Yöntem makalesi

Erken Kanser Tespitinde Kişiselleştirilmiş Protein Korona Profilleme için Standartlaştırılmış SDS-PAGE İş Akışı

DOI:

10.3791/69090

⸱

19 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NanoDelivery Lab, Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, nanopartiküller üzerinde kişiselleştirilmiş protein korona profili için SDS-PAGE analizini standartlaştırır ve kansere özgü imzaların tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve düşük maliyetli tespitini sağlar. Pankreas kanaltel adenokarsinomunun erken teşhisi için tasarlanmış olan bu cihaz, hem araştırma hem de klinik ortamlarda karmaşık proteomik yöntemlere pratik, GÜVEN uyumlu bir alternatif sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik sıvılara maruz kaldığında nanopartiküller (NP) üzerinde kişiselleştirilmiş bir protein korona (PC) oluşumu, erken kanser tespiti için umut vadeden ve minimal invaziv bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Bu çalışma, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanılarak protein korona profilini standartlaştırılmış bir protokol tanıtıyor; bu protokol sağlamlık, tekrarlanabilirlik ve otomasyon sağlamak için optimize edilmiş. Yöntem, çeşitli nanopartikül (NP) platformları, plazma kaynakları ve deneysel koşullar üzerinde titizlikle doğrulandı ve minimum operatöre bağlı değişkenlikle tutarlı tekrarlanabilir profiller gösterdi. Geleneksel proteomik tekniklerine kıyasla, bu yaklaşım Dünya Sağlık Örgütü'nün tanı için REASSURED kriterlerini karşılayan daha hızlı ve daha maliyet etkin bir çözüm sunar. Pankreas kanal adenokarsinomu (PDAC) uygulandığında, erken dönem biyobelirteçleri sınırlı olan son derece agresif bir malignite olan bu iş akışı, erken evre hastalarda bile %90'a kadar sınıflandırma doğruluğu sağlamıştır. Bu standartlaştırılmış platform, kanser taraması için ölçeklenebilir, klinik olarak aktarılabilir ve uygun fiyatlı tanı araçlarına doğru önemli bir ilerlemeyi işaret etmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanopartikül protein koronası (NP-PC)

NP'lerin biyolojik sıvılara maruz kaldıktan sonra yüzeyinde oluşan PC'nin karakterizasyonu, hastalık teşhisi ve kişiselleştirilmiş tıp için güçlü bir strateji olarak ortayaçıkmıştır 1. Bu adsorbe edilmiş protein tabakası, bileşimi dinamik ve hastalıklara özgü, NP'lerin sentetik kimliğini dönüştürür ve biyolojik etkileşimleriniyönlendirir 2. PC'nin bileşimi rastgele değildir, hem NP'lerin fizikokimyasal özelliklerine hem de tanıtıldıkları biyolojik ortama büyük ölçüde bağlıdır3. NP boyutu, şekli, yüzey yükü ve bileşimi gibi faktörler, adsorbe edilmiş proteinlerin afinite, kinetik ve yapısal düzenini önemli ölçüde etkileyebilir. Benzer şekilde, biyolojik sıvı, kaynağı, karmaşıklığı ve hastalık durumu, koronanın nihaiyapısını belirlemede kilit rol oynar 4,5,6.

Koronanın dinamik doğası, analizini daha da karmaşıklaştırır; yapısı zamanla yumuşak, gevşek bir şekilde bağlanmış dış tabakadan daha stabil ve sıkı adsorbe edilmiş bir iççekirdeğe (7,8) evrilir. Rekabetçi protein adsorpsiyon olaylarından kaynaklanan bu gelişen mimari, anlamlı şekilde tanımlanabilmesi için zaman çözünürlüğüyle ve standartlaştırılmış yaklaşımlargerektirir 9. Bu karmaşıklığa rağmen, PC'nin sadece bir eser olmadığı, sistemik hastalık değişikliklerini invaziv olmayan bir şekilde yakalayabilen biyolojik bilgilendirici bir katman olduğu artık yaygın olarak kabul edilmektedir. Bu makalede tanımlanan yöntemin amacı, kişisel PC'nin sağlam, tekrarlanabilir ve erişilebilir profillenmesi için SDS-PAGE kullanımını standartlaştırmaktır; özellikle sıvı biyopsiyaklaşımlarıyla erken kanser tespiti için.

