Method Article

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

DOI:

10.3791/68960

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Medical College, Yangzhou University, 2Department of Gastroenterology, Shanghai Institute of Pancreatic Diseases, Changhai Hospital, National Key Laboratory of Immunity and Inflammation, Naval Medical University, 3Department of Gastroenterology. Affiliated Yueqing Hospital, Wenzhou Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Post-akut pankreatit diyabet (PPDM-A) patogenezi üzerine yapılan araştırmalarda, pankreas asinar hücreleri (PAC'ler) ile adacığı hücreleri arasında anormal çift yönlü iletişim ana odak noktasıdır. Ancak, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları patofizyolojik koşulları çoğaltamaz, bu da yüksek kaliteli birincil hücrelerin çıkarılmasını kritik hale getirir. Farelerden birincil adacıkların çıkarılması için kullanılan mevcut yöntemler, çoğunlukla yüksek teknik engele sahip olan ve deneyimsiz araştırmacılar için uygun olmayan safra kanalı kanülasyonu yoluyla in-vivo pankreas perfüzyonu üzerine kuruludur.

Bu çalışma, yöntemi değiştirerek karmaşık, canlı perfüzyon ihtiyacını ortadan kaldırdı. SPF dereceli C57BL/6J fareleri (6-8 haftalık) anestezi edilip ötenazi edildi, ardından pankreas izolasyonu yapıldı. Pankreas in vitro kollajenaz P ile sindirildi; birincil adacikler Ficoll yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile ayrılmış, asinar hücreler ise hücre elek filtrelenmesi ve santrifüjasyonu ile elde edilmiştir. Hücre canlılığı ve fonksiyonu, kalsein/propidyum iyodid (Kalsein/PI) boyama, glukozla uyarlanan insülin salgısı testi ve amilazın aktivite tespiti kullanılarak değerlendirildi.

Sonuçlar, değiştirilmiş yöntemin kullanışının kolay olduğunu gösterdi: fare başına verim (120 ± 5) birincil adacık ve 1,6-1,95 × 10⁷ asinar hücreydi; Adacıqların ve asinar hücrelerin canlılık oranları sırasıyla (97,52 ± 0,16)% ve (96,55 ± 0,95)% idi. Ayrıca, adacıklar normal insülin salgılama yeteneği sergiliyordu ve acinar hücreler cerulein uyarısına karşı hassastı. Bu yöntem basit ve güvenilirdir; pankreas ekzokrin-endokrin etkileşimleri ve PPDM-A'yı incelemek için uygulanabilir bir çerçeve sağlar. Ancak, sıçanlarda geçerli olmayan bir uygulama gibi sınırlamaları vardır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akut pankreatit (AP), pankreas parenximal hasarı ve inflamatuar kaskadlar gibi birden fazla yol yoluyla pankreas endokrin fonksiyonunu bozabilir ve böylece post-akut pankreatit diyabetine (PPDM-A)1,2 yol açar. Şu anda PPDM-A'nın temel patogenezi belirsizdir ve pankreas endokrin ve ekzokrin bölmeleri arasındaki anormal çift yönlü iletişim temel araştırmaodak noktasıdır 3. Mevcut ölümsüzleştirilmiş β-hücre hatları (örneğin, INS-1, MIN6) in vitro diyabetik hücre modelleri için yaygın kullanılan araçlar olsa da, tümör kökenli yapısı, normal birincil adacik hücrelerinden glukoz yanıtlılığı ve hücresel heterojenlik açısından önemli farklılıklar yaratır. Sonuç olarak, akut pankreatit 4,5'in mikro ortamında patofizyolojik durumu gerçekten kopyalayamazlar. Bu nedenle, yüksek kaliteli birincil adacıklar ve asinar hücrelerin elde edilmesi, etkileşim mekanizmalarını açıklamak için temel teknik temel haline gelmiştir.

Farelerden birincil adacıkların izole edilmesi için mevcut yöntemler, öncelikle kanal kanülasyonu teknolojisine dayanır; bu teknoloji, safra kanalının hassas lokalizasyonu ve kanülasyonu ile in vivo perfüzyon 6,7 için pankreas parenkimine kollagenaz çözeltisi enjekte edilir. Ancak, yeni doğulan farelerden birincil adacıkları izole etmek için, Huang ve ark.8, in vitro sindirim kullanarak in-vivo pankreas perfüzyonu olmadan mükemmel sonuçlar elde etmiştir. Araştırma ekibimizin pratik deneyimine dayanarak, safra kanalı kanülasyonu ile optimal pankreas perfüzyonu gerçekleştirmek, özel eğitim olmadan hızlı ve etkili bir şekilde gerçekleştirilmek zordur. Yenidoğan farelerden birincil adacıkların izole edilmesi yönteminden ilham alan ekibimiz, perfüzyon deneyimi olmayan araştırmacılar için ekstrafüzyon protokolünü daha basit ve erişilebilir hale getirmek üzere değiştirdi. Bu değiştirilmiş yaklaşım, genç farelerden veya hassas safra kanallarına sahip farelerden birincil adacıkları izole etmek için daha basit bir alternatif sunar. Ayrıca, bu yöntem adacıqların ve asinar hücrelerin hem izolasyon verimliliği (miktarı) hem de saflığı (kalite) açısından avantajlar sunar. Araştırmacıların aynı patolojik ve fizyolojik bağlamda deneyler yapmasına olanak tanır ve adacıqlar ile asinar hücreler arasındaki etkileşim mekanizmasının derinlemesine analizini kolaylaştırır.

