Method Article

Birden Fazla Kaynaktan Dört Zoonotik Bağırsak Parazitinin Aynı Anda Tespiti için Entegre PCR Tabanlı Moleküler Tespit Sistemi

DOI:

10.3791/69180

⸱

October 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Public Health Molecular Biology, Yancheng Center for Disease Control and Prevention, 2Clinical Laboratory, Yancheng Maternal and Child Health Care Hospital Affiliated to Yangzhou University, 3Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı entegre moleküler tespit sisteminin bir kombinasyonuna dayalı olarak aynı anda birden fazla kaynaktan dört zoonotik bağırsak parazitini tespit etmek için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bulaşıcı hastalıklar insan sağlığını, ekonomik kalkınmayı ve sosyal istikrarı etkileyen kritik faktörlerdir. Bunlar arasında, zoonotik bağırsak paraziter hastalıkları, özellikle Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis ve Giardia olmak üzere ortaya çıkan, yeniden ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklar olarak giderek daha fazla küresel bir endişe odağı haline gelmiştir. Yukarıdaki parazitlerin epidemiyolojisi hakkında, tek tespit hedefleri, düşük tespit oranları ve yüksek eksik tespit oranları gibi konuların eşlik ettiği sadece birkaç çalışma yayınlanmıştır. Bu çalışma, özellikle yerel sürveyans tesislerinde hayvan-çevre arayüzleri de dahil olmak üzere birden fazla senaryoda rutin parazit tespiti için verimli bir teknik destek sağlamak amacıyla, yabani farelerden, evcil hayvanlardan ve çiftlik hayvanlarından (sığır ve koyun) toplanan örneklerde yukarıdaki dört zoonotik bağırsak parazitinin eşzamanlı tespiti için PCR testlerinin bir kombinasyonuna dayanan entegre bir moleküler tespit sistemi kurmayı amaçlamaktadır.

Bu çalışmada, 95 yabani fare ve 30 kedi ve köpeğin (25'i kedilerden ve 5'i köpeklerden) dışkısında Enterocytozoon bieneusi'nin saptanması birincil test olarak alındığında, ITS genini amplifiye etmek için iki set primer kullanıldığında, her PCR'nin pozitif sonuçları tamamen aynıydı (%5.26), ancak 2 set polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) testinin kombinasyonu Enterocytozoon bieneusi için daha yüksek pozitif oran (%6.32) ile sonuçlandı. Giardia için beta-giardin (BG) geni kullanılarak 9 pozitif örnek tespit edilirken, glutamat dehidrojenaz (GDH) ve trioz fosfat izomeraz (TPI) genleri kullanılarak pozitif numune tespit edilmedi. Yukarıdaki sonuçlar, birden fazla hedef genetik segment için PCR testlerinin bir kombinasyonunun, herhangi bir tek PCR testine kıyasla, belirlenmiş patojenler için tespit kapasitesini arttırdığını göstermiştir. Hedef diziler Sanger dizilimi ile doğrulandı. Bu sistem, birden fazla kaynaktan gelen zoonotik bağırsak parazitlerinin enfeksiyon durumunun, dağılımının ve filogenetik evriminin gözetimini geliştirmek ve kolaylaştırmak için tasarlanmıştır ve erken bir aşamada doğru ve hassas uyarılar için bir temel sağlar. Bu, insan-hayvan-çevre arayüzleri arasında Tek Sağlık hedefine ulaşmak için teknik bir köprü kurmayı amaçlamaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis ve Giardia, küresel prevalansı olan yaygın ve kolayca ihmal edilen protozoon patojenlerdir. Son yıllarda, ıslah ve doğal odakların ekolojik nişlerine izinsiz giriş, evcil hayvan yetiştiriciliğinin popülaritesi ve çiftlik hayvanı ve kümes hayvanı yetiştiriciliğinin gelişmesi gibi faktörler nedeniyle, kemirgenlerde, evcil hayvanlarda (kediler ve köpekler) ve çiftlik hayvanlarında (sığır ve koyun) çok kaynaklı zoonotik bağırsak paraziter hastalıklarının yaygınlığı giderek daha fazla ortaya çıkan bir odak noktası haline gelmiştir. salgın ve evsel ve kırsal alanlarda yeniden ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklar, insan sağlığını ve küresel halk sağlığı güvenliğini ciddi şekilde tehlikeye atıyor 1,2,3,4.

