Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yedi Günlük Gözlem Sırasında Nöropsikiyatrik Komplikasyonlarla İşemik İnme Uyanık Fare Modeli

316 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69194

⸱

19 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Branch of the Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Russian Federation, 2Pushchino Branch of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education, Russian Biotechnological University (BIOTECH University), 3Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

Uyanık farelerde odaklı iskemik inme için yeni model önerilmektedir. Bu, sıçanların iç karotis arterine hava embolüsü enjekte edilerek gerçekleştirildi. Fokal iskemik inme gelişimi, triphenyltetrazolium klorür ile beyin boyama, fonksiyonel testler ve fizyolojik parametrelerin değerlendirilmesi ile doğrulandı.

Özet

Gaz embolizmasıyla indüklenen sıçanlarda deneysel inme translasyonel modeli, inme gelişiminin özelliklerini netleştirmek ve yeni tedaviler ile kanıtlanmış ilaçların nöroprotektif etkisini değerlendirmek için oluşturulmuştur. Orta derecede zaman ve emek gerektiren bu protokol, uyanık hayvanlarda hızlı nöron ölümünün dinamiklerini gözlemlemeye olanak tanır; deliryum dahil olmak üzere felcinin akut evresini değerlendirmek ve kan basıncı, vücut sıcaklığı ve solunum dakikası hacmindeki değişiklikler gibi otonom bozuklukları izlemek için benzersiz bir fırsat sunar. Atmosfer havası (100 μL), infüzyon pompası kullanılarak harici karotis arter üzerinden ortak karotis arterine retrograd olarak yerleştirilen damar kateteri aracılığıyla infüzyon yoluyla verildi. Embolizasyondan yirmi dört saat sonra, hayvanlar stereotipik davranışsal, motor eksiklikler ve histopatolojik farklılıklar gösterir. Deneyin yedinci gününde nörolojik durumda anlamlı bir iyileşme gözlemlendi ve davranışsal testlerdeki sonuçlar kontrol değerlerine yaklaştı. Aynı zamanda, iskemik lezyonda nötrofilden makrofaj infiltrasyonuna geçiş gözlemlenir. Önerilen model, inme sonrası dönemin nöropsikiyatrik komplikasyonlarını ve ilgili fizyolojik, fonksiyonel ve histopatolojik değişiklikleri yeniden ürettiği için preklinik çalışmalarda kullanılabilir.

Giriş

Bu araştırmanın amacı, uyanık farelerde odaklı beyin iskemik felç modelini geliştirmek ve bu modelin insanlarda iskemik inme klinik yönlerine en yakın şekilde yaklaşmasını sağlamaktı. Söyland ve ark. tarafından yapılan araştırmada gösterildiği gibi, hastaların %62,6'sı uyanık halde iskemik inme belirtileri göstermişken, sadece %19'u uyanışinmesi 1 yaşamıştır. Bu nedenle, hayvanlarda beyin arter embolizasyonu sırasında uyanık bir durum meydana gelmesiyle ilgili en büyük ilgi çekici unsur olmaktadır. Fokal serebral iskemik felç çalışmasında kullanılan klasik modeller şunlardır: transkraniyal tıkanma, endovasküler filament orta serebral arter tıkanması, embolik tıkanma, endotelin-1 tıkanması ve fototromboz model2. Klasik modelleme yöntemleri, hayvanları anesteziklerin etkilerine maruz bırakır ve bu da iskemik inme modelinde son noktaların bozulmasına yol açabilir. İzoflüran, gaz anestezisinin en uygun yöntemi olarak oklüzyoncerrahisinde yaygın olarak kullanılır 3,4,5. Ancak, 24 saat sonra orta beyin arter tıkanması (MCAO) sonrası beyin bozukluk derecesi, hayvanlarda izofloran anestezisinin süresiyle ters orantılı olarak bulundu. İzofluranın, 1.000'den fazla iskemiye bağlı farklı şekilde ifade edilen gen6 ifadesi üzerinde etkisi olduğu gösterilmiştir; bu faktör ise tamamen güvenilir olmayan bir iskemik inme modeline yol açabilir.