Bu yöntem, pankreas sindirim süresinin sıkı bir şekilde kontrol edilmesini gerektirir; Sindirimden önce pankreasın doğranması da kritik bir adımdır. Ayrıca, sindirimden sonra pankreas dokusunun mekanik dağılım yoğunluğuna da dikkat edilmelidir. Bu faktörlerin hepsi izole adacik ve asinar hücrelerin miktarını ve kalitesini etkiler. Bu yöntem farelerde doğrulanmamıştır ve şu anda üretim için ölçeklendirilemez.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlarla ilgili işlemler, Changhai Hastanesi Etik Komitesi veya Laboratuvar Hayvan Merkezi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (Onay No: CHEC (A.E)-2025-026). SPF dereceli C57BL/6J fareleri (6-8 haftalık, 18-25 g ağırlığında, erkek veya dişi, n = 3) 12 saatlik ışık/karanlık döngüde besin (bakım diyeti) ve suya serbest erişimle tutuldu.

Şırıngalar ve iğneler gibi atık keskin maddeler, laboratuvarın özel keskin kaplarında toplanacak ve nitelikli profesyonel kurumlar tarafından bertaraf edilecektir. Araştırmada İnsan Olmayan Hayvanların Bakımı ve Kullanımında Etik Davranış Rehberleri'ne uygun olarak, fare leşleri laboratuvarın özel fare leş dondurucusuna yerleştirilecek ve profesyonel kurumlar tarafından yakılmalıdır.

1. Reaktif hazırlığı

NOT: Steril yoğunluk gradyan ortamı gibi çözeltiler laboratuvarın "Kimyasal Atık Toplama Tamburu"nda toplanacaktır. Tüm kimyasal atıklar, laboratuvar tarafından belirlenen nitelikli profesyonel kurumlar tarafından bertaraf edilecektir.

  1. Kolajenaz P çözeltisi hazırlanması
    1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde, sırasıyla 25 mg kollajenaz P, 42 mg susuz kalsiyum klorür ve 0,02 g tripsin inhibitörü ağırlık alın. 45,5 mL Hank's Balanced Salt Solution ve 500 μL HEPES çözeltisi eklenir, ardından tamamen çözünene kadar vortex yapın. Çözeltiyi 0,22 μm filtreyle filtreleyerek sterilize edin ve filtrelenmiş çözeltiyi yeni steril 50 mL santrifüj tüpüne aktarın. Bu, sonraki pankreas dokusu sindirimi için kullanılan 0,5 mg/mL kollajenaz P çözeltisi elde eder.
  2. Steril yoğunluk gradyan çözeltisi tedavisi
    1. Steril yoğunluk gradyanı çözeltiyi sterilizasyon için 0,22 μm filtreyle filtreleyin, ardından yeni steril 50 mL santrifüj tüpüne aktarın. Çözüm bilgisini net bir şekilde etiketleyin ve ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın. Bundan sonra "Ficoll" olarak anılır.
  3. Stop buffer ve tam ortamın hazırlanması
    1. Boş DMEM ortamına ve RPMI-1640 ortamına sırasıyla %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisillin-streptomisin çözeltisi eklenerek DMEM tam ortamı ve RPMI-1640 tam ortamı (aynı zamanda pankreas sindirimi için stop buffer) hazırlanır. Çözelti bilgilerini net bir şekilde etiketleyin ve daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
  4. Farklı konsantrasyonlarda glukoz çözeltilerinin hazırlanması
    1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde, %0,5 BSA içeren bir KRBH çözeltisi hazırlanmak için 50 mL Krebs-Ringer bikarbonat HEPES tamponu (KRBH) ve 0,25 g Bovine Serum Albumin (BSA)-V ekleyin. Daha sonra, %0,5 BSA içeren KRBH çözeltisinden 28,33 mL ile 168 μL glukoz (1 M) ve 1,5 mL kalsiyum klorür çözeltisi (50 mM) ekleyerek 5,6 mM glukoz çözeltisi hazırlanır. %0,5 BSA içeren KRBH çözeltisinin 9,28 mL'sine, 220 μL glukoz (1 M) ve 500 μL kalsiyum klorür çözeltisi (50 mM) eklenerek 22 mM glikoz çözeltisi hazırlanır.

2. Pankreas adacıklarının ve pankreas asinar hücrelerinin (PAC) izolasyonu

NOT: Tüm cerrahi aletler otoklav sterilizasyonundan geçmelidir.

  1. 12 yuvalı tabakaya Hank's Balanced Salt Solution ve kollagenaz P çözeltisi ekleyin. Ve sonraki sindirim için 50 mL'lik santrifüj tüpüne 3 mL kollagenaz P çözeltisi ekleyin.
    NOT: Üç kuyuya 2 mL Hank's Balanced Salt Solution ve bir kuyuya 2 mL kollagenaz P çözeltisi ekleyin.
  2. Ameliyattan önce fareyi %1,25 tribromoetanol enjeksiyonu ile 0,025 mL/g dozda tartın ve anestezi edin, anestezik durumunu farenin ayak pedini sıkıştırarak kontrol edin: anestezi derinliği, solunum hızının kademeli azalması ve ayak pedinin sıkışmasına yanıt vermemesiyle belirlenir. Derin anestezi doğrulandıktan sonra, fareler servikal dislokasyon yoluyla ötenazi edilir. Fareleri dezenfeksiyon için %75 etanole 5 dakika batırın, ardından pankreas izolasyonu için biyogüvenlik dolabına aktarın.
    NOT: Tribromoetanol (%1,25) satın alındığında önceden hazırlanmış bir çözelti olarak sağlanır; Manuel hazırlık gerekmez. Araştırmacılar deney boyunca eldiven ve maske takmak zorundadır. %1,25 tribromoetanol enjeksiyonu sırasında cilt teması oluşursa, kalan reaktifi hemen susuz etanolle silin, akan suyla 5 dakika durulayın ve kuruluğu hafifletmek için nemlendirici uygulayın. Bu çalışmada aşındırıcı kimyasal kullanılmamaktadır. %1,25 tribromoetanol gibi atık kimyasal reaktifler, "Tehlikeli Kimyasal Atık" etiketli özel kaplarda toplanacaktır.
  3. Farenin karın boşluğunu açmak için "V" şeklinde bir karın kesisi yapın. Sol hipokondriyak bölgedeki koyu kırmızı lenfoid organ dalaktır, dalağa bağlı beyaz organ ise pankreastır. Pankreasın alt kenarı ve pankreatikoduodenal birleşim boyunca dikkatlice kesik diseksiyon yapın.
  4. İzole pankreas dokusunu Hank's Balanced Salt Solution ile yıkayın ve kalıntı mezenterik bağlıları, dalağı ve peripankreas yağ dokusunu çıkarın.
  5. Önceden işlenmiş pankreasi, 2 mL kollagenaz P çözeltisi içeren 12 kuyruklu bir plakaya taşıyor. Pankreası sol elinizle cımbızla yerinde tutun ve sağ elinizle 1 mL bir şırınga kullanarak pankreas parenkimine kollagenaz P çözeltisi enjekte ederek pankreas dokusu saydam ve ödemli hale gelsin.
    NOT: Perfüzyon için kollajenaz P çözeltisi hacmi 600-800 μL'dir.
  6. Pankreası cerrahi makasla hızlıca 1-2 mm³ doku parçalarına kesin.
    NOT: Doku parçalarının boyutu, standart 200 μL pipet ucunun iç çapına yaklaşık eşittir.
  7. 1 mL'lik pipet ucunun distal 1-1,5 cm uzunluğundaki kısmını (açıklığı büyütmek için) kesin ve bu modifiye edilmiş uçla pankreas dokusu parçalarını 2 mL kollajenaz P çözeltisi ile birlikte 3 mL kollajenaz P çözeltisi ile önceden yüklenmiş 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın.
  8. Santrifüj tüpünü 37 °C su banyosunda 12 dakika boyunca kuluçka edin, bu süre boyunca tüpü her 5-6 dakikada bir nazikçe sallayın.
    NOT: Santrifüj tüpünün sallanma amacı, pankreas dokusu ile kollagenaz P çözeltisi arasında tam temas sağlamaktır.
  9. Kollajenaz P çözeltisinin sindirim etkisini sonlandırmak için 10 mL RPMI-1640 tam ortamı ekleyin.
  10. Pelleti 5 mL Pasteur pipetiyle (15-20 yukarı-aşağı darbe) tekrar tekrar pipitleyin, belirgin büyük doku kümeleri kalmayınca.
  11. 10 mL RPMI-1640 tam ortam ekleyin, ardından 180 × g'de 4 °C'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı atın.
  12. Pelleti 20 mL RPMI-1640 tam ortamla yeniden askıya alın. Süspansiyonu 40 ağlı bir elekten geçirin, ardından 180 × g'de 2 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
  13. Süpernatantı nazikçe atın, peleti yeniden süspansiyona almak için 20 mL Ficoll çözeltisi ekleyin ve yavaşça 15 mL RPMI-1640 tam ortam ekleyin.
    NOT: Bu noktada, berrak bir sıvı arayüzü gözlemlenebilir.
  14. 20 dakika boyunca 25 °C'de 640 × g sıcaklıkta nazikçe santrifüj yapın.
    NOT: Santrifüj sırasında arayüz bozulmasını önlemek için şiddetli sarsıntılardan kaçının.
  15. Santrifüj tüpünü dikkatlice çıkarın ve üst kırmızı orta tabakayı 5 mL Pasteur pipeti ile aspire edin. Sonra, sıvı tabaka arayüzündeki adacıkları içeren sıvıyı dikkatlice aspire edin ve yeni bir 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın. 20 mL RPMI-1640 tam orta madde ekleyin, 180 × g'de 4 °C'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı atın.
  16. Pelleti 20 mL RPMI-1640 tam ortamla yeniden süskü, 180 × g sıcaklıkta 4 °C'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı atın.
  17. Pelleti 10 mL RPMI-1640 tam ortamla yeniden süzülün ve 60 mm'lik bir hücre kültür kabına aktarın.
  18. Ters biyolojik mikroskop altında (100x büyütme), 20 μL'lik pipet kullanarak adacik elde seçilir. Seçilen adaçıkları, her kuyu başına 500 μL RPMI-1640 tam ortamla önceden yüklenmiş 24 kuyruklu bir hücre kültür plakasına aktarın.
  19. Ficoll çözeltisi katmanını at, peleti (2.15. adımdan itibaren) 10 mL DMEM tam ortamıyla yeniden süzül, 100 μm hücre süzgecinden filtreleyin, 180 × g'de 4 °C'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın.
  20. Pelleti 10 mL DMEM tam ortamla yeniden askıya alın, 180 × g sıcaklıkta 4 °C'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı atın. Sonra, sonraki deneyler için 5 mL DMEM tam ortamı ile pelleti yeniden süspansiyona alın.

3. Pankreas adacığının ve asinar hücrelerin canlılık tespiti

  1. İzole adacıkları ve uygun sayıda acinar hücresini, sırasıyla 1 mL RPMI-1640 tam ortamı ve 1 mL DMEM tam ortamı içeren 12 kuyruklu/24 kuyu hücre kültür plakalarına aktarın. Plakaları dengelemek için 37 °C, %5 CO₂ hücre kuluçka makinesine 15 dakika koyun.
  2. 12 kuyruk/24 kuyu hücre kültür plakalarını 180 × g sıcaklığında 30 saniye boyunca 25 °C'de santrifüj yapın. Bu arada, boyama reaktifini Kalsein/Propidium İyodid (Kalsein/PI) Hücre Yaşamlılık ve Sitotoksiklik Testi Kiti talimatlarına göre hazırlayın (hazırlık sırasında ışıktan korunun).
  3. Ortamı nazikçe atın, adacıkları ve asinar hücrelerini fosfatla tamponlu tuzlu (PBS) bir kez yıkayın, ardından 3.2. adımdaki koşullarda santrifüj yapın.
  4. PBS'yi atın ve adacıkları ile asinar hücreleri hazırlanmış boyama reaktifiyle yeniden askıya alın. Kültür plakasını ışığa karşı korumak için alüminyum folyo ile sarılıp 37 °C, %5 CO₂ hücre kuluçka makinesinde 30 dakika kuluçka yapın.
  5. Işık korumalı bir ortamda, floresan mikroskobu (100x büyütme) ile görüntü alın ve ImageJ ile hücre canlılık analizi yapın.

4. Asinar amilaza testi

  1. Asinar hücreleri, 1,5 × 106 hücre/kuyu yoğunluğunda, 1 mL ortam ile 12 kuyruklu bir plakada tohumlanın. Kontrol (Ctrl) ve serelen uyarılı hücreleri (10 nM, 20 nM, 50 nM; C10, C20, C50 olarak etiketlenmiş) kurun. 30 dakikalık uyarımdan sonra, üreticinin talimatlarına göre amilaza aktivite tespiti için süpernatantlar toplayın.

5. Glukozla uyarılan insülin salgılama testi

  1. 24 kuyuyla bir plakada her kuyuda 10 adacık tohumu ekleyin. Adacıqları tam RPMI-1640 ortamında 2 saat boyunca stabilize edin, ardından ortamı atın.
  2. Adacıqları 1 mL 5,6 mM glukoz çözeltisinde 1 saat kuluçka edin. Sonrasında süpernatantı topla.
  3. Adaları KRBH tamponu ile yıkayın. Sonra, adacıqları 22 mM glukoz çözeltisinde 1 saat kuluçka yapın ve üst yüzeyi tekrar toplayın.
  4. İki üst yüzeydeki insülin konsantrasyonlarını (düşük glukoz ve yüksek glukoz koşullarından) Mouse INS (İnsülin) ELISA Kiti kullanarak tespit edin. Glikozla Uyarılan İnsülin İndeksini (GSI) hesaplayın:
    GSI = Yüksek glikozlu ortamda insülin konsantrasyonu / Düşük glikozlu ortamda insülin konsantrasyonu

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ficoll çözeltisi yoğunluk gradyanı santrifüjasyonundan sonra, şeffaf renksiz sıvı tabakası ile ortam arasındaki arayüze yakın adacıklar gözlemlenmiş, tüpün tabanında tortu olarak PAC'lar bulunmuştur (Şekil 1).

Optik mikroskop altında, adacıqlar genellikle yuvarlak veya oval ve altın-kahverengi renkteydi; fare başına sabit bir verim (120 ± 5) adacık tutardı (Şekil 2A,B). Taze izole edilmiş PAC'lar küresel şeklindeydi ve ağırlıklı olarak kümeler halinde dağılmıştı (küme başına 3-8 asinar hücre). Asinar hücrelerin apikal uçları daha koyu renkteydi ve açıkça görülen zimojen granülleri vardı; Hücrelerin etrafında hiçbir granül veya veziküler yapı gözlemlenmedi ve çözelti arka planı netti. Asinar hücrelerin verimi fare başına 1,6 ila 1,95 × 10⁷ hücre arasında değişiyordu [(1,77 × 107) ± (1,75 × 106)] (Şekil 2C,D).

Adacıqlar ve asinar hücrelerin kalsein/PI boyama sonuçları Şekil 3A'da gösterilmiştir: Kalsein boyalı hücreler (yeşil) çoğunluğu oluştururken, PI boyalı hücreler (kırmızı) nadirdi. Canlı/ölü boyama görüntülerinin nicel analizi ImageJ kullanılarak gerçekleştirildi. Sonuçlar, izole adacıqların ve asinar hücrelerin yaşamlılık oranlarının sırasıyla %97,52 ± 0,16) ve (96,55 ± 0,95)% olduğunu göstermiştir (Şekil 3B).

İzole pankreas asinar hücrelerinin bazal amilaza aktivitesi (0,79 ± 0,01) U/mL idi. 10 nM, 20 nM ve 50 nM konsantrasyonlarda seirelin ile uyarıldıktan sonra, asinar hücrelerin amilazın aktiviteleri sırasıyla (1,45 ± 0,03) U/mL, (1,65 ± 0,05) U/mL ve (1,39 ± 0,02) U/mL idi. Tek yönlü ANOVA sonuçları, kontrol (Ctrl) grubuna kıyasla tüm serülen uyarılan grupların amilaza aktivitesinde anlamlı farklılıklar gösterdiğini gösterdi ( hepsi P < 0.001). Ayrıca, 20 nM ve 10 nM serulein grupları arasında (P < 0.001) amilaz aktivitesinde anlamlı bir fark gözlemlenmiştir (Şekil 4A).

5.6 mM glikoz çözeltisi ile uyarıldığında, izole adacıkların insülin salgısı (0.27 ± 0.04) ng/mL/adacığır/saat idi. 22 mM glikoz çözeltisi ile uyarıldığında, izole adacıkların insülin salgısı (0.94 ± 0.04) ng/mL/adacığır/saat ve GSI 3.44 idi. Sonuçlar, izole adacıkların farklı konsantrasyonlu glikoz çözeltileriyle uyarlama altında tipik ve etkili bir insülin salgısı yanıtı gösterdiğini göstermektedir (Şekil 4B).

Araştırma ekibimiz üyeleri, izole adacıkların ve asinar hücrelerin miktarı ve kalitesinin, işlem sırasında sıkı kontrol gerektiren ve farklı operatörlerden daha az etkilenen sindirim süresiyle yakından ilişkili olduğunu gözlemlemiştir. Bu arada, verim ve canlılıktaki dalgalanmalar, pankreasın tam diseksiyonu ve pankreas dokusunun mekanik ayrılmasıyla yakından ilişkilidir; bu da operasyon sırasında dikkat gerektirir.

figure-results-1
Şekil 1: Ficoll çözeltisi yoğunluk gradyanı santrifüjleme sonuçları. Adacık tabakası, renksiz şeffaf sıvı tabakası ile kültür ortamı arasındaki arayüzde yer alır. Santrifüj tüpünün altındaki çökelti PAC'lardır. Kısaltma: PAC'lar: pankreas asinar hücreleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Adacıqların ve PAC'ların morfolojik ve nicel özellikleri. (A) Fare pankreas dokusundan izole edilen adacik morfolojisi. Ölçeg çubuğu = 100 μm. (B) Fare pankreas dokusundan izole edilen adacık sayısının nicel analizi (n = 3). (C) Fare pankreas dokusundan izole edilen PAC'ların morfolojisi. Ölçek çubuğu = 100 μm. (D) Fare pankreas dokusundan izole edilen PAC sayısının nicel analizi (n = 3). Tüm veriler ortalama SD ± olarak ifade edildi. Kısaltma: PAC'lar: pankreas asinar hücreleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Adacıqların ve PAC'ların canlılık değerlendirmesi. (A) Fare adacıkları ve PAC'lerin yaşamlılığını değerlendirmek için kalsein/propidyum iyodid floresans boyama. Yeşil: canlı hücreler. Red: ölü hücreler. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Adacığırların ve PAC'ların yaşamlılığının nicel analizi (n = 3). Tüm veriler ortalama SD ± olarak ifade edilmiştir. Kısaltmalar: PAC'ler: pankreas asinar hücreleri; PI = propidium iyodid. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: PAC'lerin amilaza aktivitesi ve adacıqların insülin salgılanma kapasitesinin değerlendirilmesi. (A) PAC'lerin uyarma altında farklı serulen konsantrasyonlarıyla amilaza aktivitesi (Ctrl: Kontrol grubu; C10, C20 ve C50: Cerulein konsantrasyonları 10 nM, 20 nM ve 50 nM (n = 3) idi. (B) Glikozla uyarılan insülin salgısı konsantrasyonlarının (n = 3) nicel analizi. Tüm veriler ortalama SD ± olarak ifade edildi. ***P < 0.001. Kısaltmalar: GSI = Glikozla uyarlanan insülin indeksi; PAC'lar: pankreas asinar hücreleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, pankreatit sonrası diyabet (PPDM) geniş çapta ilgigörmüştür 1,9,10. AP bağlamında PAC'lerin adacığı hormon salgılanmasını etkileyen moleküler mekanizmaların araştırılması büyük öneme sahiptir.

AP'nin patogenezi, esas olarak asinar hücrelerde pankreas enzimlerinin aşırı aktivasyonuyla ilişkilidir ve bu da pankreas dokusunun otosindirimineyol açar 11,12. AR42J, 266-6 (acinar hücre hatları) ve MIN6, INS-1 (β-hücre hatları) gibi hücre hatları mevcut olsa da, bu in vitro hücre modelleri birincil asinar hücreler ve adacik 4,5'in fizyolojik karmaşıklığını tam olarak kopyalayamaz. Bu nedenle, pankreasın ekzokrin ve endokrin bölmeleri arasındaki etkileşim üzerine derinlemesine çalışmalar için primer acinar hücreler ve adacıqların izole edilmesi kritik öneme sahiptir. Şu anda adacığı izolasyonu yöntemleri iyi yerleşmiştir; ancak çoğu, adacıqlar ile pankreas asinar hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için araştırma ihtiyaçlarını karşılamakta başarısız 6,7,8.

Bu deneysel protokol, pankreas perfüzyon prosedürünü optimize eder, teknik engeli düşürür ve böylece safra kanalı kanülasyonu konusunda özel eğitimi olmayan araştırmacıların deney yapmasını sağlar. Aynı zamanda, izole adacıkların ve asinar hücrelerin miktarını ve kalitesini sağlar; birincil fare adacıkları ile birincil pankreas asinar hücrelerinin eşzamanlı izolasyonu için basit ve hızlı bir yöntem sunar.

Bu yöntem adacığı izolasyon sürecini basitleştirse de, önemli adımlar yüksek verim ve adacik ile pankreas asinar hücrelerinin etkili ayrılmasını sağlamak için sıkı kontrol gerektirir. Bu adımlar arasında yeterli pankreas perfüzyonu, doğru doku bozulması (kapsamlı doğramanın sağlanması), pankreas sindirimi (sindirim süresinin hassas kontrolü ve sindirim sırasında manuel sallanma) ve mekanik pipetleme (pipetleme vuruşlarının sayısı ve yoğunluğunun kontrolü) yer alır. Adacık seçilmeden önce, yeniden askılanan adacıklar daha verimli bir adacığın seçilmesini sağlamak için yaklaşık 10 dakika hücre kuluçka içinde stabilize edilmelidir.

Pankreas perfüzyonu sırasında, daha berrak sıvı vezikülleri enjekte edildiğinde daha iyi sonuçlar elde edildiğini belirtmek önemlidir; Tüm pankreas dokusu tamamen perfüze olmalı, ancak perfüzyon süresi 1-2 dakika içinde kontrol edilmelidir. Düşük hücre canlılığı tespit edilirse, pankreas dokusu ile kollagenaz P arasındaki temas süresini ayarlayın (perfüzyon süresi ve su banyosu sindirim süresi dahil). Ayrıca, izolasyon sırasında mekanik hasara dikkat edin—örneğin, pankreas dokusunu dağıtırken aşırı kuvvetten kaçının. Kontaminasyonu önlemek için adacıkların ve asinar hücrelerin izolasyonu boyunca aseptik tekniğin korunması gerekir. Hazırlanan reaktifler 0.22 μm filtreden geçirilmelidir. İzolasyon süreci bir biyogüvenlik dolabında yapılmalı ve izolasyon sırasında kullanılan tüm aletler ve tüketim malzemeleri steril olmalıdır. Hazırlanan iki tam ortam ayrıca %1 penisillin-streptomisin çözeltisi içerir.

Fare anestezisi için: farenin boyun derisini sol başparmak ve işaret parmakla sabitleyin, yüzük ve küçük parmaklarla karnını destekleyin (karın boşluğunu açığa çıkarmak için başı aşağı, karın yukarı pozisyonunu koruyarak). Şırıngayı sağ elinizle tutun, farenin sol alt karın derisine (kasıktan 1 cm ve orta hattan 0,5 cm) 30° açıyla yerleştirin, anestezi yavaşça enjekte edin ve iğne çekildikten sonra 10 saniye steril pamuklu çubukla enjeksiyon bölgesine bastırarak ilaç sızıntısını önleyin. Fare tamamen anestezi edildikten sonra servikal dislokasyon yoluyla ötenazi yapın.

Kontamine bir iğneyle (fare kanı veya dokusuna maruz kalırsa) veya fare tarafından ısırılırsa, hemen yaranın çevresindeki alanı en yakın lavaboya sıkın (yaranın proksimal ve distal ucundan az miktarda kan dışarı atmak için sıkıştırın), yarayı sürekli akan suyla 15 dakika boyunca durulayın, ardından %75 etanol veya %0,5 povidon-iyot ile dezenfekte edin.

Asinar hücre amilazı aktivite testlerinin sonuçları, izole pankreas asinar hücrelerinin düşük bazal aktivasyon seviyesine sahip olduğunu ve serelin uyarısına karşı hassas olduğunu gösterdi: amilaz aktivitesi, cerulein konsantrasyonu arttıkça kademeli olarak arttı, en yüksek seviyeye ulaştı 20 nM serulen ve cerulein konsantrasyonu 50 nM olduğunda hafifçe azaldı. Glikozla uyarlanan insülin salgısı testinin sonuçları, izole adacıqların farklı konsantrasyonlu glikoz çözeltileriyle uyarıldığında tipik ve etkili bir insülin salgısı yanıtı gösterdiğini gösterdi. Bu sonuçlar, bu protokolle çıkarılan asinar hücreler ve adacıkların sonraki in vitro deneyler için uygun olduğunu göstermektedir.

Bu deneysel protokolün adacık ve asinar hücre izolasyon prosedürü kullanımı kolaydır. Deneysel sonuçlar, bu protokolle izole edilen adacıklar ve asinar hücrelerin mükemmel miktarda ve yaşamlılık sergilediğini göstermektedir. Ayrıca, ekibimizin birden fazla üyesi bu protokolü birden fazla fare kullanarak doğrulamıştır; Doğrulama sonuçları, iyi tekrarlanabilirlik, güvenilir veri ve hücre veriminde minimum dalgalanmalar olduğunu göstermektedir. Ancak, bu protokolün bazı sınırlamaları da vardır. Operatörün teknik becerilerine az bağımlılığı olmasına rağmen, fare pankreası tamamen parçalamak için operatörün temel fare anatomisi bilgisine sahip olması gerekir - bu, tüm izolasyon süreci için ön koşuldur. Pankreas dokuları aynı anda birden fazla fareden izole edilirse, kollajenaz P çözeltisi ve diğer reaktiflerin miktarı buna göre ayarlanmalıdır. Ayrıca, ikiden fazla fareden eşzamanlı izolasyon önerilmemektedir: farklı farelerin pankreas dokularının diseksiyon, perfüzyon ve doğrama sırasında işlenmesi arasındaki zaman farkı, pankreas dokusu ile kollagenaz P arasındaki temas süresini etkiler ve böylece hücre izolasyonunun verimliliğini ve yaşamlılığını azaltır. Bu nedenle, büyük ölçekli uygulaması sınırlı olabilir. Ayrıca, bu protokol farelerde doğrulanmamıştır. Sıçanlardan adacıklar ve asinar hücreleri izole edilirse, bazı reaktiflerin dozu ve sindirim süresi daha fazla ayarlanabilir.

Sonuç olarak, bu deneysel protokol, birincil fare adacığı ile birincil pankreas asinar hücrelerinin eşzamanlı izolasyonu için basit ve hızlı bir yöntem sunar. Deneyimsiz araştırmacılar için adacığik ve asinar hücre izolasyonu yapmaları için daha uygundur ve aynı zamanda pankreas ekzokrin-endokrin etkileşimleri üzerine in vitro çalışmalar için pratik bir deneysel çerçeve sunar.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X.T., H.C. ve J.L. bu çalışmaya eşit derecede katkıda bulunmuşlardır. Çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe no. 82370658, 82170657, 82370655 ve 82400760) ve Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (hibe no. LGF22H030014). Yazarlar, görsellerin oluşturulmasında yardımları için bioRender (www.biorender.com)'a teşekkür ediyor.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μ m filtresiMillexSLGPR33RBHazırlanan kollagenaz P çözeltisini filtreleyin
0,25 M Kalsiyum klorür (steril)BeyotimeST365İnsülin salgılanmasını aktive etmek için kalsiyuma bağımlı sinyal yolu
1 ml şırıngaJierui10084692516405Pankreas dokusuna kollagenaz P perfüzyonu için kullanılır.
%1,25 tribromoetanol çözeltisiPekin Yosida Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.JT0781Anestezi
1.5 mL Santrifüj TüpüEppendorf30121589Santrifüj ve depolama için hücre süpernatantını toplayın.
1x Hank' s dengeli tuz çözeltisiBiosharpBL561AKollagenaz P çözeltisini hazırlayın ve pankreas dokusunu durulayın
12 kuyruklu hücre kültür plakasıSARSTEDT83.3921Pankreas dokusunu ve kültürden çıkarılan asinar alın
15 mL santrifüj tüpüBeijing Labgic Technology Co., Ltd.CT-002-15ADeney sırasında tutma çözümleri
24-kuyu hücre kültür plakasıSARSTEDT83.3922Çıkarılan adacıqları kültürle yetiştirin
40-mesh  ElektenWeidan EnstrümanlarıYokPankreas dokusunu filtrele
5 mL Pasteur pipetiBiosharpBS-XG-03LSıvıların pipetlenmesi ve pankreas dokusunun fiziksel olarak bozulması
50 mL santrifüj tüpüBeijing Labgic Technology Co., Ltd.CT-002-50ADeney sırasında çözeltileri tutmak, dokuları tutmak ve santrifüjlemek
60 mm hücre kültürü çanaklarıBeijing Labgic Technology Co., Ltd.12211Kolay toplama için adacikleri içeren kültür ortamı için bir konteyner
%75 etanol çözeltisiHYNAUTYokFareleri dezenfeksiyon için ıslatın.
Adobe Photoshop 2023Adobe Inc.YokGörüntüler oluşturun.
Beckman Allegra X-12/X-12R SantrifüjBECKMANAllegra X-12/X-12RSantrifüj
Sığır serum albümini (BSA)-VSolarbioA8020Adacığın normal fizyolojik işlevini koruyun ve (bunu) farklı konsantrasyonlarda glikoz çözeltileri hazırlamak için kullanın.
C57BL/6J fareleri, SPF sınıfı, 6&ntir; 8 haftalık, 18 kilo ve dash; 25 gDeniz Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Merkezi 
Kalsein/PI Hücre Yaşamlılığı ve Sitotoksisite Testi KitiBeyotimeC2015LCanlı ve ölü hücrelerin aynı anda Kalsein-(Kalsein) ve Propidium iyodid (PI) çift floresans boyama yöntemiyle hayvan hücrelerinin canlılığını ve sitotoksisitesini tespit etmek.
Kalsiyum klorür (susuz olan)Sangon Biyoteknoloji10043-52-4Kollagenaz P çözeltisini hazırlayın
Hücre süzgeci (100 μ m)BiosharpBS-100-XBSAsinar hücrelerin filtrelenmesi
Kollagenaz PSigma11213857001Pankreas dokusunu sindir
D-(+)-Glikoz çözeltisi (%20, steril)BeyotimeST491Adacıklardan insülin salgılanmasını uyar.
DMEM temel (1 kat) (Dulbecco' s modifiye kartal orta)GibcoC11995500BTKültür asinar hücreleri
Fetal sığır serumu (FBS)BiowestS140B-500Kültür ortamını hazırlayın
Ficoll-Paque PREMIUM steril çözeltiCytiva17544203yoğunluk gradyan tabakası için yoğunluk gradyan ortamı
GraphPad Prism 8.0.1GraphPad Yazılımı, LLCYokGörüntüler oluşturun ve istatistiksel analiz yapın.
HEPES çözeltisi (1 M)BiosharpBL1061AKollagenaz P çözeltisini hazırlayın
Yüksek hızlı/soğutmalı santrifüjSigma3K15Santrifüj
ImageJUlusal Sağlık Enstitüleri Optik ve Hesaplamalı Enstrümantasyon Laboratuvarı (LOCI)YokHücre floresans görüntülerini analiz edin ve hücre canlılığını hesaplayın.
Ters Biyolojik MikroskopLeicaYokHücre morfolojisini gözlemleyin ve adacıqları seçin.
Ters floresans mikroskobuOLYMPUSIX73Hücresel floresan sinyalleri gözlemleyin ve floresan görüntüler yakalayın.
Krebs-Ringer bikarbonat HEPES tamponuLEAGENECZ0103Adacığın normal fizyolojik işlevini koruyun ve (bunu) farklı konsantrasyonlarda glikoz çözeltileri hazırlamak için kullanın.
Fare INS (İnsülin) ELISA KitiWuhan İnce Biyoteknoloji A.Ş., Ltd.EM0260Adacıkların insülin salgılanma seviyesini tespit edin.
Oftalmik forseps (10 cm, kanca ile kavisli)Qingyi Tıbbi CihazlarıYokDiseksiyona yardım edin
Oftalmik penseps (10 cm, dişli ile düz)Qingyi Tıbbi CihazlarıYokPankreas dokusunun diseksiyonu ve ani ayrılması ile pankreas dokusunun çıkarılmasında yardımcı olmak
Penisilin streptomisin çözeltisiGibco15140-122Kontaminasyonu önlemek için kültür ortamını hazırlayın
RPMI-1640 orta,KeyGEN BioTECHKGL1501-500Kollajenaz P sindirim çözeltisini sonlandırın ve adacıqları kültürleyin
Glycine max'ten (soya fasulyesi) tripsin inhibitörüSigmaT6522Kollagenaz P çözeltisini hazırlayın
Cerrahi makas (10 cm, düz sivri)Qingyi Tıbbi CihazlarıYokAnatomide yardım ve pankreas dokusunu küçük parçalara ayırmak
Su BanyosuOAICLABAH-HFSindirim sıcaklığını koruyun.
α-amilaza ve β-amilaza aktivite test kitiElabscienceE-BC-K006-MFarklı koşullarda asinar hücrelerin salgıladığı amilazın seviyelerini tespit edin

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Diabetes mellitus as a consequence of acute severe pancreatitis: unraveling the mystery. World J Diabetes. 14 (8), 1212-1225 (2023).">Manrai, M., et al. Diabetes mellitus as a consequence of acute severe pancreatitis: unraveling the mystery. World J Diabetes. 14 (8), 1212-1225 (2023).
  2. Post-acute pancreatitis diabetes: a complication waiting for more recognition and understanding. World J Gastroenterol. 29 (28), 4405-4415 (2023).">García-Compeán, D., et al. Post-acute pancreatitis diabetes: a complication waiting for more recognition and understanding. World J Gastroenterol. 29 (28), 4405-4415 (2023).
  3. Risk of diabetes mellitus after first-attack acute pancreatitis: a national population-based study. Am J Gastroenterol. 110 (12), 1698-1706 (2015).">Shen, H. N., Yang, C. C., Chang, Y. H., Lu, C. L., Li, C. Y. Risk of diabetes mellitus after first-attack acute pancreatitis: a national population-based study. Am J Gastroenterol. 110 (12), 1698-1706 (2015).
  4. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K⁺ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).">Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K⁺ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
  5. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228 (1-2), 121-128 (2004).">Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228 (1-2), 121-128 (2004).
  6. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. J Vis Exp. (88), e50374(2014).">Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. J Vis Exp. (88), e50374(2014).
  7. A simple high-efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice. J Vis Exp. (150), e57048(2019).">Villarreal, D., et al. A simple high-efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice. J Vis Exp. (150), e57048(2019).
  8. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. J Vis Exp. (119), e55160(2017).">Huang, C., Gu, G. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. J Vis Exp. (119), e55160(2017).
  9. Global epidemiology and holistic prevention of pancreatitis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (3), 175-184 (2019).">Petrov, M. S., Yadav, D. Global epidemiology and holistic prevention of pancreatitis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (3), 175-184 (2019).
  10. Global incidence and mortality of pancreatic diseases: a systematic review, meta-analysis, and meta-regression of population-based cohort studies. Lancet Gastroenterol Hepatol. 1 (1), 45-55 (2016).">Xiao, A. Y., et al. Global incidence and mortality of pancreatic diseases: a systematic review, meta-analysis, and meta-regression of population-based cohort studies. Lancet Gastroenterol Hepatol. 1 (1), 45-55 (2016).
  11. Cathepsin B-mediated activation of trypsinogen in endocytosing macrophages increases severity of pancreatitis in mice. Gastroenterology. 154 (3), 704-718.e10 (2018).">Sendler, M., Weiss, F. U., Golchert, J., et al. Cathepsin B-mediated activation of trypsinogen in endocytosing macrophages increases severity of pancreatitis in mice. Gastroenterology. 154 (3), 704-718.e10 (2018).
  12. Biochemical analyses of cystatin-C dimers and cathepsin-B reveals a trypsin-driven feedback mechanism in acute pancreatitis. Nat Commun. 16 (1), 1702(2025).">Modenbach, J. M., Möller, C., Asgarbeik, S., et al. Biochemical analyses of cystatin-C dimers and cathepsin-B reveals a trypsin-driven feedback mechanism in acute pancreatitis. Nat Commun. 16 (1), 1702(2025).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Primary Islet IsolationPancreatic Acinar CellsFicoll Density GradientCollagenase P DigestionMouse Pancreas IsolationCell Sieve FiltrationGlucose Stimulated Insulin SecretionCalcein PI StainingAmylase Activity DetectionExocrine Endocrine Interaction

Related Articles