Bu parazitler karmaşık jenerik içi türlere ve geniş konakçı adaptasyonuna sahiptir. Sadece kemirgenleri, evcil hayvanları, geviş getiren hayvanları, kümes hayvanlarını ve kuşları değil, aynı zamanda insanları enfekte edebilen ve karın ağrısı, ishal ve kusma gibi klinik semptomlara neden olabilen zoonotik türleri de enfekte edebilirler. Özellikle çocuklar, yaşlılar, hamile kadınlar ve bağışıklığı baskılanmış popülasyonlar arasında hassastırlar ve su, yiyecek ve hava yoluyla bulaşarak önemli zoonotik halk sağlığı riskleri oluşturabilirler 3,5,6.

Şu anda, yukarıdaki dört parazitin tanımlanması öncelikle, özellikle türler ve genotipler arasında ayrım yapmada, cinsler içindeki morfolojik benzerlikler ve öznel faktörler nedeniyle yanlış tanımlamaya eğilimli olan morfolojiye dayanmaktadır. Moleküler biyoloji teknikleri, bu parazitlerin türlerini, cinslerini ve genotiplerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Blastocystis ve Cryptosporidium için tespit esas olarak küçük alt birim ribozomal ribonükleik asit (SSU rRNA) geni 3,7,8'e odaklanır; Enterocytozoon bieneusi için, dahili kopyalanmış aralayıcı (ITS) geni 4,9; ve Giardia için beta-giardin (BG), glutamat dehidrojenaz (GDH) ve trioz fosfat izomeraz (TPI) genleri10,11. İç içe konmuş konvansiyonel polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bu dört parazitin tanımlama ve tipleme yeteneklerini büyük ölçüde geliştirmiş olsa da, gözden kaçan vakaları tespit etmede ve önemli genetik özelliklere sahip yeni türleri veya yarı türleri tanımlamada yetersizdir. Bu genellikle insanlarda, hayvanlarda ve diğer konakçılarda epidemiyolojik araştırma, bulaşma ve hastalık kontrolünün etkinliğini etkileyerek insanlarda, hayvanlarda ve çevrede halk sağlığı güvenliği açısından büyük zorluklar yaratır.

Bu dört parazitin semptomları, bulaşma yolları ve konakçı aralığındaki benzerlikler nedeniyle, eksik tespiti önlerken ve önemli genetik farklılıklara sahip yeni türleri veya yarı türleri doğru bir şekilde tanımlarken etkili tespit için henüz entegre bir moleküler sistem yoktur. Bu çalışma, çok kaynaklı örneklerde (yabani fareler, evcil hayvanlar, sığırlar ve koyunlar) dört zoonotik bağırsak parazitinin aynı anda tespiti için literatürü gözden geçirerek PCR-yüksek verimli dizileme teknolojisine dayalı olgun bir entegre moleküler tespit sistemi kurmuştur. Biyoinformatik analiz ile birlikte bu sistem, çok kaynaklı zoonotik bağırsak parazitlerini tanımlamak, enfeksiyon dağılımı ve filogenetik evrim gibi epidemiyolojik faktörleri izlemek ve insan ve hayvan enfeksiyonları ile çevresel kontaminasyonun erken uyarısını yapmak için uygulandı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, Jiangsu Eyaleti Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi'nin hayvan etik komitesi tarafından onaylandı ve yürütüldü. Bu çalışma, Amerikan Veteriner Hekimler Birliği Hayvan Ötenazisi Kılavuzu'nun 2020 Baskısı, Deney Hayvanlarının İdaresine İlişkin Yönetmeliklerin yol gösterici ilkeleri (Çin Halk Cumhuriyeti Devlet Bilim ve Teknoloji Komisyonu'nun 2 No'lu Emri, 1988) ve Çin Halk Cumhuriyeti Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından yayınlanan Hayvanlara İnsani Muamele için Yol Gösterici İlkeler.