Farelerde iskemik inme modellemesinin bir metodolojisi, kan pıhtısı içteki karotisarteriye enjekte edilir 7. Buna rağmen, bu modelde iskemik inme indüksiyonu, isofluran ile kateterizasyondan 1 saat sonra gerçekleştirilmiştir. Bu ön koşullandırmanın, trombus uygulamasının nörolojik ve fizyolojik sonuçlarının gelişimini bozmuş olabileceği düşünülebilir.

Uyanık farelerde iç karotis arterinin embolizasyonu ve ardından orta beyin arter havzasında odaklı beyin hasarı ile iskemik felci modellemek için alternatif yöntem önerilmektedir. Kateterizasyon, iskemik inme modellenmesinden 24 saat önce gerçekleştirildi. Bu, embolus uygulamasının etkilerinin anesteziden etkilenmemesini sağladı.

Önerilen model, iskemi için endotelin-18, filament9 veya pıhtılaşan pigment10 kullanmamaktadır. Farelere kateter ile uygulanacak ajanın seçimi, bu yöntemin mümkün olacağı varsayımına dayanıyordu ve böylece hayvanı stereotaksik bir çerçeveye sabitleme ve anestezi etme gerekliliğiniortadan kaldırıyordu 8,10.

Ayrıca, model embolizasyondan hemen sonra hayvanlarda fizyolojik ve nörolojik parametrelerin gözlemlenmesini sağlar; Iskemik inme modellemesinin alternatif yöntemleri bununla uyumlu görünmemektedir. Literatürde, iskemik inme modellemesi sonrası beyin hasarı ve nörolojik bozulmanın son noktaları en çok 11,12,13,14 tıkanıklıktan 24 saat sonra değerlendirilir.

Uyanık sıçanların iskemik inme modellemesinde kullanılması, yaygın klasik odaklı iskemik inme modeline ek veya alternatif olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir. Bu yaklaşım, iskemik inme tedavisinde kayıtlı veya gelişmekte olan ilaç ajanlarının nöroprotektif potansiyelinin daha kapsamlı bir şekilde incelenmesini kolaylaştırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışma, laboratuvarın standart işletim prosedürlerine uygun olarak yürütüldü ve Rusya Bilimler Akademisi Shemyakin-Ovchinnikov Biyoorganik Kimya Enstitüsü Şubesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi Biyoetik Komisyonu tarafından onaylandı (Protokol No. 1016/25, 17 Ocak 2025 tarihli). Bu çalışmada, 10-12 haftalık 28 erkek Sprague-Dawley (SD) sıçan kullanıldı; ortalama vücut ağırlığı 301 g ve mikrobiyolojik durumu Özgül Patojensiz (SPF) idi. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hayvan hazırlığı

  1. SPF durumuna sahip 28 erkek SD sıçan kullanın, 10-12 haftalık. Sahte grup için 12 hayvan ve serebral arterial gaz embolizmi (CAE) ile iskemik felç modeli için 16 hayvan kullanın.
  2. Tüm aletleri dezenfektan çözeltisinde 24 saat sterilize edin (%0,5 klorheksidin biglukonat, %70 etanol).
  3. Sıçanları kasa içi enjeksiyonla anestezi yapın; tiletamin 15 mg/kg ve zolazepam 15 mg/kg + ksilazin hidroklorür 10 mg/kg karışımıyla (kurum tarafından onaylanmış protokollere uygun olarak).
  4. Anestezinin cerrahi aşamasına ulaşıldığından emin olun: hayvanın gözünün köşesine dokunun, hayvanın kuyruğunun ucunu sıkıştırın.
    NOT: Bu manipülasyonlardan sonra refleks gözlemlenmediğinde hayvan anestezi olarak kabul edilir.
  5. Ventral boyun bölgesindeki ameliyat alanını koparın.
  6. Hayvanı ameliyat masasına sabitleyin, uzuvları ve üst kesici dişlerini yumuşak turniketlerle sabitleyin.
  7. 0,8 mm çapında polietilen tüpleri 10 cm uzunluğunda borular halinde kesin, ardından polietilen tüpün ucunu metal bir boruya geçirip sıcak suya (90 °C) batırarak ucundan yaklaşık 5 mm genişliğinde bir stabilizator spiral bükürün. Tüpü heparin (50 ME) ile doldurun. Spiralin karşı ucunu bir balıkçı misinası parçasından yapılmış bir tıpla kapatın.
    NOT: Kateter tıbbi kalitede polietilen tüplerden yapılmıştır. Kateteri tutarken bükülmekten veya sıkıştırmaktan kaçının.

