki formül25'i kullanarak düzeltilmiş enfarktüs hacmi yüzdesini hesaplayın:
      Düzeltilmiş enfarktüs hacmi (%) = {[toplam lezyon hacmi − (sol yarımküre hacmi − sağ yarımküre hacmi)] / sağ yarımküre hacmi} × %100.
    4. Eşlenmemiş bir t-testi aracılığıyla düzeltilmiş enfarktüs hacimlerini görselleştirmek ve istatistiksel olarak analiz etmek için GraphPad Prism yazılımını kullanın. İstatistiksel anlamlılığı P < 0.05 olarak tanımlayın.

3. RNA yüksek verimli dizileme

  1. Her gruptaki üç sıçandan beyin dokularını seçin. Üreticinin talimatlarına göre Ribo-Zero rRNA Kaldırma Kitini kullanarak toplam RNA örneklerinden ribozomal RNA'yı (rRNA) çıkarın.
    1. Standart protokolü izleyerek TruSeq RNA Kitaplığı Hazırlık Kitini kullanarak tamamlayıcı DNA (cDNA) kitaplıkları oluşturun. Küme oluşturma ve dizileme için saflaştırılmış cDNA kitaplıklarını kullanın.
  2. Yeni oluşturulan kitaplıklara güvenmeden, bu çalışma için tüm sıralama kitaplıklarını ve veri kümelerini sağlayan daha önce oluşturulan26 temel verileri kullanın. Mevcut çalışmayı, yeni RNA-seq kitaplıkları oluşturmadan veya verileri dizilemeden bu mevcut veri kümelerinin entegre füzyon analizine odaklayın.
    1. Önceki çalışma için ilgili kurumsal etik kurullardan onay alın. MCAO'lu sıçanlarda miRNA ekspresyon profilini sistematik olarak değerlendirmek için yüksek verimli dizileme gerçekleştirin ve daha önce tarif edildiği gibi standartlaştırılmış protokollere bağlı kalın27.
      NOT: RNA dizileme kitaplığı için kalite kontrol verileri Ek Dosya 1'de verilmiştir.

4. Uzun kodlamayan RNA'ların, mikroRNA'ların ve haberci RNA'ların diferansiyel ekspresyon analizi

  1. Uygun olduğu şekilde Ensembl (https://www.ensembl.org/index.html), miRBase (https://www.mirbase.org/) ve NONCODE'dan (http://www.noncode.org/) protein kodlayan genler, miRNA'lar ve lncRNA'lar için ek açıklamalar alın 28,29,30. StringTie31 (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/) kullanarak gen ekspresyonunu ölçün.
    1. StringTie derleyicisini kullanarak her örnekten hizalanmış okumaları transkriptomlarda birleştirin. Tüm örneklerden transkriptom derlemelerini tümleştirmek için StringTie birleştirme modülünü kullanın ve kohort genelinde tutarlı birleşik bir transkript kümesi oluşturun. Transkript bolluğunu32 tahmin etmek için bu birleştirilmiş transkriptomu kullanın.
    2. Kırpılmış Ortalama M-değerleri (TMM) normalizasyonu uygulayarak ve her transkript33,34 için Milyon haritalanmış okuma başına transkriptin Kilobaz Başına Parçalarını (FPKM) hesaplayarak protein kodlayan genlerin ve lncRNA'ların nicelleştirilmesini gerçekleştirin.
  2. MCAO ve kontrol grupları arasında diferansiyel olarak eksprese edilen lncRNA'ları (DEL'ler), miRNA'ları (DEM'ler) ve mRNA'ları (DEM'ler) tanımlamak için edgeR paketini (https://bioconductor.org/) kullanarak diferansiyel ekspresyon analizi gerçekleştirin. Filtrelenmiş ham sayı matrisini bir edgeR DGEList nesnesine dönüştürün. Ortak dağılımı tahmin edin ve her gene veya miRNA'ya aynı dağılım değerini atayın.
    1. Gruplar arasında gen ekspresyonunu karşılaştırmak için kesin bir test yapın. Her diferansiyel olarak eksprese edilen gen35 için log2 kat değişimini (log2FC), milyon başına log sayısını (logCPM), P-değerlerini ve yanlış keşif oranı (FDR)-ayarlı P-değerlerini alın. İstatistiksel anlamlılığı şu şekilde tanımlayın: P < 0.05 ve katlama değişim eşiği |log2(FC)| > 1.