1. Yabani farelerden, evcil hayvanlardan ve çiftlik hayvanlarından (sığır ve koyun) taze dışkı hazırlanması

  1. Fareleri, şeffaf, hava geçirmez bir plastik kutu içinde konserve sıkıştırılmış bir karbondioksit kaynağından karbondioksit soluyarak, dakikada kap hacminin %30-70'i kadar bir değiştirme oranıyla uyuşturun. Tam anestezi ve komadan sonra farelere servikal çıkık yapın.
  2. Taze dışkı örneği toplama: Dışkılamadan sonraki 1 saat içinde köpeklerden, kedilerden, sığırlardan ve koyunlardan dışkı örneklerini, hayvanın dışkısı başına bir tüp olacak şekilde toplayın ve çapraz kontaminasyonu önleyin.
    1. Farklı vahşi habitatlarda serbest bırakma cihazları olan yem kafeslerini kullanarak kemirgenleri yakalayın. Yakalanan fareleri fare torbalarına koyun ve hemen laboratuvara taşıyın. Bir biyogüvenlik kabininde steril çalışma altında, dışkı içeren rektumu toplamak için fareleri parçalara ayırın, 2 mL'lik bir kriyotüpe yerleştirin ve daha sonra tespit edilmek üzere -80 °C'de saklayın.
    2. Araştırma nesneleri olarak farklı bölgelerdeki evcil hayvan dükkanlarından köpek ve kedileri seçin. Taze atılan dışkıyı hemen 5 mL'lik kriyotüplere toplayın, eksiksiz numune bilgileriyle etiketleyin ve -80 °C'de saklanmak üzere derhal laboratuvara taşıyın.
    3. Araştırma nesneleri olarak hayvancılık çiftliklerinden (yoğun veya serbest dolaşan) sığır ve koyunları seçin. Taze atılan dışkıyı hemen 50 mL'lik kriyotüplere toplayın, eksiksiz numune bilgileriyle etiketleyin ve -80 °C'de saklanmak üzere derhal laboratuvara nakledin.

2. Yabani farelerin, evcil hayvanların ve çiftlik hayvanlarının (sığır ve koyun) taze dışkılarından toplam DNA'nın çıkarılması

  1. Dışkı ön tedavisi:
    NOT: QIAamp Hızlı DNA Dışkı Mini Kiti kullanılmıştır.
    1. Bir biyogüvenlik kabininde steril çalışma altında, fosfat tamponlu salin (PBS) tamponuna farklı kaynaklardan yaklaşık 200 mg dışkı ekleyin, çelik boncuklar ekleyin ve bir doku öğütücü kullanarak iyice homojenize edin.
    2. Bunu 70 °C'de 5 dakika ısıtın ve oda sıcaklığında (15-25 °C) 10.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
    3. 25 μL proteinaz K içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne 600 μL süpernatant ekleyin, 600 μL Buffer AL ekleyin ve 15 saniye vorteks yapın.
    4. 70 °C'de 10 dakika inkübe edin. Lizata 600 μL %100 susuz etanol ekleyin ve karıştırmak için girdap ekleyin.
  2. Bir döndürme kolonuna dikkatlice 600 μL lizat ekleyin, 1 dakika boyunca 14000 × g'da santrifüjleyin ve döndürme kolonunu yeni bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
  3. Döndürme kolonunu dikkatlice açın, 500 μL Buffer AW1 ekleyin, 1 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin ve döndürme kolonunu yeni bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin. Döndürme kolonunu dikkatlice açın, 500 μL Buffer AW2 ekleyin ve 3 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin.
  4. Döndürme kolonunu 2 mL'lik yeni bir toplama tüpüne (ayrı olarak hazırlanmış) yerleştirin ve 3 dakika boyunca 14000 × g'da santrifüjleyin. Döndürme kolonunu yeni etiketli 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve doğrudan döndürme kolonu membranına 100 μL Elüsyon Tamponu ekleyin.
  5. DNA'yı ayrıştırmak için oda sıcaklığında (15-25 °C) 1 dakika inkübe edin ve 14000 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
  6. Bir ultra mikro spektrofotometre kullanarak DNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin. Ekstrakte edilen DNA'yı daha sonraki tespit için kullanın veya uzun süreli koruma için -20 °C'de saklayın.
    NOT: Ekstrakte edilen DNA'nın bütünlüğünü ve saflığını sağlamak için A260/A280 oranı 1.8-2.0 olmalıdır.