2. Karotis arter kateterizasyonu

  1. Hayvanın boynunun ventral tarafında yaklaşık 5 mm uzunluğunda bir kesi yapın.
  2. Boyun kasını forseps ile dissekse edin. Karotis arterinin dış ve iç karotis arterlere dallandığı alanı açın.
  3. Trakea boyunca uzanan atarderi bul. Arteriz boyunca uzanan vagus sinirine dokunmadan bağ dokusu kılıfından pensle dikkatlice serbest bırakın.
  4. Dış karotis arterin bir bölümünü izole etmek için forseps kullanın.
  5. Ortak karotis arterinin bifurkasyonuna 3-5 mm kuyoda geçici bir bağ yerleştirin.
  6. Dış karotis arteriye, biri bifurkasyondan hemen sonra, diğeri ise bifurkasyondan 4 mm uzaklıkta distal olmak üzere iki ligatur yerleştirin.
    NOT: Kateter yerleştirme bu iki bağ arasında yapılacaktır. Bifurkasyondan hemen sonra yerleştirilen bağ, kateteri damarda sabitler.
  7. İç karotis arteriye, ortak karotis arterinin bifurkasyonuna bir geçici ligatür kranial yerleştirilin.
  8. İkifrakasyondan sonra pterigopalatina arterine bir ligatür yerleştirin.
    NOT: 2.7 ve 2.8. adımlarda ligaturlar uygulanırken, ortak karotis arterinin ana gövdesinin arkasında gizlenmiş kollaterallerin varlığı nedeniyle kanama meydana gelebilir. Bu durumda, bağlanmaları gerekir.
  9. Ligaturlar arasında dış karotis arterinde makasla bir kesi yapın. Hazırlanan kateteri (adım 1.7) damarda oluşan deliğe yerleştirin ve ortak karotis arterine yönlendirin.
  10. Distal ligatürü serbest bırakın ve kateteri damar boyunca daha aşağı iterek ortak karotis arterine girer. Kateter içeride olan dış karotis arterinin kesitine dikkatlice iki bağlayıcı bağlayın. Üçüncü ligatürü kateterin önüne yerleştirin ve onu da bağlayın.
    1. Kateteri yumuşatıcı halkaya bağlayıcı ile sabitleyin. Karotis ve dış karotis arterlerden bağları çıkarın.
      NOT: Kateter basılırken, damardan kan sızabilir.
  11. Damardan kan sızması durumunda, damardaki delik ile üçüncü ligatür arasına çift bağlanmalar yerleştirilir.
  12. Sabit kateteri oluklu iğne yönlendiricisi ile oluk kısmına yönlendirin.
  13. Ventral yarayı 4.0 dikiş malzemesiyle dikin. Sürekli dikiş kullanın.
  14. Derinin dorsal tarafını kateterin etrafına 4.0 dikiş malzemesi ile sıkıca dikin. Sürekli dikiş kullanın. Kateterin dış yüzeyine bir parça yapıştırıcı alçı takın ve daha sağlam bir sabitleme için dikişe bağlayın.
  15. Antibiyotik siprofloksasin 5 mg/kg dozda kas içi uygulanır.