5. Diferansiyel olarak eksprese edilen mikroRNA'ların uzun kodlamayan RNA ve haberci RNA hedeflerinin tahmini

  1. DEMis ve DEL dizilerini uygun veritabanlarından alın. DEMİ'ler ve DEL'ler arasındaki potansiyel etkileşimleri belirlemek için miRNA-lncRNA etkileşim tahmin araçları miRanda36 ve RNAhybrid37'yi kullanın. miRWalk 3.0 veritabanından miRNA-mRNA etkileşim çiftleri elde edin (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)38

6. Uzun kodlamayan RNA - mikroRNA - haberci RNA düzenleyici ağının oluşturulması

  1. ceRNA hipotezi 39,40'a dayalı olarak lncRNA-miRNA-mRNA düzenleyici ağını oluşturun.
    1. DEL'ler ve DEM'ler arasındaki Pearson korelasyon katsayısını (PCC) hesaplayın. PCC 0.99 ve P > 0.01 ise daha fazla analiz için lncRNA< mRNA çiftlerini seçin.
    2. Birlikte eksprese edilen her lncRNA-mRNA çifti için, her iki transkripti de hedefleyen paylaşılan miRNA'ları tanımlayın. miRNA-mRNA-lncRNA ortak ekspresyon ağını oluşturmak için bu paylaşılan miRNA'ları kullanın.
    3. lncRNA-miRNA-mRNA etkileşim ağını41,42 oluşturmak ve görselleştirmek için Cytoscape'i (https://cytoscape.org/) kullanın. Bu adımları takip et:
      1. Her düğüm için aralık merkeziliğini (BC), yakınlık merkeziliğini (CC) ve derece merkeziliğini (DC) hesaplamak için CytoNCA eklentisini kullanın.
      2. Son anahtar alt ağı oluşturmak için üç metriğin de medyan değerlerini aşan merkezilik puanlarına sahip genleri seçin.
      3. Protein-protein etkileşim ağındaki ilk 10 hub genini belirlemek ve Adım 2'de tanımlanan anahtar düğümleri çıkarmak için CytoHubba eklentisini kullanın.
      4. CeRNA ağının her bileşeni için düğüm derecesini hesaplayın.

7. Fonksiyonel zenginleştirme analizleri

  1. RNA fonksiyonunu43 daha fazla araştırmak için GO ve KEGG yolu zenginleştirme analizleri gerçekleştirin. Zenginleştirme sonuçlarını görselleştirmek için clusterProfiler paketini (https://bioconductor.org/) kullanın44.

8. lncRNA - ceRNA ile ilgili yollarda yer alan anahtar proteinlerin ekspresyon seviyelerini tespit etmek için Western blot analizi

  1. Derin anestezi altında, tüm beyni hızla çıkarın. Meninksleri ve kan damarlarını dikkatlice çıkardıktan sonra, sıçanın enfarktüslü bölgesindeki kortikal dokuyuizole edin 45. Dokuyu küçük parçalara ayırmak için ince makas kullanın ve her parçanın ağırlığının 50 mg ile 100 mg arasında olduğundan emin olun. Tartılan doku örneklerini önceden soğutulmuş homojenizasyon tüplerine aktarın.
    1. Protein lizis tamponunu, PMSF'nin RIPA lizis tamponuna 1:100 hacim oranında (nihai konsantrasyon 1 mM PMSF) hazırlayın. Lizis tamponunu 20 mg doku başına 200 μL oranında ekleyin. Doku ince bir şekilde parçalanana kadar ısıyla sterilize edilmiş bir cam homojenizatör kullanarak numuneleri iyice homojenize edin.
    2. Homojenatları buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, tam lizizi kolaylaştırmak için her 10 dakikada bir hafifçe çalkalayın. Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 28.656,6 × g'da santrifüjleyin. Peleti bozmadan toplam protein içeren süpernatanı dikkatlice aspire edin.
  2. Protein örneğine 1:4 oranında 5× sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yükleme tamponu ekleyin (1 hacim 5× tampona 4 hacim protein numunesi). Seyreltmeden sonra, SDS-PAGE yükleme tamponunun nihai çalışma konsantrasyonu 1×'dir.
    1. İyice karıştırın ve proteinleri tamamen denatüre etmek için kaynar su banyosunda 10 dakika ısıtın. Numunelerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. SDS-PAGE jel kuyucuklarına her numuneden 30 μg yükleyin.
    2. Elektroforezi iki aşamada gerçekleştirin: proteinleri istifleme jeli yoluyla çözmek için 30 dakika boyunca 80 V uygulayın, ardından çözme jelindeki proteinleri ayırmak için 1 saat boyunca 120 V'a yükseltin.
  3. Jelin boyutuna uyacak şekilde önceden kesilmiş filtre kağıdı ve poliviniliden diflorür (PVDF) membranları hazırlayın. Aktive etmek için PVDF membranını 3 dakika metanol içinde bekletin. Hem PVDF membranını hem de filtre kağıdını 5 dakika boyunca transfer tamponuna daldırın.
    1. Transfer sandviçini aşağıdaki sırayla (yukarıdan aşağıya) monte edin: anot plakası, üç kat filtre kağıdı, PVDF membran, jel, üç kat filtre kağıdı, katot plakası. Jel, membran ve filtre kağıdı katmanlarının uygun şekilde hizalandığından emin olun. Eşit aktarımı sağlamak için her adımda tüm hava kabarcıklarını giderin.
  4. Protein transferinden hemen sonra, kalan transfer tamponunu çıkarmak için PVDF membranını Batı yıkama tamponunda 5 dakika durulayın. Membranı oda sıcaklığında 2 saat boyunca %5 yağsız süt tozu içeren Western bloke edici tamponda hafifçe çalkalayarak bloke edin veya fosforile proteinler tespit ediyorsanız %5 BSA kullanın.
  5. Bloke ettikten sonra, membranı birincil antikor (1:1000) ile gece boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Ertesi gün, membranı ikincil antikor (1:10.000) ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  6. Işık girişimini önlemek için karanlık bir odada kemilüminesan algılama gerçekleştirin. PVDF membranının protein tarafını otomatik görüntüleme sisteminde pozlama plakasının ortasına düz bir şekilde yerleştirin.
    1. Kullanmadan hemen önce eşit hacimlerde ECL reaktifi A ve ECL reaktifi B'yi temiz bir santrifüj tüpünde karıştırın. Lüminesans reaksiyonunu başlatmak için karışık ECL çözeltisini membran yüzeyine eşit şekilde uygulayın.
    2. Oda sıcaklığında 1-2 dakika inkübasyondan sonra, membran yüzeyini bozmadan fazla sıvıyı nazikçe çıkarın. Sinyal yakalamayı optimize etmek için görüntüleme sistemindeki pozlama parametrelerini lüminesans yoğunluğuna göre ayarlayın.