3. Küçük alt birim ribozomal RNA'yı (SSU rRNA) hedefleyen Cryptosporidium ve Blastocystis'in iç içe konvansiyonel PCR tespiti

NOT: Bu adım için Dream Taq Green PCR Mix kullanılmıştır.

  1. PCR Karışımını kullanarak PCR reaksiyon sistemini buz üzerinde hazırlayın: 25 μL 2× Taq tamponu, 2 μL ileri ve geri primerlerin her biri, 16 μL ddH2O ve 5 μL şablon, toplam hacmi 50 μL'dir.
  2. Cryptosporidium için 3.2.1-3.2.2 adımlarını izleyin.
    1. İlk tur reaksiyon primerleri olarak F1R11 ve F-1R1-1 8,11'i kullanın. Reaksiyon programını ayarlayın: 94 °C'de 5 dakika ilk denatürasyon, 94 °C'de 40 saniye boyunca 30 döngü denatürasyon, 55 °C'de 40 saniye tavlama ve 72 °C'de 90 saniye uzatma, 72 °C'de 7 dakika boyunca son uzama.
    2. Aşağıdaki reaksiyon programı ile ikinci tur primerler olarak F2R21 ve F-1R2-1 8,11'i kullanın: 94 °C'de 5 dakika ilk denatürasyon, 94 °C'de 40 saniye boyunca 30 döngü denatürasyon, 55 °C'de 40 saniye tavlama ve 72 °C'de 1 dakika uzatma, 72 °C'de 7 dakika son uzama ile.
  3. Blastocystis için 3.3.1-3.3.4 adımlarını izleyin.
    1. İlk tur reaksiyon primerleri olarak F1R13 ve F1-1R-1 3,12 kullanın. F1R1 için reaksiyon programını şu şekilde ayarlayın: 94 °C'de 5 dakika ilk denatürasyon, 94 °C'de 40 saniye boyunca 30 döngü denatürasyon, 60 °C'de 40 saniye tavlama ve 72 °C'de 100 saniye uzatma, 72 °C'de 7 dakika boyunca son uzama.
    2. F1-1R-1 için reaksiyon programını şu şekilde ayarlayın: 94 °C'de 5 dakika ilk denatürasyon, 94 °C'de 40 saniye 30 döngü denatürasyon, 55 °C'de 40 saniye tavlama ve 72 °C'de 1 dakika uzatma, 72 °C'de 7 dakika son uzama ile.
    3. İkinci tur primerler olarak F2R23 ve F2-1R-1 3,12'yi kullanın. F2R2 için reaksiyon programını şu şekilde ayarlayın: 94 °C'de 5 dakika ilk denatürasyon, 94 °C'de 40 saniye boyunca 30 döngü denatürasyon, 60 °C'de 40 saniye tavlama ve 72 °C'de 1 dakika uzatma, 72 °C'de 7 dakika boyunca son uzama.
    4. F2-1R-1 için reaksiyon programını şu şekilde ayarlayın: 94 °C'de 5 dakika ilk denatürasyon, 94 °C'de 40 saniye 30 döngü denatürasyon, 55 °C'de 40 saniye tavlama ve 72 °C'de 50 saniye uzatma, 72 °C'de 7 dakika son uzama.
      NOT: Primer dizileri Tablo 1 1,3,8,11,12'de gösterilmiştir.
PatojenBeklenen ürün boyutu (bp)Primer dizileri (5′-3′)Başvuru
Cryptosporidium830F1: CCATTTCCTTCGAAACAGGA1
R1: TTCTAGAGCTAATACATGCG
F2: AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
R2: GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
607F-1: GACATATCATTCAAGTTTCTGACC8,11
R1-1: CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
R2-1: TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
Blastosist600F1: GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC3
R1: GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
F2: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
R2: GAGCTTTTTAACTGCAACAACG
460F1-1: TGCTTTCGCACTTGTTCATC3,12
F2-1: GATTTATTGTCACTACCTCC
R-1: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

Tablo 1: Cryptosporidium ve Blastocystis'in SSU rRNA'sı için primer dizileri.