3. CAE grup hayvanlarında odaklı beyin iskemi modellemesi

  1. Fare kateterizasyonundan yirmi dört saat sonra, hayvanı uyanık bir duruma getirerek laboratuvar hayvan immobilizatoruna yerleştirilin; böylece oğa yerleştirilen katetere erişilebilsin.
  2. 0,5 mL tuzlu çözelti (%0,9 NaCl) ile dolu bir şırıngayı 30 G iğne ile infüzyon pompasına yerleştirin.
  3. Şırınga iğnesini boş bir polietilen katetere (100 μL kapasiteli) bağlayın. Polietilen kateterin diğer ucunu implante edilen katetere bir adaptör ile bağlayın.
    NOT: Doğru kateter implantasyonu ve trombüsün olmaması, implante edilen kateterden gelen heparinin hava içeren katetere aktarılmasıyla ve havanın hafifçe sıkışmasına neden olduğunda kanıtlanır. Bunun nedeni, farenin kan basıncının bağlı kateterdeki hava basıncını aşmasıdır.
  4. İnfuzyon pompasında enjeksiyon hızını 10 μL/dakika olarak ayarlayın. İnfuzyon pompasının enjeksiyon hacmini 120 μL olarak ayarlayın.
  5. İnfuzyon pompasını çalıştırın. Polietilen kateterden 100 μL hava ve 20 μL tuzlu çözelti (%0,9 NaCl) enjekte edin.
    NOT: Enjeksiyon işlemi 10 dakikalık bir süreçtir. Bu sırada hayvanı gözlemleyin. Enjeksiyon sırasında hayvan immobilizatoru ses çıkarabilir, kemirebilir veya kazabilir.
  6. Hayvanı immobilizatordan çıkarın.
  7. Hayvanın nörolojik durumunu hemen 0-5 puanlık bir ölçekle değerlendirin: 0 = nörolojik açığı yok, 1 = ön uzuvu tamamen düzeltememek, 2 = rotasyon, 3 = uzuv desteği kaybı, 4 = depresif bilinç seviyesinde kendiliğinden yürüme yok ve 5 = ölüm.
    NOT: Daha ayrıntılı bir açıklama için kaynak15'e bakınız. Bir hayvanın hava verildikten hemen sonra nörolojik bozukluk göstermemesi mümkündür. Bu, hayvanın anatomik özellikleri veya yüksek tansiyon nedeniyle tıkanıklığın gerçekleşmediğini gösterir.
  8. Nörolojik semptomlar yoksa hayvanı deneyden dışlayın.
    NOT: CAE olan farelerde nörolojik defisit ölçeğinde 1-4 puan gösterilir. Çoğu zaman, uzuv desteğinin kaybı ya da depresif bir bilinç seviyesinde kendiliğinden yürümemektir.
  9. Antibiyotik siprofloksasin 5 mg/kg dozda kas içi uygulanır.