9. İstatistiksel analiz

  1. Bant gri değerlerini ölçmek için ImageJ yazılımını kullanarak Western blot sonuçlarını analiz edin. Deneysel verilerin istatistiksel analizi için GraphPad Prism'i kullanın. Tüm verileri ortalama ± standart sapma (x ± SD) olarak ifade edin. Eşleştirilmemiş bir t-testi kullanarak gruplar arasındaki istatistiksel farklılıkları değerlendirin.
    1. İki bağımsız örnek grubundan gelen verileri, her grup ayrı bir sütuna karşılık gelecek ve örnekler birbirinden bağımsız olacak şekilde yazılımın veri tablosuna girin. "Analiz Et" fonksiyonu altında "Normallik ve simetri testleri"ni seçerek ve Shapiro-Wilk testini her iki gruba da uygulayarak normalliği doğrulayın.
    2. Her iki grup için de P > 0,05 ise, verilerin normal dağıldığını düşünün. Bu temelde, analizi gerçekleştirmek için Analiz işlevindeki t-testleri altında Eşleştirilmemiş t-testi'ni seçin. İstatistiksel anlamlılığı P < 0.05 olarak tanımlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Her bir sıçan modeli grubunun başarı oranı doğrulama deneysel sonuçları Şekil 1'de gösterilmektedir. Modellemeden sonra sıçanlara nörolojik fonksiyon skorlaması yapıldı (Şekil 1A). Model grubu ciddi nörolojik defisitler sergiledi ve puanları 1 ile 3 arasında değişenler sonraki deneylere dahil edildi. Şekil 1B ve C, kırmızı normal beyin dokusunu ve beyaz enfarktüslü alanı temsil eden TTC boyama sonuçlarını göstermektedir. Model grupt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İnme patogenezinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak ve potansiyel tanı ve tedavi hedeflerini belirlemek için, MCAO'yu takiben sıçanlardan alınan beyin dokuları üzerinde RNA-Seq ve küçük RNA-Seq (sRNA-Seq) analizleri yapıldı. Bu çalışma öncelikle lncRNA'ları, miRNA'ları ve mRNA'ları içeren karmaşık düzenleyici ağları araştırmayı amaçlamaktadır. lncRNA-miRNA-mRNA düzenleyici ağını aydınlatmak için MCAO ile indüklenen sıçan beyin dokularından RNA-Seq ve sRNA-Seq veri kümeler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

Bu makale, Anhui Eyaleti Akademik Lider Rezerv Aday Finansman Projesi (No.2022H287), Anhui İl Sağlık Araştırmaları Anahtar Projesi (Referans: AHWJ2022a013), Anhui Eyalet Koleji Doğa Bilimleri Araştırma Anahtar Projesi (NO.2023AH050745) ve Anhui İl Hijyen ve Sağlık Üstün Yetenekler Projesi (NO. ahsjhmypygc20230074) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%2 (a/h) TTC boyama solüsyonuBeijing Kangle Klon Biyoteknoloji Co., Ltd. 20230805TTC boyama
%4 (a/h) paraformaldehit çözeltisiBeyotimeP0099Sabit beyin dokusu
40 erkek SPF dereceli SD SıçanHagzhou Ziyuan Laboratuvar Hayvanları Yetiştiriciliği Co, LtdSCXK [zhe] 2024-0004Laboratuvar hayvanı
%5 yağsız süt tozuBilimsel FizikPH1519 SerisiWB
Agaroz Elektroforez SistemiPekin Liuyi Biyoteknoloji Co., Ltd.DYCP-44P SerisiWB
Otomatik pozlama cihazıŞangay Peiqing Teknoloji Co., Ltd.JS-M6PWB
Otomatik pozometreŞangay Peiqing Teknoloji Co, LTDJS-M6PWB
Otomatik buz makinesiChangshu Şehri Xueke Elektrikli Aletler Co, LTDIMS-20WB
Kalmodulinİlgi49B2443WB
CamKIIİlgi14G0796 SerisiWB
merkezkaçHaimen Qilinbeier Enstrüman İmalat A.Ş.LX 300 SerisiWB
clusterProfiler paketiBiyoiletkenclusterProfiler_4.17zenginleştirme analizleri
CX36 SerisiZENBION24AP24WB
CX43 SerisiZENBIOM08NO01WB
ECL ultra hassas kemilüminesans kitiBiyokeskinBL520BWB
Elektrikli termostatik hava kurutma fırınıŞangay Sanfa Bilimsel Enstrüman Co, LTDDHG-9070 SerisiWB
Elektroforez aparatıŞangay Tianeng Teknoloji A.Ş., LTD. (Tanon)EPS300 SerisiWB
Elektroforez aparatıŞanghay Tanon Bilim ve Teknoloji A.Ş.EPS300 SerisiWB
Elektroforez tankıŞanghay Tanon Bilim ve Teknoloji A.Ş.VE-180WB
GABRA6İlgi46V5371WB
Keçi Anti-fare IgGZs-BIYOGRAFI142637WB
Keçi Anti-Tavşan IgGZs-BIYOGRAFI139931WB
GRIA3İlgi0C33051WB
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjAnhui Jiawen enstrüman ekipmanları Co, LTDJW-3021HRWB
HiSeq 2500 sistemiAydınlatma/RNA yüksek verimli dizileme
ImageJ yazılımıUlusal Sağlık EnstitüleriResimJ 1.54kTTC boyama
Manyetik ısıtma karıştırıcıChangzhou şehri ve enstrüman fabrikasıJJ-79-1WB
MikropipetAlmanya Eppendorf/WB
Normal sıcaklık mikro santrifüjHaimen Qi Limber Enstrüman İmalat A.Ş., LTD. LX300LX300 SerisiWB
NPY1Rİlgi2D38248 SerisiWB
PipetEppendorf Hakkında0.5-10ulWB
PKCİlgi17E3745WB
önceden boyanmış protein İşaretleyiciBiyokeskinBL712CWB
PVDF membranKırlangıçIPVH00010WB
Ribo-Zero rRNA Kaldırma kitiIllumina, San Diego, Kaliforniya, ABD/RNA ekstraksiyonu
RIPA lizatıBiyokeskinBL504AWB
Sodyum pentobarbitalPekin Think-Far Technology Co., Ltd.MERCKAnestezi
Transfer Membran CihazıŞanghay Tanon Bilim ve Teknoloji A.Ş.VE-186WB
Transmembran aparatıŞangay Tianeng Teknoloji A.Ş., LTD. (Tanon)VE-186WB
β-aktinZs-BIYOGRAFI19AW0505 SerisiWB

Kaynaklar

  1. Marquez-Ortiz, R. A., et al. Neuroimmune support of neuronal regeneration and neuroplasticity following cerebral ischemia in juvenile mice. Brain Sci. 13 (9), 1337(2023).
  2. Han, M., Ma, B., She, R., Xing, Y., Li, X. Correlations between serum cxcl9/12 and the severity of acute ischemic stroke, a retrospective observational study. Neuropsychiatr Dis Treat. 19, 283-292 (2023).
  3. Wang, J., Shan, A., Shi, F., Zheng, Q. Molecular and clinical characterization of ang expression in gliomas and its association with tumor-related immune response. Front Med (Lausanne). 10, 1044402(2023).
  4. Ma, W., et al. Effects of ischemic postconditioning and long noncoding RNAs in ischemic stroke. Bioengineered. 13 (6), 14799-14814 (2022).
  5. Deng, Y., et al. High-throughput sequencing to investigate lncRNA-circRNA-miRNA-mRNA networks underlying the effects of beta-amyloid peptide and senescence on astrocytes. Front Genet. 13, 868856(2022).
  6. Li, R. B., Yang, X. H., Zhang, J. D., Cui, W. Gas6-as1, a long noncoding RNA, functions as a key candidate gene in atrial fibrillation-related stroke determined by ceRNA network analysis and WGCNA. BMC Med Genomics. 16 (1), 51(2023).
  7. Shu, J., Yang, L., Wei, W., Zhang, L. Identification of programmed cell death-related gene signature and associated regulatory axis in cerebral ischemia/reperfusion injury. Front Genet. 13, 934154(2022).
  8. Zou, J. B., et al. Reconstruction of the lncRNA-miRNA-mRNA network based on competitive endogenous RNA reveal functional lncRNAs in cerebral infarction. Sci Rep. 9 (1), 12176(2019).
  9. Zheng, H. Y., et al. Longitudinal transcriptome analyses show robust T cell immunity during recovery from COVID-19. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 294(2020).
  10. Lu, Z., Deng, M., Ma, G., Chen, L. Trim38 protects h9c2 cells from hypoxia/reoxygenation injury via the traf6/tak1/nf-κb signalling pathway. PeerJ. 10, e13815(2022).
  11. Zhang, C., et al. Long noncoding RNAs in intracerebral hemorrhage. Front Mol Neurosci. 16, 1119275(2023).
  12. Wei, R., Zhang, L., Hu, W., Wu, J., Zhang, W. Long noncoding RNA ak038897 aggravates cerebral ischemia/reperfusion injury via acting as a cerna for mir-26a-5p to target dapk1. Exp Neurol. 314, 100-110 (2019).
  13. Retraction: LncRNA snhg1 regulates cerebrovascular pathologies as a competing endogenous RNA through hif-1α/vegf signaling in ischemic stroke. J Cell Biochem. 126 (4), e70017(2025).
  14. Yu, Z., et al. Tnf-α stimulation enhances the neuroprotective effects of gingival MSCs-derived exosomes in retinal ischemia-reperfusion injury via the meg3/mir-21a-5p axis. Biomaterials. 284, 121484(2022).
  15. Li, Y., et al. Profiling immune cell-related gene features and immunoregulatory ceRNA in ischemic stroke. Mol Biomed. 5 (1), 72(2024).
  16. Fan, R., et al. Integrated analysis of circRNA-associated ceRNA network in ischemic stroke. Front Genet. 14, 1153518(2023).
  17. Cheng, L., Zhao, Y., Ke, H. Comprehensive analysis of lncRNA-miRNA-mRNA cerna network in ischemic stroke. Heliyon. 10 (9), e29651(2024).
  18. Li, S., et al. Construction of lncRNA-mediated ceRNA network for investigating immune pathogenesis of ischemic stroke. Mol Neurobiol. 58 (9), 4758-4769 (2021).
  19. Wang, X. Z., et al. Construction of circRNA-mediated immune-related ceRNA network and identification of circulating circRNAs as diagnostic biomarkers in acute ischemic stroke. J Inflamm Res. 15, 4087-4104 (2022).
  20. Movassaghi, S., et al. Effect of pentoxifylline on ischemia-induced brain damage and spatial memory impairment in rats. Iran J Basic Med Sci. 15 (5), 1083-1090 (2012).
  21. Saund, J., Dautan, D., Rostron, C., Urcelay, G. P., Gerdjikov, T. V. Thalamic inputs to dorsomedial striatum are involved in inhibitory control: Evidence from the five-choice serial reaction time task in rats. Psychopharmacology (Berl). 234 (16), 2399-2407 (2017).
  22. Fei, C., et al. Effects of tao hong si wu decoction on circular rna expression profiles in rats with middle cerebral artery occlusion. Chinese Pharmacological Bulletin. 40 (05), 954-963 (2024).
  23. Ma, R., et al. Correlation of thrombin and lc3II/I expression in different ischemic phases and different brain regions in the MCAO model rats. J Hunan Univ Chinese Med. 42 (06), 899-905 (2022).
  24. Li, S., et al. Regulation of nr4a1 by taohong siwu decoction inhibits endothelial cell apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injury. J Ethnopharmacol. 353 (Pt A), 120285(2025).
  25. Ji, Z. J., et al. Neuroprotective effect of taohong siwu decoction on cerebral ischemia/reperfusion injury via mitophagy-NLRP3 inflammasome pathway. Front Pharmacol. 13, 910217(2022).
  26. Duan, X., et al. RNA sequencing for gene expression profiles in a rat model of middle cerebral artery occlusion. Biomed Res Int. 2018, 2465481(2018).
  27. Duan, X., et al. Identification and functional analysis of microRNAs in rats following focal cerebral ischemia injury. Mol Med Rep. 19 (5), 4175-4184 (2019).
  28. Zerbino, D. R., et al. Ensembl 2018. Nucleic Acids Res. 46 (D1), D754-D761 (2018).
  29. Ji, X., et al. A comprehensive rat transcriptome built from large-scale RNA-seq-based annotation. Nucleic Acids Res. 48 (15), 8320-8331 (2020).
  30. Zheng, Y., et al. Npinter v5.0: NcRNA interaction database in a new era. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D232-D239 (2023).
  31. Oliveira, L. A., et al. The widespread misuse of stringtie's gene identifier tags as de facto gene symbols does not allow consistent gene identification in published research. Gene. 954, 149440(2025).
  32. Pertea, M., et al. Stringtie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nat Biotechnol. 33 (3), 290-295 (2015).
  33. Zaghlool, A., et al. Characterization of the nuclear and cytosolic transcriptomes in human brain tissue reveals new insights into the subcellular distribution of RNA transcripts. Sci Rep. 11 (1), 4076(2021).
  34. Zhang, W., et al. Transcriptomic data of peach varieties with different chilling requirement levels. BMC Genom Data. 25 (1), 99(2024).
  35. Chamorro Petronacci, C. M., et al. Identification of prognosis-associated microRNAs in HNSCC subtypes based on the TCGA dataset. Medicina (Kaunas). 56 (10), 535(2020).
  36. Wang, X., et al. Exosomes activate hippocampal microglia in atrial fibrillation through long-distance heart-brain communication. BMC Cardiovasc Disord. 24 (1), 627(2024).
  37. Jiang, P., et al. Circrna-phf21a_0002 promotes pyroptosis to aggravate hepatic ischemia/ reperfusion injury by sponging let-7b-5p. Heliyon. 10 (16), e34385(2024).
  38. Faraldi, M., et al. Circulating biomarkers associated with walking performance in elderly subjects: Exploring miRNAs, metabolic and inflammatory biomarkers. Geroscience. 47 (3), 3977-3996 (2025).
  39. Jiang, H., et al. Reconstruction and analysis of the lncRNA-miRNA-mRNA network based on competitive endogenous RNA reveal functional lncRNAs in rheumatoid arthritis. Mol Biosyst. 13 (6), 1182-1192 (2017).
  40. Alipour, S., et al. Innovative targets of the lncRNA-miRNA-mRNA network in response to low-dose aspirin in breast cancer patients. Sci Rep. 12 (1), 12054(2022).
  41. Ono, K., et al. Cytoscape web: Bringing network biology to the browser. Nucleic Acids Res. 53 (W1), W203-W212 (2025).
  42. Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  43. Huckvale, E. D., Moseley, H. N. B. Predicting the pathway involvement of all pathway and associated compound entries defined in the Kyoto Encyclopedia of genes and genomes. Metabolites. 14 (11), (2024).
  44. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. Clusterprofiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  45. Ueno, Y., et al. Axonal outgrowth and dendritic plasticity in the cortical peri-infarct area after experimental stroke. Stroke. 43 (8), 2221-2228 (2012).
  46. Arkelius, K., et al. Lox-1 and mmp-9 inhibition attenuates the detrimental effects of delayed rt-PA therapy and improves outcomes after acute ischemic stroke. Circ Res. 134 (8), 954-969 (2024).
  47. Hou, L., et al. Itgam is a critical gene in ischemic stroke. Aging (Albany, NY). 16 (8), 6852-6867 (2024).
  48. Miao, M., Lyu, M., Zhong, C., Liu, Y. Correlation between mmp9 promoter methylation and transient ischemic attack/mild ischemic stroke with early cognitive impairment. Clin Interv Aging. 18, 1221-1232 (2023).
  49. Li, W., et al. Clec7a knockdown alleviates ischemic stroke by inhibiting pyroptosis and microglia activation. J Integr Neurosci. 23 (12), 219(2024).
  50. Shi, Y., et al. C5ar1 mediates the progression of inflammatory responses in the brain of rats in the early stage after ischemia and reperfusion. ACS Chem Neurosci. 12 (21), 3994-4006 (2021).
  51. Yan, Y., Chen, L., Zhou, J., Xie, L. Snhg12 inhibits oxygen-glucose deprivation-induced neuronal apoptosis via the mir-181a-5p/negr1 axis. Mol Med Rep. 22 (5), 3886-3894 (2020).
  52. Wei, X. Y., et al. Long noncoding RNA RPL34-AS1 ameliorates oxygen-glucose deprivation-induced neuronal injury via modulating miR-223-3p/igf1r axis. Hum Cell. 35 (6), 1785-1796 (2022).
  53. Zhou, X., et al. Long noncoding RNA norad protects against cerebral ischemia/reperfusion injury-induced brain damage, cell apoptosis, oxidative stress, and inflammation by regulating miR-30a-5p/ywhag. Bioengineered. 12 (2), 9174-9188 (2021).
  54. Gao, H., et al. Long noncoding RNA Peg13 alleviates hypoxic-ischemic brain damage in neonatal mice via mir-20a-5p/xiap axis. Neurochem Res. 47 (3), 656-666 (2022).
  55. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  56. Zhao, W., et al. Comparison of RNA-seq by poly (a) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15 (1), 419(2014).
  57. Wang, C., et al. The construction and analysis of lncRNA-miRNA-mRNA competing endogenous RNA network of Schwann cells in diabetic peripheral neuropathy. Front Bioeng Biotechnol. 8, 490(2020).
  58. Pillai-Kastoori, L., et al. Antibody validation for Western blot: By the user, for the user. J Biol Chem. 295 (4), 926-939 (2020).
  59. Liu, Q., et al. Mir-190a potentially ameliorates postoperative cognitive dysfunction by regulating tiam1. BMC Genomics. 20 (1), 670(2019).
  60. Vella, D., Zoppis, I., Mauri, G., Mauri, P., Di Silvestre, D. From protein-protein interactions to protein co-expression networks: A new perspective to evaluate large-scale proteomic data. EURASIP J Bioinform Syst Biol. 2017 (1), 6(2017).
  61. Panfil, K., Deavours, A., Kirkpatrick, K. Effects of the estrous cycle on impulsive choice and interval timing in female rats. Horm Behav. 149, 105315(2023).
  62. Ouyang, S., et al. Comprehensive bioinformatics analysis to reveal key RNA targets and hub competitive endogenous RNA network of keratoconus. Front Genet. 13, 896780(2022).
  63. Chen, X., et al. Cx3cl1/cx3cr1 axis attenuates early brain injury via promoting the delivery of exosomal microRNA-124 from neuron to microglia after subarachnoid hemorrhage. J Neuroinflammation. 17 (1), 209(2020).
  64. Karim, M. R., et al. Explainable AI for bioinformatics: Methods, tools and applications. Brief Bioinform. 24 (5), bbad236(2023).
  65. Shainer, I., et al. Transcriptomic neuron types vary topographically in function and morphology. Nature. 638 (8052), 1023-1033 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

skemik nmelncRNA fadesimiRNA fadesiceRNA AFonksiyonel Zenginle tirmeKalsiyum SinyalizasyonuGap Junction SinyalizasyonuWestern Blot

İlgili makaleler