4. Enterocytozoon bieneusi ITS Geni ve Giardia BG, GDH ve TPI genlerinin iç içe konvansiyonel PCR tespiti

NOT: Bu adım için Dream Taq Green PCR Mix kullanılmıştır.

  1. PCR karışımını kullanarak PCR reaksiyon sistemini buz üzerinde hazırlayın: 25 μL 2× Taq tamponu, 2 μL ileri ve geri primerlerin her biri, 16 μLddH2O ve 5 μL şablon, toplam hacmi 50 μL'dir.
  2. Enterocytozoon bieneusi için 4.2.1-4.2.2 adımlarını izleyin.
    1. İlk tur reaksiyon primerleri olarak F1R19 ve F1-1R1-12 kullanın. Reaksiyon programını şu şekilde ayarlayın: ilk denatürasyon 94 °C'de 5 dakika, 30 döngü denatürasyon 94 °C'de 40 saniye, 55 °C'de 40 saniye tavlama ve 72 °C'de 50 saniye uzatma, son uzama 72 °C'de 7 dakika boyunca.
    2. İkinci tur primerler olarak F2R29 ve F2-1R2-12'yi kullanın, reaksiyon programı aşağıdaki gibidir: 94 °C'de 5 dakika ilk denatürasyon, 94 °C'de 40 saniye 30 döngü denatürasyon, 55 °C'de 40 saniye tavlama ve 72 °C'de 50 saniye uzatma, 72 °C'de 7 dakika son uzama.
  3. Giardia için 4.3.1-4.3.3 adımlarını izleyin.
    1. Üç hedef gen için ilk tur reaksiyon primerleri olarak BG-F1R1, GDH-F1R1 ve TPI-F1R1 2,10'u kullanın. Hepsi için ilk tur reaksiyon programını şu şekilde ayarlayın: ilk denatürasyon 94 °C'de 5 dakika, 30 döngü 94 °C'de 40 saniye, 50 °C'de 40 saniye tavlama ve uzatma 72 °C'de 1 dakika, son uzama 72 °C'de 7 dakika boyunca.
    2. BG-F2R2 2,10 ve TPI-F2R2 2,10 için ikinci tur reaksiyon programını şu şekilde ayarlayın: 94 °C'de 5 dakika ilk denatürasyon, 94 °C'de 40 saniye boyunca 30 döngü denatürasyon, 55 °C'de 40 saniye tavlama ve 72 °C'de 50 saniye uzatma, 72 °C'de 7 dakika boyunca son uzama.
    3. GDH-F2R2 2,10 için ikinci tur reaksiyon programını şu şekilde ayarlayın: 94 °C'de 5 dakika ilk denatürasyon, 94 °C'de 40 saniye boyunca 30 döngü denatürasyon, 60 °C'de 40 saniye tavlama ve 72 °C'de 50 saniye uzatma, 72 °C'de 7 dakika son uzama.
      NOT: Primer dizileri Tablo 2 2,9,10'da gösterilmiştir.
PatojenBeklenen ürün boyutu (bp)Primer dizileri (5′-3′)Başvuru
Enterocytozoon bieneusi390F1: GGTCATAGGGATGAAGAG9
R1: TTCGAGTTCTTTCGCGCTC
F2: GCTCTGAATATCTATGGCT
R2: ATCGCCGACGGATCCAAGTG
390F1-1: GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT2
R1-1: TATGCTTAAGTCCAGGGAG
F2-1: AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG
R2-1: AGTGATCCTGTATTAGGGATATT
Giardia511BG-F1: AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC2,10
BG-R1: GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC
BG-F2: GAACGAACGAGATCGAGGTCCG
BG-R2: CTCGACGAGCTTCGTGTT
530GDH-F1: TTCCGTRTYCAGTACAACTC2,10
GDH-R1: ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA
GDH-F2: ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
GDH-R2: GTGGCGCARGGCATGATGCA
530TPI-F1: AAATIATGCCTGCTCGTCG2,10
TPI-R1: CAAACCTTITCCGCAAACC
TPI-F2: CCCTTCATCGGIGGTAACTT
TPI-R2: GTGGCCACCACICCCGTGCC