4. Fizyolojik parametrelerin değerlendirilmesi

  1. CAE'den bir saat sonra, hayvanın nörolojik durumunu 0-5 puanlık bir ölçekle değerlendirin: 0 = nörolojik eksiklik yok, 1 = ön uzuvu tamamen düzeltememek, 2 = dönme, 3 = uzuv desteğinin kaybı, 4 = depresif bilinç seviyesinde kendiliğinden yürümemek ve 5 = ölüm15.
    NOT: 1 saat sonra, hava baloncuğu hızla yeniden emildiği için hayvan herhangi bir belirti göstermeyebilir; bu da arterial embolizasyonun yetersiz olduğunu gösterir.
  2. Nörolojik semptomlar olmadıkta, CAE'den 1 saat sonra hayvanı deneyden dışlayın (nörolojik defartıölçeğinde 0 puan olan fareler, 15).
  3. Antibiyotik siprofloksasini 5 mg/kg dozda kas içi 24 saat ve 48 saat sonra uygulanır.
  4. Fizyolojik parametrelerin değerlendirilmesi için sahte grup ve CAE grubundan hayvanları rastgele izlemek.
  5. Hayvanları CAE'den hemen önce ve CAE'den sonra 3 saat, 24 saat, 4 gün ve 7 gün içinde Sartorius tartısında gram doğruluğuyla tartın.
  6. CAE'den hemen önce ve CAE'den sonra 3 saat, 24 saat, 4 gün ve 7 gün içinde 32 °C ile 42 °C arasında çalışma aralığına sahip dijital termometre kullanarak sıçanların rektal vücut sıcaklığını ölçin.
  7. CAE'den hemen önce ve CAE'den sonra 3 saat, 24 saat, 4 gün ve 7 gün sonra, bilgisayarlı sistemde kuyruk manşeti kullanarak sistolik kan basıncını ve kalp atış hızını invaziv olmayan şekilde ölçün; kan basıncı ve solunum parametrelerini kaydetmektir.
    1. Isıtma pedini açın ve 40 °C sıcaklığa kadar ısıtın.
    2. Hayvanı immobilizatora yerleştirin ve ısıtma pedinin üzerine yerleştirin. Hayvanın 3-5 dakika sakinleşmesine izin verin.
    3. Sonra, hayvanın kuyruğuna, kuyruğun tabanından 2-3 cm uzaklıkta, kardiyovasküler parametreleri ölçmek için sensörlü bir manşet yerleştirin.
    4. Transdüserin yerleşimini doğrudan ventral kuyruk arterinin altına ayarlayın.
    5. Sinyalin stabil olduğundan ve kalp atış hızının programda gösterildiğinden emin olun. Sinyali kaydetmeye başlayın.
    6. Manşet basıncı birikmesini açın.
    7. Manşet basıncı tamamen boşalana kadar nabız ve sistolik kan basıncını kaydedin.
    8. Hayvanın kalp atış hızı sinyalinin geri dönüşünün net bir şekilde gösterildiğinden emin olun.
    9. 4.4.3-4.4.5 adımlarını tekrarlayın. İki kez daha ve hayvanı immobilizatordan serbest bırakın.
    10. Üç ölçümden ortalama nabız ve sistolik kan basıncını hesaplayın.
  8. CAE'den hemen önce ve CAE'den sonra 3 saat, 24 saat, 4 gün ve 7 gün içinde bilgisayarlı bir sistem kullanarak kan basıncını ve solunum parametrelerini kaydetmek için ölçün.
    1. Hayvanı bir elinizde, hayvan için doğal bir pozisyonda sabitleyin.
    2. Hayvanın burnuna bağlı tüplü bir maske yerleştirin.
      NOT: Hayvanın maskeye nefes almaya alışması zaman alacaktır.
    3. Hayvanın sakinleştiğinden emin olun.
    4. 10 saniyelik kayıt solunum hacmi ve solunum hızı.
    5. Kayıt sırasında hayvanın iç çekmediğinden veya yutmadığından emin olun.
    6. 4.5.2-4.5.3 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
    7. Üç ölçümden ortalama solunum hacmi ve solunum hızını hesaplayın.
    8. Solunum dakikası hacmini şu formülle hesaplayın:
      Dakika solunum hacmi = Solunum hızı × Solunum hacmi.