Kişiselleştirilmiş PC ve kanser tespitindeki önemi

Bu yöntemin bilimsel temeli, kişiselleştirilmiş PC kavramındadır. Hasta plazmasıyla kuluçka aşamasında, NP'ler bireyin fizyolojik veya patolojik durumunu yansıtan benzersiz bir protein parmak iziadsorbasyon yapar 11,12. Bu kavram, hastalık varlığında PC bileşiminde önemli değişiklikler gösteren çalışmalarla doğrulanmıştır; bunlar arasında pankreas kanalal adenokarsinom (PDAC), akciğerkanseri 13, meningioma14 ve glioblastomamultiforme 15 bulunmaktadır. Özellikle, PDAC'ta hasta plazmasından elde edilen PC'ler, sağlıklı bağışçılardan önemli ölçüde farklıdır. Bu farklılıklar, %90'a kadar tanı doğruluğuna ulaşan sınıflandırıcı modellerde kullanılmıştır. Böylece PC, hastalığa özgü sinyallerin nano ölçekli bir konsansantörüolarak hizmet eder 16.

Son çalışmalar, kanser hastalarından alınan PC'lerin iltihaplanma, pıhtılaşma, komplement aktivasyonu ve hücredışı vezikül taşınımında rol alan proteinlerle zenginleştiğini göstermiştir; bu biyolojik yollarmalignite 17'de disregule edildiği bilinmektedir. Bu protein kalıpları bireysel hasta sınıfları içinde oldukça tekrarlanabilir, ancak farklı hastalık durumları arasında açıkça farklıdır; bu da koronanın sadece genel bir hastalık sensörü olarak değil, aynı zamanda hastalığa özgü bir sınıflandırıcı olarak da işlev görebileceğini gösterir. PDAC bağlamında, en ölümcül ve en sinsi malignitlerden biri, grubumuz PCkarakterizasyonu 18,19,20'ye dayalı NP-özellikli kan (NEB) testlerinde öncülük etmiştir. Bu minimal invaziv yaklaşım, NP'lerin düşük bolluklu ve hastalık nedeniyle değiştirilmiş plazma proteinlerini seçici olarak zenginleştirme kapasitesinden yararlanarak, onları basit, tezgah üstü elektroforetik ayrımla tespit edilebilir hale getirir.

Geleneksel proteomik tekniklere göre avantajlar

Bu yaklaşımın geliştirilmesinin gerekçesi, kütle spektrometrisi (MS) gibi geleneksel proteomik tekniklerinin sınırlamalarından kaynaklanır; bu teknikler, derin proteom kapsamı sunmakla birlikte, pahalı, zaman alıcı ve yüksek verimli tarama veya bakım noktası tanısına uygun değildir21. Bir diğer önemli zorluk ise MS'nin içsel karmaşıklığıdır; örnek hazırlığı, cihaz kalibrasyonu, alım parametreleri ve veri analizi iş akışlarındaki değişiklikler, bildirilen PC bileşiminde laboratuvarlar arasında önemli farklılıklara katkıdabulunur 22. Buna karşılık, PC'nin SDS-PAGE analizi, hastalıkla ilişkili proteomik desenleri yakalamak için hızlı ve maliyet etkin bir yöntem sunar. Önemli olarak, SDS-PAGE okuması bireysel biyobelirteçlerin mutlak tanımlanmasına değil, densitometri ve çok değişkenli istatistiklerle analiz edilebilen küresel protein profilindeki sistematik değişikliklerin tespitine dayanır.

Antikor tabanlı testlerin aksine, bilinen hedeflerle sınırlı ve çapraz reaktiviteye yatkın olan bu testler, SDS-PAGE protein ortamına tarafsız bir bakış sunar; orijinal örneğin bütünlüğünü korur ve protein tanımlama için LC-MS/MS gibi tamamlayıcı platformlarla aşağı akış entegrasyonunu sağlar. Ayrıca, SDS-PAGE örnek fraksiyonlama veya tükenme adımları gerektirmediğinden, düşük hacimli biyolojik örneklerin analizi için özellikle uygundur; bu özellik, kırılgan popülasyonların erken tanı veya taraması uygulamalar için vazgeçilmezbir özelliktir. 23. Tüm bu nedenlerle, bu protokol DSÖ'nün REASSURED kriterleriyle (Gerçek zamanlı bağlantı, örnek toplama kolaylığı, Uygun fiyatlı, Duyarlı, Özel, Kullanıcı dostu, Sağlam, Ekipmansız ve Teslimat Edilebilir) tutarlıdır ve ölçeklenebilir tanı için pratik bir araçhaline getirmektedir 24. Bu kanıta dayanarak, hasta plazmasıyla kuluçka yapılan NP'lerin SDS-PAGE kullanılarak sistematik olarak profil edilebilen tekrarlanabilir, hastalığa özgü bir PC adsorbe yaptığı varsayımlandı. Ayrıca, bu kişiselleştirilmiş koronaların standart elektroforetik analizinin kanser hastalarını sağlıklı bireylerden ayırabileceğini, böylece sağlam ve klinik olarak çevrilebilir bir tanı aracı sağlayabileceğini öneriyoruz.

İş akışı ve klinik uygulanabilirlik

SDS-PAGE tabanlı korona profilleme protokolü, NP'lerin hazırlanması ve seyreltilmiş plazma ile kuluçka aşamasından, korona izolasyonuna, jel elektroforezine ve nicel densitometrik analizlere kadar her adımı sistematize eder (Şekil 1). İnküçasyon süresi, plazma seyreltmesi ve NP tip25 gibi temel parametreler, optimal protein yakalama ve jel görüntü çözünürlüğü sağlamak için ince ayarlanmıştır. Protokol ayrıca örnek verimliliği, depolama kararlılığı ve partiden partiyetutarlılık gibi pratik konuları da ele alır 26. Ayrıca, yıkıcı olmayan bir teknik olduğu için, SDS-PAGE, MS gibi tamamlayıcı proteomik yaklaşımlarla sorunsuz bir şekilde birleştirilerek bireysel proteinbantlarının moleküler bileşimini tespit edebilir 15. İş akışı, manuel ve otomatik pipetleme platformlarıyla uyumluluk dahil olmak üzere yüksek operatörler arası tekrarlanabilirlik için optimize edilmiş ve farklı NP kimyaları ile plazma konsantrasyonlarında sağlamdır. Bu özellikler, yöntemin çeşitli laboratuvar ortamlarında uygulanmasını sağlar ve hem merkezi tanı merkezlerine hem de merkeziyetsiz araştırma laboratuvarlarına uygun hale getirir. Bu nedenle, bu teknik özellikle erken tanı, biyomarker keşfi ve translasyonel nanotıp alanlarında çalışan araştırmacılar ve klinisyenler için uygundur. Geniş bir patoloji yelpazesine uygulanabilir ve plazmanın ötesinde tükürük veya idrar gibi çeşitli biyolojik sıvılara uyarlanabilir. Bu protokolün esnekliği ve dayanıklılığı, onu klinik doğrulama hatlarına, büyük ölçekli tarama çalışmalarına ve bakım noktası platformlarına entegre etmek için güçlü bir aday haline getirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, çeşitli NP tiplerinde oluşturulan PC'nin hazırlanması, insan plazması (HP) ile kuluçka, izolasyon ve analizi için ayrıntılı ve standart bir iş akışı sağlar. Şekil 2, NP sentezinden protein profillerinin çok değişkenli SDS-PAGE analizine kadar ardışık deneysel adımları özetleyen tüm protokolün grafik bir gösterimidir. Önemli olarak, metodoloji, öncekiçalışmalar 18,26'da gösterildiği gibi, grup tarafından standartlaştırılmıştır ve sonuçların tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini garanti altına almıştır. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. NP'lerin hazırlanması ve karakterizasyonu

  1. GO nanosheets
    1. 4 mg/mL stok çözeltiyi ultra saf suda istenen konsantrasyona kadar seyreltin. Doğru dağılımı sağlamak için %28 genlikte (nabz: 0.8/0.6 s) 2 dakika sonikasyon yapın.
    2. UV-Vis spektroskopisiyle konsantrasyonu niceleştirin
    3. 633 nm He-Ne lazeri kullanarak dinamik ışık saçılması (DLS) ile hidrodinamik boyut ve zeta potansiyeli ölçün. Numuneleri, küvet tespit sınırlarına göre ultrasaf suda seyreltilerek hazırlayın (örneğin, 1 mL küvetler için 1:100 seyreltme). Üç kopyadan ortalama ± standart sapma (SD) kaydedilir.
  2. Altın NP'ler
    1. Sitratla stabilize edilmiş 100 nm altın NP'leri (stoktan konsantrasyon: 3.8E+9 parçacık/mL) daha fazla değişiklik yapmadan kullanın.
    2. 633 nm He-Ne lazeri kullanarak dinamik ışık saçılması (DLS) ile hidrodinamik boyut ve zeta potansiyeli ölçün. Numuneleri, küvet tespit sınırlarına göre ultrasaf suda seyreltilerek hazırlayın (örneğin, 1 mL küvetler için 1:100 seyreltme). Üç kopyadan ± SD ortalaması.
  3. DOTAP lipozomları
    1. 1,2-dioleoyl-3-trimetilamoniyum-propan (DOTAP) tozunu uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven, gözlük) giyerek sertifikalı kimyasal bir duman başlıkta kloroformda çözüp çözebilirsiniz. Vakumda 2 saat buharlaştırın, lipid filmini ultra saf suyla yeniden askıya alın ve nihai konsantrasyon 1 mg/mL'ye ulaşın ve gece boyunca 4 °C'de hidratlayın. Son olarak, lipozom çözeltisini 0.1 μm polikarbonat filtreden 20 kez dışarıya çıkarın.
    2. 633 nm He-Ne lazeri kullanarak dinamik ışık saçılması (DLS) ile hidrodinamik boyut ve zeta potansiyeli ölçün. Numuneleri, küvet tespit sınırlarına göre ultrasaf suda seyreltilerek hazırlayın (örneğin, 1 mL küvetler için 1:100 seyreltme). Üç kopyadan ± SD ortalaması.
      DIKKAT: Kloroformu tam PPE'li bir duman davlumbasında kullanın. Organik çözücü atıkları kurumsal kimyasal güvenlik prosedürlerine uygun olarak bertaraf etmektir.
      NOT: Boyut dağılımları yaklaşık 300 nm merkezli GO için, 125 W'da 10 dakika sonikasyon, 7.700 x g hassasiyette 30 dakika 4 °C'de santrifüj yapın, süpernatı toplayın, tekrar 18.620 x g'de 30 dakika santrifüj yapın ve pelleti tekrar askıya alın. Boyut dağılımları yaklaşık 100 nm merkezli GO için, 4 °C'de 3 × 180 dakika sonikat edilir, her turdan sonra 4 °C'de 30 dakika boyunca 10.000 x g ile santrifüj yapılır ve son süpernatantı toplar.

2. İnsan plazmasının hazırlanması

  1. Ticari insan plazması (HP)
    1. Ticari liyofilize plazmayı gerektiğinde ultrasaf suyla seyreltin.
    2. Yeniden oluşturulan plazmayı 18620 x g sıcaklığında 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin, üst organı toplayıp -80 °C'de depolayın ve kullanıma kadar saklanın.
  2. Hastadan kaynaklanan HP
    1. 1216 x g hassasiyetinde 4 °C'de 10 dakika boyunca kan örnekleri santrifüj yapın ve plazma ayrılması için süpernatantı toplayın.
    2. Aliquot 450 μL plazma örnekleri 0,5 mL protein düşük bağlanma tüplerinde alın ve kullanılana kadar -80 °C sıcaklıkta saklanın.
      NOT: Tüm insan plazma örnekleri kurumsal etik yönergelere uygun olarak toplanmakta ve tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onayı alınmıştır.
      DIKKAT: İnsan plazması biyolojik tehlikelidir. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlükle biyolojik güvenlik dolabının (BSC) içinde tutun. Tüm plazma içeren malzemeleri kurumsal biyogüvenlik ve atık bertaraf düzenlemelerine uygun olarak bertaraf etmelidir.

3. PC'nin Oluşumu

  1. Manuel sıvı taşıma
    1. Plazma seyreltmesini ayarlamak için Bicinchoninic Acid (BCA) testiyle protein konsantrasyonunu niceleyerek optimal NP: plazma oranını belirleyin.
    2. İstenilen plazma konsantrasyonlarına ulaşmak için 100 μL NP süspansiyonu 100 μL plazmaya eklenin.
    3. 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
      NOT: BCA testi için, Reaktifler A ve B'yi (50:1) karıştırın, BSA standart seyreltmeleri hazırlayın, 10-25 μL örnek/standart + 200 μL reaktif ekleyin, 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın ve 562 nm'de absorbansı ölçün. Plazma konsantrasyonları genellikle NP hacmine göre %0,5 ile %50 v/v arasında ayarlanır, NP türüne bağlı olarak. GO için daha düşük konsantrasyonlar kullanın (%0,5'ten %5'e kadar önerilir); DOTAP/altın NP'leri için daha yüksek konsantrasyonlar kullanın (%50'ye kadar). 1.5 mL düşük bağımlı protein tüpleri kullanın.
  2. Otomatik kuluçka protokolü
    1. Sıvı işleme yazılım protokolünü otomatik pipetleme platformuna yükleyin (20 μL + 200 μL başlıklar).
    2. Her NP tipinden 100 μL düşük bağımlı 1.5 mL tüplere dağıtın.
    3. 2.1 ve 2.2'de olduğu gibi hazırlanmış yeniden oluşturulmuş plazmayı aşağıdaki formüle göre ekleyin:
      burada VNP, NP askıya alma hacmidir. 100 μL NP için:
      figure-protocol-1
      %5: 5.3 μL HP
      %20: 25 μL HP
      %50: 100 μL HP
    4. 200 μL'ye ulaşmak için ultra saf su ekleyin:
      5%: 94.7 μL
      %20: 75 μL
      %50: Hiç yok
    5. Miks örnekleri:
      %5: 15 μL döngü
      %20: 50 μL döngü
      %50: 100 μL döngü3.2.6. 37 °C'de 1 saat kuluçka
      NOT: Ek Şekil 1, NP-HP karışımlarını üç nihai plazma konsantrasyonunda (%5, %20 ve %50 v/v) hazırlamak için kullanılan otomatik kurulumun grafik arayüzünü göstermektedir; her biri üçlü olarak. Güverte düzeninde uç rafları, bir atık rezervuarı ve NP süspansiyonları (GO, altın nanoküreler ve DOTAP lipozom) (NP), HP ve ultrasaf su (H2O) içeren 3 × 4 düşük bağlı tüp rafı bulunur. Protein düşük bağlı tüpler kullanın.

4. SDS-PAGE tarafından PC analizi

  1. PC izolasyonu
    1. NP-HP örneklerini 18.620 x g, 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Tüpün tabanında görünür bir pelet olmalı. Süpernatantı dikkatlice atın, ilerlemeden önce şeffaf görünmelidir ( bkz. Ek Şekil 2).
    2. Pelleti 200 μL ultra saf suyla yıkayıp tekrar süskü ve tekrar santrifüj yapın. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, kompakt bir pelet hâlâ görünür olmalı ve NP-protein komplekslerinin başarılı izolasyonu doğrulanır ( bkz. Ek Şekil 2).
    3. Yükleme tamponunu (LB) hazırla:
    4. Plazma durumu ve karışım indirgeme ajanı (1:10), SDS örnek tamponu denatüre proteinleri (1:2) ve suya dayalı toplam LB hacmi hesaplayın.
    5. Pelleti uygun 1x LB hacimde tekrar süzülün ve 100 °C'de 10 dakika kaynatın.
    6. 18.620 x g, 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı topla.
  2. SDS-PAGE örnek yükleme
    1. Merdiveni, molyar ağırlık (MW) standardını yükleme tamponu ile seyreltileyerek hazırlayın.
    2. 10x Tris/Glycine/SDS tamponu 1x kadar seyreltin.
    3. Elektroforez odasını %4-20 lekesiz gradyan jel ile birleştirin ve üreticinin belirttiği seviyeye ulaşana kadar akan tampon ekleyin.
    4. Her kuyuya 10 μL örnek ve 7 μL merdiven yükleyin. Oda sıcaklığında 150 V'da ~90 dakika boyunca jel çalıştırın.
      NOT: LB hacmi, jel görüntüsünde optimal protein görselleştirmesini sağlamak için 3.1.1'de seçilen plazma konsantrasyonuna göre hesaplanmalıdır (genellikle 20 μL LB'de 10 μg protein).
      DIKKAT: Optimal tekrarlanabilirlik için, yeni hazırlanmış NP-plazma örnekleri kullanılarak SDS-PAGE analizi yapın. Yıkanmış peletlerin -80 °C sıcaklıkta 24 saat boyunca saklanması, hem fizikokimyasal özelliklerde (yeniden süspansiyon ve DLS/zeta potansiyel ölçümlerinden sonra) hem de protein korona parmak izlerinde (protokolün 4.3.1. adımından itibaren peletler işlendiğinde; bkz. Ek Şekil 3) tespit edilebilir değişikliklere yol açtı.

5. Protein desenleri analizi

  1. Görüntü işleme
    1. Kemilyünlüminesans görüntüleyici kullanarak görüntü jelleri.
    2. Jel görüntüsünü aşağıdaki şekilde işleyin:
      1. Jel görselini içe aktarın ve TIFF dosyası olarak kaydedin, özellikle çevresel şeritleri etkileyen eğik şerit bozulmaları gibi istenmeyen etkiler için düzeltin. Tüm jel şeritleri tespit edin. Arka plan sinyalini görüntüden çıkarın.
      2. Dikey kaymaları, piksel birimleri moleküler ağırlık birimlerine dönüştürerek kalibre edin; bu, işaretleyici şeridin çift terimli üstel uyumuna dayanır. Yoğunluk profillerini ve şerite özgü sinyal dağılımlarını görselleştirmek için grafiksel çıktılar üretin.
    3. İşlenen verileri, yani hesaplanan tek boyutlu profilleri dışa aktarın.
    4. Moleküler ağırlık dağılımlarını profilleri normalleştirerek hesaplayın ve her şerit için istenen MW aralıkları boyunca integral alanlar hesaplayın.
    5. Çıktı verilerini, yani belirlenen moleküler ağırlık aralıklarındaki integral alanları dışa aktarın.
  2. Tanı için çok değişkenli analiz
    1. Sınıflandırma analizi için lineer ayırt edici analiz (LDA) veya diğer çok değişkenli yöntemler uygulanır.
    2. Doğruluğu, hassasiyeti, özgüllüğü hesaplayın ve ROC analizi yapın.
      NOT: Görüntü işleme, profil normalizasyonu, uyum ve sınıflandırma için kullanılan betikler27'den itibaren mevcuttur ve ilgili kullanıcı kılavuzu da burada mevcuttur.
      DIKKAT: İnsan plazmasını kullanırken biyogüvenlik protokollerine uyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PC deneylerini standartlaştırmadaki en büyük zorluklardan biri, daha önce bu çalışmada vurgulandığı gibi, teknik ve operatöre bağlı değişkenliği en azaindirmektir 26. Operatör önyargısı gibi deneysel değişkenlerin etkisi ve otomatik araçların tekrarlanabilirlik üzerindeki etkisiyle ilgili açık sorular hâlâdevam etmektedir 18,28.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NP türleri arasında yöntem çok yönlülüğü ve tekrarlanabilirlik

Burada sunulan protokol, HP ile kuluçka sırasında NP'de oluşan PC'yi izole etmek ve karakterize etmek için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar. Önceki ve mevcutçalışmalarda gösterildiği gibi, yöntem kişiselleştirilmiş bilgisayarın biyolojik ve tanısal açıdan ilgili özelliklerini yakalayan SDS-PAGE tabanlı moleküler parmak izlerinin olu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araştırma kısmen MUR tarafından finanse edilmiştir; Avrupa Birliği-NextGenerationEU tarafından finanse edilen NRRP'ye Tamamlayıcı Yatırımlar Ulusal Planı, "D3 4 HEALTH-Dijital Odaklı Teşhis, Prognostik ve Sürdürülebilir Sağlık Bakımı için Tedaviler" Projesi. PNC0000001, Spoke 3 Linea tematica 2, görev 4, bileşen 2 CUP: B53C22006120001. Bu çalışma, IG. 2020-ID. 24521 projesi kapsamında AIRC Vakfı tarafından da desteklendi, P.I. Pozzi Daniela.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5ML Protein LoBind TÜPÜEppendorf22431081
10x Tris/Glisin/SDSBiorad1610732
SantrifüjLabortechnikZ 216 MK Hermle18.620 RCF'de 20 dakika boyunca 4 derece ve derecede kullanıldı; C
ChemiDoc görüntüleme sistemiBio-Rad12003153Jel görüntü elde etmek için kullanılır
KloroformSigma AldrichC2432-1LDOTAP için çözücü
Corning 1-200 & mikro; L Universal Fit Toplu Paketlenmiş Pipet UçlarıCorning4845
Criterion TGX Lekesiz Precast JellerBiorad5678095
6 x 1L damıtılmış suThermo Fisher15230001
DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimetilamoniyum-propan)Avanti Polar Lipidleri890890P-200mgKatyonik lipozomların hazırlanmasında kullanılır; kloroformda çözünür, buharlaştırılır, hidratlanır ve ekstrüze edilir
Enduro 300V Güç Kaynağı Labnet E0303-230V
GloMax Discover Microplate ReaderPromegaGM3000
Altın nanopartiküller (sitratla stabilize edilmiş)Sigma-Aldrich742031-25MLNanomateryal olarak kullanılmıştır; Daha fazla arıtma olmadan kullanılmıştır
Gradient poliakrilamid jel (4&ntir; %20 TGX)Bio-Rad5678095SDS&ndash için kullanılır; SAYFA
Grant Instrument  Thermoshaker HC24N (24 x 1.5mL mikrotüpler)Fisher bilimselPHMT-PSC24N
Grafen Oksit (GO) çözeltisiGrafeneGO-4-1000Nanomateryal olarak kullanılmıştır; 0,25 mg/mL'ye seyreltiltilip soniklenmiştir
İnsan Plazması (HP)Sigma-AldrichP9523-5MLNanopartikül kuluçkasında kullanılır
ImageLab YazılımıBio-Rad. Sürüm 6.1.0.07/Jel görselini TIFF dosyası olarak dışa aktarmak için kullanılır
Laemmli yükleme tamponu 2xBiorad1610737Pelletlerin yeniden süzülmesi için kullanılır
MATLABMathWorks. Versiyon R2022a/Görüntü işleme, veri analizi ve profil hesaplama için kullanılır
Mini-EkstruderAvanti Polar Lipidleri610020Lipozom hazırlamada kullanılır
NuPAGE Örnek İndirgetici Ajan (10X)Termo BilimselNP004
Fosfat Tuzlu TamponuCorning 21-031-cmDOTAP-HP örnekleri için kullanılıyor
Pierce BCA Protein Analiz Seti, 1 Kit (1 L)ThermoFisher23225
Pipet uçları 0.5-10ul şeffafAxygenT-300-STK
PIPETMAN L P10L, 0.5-10 ve mikro; L, Metal EjtörGilsonFA10002M
PIPETMAN P20, 2-20 & MIKRO; L, Metal EjtörGilsonF144056M
PIPETMAN P200, 20-200 & MICRO; L, Metal EjtörGilsonF144058M
PIPETMAX otomatik pipetleme sistemiGilsonGSYS0021Otomatik örnek işleme için kullanılır
Polikarbonat filtre (0.1 ve mikro; m)Avanti Polar Lipidleri610005-1EALipozom ekstrüzyonu için kullanılır
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein StandartlarıBiorad1610373
Precision Plus Protein Lekesiz Standartları Biorad1610363EDU
Vibra hücresi sonikatörü VC505Sonics and Materials Inc.VC505
ZetaSizerMalvernZS90Dinamik ışık saçılması (DLS) ve mikroelektroforez (ME) ölçümleri için kullanılır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, R., Chen, C. The crown and the scepter: Roles of the protein corona in nanomedicine. Adv Mater. 31 (45), 1805740(2019).
  2. Caputo, D., et al. Nanotechnology meets oncology: A perspective on the role of the personalized nanoparticle-protein corona in the development of technologies for pancreatic cancer detection. Int J Mol Sci. 23 (18), 10591(2022).
  3. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: A test study. ACS Nano. 5 (9), 7503-7509 (2011).
  4. Hajipour, M. J., et al. Personalized protein coronas: A "key" factor at the nanobiointerface. Biomater Sci. 2 (9), 1210-1221 (2014).
  5. Quagliarini, E., et al. Protein corona-enabled serological tests for early-stage cancer detection. Sens Int. 1, 100025(2020).
  6. Caracciolo, G., et al. Size and charge of nanoparticles following incubation with human plasma of healthy and pancreatic cancer patients. Colloids Surf B Biointerfaces. 123, 673-678 (2014).
  7. Barrán-Berdón, A. L., et al. Time evolution of nanoparticle-protein corona in human plasma: Relevance for targeted drug delivery. Langmuir. 29 (21), 6485-6494 (2013).
  8. Yu, Y., Luan, Y., Dai, W. Dynamic process, mechanisms, influencing factors, and study methods of protein corona formation. Int J Biol Macromol. 205, 731-739 (2022).
  9. Hadjidemetriou, M., Kostarelos, K. Evolution of the nanoparticle corona. Nat Nanotechnol. 12 (4), 288-290 (2017).
  10. Caputo, D., et al. A protein corona-enabled blood test for early cancer detection. Nanoscale. 9 (1), 349-354 (2017).
  11. Pozzi, D., Caracciolo, G. Exploiting differences in personal nanoparticle corona profiles for cancer diagnostics. , Taylor & Francis. 431-433 (2025).
  12. Vence, M. G., et al. Potential clinical applications of the personalized, disease-specific protein corona on nanoparticles. Clin Chim Acta. 501, 102-111 (2020).
  13. Di Domenico, M., et al. Nanoparticle-biomolecular corona: A new approach for the early detection of non-small-cell lung cancer. J Cell Physiol. 234 (6), 9378-9386 (2019).
  14. Papi, M., et al. Exploitation of nanoparticle-protein interactions for early disease detection. Appl Phys Lett. 114 (16), 163702(2019).
  15. Di Santo, R., et al. Protein corona profile of graphene oxide allows detection of glioblastoma multiforme using a simple one-dimensional gel electrophoresis technique: A proof-of-concept study. Biomater Sci. 9 (13), 4671-4678 (2021).
  16. Caputo, D., et al. Synergistic analysis of protein corona and haemoglobin levels detects pancreatic cancer. Cancers. 13 (1), 93(2020).
  17. Colapicchioni, V., et al. Personalized liposome-protein corona in the blood of breast, gastric and pancreatic cancer patients. Int J Biochem Cell Biol. 75, 180-187 (2016).
  18. Di Santo, R., et al. Personalized graphene oxide-protein corona in the human plasma of pancreatic cancer patients. Front Bioeng Biotechnol. 8, 491(2020).
  19. Digiacomo, L., et al. Efficient pancreatic cancer detection through personalized protein corona of gold nanoparticles. Biointerphases. 16 (1), 011010(2021).
  20. Caputo, D., Caracciolo, G. Nanoparticle-enabled blood tests for early detection of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Lett. 470, 191-196 (2020).
  21. Caracciolo, G., et al. Challenges in molecular diagnostic research in cancer nanotechnology. Nano Today. 27, 6-10 (2019).
  22. Ashkarran, A. A., et al. Measurements of heterogeneity in proteomics analysis of the nanoparticle protein corona across core facilities. Nat Commun. 13 (1), 6610(2022).
  23. Pederzoli, F., et al. Protein corona and nanoparticles: How can we investigate on. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 9 (6), e1467(2017).
  24. Otoo, J. A., Schlappi, T. S. REASSURED multiplex diagnostics: A critical review and forecast. Biosensors. 12 (2), 124(2022).
  25. Papi, M., Caracciolo, G. Principal component analysis of personalized biomolecular corona data for early disease detection. Nano Today. 21, 14-17 (2018).
  26. Giulimondi, F., et al. Reproducibility of biomolecular corona experiments: A primer for reliable results. Part Part Syst Charact. 40 (2), 2200169(2023).
  27. Renzi, S., et al. Structuring lipid nanoparticles, DNA, and protein corona into stealth bionanoarchitectures for in vivo gene delivery. Nat Commun. 15 (1), 9119(2024).
  28. Van Dorpe, S., et al. Integrating automated liquid handling in the separation workflow of extracellular vesicles enhances specificity and reproducibility. J Nanobiotechnology. 21 (1), 157(2023).
  29. Quagliarini, E., et al. The influence of protein corona on graphene oxide: Implications for biomedical theranostics. J Nanobiotechnology. 21 (1), 267(2023).
  30. Jiříčková, A., et al. Synthesis and applications of graphene oxide. Materials. 15 (3), 920(2022).
  31. Saorin, A., et al. A redefined protocol for protein corona analysis on graphene oxide. ACS Nanosci Au. , (2025).
  32. Digiacomo, L., et al. Nanoparticle-protein corona enhances accuracy of Ca-19.9-based pancreatic cancer classification. Nanoscale. 17 (12), 7066-7075 (2025).
  33. Caputo, D., et al. Improving the accuracy of pancreatic cancer clinical staging by exploitation of nanoparticle-blood interactions: A pilot study. Pancreatology. 18 (6), 661-665 (2018).
  34. Quagliarini, E., et al. A decade of the liposome-protein corona: Lessons learned and future breakthroughs in theranostics. Nano Today. 47, 101657(2022).
  35. Wu, S. Y., An, S. S. A., Hulme, J. Current applications of graphene oxide in nanomedicine. Int J Nanomedicine. 10 Suppl 1, 9-24 (2015).
  36. Caputo, D., et al. Multiplexed detection of pancreatic cancer by combining a nanoparticle-enabled blood test and plasma levels of acute-phase proteins. Cancers. 14 (19), 4658(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Nanopartik l Plazma Etkile imiGrafen Oksit Nanopartik llerDinamik I k Sa l mBCA AnaliziElektroforetik ProfillerPankreas Kanseri Biyobelirte leri

İlgili makaleler