Tablo 2: Enterocytozoon bieneusi ITS geni ve Giardia BG, GDH ve TPI genleri için primer dizileri.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fareler Cryptosporidium, Blastocystis SSU rRNA geni, Enterocytozoon bieneusi ITS geni ve Giardia BG geni PCR test sonuçları
Farelerden alınan 95 rektal dışkı örneğinin tümü, iki set primer kullanılarak Enterocytozoon bieneusi'nin ITS geni için test edildi, her yöntem için 5 pozitif örnek elde edildi ve toplamda 6 pozitif ör...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis ve Giardia yaygın zoonotik bağırsak parazitleridir; ilk ikisi ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından Kategori B biyolojik patojenler olarak sınıflandırılmıştır ve dördü de Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından dünya çapında en önemli gıda kaynaklı parazitlerin 24'ü olarak listelenmiştir. Potansiyel olarak insanları, hayvanları enfekte edebilir ve çevreyi kirletebilirler, bu da hastalık salgı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Jiangsu İl Sağlık Komisyonu tarafından desteklenmiştir (hibe nos. Ym2023024), Yancheng Belediye Tıbbi Araştırma Projesi (hibe no. YK2023085) ve Ortaya Çıkan ve Yeniden Ortaya Çıkan Bulaşıcı Hastalıklar için Patojenik Mikrobiyoloji Anahtar Laboratuvarı Açık Fonu (Jiangsu Eyaleti Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi) (PM202402).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose Qingke TechTSJ001
Qiaquick jel ekstraksiyon kitiQiagen 28704DNA jel çıkarma kiti
100 bp artı DNA merdiveniTransGen  BiyoteknolojiBM311DNA Merdiveni
4S Yeşil Plus Nüklein Asit LekesiBBIA616696-0500DNA lekesi
10& kez; TBE BufferSolarbioT1051Elektroforeiz tamponu
Qubit 4.0Termohttps://www.thermofisher.com/in/en/home
/endüstriyel/spektroskopi-elemental
-izotop-analizi/moleküler-spektroskopi/
fluorometers/qubit/models/qubit-4.html?
ef_id=:G:s& s_kwcid=AL!3652!10!77515
785702067!!!! 77516061528018!! 380468
453!1240249321530142& cid=bid_pca_
aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid
00000_0se_bng_bt_pur_con		Floresans nicel aleti
MINI Space 1000Tanonhttp://en.biotanon.com/PRODUCT/
PRODUCTLIST?ID=3040&
TYPE=DETAIL		Jel görüntüleyici
  DNA çıkarımı için hızlı DNA dışkısı mini kitiQIAGEN51604Nüklein asit ekstraksiyon kiti
ProFlex TabanıTermohttps://www.thermofisher.com/
in/en/ev/yaşam bilimleri/pcr/
termal-döngüler-gerçek-zaman-
enstrumanları/termal döngüler
/proflex-pcr-system.html		PCR
Dream Taq Green PCR KarışımıTermoK1082PCR amplifikasyonu 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhao, Q., et al. Cryptosporidium spp. in large-scale sheep farms in China: prevalence and genetic diversity. Sci Rep. 14 (1), 11218(2024).
  2. Li, F., Wang, R., Guo, Y., Li, N., Feng, Y., Xiao, L. Zoonotic potential of Enterocytozoon bieneusi and Giardia duodenalis in horses and donkeys in northern China. Parasitol Res. 119 (3), 1101-1108 (2020).
  3. Jinatham, V., Maxamhud, S., Popluechai, S., Tsaousis, A. D., Gentekaki, E. Blastocystis One Health approach in a rural community of Northern Thailand: prevalence, subtypes and novel transmission routes. Front Microbiol. 12 (1), 746340(2021).
  4. Deng, L., et al. Occurrence and genetic characteristics of Cryptosporidium spp. and Enterocytozoon bieneusi in pet red squirrels (Sciurus vulgaris) in China. Sci Rep. 10 (1), 1026(2020).
  5. Zhao, W., Zhou, H. H., Ma, T. M., Cao, J., Lu, G., Shen, Y. J. PCR-based detection of Cryptosporidium spp. and Enterocytozoon bieneusi in farm-raised and free-ranging geese (Anser anser f. domestica) from Hainan Province of China: natural infection rate and the species or genotype distribution. Front Cell Infect Microbiol. 9 (1), 416(2019).
  6. Feng, Y., Xiao, L. Zoonotic potential and molecular epidemiology of Giardia species and giardiasis. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 110-140 (2011).
  7. Zhao, G. H., et al. Genotyping Cryptosporidium andersoni in cattle in Shaanxi Province, Northwestern China. PLoS One. 8 (4), e60112(2013).
  8. Ryan, U., Xiao, L., Read, C., Zhou, L., Lal, A. A., Pavlasek, I. Identification of novel Cryptosporidium genotypes from the Czech Republic. Appl Environ Microbiol. 69 (7), 4302-4307 (2003).
  9. Gui, B. Z., et al. Novel genotypes and multilocus genotypes of Enterocytozoon bieneusi in two wild rat species in China: potential for zoonotic transmission. Parasitol Res. 119 (1), 283-290 (2020).
  10. Ye, J., et al. Occurrence of human-pathogenic Enterocytozoon bieneusi, Giardia duodenalis and Cryptosporidium genotypes in laboratory macaques in Guangxi, China. Parasitol Int. 63 (1), 132-137 (2014).
  11. Alves, M., Xiao, L., Sulaiman, I., Lal, A. A., Matos, O., Antunes, F. Subgenotype analysis of Cryptosporidium isolates from humans, cattle, and zoo ruminants in Portugal. J Clin Microbiol. 41 (6), 2744-2747 (2003).
  12. Santín, M., Gómez-Muñoz, M. T., Solano-Aguilar, G., Fayer, R. Development of a new PCR protocol to detect and subtype Blastocystis spp. from humans and animals. Parasitol Res. 109 (1), 205-212 (2011).
  13. Bouwknegt, M., et al. Prioritisation of food-borne parasites in Europe, 2016. Euro Surveill. 23 (9), 17(2018).
  14. Xiao, L., Fayer, R. Molecular characterisation of species and genotypes of Cryptosporidium and Giardia and assessment of zoonotic transmission. Int J Parasitol. 38 (11), 1239-1255 (2008).
  15. Cacciò, S. M., Beck, R., Lalle, M., Marinculic, A., Pozio, E. Multilocus genotyping of Giardia duodenalis reveals striking differences between assemblages A and B. Int J Parasitol. 38 (13), 1523-1531 (2008).
  16. Wawrzyniak, I., et al. Blastocystis, an unrecognized parasite: an overview of pathogenesis and diagnosis. Ther Adv Infect Dis. 1 (5), 167-178 (2013).
  17. Honigsbaum, M. Disease X and other unknowns. Lancet. 393 (10180), 1496-1497 (2019).
  18. A scientific framework for epidemic and pandemic research preparedness. , WHO. At https://cdn.who.int/media/docs/default-source/consultation-rdb/prioritization-pathogens-v6final.pdf?sfvrsn=c98effa7_7&download=true (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PCR DetectionZoonotic ParasitesIntestinal ParasitesMolecular DetectionCryptosporidium DetectionEnterocytozoon BieneusiBlastocystis DetectionGiardia DetectionSanger SequencingOne Health

Related Articles