5. Fonksiyonel ve davranışsal parametrelerin değerlendirilmesi

  1. Hayvanın nörolojik durumunu 0-5 puan ölçeğiyle değerlendirin: 0 = nörolojik açığı yok, 1 = ön uzuvu tamamen düzeltememek, 2 = rotasyon, 3 = uzuv desteği kaybı, 4 = depresif bilinç seviyesinde kendiliğinden yürümemek, 5 = ölüm15.
  2. CAE'den hemen önce ve CAE'den sonra 3 saat, 24 saat, 4 gün ve 7 gün içinde bir Rota-Rod üzerinde motor fonksiyon ve koordinasyonu değerlendirin.
    1. Hayvanları Rota Rod cihazında test için eğitin.
      1. Hayvanı sabit bir çubukta 5-30 saniye koyun.
      2. Sabit bir çubuğu en az 10 saniye tutabilen hayvanlar, yaklaşık 30 saniye minimum ivmelenme ile dönen bir çubukta çalıştırırlar.
      3. Hayvanları, uygun bir hızda dönen bir kamış üzerinde özgürce durabilene kadar eğitmeye devam edin.
    2. Hayvanları 7 cm çapında döner yatay bir çubuk üzerine en az 1 rpm hızda yerleştirin.
    3. Her 10 saniyede bir 1 rpm'den maksimum 60 rpm'ye kadar hızlanmayı başlatın.
    4. Farenin dönen çubukta ne kadar vakit geçirdiği kaydedilsin.
  3. CAE'den hemen önce ve CAE'den sonra 3 saat, 24 saat, 4 gün ve 7 gün içinde bilgisayarlı bir sistem kullanarak fare lokomotor aktivitesini değerlendirin.
    1. Hayvanı açık bir alanın ortasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca kat edilen mesafeyi ve sıçanın aktivite süresini kaydedin.
  4. CAE'den 3 saat, 24 saat, 4 gün ve 7 gün sonra Grip Strength Meter'de ön uzuv tutuş gücünü değerlendirin.
    1. Hayvanı kuyruğundan tutun ve hayvanın ön uzuvlarıyla çubukları tutmasına izin verin.
    2. Hayvanı ızgaraya paralel çekin, ta ki fare ızgarayı bırakana kadar.
    3. Üç deneme yapın ve en yüksek sonucu seçin.

6. S100 kalsiyum bağlayıcı protein B (S100b) seviyesinin değerlendirilmesi

  1. CAE modellemesinden önce, CAE'den 24 saat ve 7 gün sonra sıçanlarda serum S100b seviyelerini ölçün.
    1. Hayvanı laboratuvar hayvan immobilizatoruna yerleştirin.
    2. Isıtma pedini açın ve 40 °C sıcaklığa kadar ısıtın.
    3. Hayvanı ısıtma yastığı üzerindeki laboratuvar hayvan immobilizatoruna yerleştirin. Hayvanın sakinleşmesi için 5 dakika bekleyin.
    4. Hayvanı yan yatağa koy.
      NOT: Kuyruğun üzerinde kuyruk damarı görünür olmalıdır.
    5. Kaudal vene intravenöz kateter yerleştirin.
    6. 1.5 mL'lik bir tüpten 1 mL kan alın.
    7. Kanı oda sıcaklığında 40 dakika bekletin.
    8. Kan örneğini 4 °C'de 1500 x g hassasiyetinde 15 dakika boyunca santrifüj yapın.
    9. Serumu otomatik pipetle ayrı bir 1.5 mL tüpte toplayın.
      NOT: Serum berrak ve şeffaf olmalı, eritrositlerin kırmızı karışımı olmamalıdır.
    10. Serumu uygun ELISA kiti kullanarak enzim bağlantılı immünosorbent testi (ELISA) ile analiz edin.

7. Kateter çıkarma

  1. Kateter çıkarma işlemini CAE'den 24 saat sonra, 5. adımdaki testlerden sonra gerçekleştirin.
    1. Hayvanları, 1-2 dakika boyunca bağlantılı gaz anestezi sistemi ve oksijen konsantratörü ile inhalasyon odasına yerleştirin; odada izofloran beslemesi %2,5-3,5 hacimde, oksijen besleme hızı 3 L/dakika olarak yerleştirilir.
    2. Hayvanı, 1.0-2.0 L/dakika oksijen akış hızıyla %2-3 oranında izofluran dozlama modunda maske gaz ile ısıtıcı pede (37,5 °C) aktarın.
    3. Bayrağı yara dikişini kesmeden veya katetere zarar vermeden kesin.
    4. Kateterin dış ucunu temizleyin, dezenfektan çözeltisi ile (%0,5 klorheksidin biglukonat ve %70 etanol) tedavi edin.
    5. Önceki ameliyattan kalan dikişi boynun ventral tarafından çıkarın. Kesi boyunca, penseps kullanarak kateter sarmalını nazikçe izole edin.
    6. