Yöntem makalesi

In vitro kimerik antijen reseptör T hücresi taraması için hastadan türetilen üç boyutlu tümör organoid modeli

DOI:

10.3791/69113

⸱

30 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hasta kaynaklı tümör organoidleri ve kimerik antijen reseptör T (CAR-T) hücrelerini kullanarak CAR-T hücrelerinin katı tümör hücrelerine karşı spesifik sitotoksik aktivitesini değerlendirmek için in vitro bir ortak kültür modeli oluşturur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimerik antijen reseptörü T (CAR-T) hücre tedavisi, hematolojik malignitelerde heyecan verici klinik etkinlik sağlamıştır, ancak katı tümörler için CAR-T hücre tedavisi hâlâ daha fazla geliştirme gerektirir. Hasta kaynaklı tümör organoidleri, hasta heterojenliğini koruyan in vitro hastalık modelleridir ve kemoterapi ile hedefli ilaçların etkinliği ve güvenliğini test etmek için kullanılmıştır. Bu yöntem, tümör organoidlerinin CAR-T hücreleriyle birlikte kültürlenmesine yönelik in vitro etkinlik test modelini tanımlar. Hastalardan alınan kolorektal kanser örnekleri, bazaz membran matriksinde üç boyutlu (3D) yapıya sahip tümör organoidlerine dönüştürülür. Tümör organoidleri istikrarlı büyüyebilir ve sürekli geçiş yapabilir. Olgun tümör organidleri yıkama ve santrifüjleme ile matriksden ayrılır ve CAR-T hücreleri farklı efektör-hedef (E:T) oranlarında eklenerek bağışıklık organoid ortak kültür sistemi oluşturulur. 6-24 saat sonra, organoidlerin morfolojisi ve hücrelerarası yapıları parlak alan görüntülemesiyle gözlemlenir. Bu deney, organoidlerin canlılığını yansıtabilen ve CAR-T hücrelerinin tümör organoidleri üzerindeki sitotoksik etkisini değerlendirebilen ko-kültür sisteminde ölü hücre boyama işlemi de gerçekleştirmektedir. Bu deney, CAR-T hücreleri ile 3D tümör organoidleri arasındaki etkileşimi etkili bir şekilde gözlemleyebilir ve sonuçlar CAR-T hücrelerinin tümör öldürme aktivitesini değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimerik antijen reseptörü T (CAR-T) hücre tedavisi, hematolojik kanserlerin tedavisinde dikkat çekici klinik başarıgöstermiştir 1. Ancak, tümör heterojenliği ve antijen kaybı, tümör kütlesi içindeki fiziksel ve kimyasal engeller ile immünosupresif tümörmikroçevresi 2,3 gibi birkaç büyük engel nedeniyle katı tümörlerde uygulanması sınırlı kalır. Bu zorluklar, katı tümör ortamlarında CAR-T hücre tedavisinin sınırlı etkinliğine katkıda bulunur.

CAR-T hücre etkinliğinin in vitro değerlendirmesi, preklinik gelişim sürecinde kritik bir adımdır. En yaygın kullanılan modeller, tümör hücre hatlarıdır; bunlar ya spesifik tümörle ilişkili antijenleri ifade edebilir ya dalusiferaz 4,5 gibi raporlayıcı genler taşıyacak şekilde tasarlanabilir. Sonuç olarak, geleneksel hücre hattı tabanlı testlerden elde edilen sonuçlar genellikle klinik sonuçları öngöremez. Hastadan türetilen tümör modelleri, katı tümörler bağlamında CAR-T fonksiyonunu daha doğru değerlendirmek için umut verici bir alternatif sunar.

Birçok çalışma CAR-T hücre değerlendirmesi için PDTO'ları kullanmaya başlamış olsa da, 3D tümör mimarisinin korunmasını etkili bir şekilde bağışıklık hücre-tümör hücresi etkileşimiyle dengeleyen standart, sağlam ve erişilebilir ortak kültür protokollerinin kurulmasındaki zorluklar hâlâ devam etmektedir. Hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDTO'lar), hasta tümör dokuları veya hücrelerinden üretilen üç boyutlu (3D) ex vivo hastalık modelleridir. PDTO'lar, kolorektal, meme, pankreas ve akciğer kanserleri dahil olmak üzere çok çeşitli tümör türleri için başarıyla belirlenmiştir. Bu yapılar, orijinal tümörün histolojik mimarisini, moleküler profillerini ve fonksiyonel heterojenliğinikorur 6. Birincil tümör hücreleri ve hastadan kaynaklanan ksenograftların (PDX) yanında, PDTO'lar hastaya özgü hastalık özelliklerini modellemek için değerli bir platformoluşturur 7. Geleneksel tümör hücre hatları veya birincil kültürlere kıskandığında, PDTO'lar in vivo tümör ortamını daha yakından yansıtır; karmaşık hücresel bileşimler ve yapısal organizasyongösterir 8. Ayrıca genomik istikrarı korur ve gen ifade kalıplarını uzun geçişler boyunca korur, böylece terapötik yanıtların daha doğru değerlendirilmesinisağlar 9,10. PDTO'lar, tümör biyolojisi, ilaç taraması ve hassas tıp çalışmalarında başarıyla kullanılmıştır ve yeni CAR hedeflerinin tanımlanması, CAR tasarım optimizasyonu ve sitotoksisitedeğerlendirmesi gibi immünoterapi testlerinde giderek daha fazla tanınmaktadır. Organoid kültürün yaygın bir sınırlaması, 3D yapı bakımı için Matrigel (bundan sonra bazal membran matrisi [BMM] olarak adlandırılır) gibi ekstrasellüler matris (ECM) bileşenlerine bağımlılığıdır; bu da ortak kültür testlerinde bağışıklık hücresinin sızmasını engelleyebilir. Ortak kültürde tutarlılık ve optimal hücre etkileşimini sağlamak için, belirli bir boyut aralığında (örneğin, çapı 100-200 μm) organoidler genellikle seçilir.

Bu protokol, kolorektal kanserden türetilen PDTO'lar kullanılarak CAR-T hücresi sitotoksisitesini değerlendirmek için bir ortak kültür platformunu tanımlar. Hasta tümör örnekleri enzimatik olarak ayrılır ve BMM'de kültürlenir ve 3D organoid üretilir. Olgunlaşıp genişledikten sonra, tekdüze boyuttaki organoidler izole edilir ve floresan olarak etiketlenir. Çok kuyu plakalarına tohumlanır ve CAR-T hücreleriyle farklı efektör-hedef (E:T) oranlarında birlikte kültürlenirler. Bu yaklaşımın temel özelliği, ortak kültür öncesinde PDTO'ların BMM'den kasıtlı olarak çıkarılmasıdır; bu da CAR-T hücrelerinin tümör organoidlerine doğrudan ve engelsiz erişimini sağlarken, süspansiyonda 3D bütünlüklerini korur. 24 saat sonra, parlak alan mikroskopisi, 3D morfolojisinin bozulması, tümör hücre küçülmesi ve canlılık kaybı ile karakterize edilen ilerleyici PDTO ayrışmasını ortaya koyar. Canlı hücre görüntüleme ve floresan mikroskobi, floresan olarak işaretlenmiş CAR-T hücreleri ile tümör hedefleri arasındaki etkileşimleri daha da görselleştirir. Sitotoksisiteyi değerlendirmek için nicel hücre ölümü testleri kullanılır. Bu organoid tabanlı bağışıklık ko-kültürü, CAR-T hücrelerinin antitümör etkinliğini ex vivo değerlendirmek için sağlam ve hastaya özgü bir platform sağlar; terapötik optimizasyonu mümkün kılar ve klinik çeviriyi destekler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolorektal kanser hastasından kaynaklanan organoidler kullanıldı. Tümör dokusu parçaları, histolojik olarak doğrulanmış primer kolorektal adenokarsinomlu (CRC) tedavi görmeyen hastalardan alındı. Tüm dokular, Shenzhen Qianhai Shekou Serbest Ticaret Bölgesi Hastanesi'nde standart tanı işlemleri sırasında toplanan endoskopik biyopsi örneklerinden temin edilmiştir. Tüm donör dokular, kurumsal patologlar tarafından histopatolojik muayene yoluyla CRC olarak doğrulandı. Protokol kurumsal yönergelere uyar. Tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onaylar alındı. Çalışma, Shenzhen Qianhai Shekou Serbest Ticaret Bölgesi Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (2024KY-009-01K).

1. PDTO kültürü

  1. Doku hazırlığı
    1. Histolojik olarak doğrulanmış primer kolorektal adenokarsinomlu (CRC) hastalardan kolonoskopi biyopsisi ile elde edilen tümör dokusu parçalarını, steril 50 mL tüpe yerleştirin.
    2. 30 mL soğuk doku yıkama çözeltisi eklenin; bunlar Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), %1 İnsığır Serum Albümini (BSA), 100 U/mL penisilin (0,1 mg/mL) streptomisin, 50 μg/mL gentamisin, 5 μg/mL amfoterisin B ve 10 μM Rho ilişkili kinaz inhibitörü (Y-27632) içerir.
    3. Tüpü buzun üzerine koyun ve mendiliyi yıkamak için 5 dakika boyunca nazikçe sallayın.
    4. 1.1.3 adımını tekrarlayın. Yeni doku yıkama çözeltisi ile iki kez daha kullandım.
  2. Doku sindirimi
    1. Nekrotik veya yağ dokusunu kesin ve tümörü doku parçalarına bölün.
    2. 8 mL sindirim ortamı (DMEM ortamı, 500 U/mL kollagenaz IV, 1,5 mg/mL kollagenaz II, 20 μg/mL hyaluronidase, 0,1 mg/mL dispaz tip II, 10 μM Y-27632 ve %1 fetal sığır serumu) 37 °C'ye ısındır.
    3. Parçaları sindirim tamponuna aktarın ve 37 °C'de su banyosunda kuluçka yapın. Tüpü her 5 dakikada ~10 saniye boyunca elle nazikçe çevirerek enzim nüfuzunu kolaylaştırın.
      NOT: Sindirim tamponu hacmini doku blok boyutuna göre ayarlayın. Genellikle, endoskopik biyopsi boyutları için 8-10 mL yeterlidir.
    4. Dissosiyasyon durumunu kontrol etmek için 15 dakika sonra mikroskop altında gözlemleyin. Doku parçaları kalırsa, sindirimi maksimum 30 dakikaya kadar sürdürebilirsiniz.
    5. Kümeler göründüğünde, mekanik olarak ayrışmak için 10 mL'lik pipet kullanarak nazikçe (5-10 kez) pipet yapın. Santrifüj 350 × g'de 5 dakika boyunca koyun.
    6. Üst yüzeyi atmak; Pelleti 10 mL yıkama çözeltisinde tekrar süspansiyona salın, 350 × g sıcaklıkta 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Yıkamayı iki kez tekrarlayın.
      NOT: PDTO'lar genellikle kültürden sonra 3-5 gün içinde kompakt küresel yapılar oluşturmaya başlar. Organoidler sağlam bir çoğalma gösterdi ve 10-14. gün arasında deney için uygun boyuta (yaklaşık 100-200 μm çap) ulaştı. Sağlıklı büyümeyi sürdürmek ve aşırı birleşme veya merkezi nekrozu önlemek için geçiş her 7-10 günde bir gerçekleştirildi. Genellikle, biyopsi başına 8-10 mL sindirim tamponu (2 mm³ parça) kullanılır ve böylece TrypLE Express 1× nihai çalışma konsantrasyonunda elde edilir.

2. PDTO'ların İnşası

  1. Matris gömme
    1. 200 μL BMM (4 °C'de önceden soğutulmuş) temiz bir tüpten alın ve hücre pelletini önceden soğutulan pipet ucu ile en az 10-15 kez yukarı ve aşağı pipetleyin; süspansiyon homojen hale gelene kadar görünür kümeler oluşmaz.
    2. 24 kuyuluğa sahip bir plakanın her kuyusuna yaklaşık 30 μL damlacık dağıtın. 37 °C'de 10 dakika kuluçka yapın ve katılaşın.
    3. 500 μL organoid kültür ortamı ekleyin (İleri DMEM/F12 ortamı, 50 μg/mL R-spondin 1, 10 μg/mL Noggin, 500 μg/mL EGF, 100x HEPES, 100x Glutamax, 500x Normocin, 500x Gentamisin/amfoterisin B, 50x N2, 100x B27, 500 mM n-Asetilsistein, 1 M Niacinamide, 5 mM Alk 4/5/7 inhibitörü, 30 M p38 inhibitörü, 100 μM Gastrin, ve her kuyu başına 100 μM Prostaglandin E2) içerir.
      NOT: Her damlacık başına yaklaşık 30 μL BMM kullanın; Hücre yoğunluğuna göre ayarlayın.
  2. Kültür bakımı
    1. 37 °C'de kültür organoidleri ve %5CO2; Her 3 günde bir malzeme değiştir.
    2. Organoid oluşumunu günlük olarak izleyin. 3. güne kadar küçük küreler bekleyin.
    3. 6-10. günler arasında başarılı organoid oluşumunu değerlendirin. Oluşum süresi (3 ila 14 gün arasında değişir) doku canlılığı ve kök yapısına bağlıdır.

3. Pas PDTO'ları

  1. Ayrıştırma
    1. Santrifüjü 4°C'ye kadar önceden soğutun. Ortamı çıkarın ve 1 mL buz gibi soğuk HBSS ekleyin ve BMM'yi bozmak için 3-5 kez nazikçe pipet ekleyin.
      NOT: İyi büyümüş organoidler çıplak gözle küçük beyaz noktalar olarak gözlemlenebilir.
    2. Süspansiyonu steril 15 mL bir tüpe aktarın ve 350 × g seviyesinde 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  2. Enzim ayrışması
    1. Üst maddeyi atıp 1 mL TrypLE ekleyin. 37 °C-lik bir banyoya 2 dakika koyun.
    2. TripLE'yi nötralize etmek için 2 ml HBSS ekleyin; 350 × g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    3. Üst maddeyi çıkarın ve 2 mL HBSS ile tekrar süzülün. Tekrar 350 × g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  3. Yeniden gömülme
    1. Pellete taze BMM ekleyin, 1:3-1:6 oranında (organoid pellet: BMM, v/v); Nazikçe tekrar tekrar çek. Her damlacık yaklaşık 30 μL nihai hacim içerir. Damlaları yeni bir 24 kuyu levhaya yerleştirir; 37 °C'de 10 dakika kuluçka için.
    2. Her kuyu başına 500 μL kültür ortamı ekleyin ve %5CO2 ile 37 °C'de kuluçka yapın.
    3. Kuyular her gün incelen; yaklaşık 48 saat içinde 3D yeniden birleştirmeyi gözlemler.
    4. 3-5 geçişten sonra, aşağı akış testleri veya kriyo-koruma için sağlıklı organoidler seçin.

4. CAR-T hücreleri ve PDTO'ların birlikte kültürlenmesi

  1. Ortak kültür ortamı hazırlama
    1. CAR-T kullanılabilirliğini desteklemek için 10 ng/L IL-2 ve 0,05 mM β-merkaptoetanol içeren baz organoid kültür ortamı takviye edin.
      NOT: Baz ortam, PDTO'ların 3D yapısını ve uygulanabilirliğini destekler.
  2. PDTO hazırlığı
    1. Olgun PDTO'lar içeren BMM damlacıklarını (örneğin, 4-6. Günler) steril hücre kazıyıcı veya pipet ucu kullanarak kültür plakasından çıkarın.
    2. BMM/PDTO karışımını 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
    3. Tüpe 5-10 mL buz gibi soğuk HBBS veya doku yıkama çözeltisi (adım 1.1.2'de açıklandığı gibi) ekleyin. BMM'den organoid maddeleri çıkarmak için nazikçe 5-10 kez ters çevirin.
    4. Karışımı buzun üzerinde 5 dakika bekletin. BMM likit hale gelirken, ayrışmış PDTO'lar askıya alınmaya devam eder.
    5. BMM içeren süpernatantı dikkatlice aspire edin, PDTO pelletini geride bırakın. Peleti rahatsız etmekten kaçının.
    6. BMM'nin tamamen kaldırılmasını sağlamak için 4.2.3'ten 4.2.5'e kadar olan adımları iki kez daha tekrarlayın.
    7. Son yıkamadan sonra, PDTO içeren süpernatantı toplayıp 300 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    8. Süpernatantı aspire edin ve PDTO pelletini 1-2 mL organoid kültür ortamı veya ortak kültür ortamında yeniden süzülür.
    9. (Sayma için isteğe bağlı) Tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
      1. Hassas sayım gerekirse, yeniden askılanan organoidleri yeni bir tüpe aktarın ve 37 °C'de önceden ısıtılmış TrypLE Express ile 3-5 dakika kuluçka yapın, ardından nazik pipetleme ile tek hücreli süspansiyon elde edilir. Hücre sayımı (örneğin, hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak) devam edin.
        NOT: Bu adım organoidleri ayırır ve yeniden kaplamadan önce sadece sayma amaçları içindir.
    10. Boyut seçimi ve standartlaştırma: Ortak kültür için tutarlı organoid boyutunu sağlamak için, yeniden askılanan PDTO'lar (adım 4.2.8'den itibaren) 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine yerleştirilen 70 μm hücre süzgecinden geçirilir. Bu adım, büyük organoid agregaları ve kalıntıları ortadan kaldırır; bu da uniform ortak kültüre uygun standart boyut fraksiyonunu temsil eder.
    11. Standart organoid süspansiyonu 300 × g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
    12. Süpernatantı aspire edin ve standartlaştırılmış PDTO'ları uygun bir hacmde önceden ısıtılmış ortak kültür ortamında yeniden askıya alın.
    13. Standartlaştırılmış PDTO'ları sayın (örneğin, mikroskop altında hemositometre kullanarak, alan başına organoid sayısını sayarak).
      NOT: Sayım hücre numarasına değil, organoid sayısına dayanır.
    14. Standartlaştırılmış PDTO'ları, hedef sayıda kuyu başına istenen çok kuyu plakasına (örneğin, 96 kuyuyla U-bottom plakası) tohumlayın.
    15. CAR-T hücrelerini kuyulara istenen efektör-hedef (E:T) oranlarında ekleyin.
  3. PDTO'ların Etiketlenmesi
    1. Santrifüjü 4 °C'ye kadar önceden soğutun. Ortamı aspire edin; Damlacıkları yerinden çıkarmak için 1 mL HBSS ekleyin.
    2. 15 mL santrifüj tüpüne aktarın, 4 mL HBSS ekleyin ve nazikçe pipet yapın. Santrifüj 350 × g'de 5 dakika boyunca koyun.
    3. Süpernatantı atın, 5 mL HBSS ekleyin ve nazikçe pipet yapın. Tekrar 350 × g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Hoechst 33342 çalışma çözümünü hazırlayın.
    5. Pelleti 1 mL Hoechst 33342 çözeltisinde (son konsantrasyon 5 μg/mL) yeniden süzülür. Boyanın eşit penetrasyonunu sağlamak için 3-5 kez çevirerek nazikçe karıştırın. Tüpü alüminyum folyoya sararak ışıktan korun. 37 °C'de 10 dakika kuluçka yapın. Boyadan sonra fazla boya çıkarmak için HBSS ile iki kez yıkayın.
  4. PDTO'ların kaplama
    1. Jel damlacık-kuyuk oranında organoid yoğunluğunu 1:5 olarak tahmin edin; yaklaşık 1 ×103 organoid/mL ile birlikte kültür ortamında tekrar süzülür.
    2. 96 kuyu başına 100 μL eklenir; Her koşul başına en az üçlük ekleyin.
      NOT: Bu aşamada hücre sayımı yapılmamalıdır; organoidler sağlam kalır.
  5. CAR-T ortak kültürü
    NOT: Bu protokol, PDTO'larla birlikte CAR-T hücrelerinin birlikte kültürlenmesi ve etkinlik değerlendirmesine odaklanır. Bu çalışmada kullanılan CAR-T hücrelerinin üretimi ve karakterizasyonu Bölüm 8'de açıklanmıştır.
    1. CAR-T hücrelerini log fazında hasat edin. Uygulanabilirliği doğrulamak için Trypan Blue ile boya >95%.
    2. Santrifüj hücreleri 350 × g 5 dakika boyunca; Ortak kültür ortamında yeniden devam edin.
    3. Konsantrasyonları 4 × 106/mL, 2 × 106/mL ve 1 × 106/mL olarak ayarlayın.
    4. Deneysel tasarıma göre her kuyuya 100 μL CAR-T süspansiyonu ekleniyor. Kuyular kontrolü için 100 μL ortak kültür ortamı ekleyin.
    5. Levha 37 °C'de, %5CO2 sıcaklığında 6-24 saat kuluçka yapın.

5. Ölü hücre lekelenmesi

  1. SYTOX yeşil boyama
    1. Her 1 × 105hücre için , 1 μL SYTOX Green (1000x) seyreltilerek 1 mL test tamponu ile 100 μL Nuclear Green boyama çözeltisi hazırlanır.
    2. 6 ve 24 saatlik ortak kültür zaman noktalarında, her kuyuya 100 μL SYTOX Green boyama çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 20 dakika karanlıkta kuluçka yapın.

6. Görüntü Edinimi

  1. Süpernatantı aspire edin ve 100 μL DMEM/F12 ekleyin.
  2. Mikroskop kullanarak parlak alan ve floresans görüntüleri (örneğin, konfokal) yakalayın:
    Hoechst 33342 (PDTO'lar): uyarılma (Ex)/emisyon (Em) = 350 nm/461 nm
    mCherry (CAR-T): Ex/Em = 587 nm/610 nm
    SYTOX Yeşil (ölü hücreler): Ex/Em = 504 nm/528 nm
  3. Her kuyu başına en az üç kez fotoğraf çekin, merkezi alana odaklanın.

7. Veri analizi

  1. Launch ImageJ (sürüm 1.54, NIH, https://imagej.nih.gov/ij/); SYTOX Yeşil kanal görüntülerini içe aktarın. Floresan sinyallerini arka plandan ayırt etmek için eşiği manuel olarak ayarlayın (Görüntü > Eşik > Ayarlayın).
  2. Entegre yoğunluğu hesaplamak için Analyze > Measure fonksiyonunu kullanın. Verileri uygun bir istatistiksel analiz yazılımında (örneğin, GraphPad Prizma) sonraki istatistiksel analiz için .csv olarak dışa aktarın.
  3. Floresans sinyallerini arka plandan ayıracak eşik ayarlayın.
  4. Tüm alanı seçin; Toplu floresans sinyal yoğunluğunu hesaplamak için Analyze > Measure çalıştırın.
  5. Verileri dışa aktarın ve 24 saat içinde tedavi edilen ve kontrol arasındaki karşılaştırma için istatistiksel analiz yapın.

8. CAR-T Hücrelerinin Üretimi ve Karakterizasyonu

  1. CAR yapı tasarımı
    NOT: Bu çalışmada kullanılan CAR-T hücreleri, kolorektal kanserde sıkça fazla ekspresye edilen B7-H3 (CD276 geni tarafından kodlanan) antijenihedef almaktadır 14. CAR yapısı şunlardan oluşur:
    Ekstrasellüler domaini: B7-H3 klonu 376.96'ya karşı monoklonal bir antikordan türetilen tek zincirli değişken parça (scFv).
    Menteşe ve transmembran alanı: CD8α menteşe ve transmembran alanı.
    Ortak uyarıcı alan: insan CD28.
    Sinyal alanı: insan CD3ζ.
  2. CAR-T hücre üretimi
    1. İzolasyon: Sağlıklı donör buffy tüylerinden periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) Ficoll-Paque yoğunluk gradyan santrifüjasyonu14 ile izole edin.
    2. Aktivasyon: İnsan PBMC'lerini, T hücre ortamında 48 saat boyunca plaka bağ anti-CD3/CD28 antikorlarıyla 10 ng/mL IL-7 ve 5 ng/mL IL-15 takviyesi ile aktive edin. T hücre ortamını, eşit hacimde (her biri 250 mL) RPMI 1640 ve Click's Media karıştırarak ve %10 fetal sığır serumu (FBS), 1x GlutaMAX ve %1 penisillin-streptomisin (Pen/Streptokok) ile takviye ederek hazırlayın.
    3. Transdüksiyon: Aktive edilmiş T hücrelerini, daha önce tarif edildiği gibi retronektin kaplı bir plaka kullanarak retrovirüs süpernatantı ile transdüksiyonyapın 15.
    4. Genişleme: T hücreleri, transdüksiyondan 3 gün sonra, IL-7 ve IL-15 içeren tam insan T hücresi ortamında karakterizasyon ve fonksiyonel testlerden önce ek 7-9 gün boyunca hasat edilip kültürlendirin.
  3. CAR-T hücre karakterizasyonu
    1. CAR ekspresyonu: Transdüksiyondan 5-7 gün sonra CAR ifadesini, rekombinant B7-H3-Fc proteini kullanılarak akış sitometrisiyle değerlendirin, ardından insan Fc14'e karşı floresan etiketli ikincil antikor uygulanır. Tipik transdüksiyon verimliliği (CAR+ hücreleri) %80 ile %90 arasında değişir.
    2. Fenotip: T hücresi alt kümelerini (örneğin, CD4+, CD8+ vb.) akış sitometrisiyle CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7 vb. karşı antikorlar kullanarak karakterizeedin.
    3. Fonksiyonel doğrulama (Isteğe bağlı ön ko-kültür): Ortak kültür deneylerinden önce, B7-H3-pozitif ve B7-H3-negatif hedef hücre hatlarıyla birlikte kültürlenerek ve sitokin salınımını (örneğin, ELISA ile IFN-γ) veya sitotoksisiteyi (örneğin, akışsitometrisi 15 kullanılarak) ölçerek CAR-T hücrelerini fonksiyonel olarak doğrulayın.
  4. Ortak kültüre hazırlık (PDTO Testi)
    1. CAR-T hücreleri, aktivasyon sonrası log-faz genişleme sırasında (genellikle 10-14 günler arasında) birlikte kültür için kullanın. Kullanımdan önce, hücreleri HBSS ile iki kez yıkayarak IL-7/IL-15'i çıkarın ve step 4.1'de tarif edilen ortak kültür ortamında tekrar süzüldürün.
    2. Trypan Blue boyama ile uygulanabilirliğin %>95 olduğunu doğrulayın.
    3. Görsel kontrol noktaları: 3-5. günlerde küçük küresel kümeleri (50-100 μm) ve 10-14. günlerde olgun küreleri (100-200 μm) kontrol edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolorektal kanser organoidleri, endoskopik biyopsi örneklerinden başarıyla türetilmiştir (Şekil 1), tümör kimliği patolojik tanı ile doğrulanmış (Şekil 2). BMM'de kültürlenen tümör parçaları 24 saat içinde 3D yapılar oluşturmaya başladı. Birinci nesil organoidler (P0) 7-14. günler arasında geçiş yapıldı. Organoidler küresel, kistik ve dairesel yapılar dahil olmak üzere çeşitli morfolojiler sergilemiştir (Şek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, CAR-T hücrelerinin PDTO'lar üzerindeki sitotoksik etkisini değerlendirmek için parlak alan görüntüleme ve floresan boyama ile organoid canlılığı değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu çift modaliteli yaklaşım, tümör hücre ölümünün 3D model sisteminde sağlam görselleştirilmesini sağlar ve CAR-T sitotoksisitesinin yarı nicel bir değerlendirmesini sağlar.

Bu protokolün kritik bir bileşeni kültür ortamıdır. CAR-T hücreleri ve tümör organoidlerin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Ana Araştırma ve Geliştirme Programı (2022YFC2304400, 2022YFC2304401), Nanshan Tıp ve Sağlık Sistemi Bilim ve Teknoloji Projesi (NSZD2024046, NS2024105) ve Shenzhen Tıbbi Araştırma Fonu (D2401023) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15-mL tüpSAINING3030100
24 kuyuklu plakaCORNING3524
50-mL tüpSAINING3030000
96 kuyu plakasıCORNING3599
İleri DMEM/F12GibcoC11330500BT
Alk 4/5/7 inhibitörüMCEHY-10432 
B27Gibco17504044
Biyogüvenlik Kabini (Sınıf II)Thermo FisherYok
Sığır Serum AlbüminiSigma AldrichA9056
Hücre kültürü çanakıBIOFILTCD010060
SantrifüjEppendorf5810R
Click's MediumFUJI FILMI9195
CO2 Kuluçka MakinesiYamataIP610
Kollagenaz IISolarbioC8150
Kollagenaz IVSigma AldrichC9407
Konfokal lazer mikroskobuZeissLSM900
Kriyokoruyucu ortamZENOAQCELLBANKERTM2
Sindirim tamponuReaktifler kendi içinde hazırlanırYokEl yazmasında sunulan kompozisyon
Dijital ShakerMIULABHS-25
Dispase tip IISigma-aldrichD4693
DMEMGibcoC11995500BT
Dynabeads İnsan T-Aktivatörü CD3/CD28Thermo Fisher11131D
EGFPeproTechAF-100-15-500UG
Fetal sığır serumuGibco1631389
GastrinGlpBioGA20228
Gentamisin/amfoteritin BGibcoR0151
GlutamaxGibco35050061
Hanks'in Dengeli Tuz ÇözümüGibcoC14175500BT
HEPESGibco15630080
Hoechst 33342 BeyotimeC1027
HiyalüronidazSolarbioh8030
IL-15Peprotech200-15-10UG
IL-2NovoproteinCK24-10
IL-7Peprotech200-07-10UG
ImageJNIH (açık kaynak)https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted  Floresan mikroskopMshotMF52-N
MatrigelCorning356231
N2Gibco17502048
n-AsetilsisteinSigma AldrichA7250-5G
NiasinamideSigma AldrichN0636-100G
NogginPeproTech120-10C-20
NorbosinInvivoGenant-nr-1
Organoid kültür ortamıReaktifler kendi içinde hazırlanırYokEl yazmasında sunulan kompozisyon
p38 inhibitörüMCEHY-10295 
Penisilin StreptomiGibco15140122
Prostaglandin E2MCEHY-101952 
Rho ile ilişkili kinaz inhibitörü Kök hücre72304
RPMI 1640HyCloneSH30809.01B
R-spondin 1PeproTech120-38-20UG
S1 Pipet Dolgu MaddeleriTermo Bilimsel9501
Serolojik PipetBIOFILGSP-010-050
Tek kanallı pipetEppendorf3123000063
Tek kanallı pipetEppendorf3123000055
Tek kanallı pipetEppendorf3123000098
Tek kanallı pipetEppendorf3123000022
Steril Tek Kullanımlık SkalpellerTech-SSSD10
SYTOX YeşilBeyotimeC1181S
TexMACS MediumMiltenyi Biotec130-097-196
Termostat su tankıBluepardBWS-10
Trypan MavisiPhygenePH0519
TrypLE ExpressGibco12605028
β-merkaptoetanolGibco21985023

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, J., Jiang, G. The journey of CAR-T therapy in hematological malignancies. Mol Cancer. 21 (1), 194(2022).
  2. Maalej, K. M., et al. CAR-cell therapy in the era of solid tumor treatment: Current challenges and emerging therapeutic advances. Mol Cancer. 22 (1), 20(2023).
  3. Albelda, S. M. CAR T cell therapy for patients with solid tumours: Key lessons to learn and unlearn. Nat Rev Clin Oncol. 21 (1), 47-66 (2024).
  4. Shi, H., et al. IL-15 armoring enhances the antitumor efficacy of claudin 18.2-targeting CAR-T cells in syngeneic mouse tumor models. Front Immunol. 14, 1165404(2023).
  5. Zhang, D. K. Y., et al. Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner. Nat Commun. 14 (1), 506(2023).
  6. Qu, S., et al. Patient-derived organoids in human cancer: A platform for fundamental research and precision medicine. Mol Biomed. 5 (1), 6(2024).
  7. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4(2020).
  8. Qu, J., Kalyani, F. S., Liu, L., Cheng, T., Chen, L. Tumor organoids: Synergistic applications, current challenges, and future prospects in cancer therapy. Cancer Commun. 41 (12), 1331-1353 (2021).
  9. Mo, S., et al. Patient-derived organoids from colorectal cancer with paired liver metastasis reveal tumor heterogeneity and predict response to chemotherapy. Adv Sci. 9 (31), 2204097(2022).
  10. Nam, C., Ziman, B., Sheth, M., Zhao, H., Lin, D. -C. Genomic and epigenomic characterization of tumor organoid models. Cancers. 14 (17), 4090(2022).
  11. Taurin, S., et al. Patient-derived tumor organoids: A preclinical platform for personalized cancer therapy. Transl Oncol. 51, 102226(2025).
  12. Tao, B., et al. Organoid-guided precision medicine: From bench to bedside. MedComm. 6 (5), e70195(2025).
  13. Ning, R. -X., et al. Application status and optimization suggestions of tumor organoids and CAR-T cell co-culture models. Cancer Cell Int. 24 (1), 98(2024).
  14. Du, H., et al. Antitumor responses in the absence of toxicity in solid tumors by targeting B7-H3 via chimeric antigen receptor T cells. Cancer Cell. 35 (2), 221-237.e8 (2019).
  15. Sun, S., et al. Preclinical evaluation of antitumor activity and toxicity of TROP2-specific CAR-T cells for treatment of triple-negative breast cancer. J Immunother Cancer. 13 (9), e012442(2025).
  16. Schnalzger, T. E., et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO J. 38 (12), e100928(2019).
  17. Zou, F., et al. The CD39+ HBV surface protein-targeted CAR-T and personalized tumor-reactive CD8+ T cells exhibit potent anti-HCC activity. Mol Ther. 29 (5), 1794-1807 (2021).
  18. Yu, L., et al. Patient-derived organoids of bladder cancer recapitulate antigen expression profiles and serve as a personal evaluation model for CAR-T cells in vitro. Clin Transl Immunol. 10 (2), e1248(2021).
  19. Wang, X., et al. Dynamic profiling of antitumor activity of CAR T cells using micropatterned tumor arrays. Adv Sci. 6 (23), 1901829(2019).
  20. Dekkers, J. F., et al. Uncovering the mode of action of engineered T cells in patient cancer organoids. Nat Biotechnol. 41 (1), 60-69 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CAR T H cre TaramaBoyutlu OrganoidlerHasta Kaynakl Organoidlermm n Organoid Ko K lt rKolorektal Kanser OrganoidleriBazal Membran Matrisil H cre BoyamaT m r ld rme AktivitesiSitotoksisite Analizi

İlgili makaleler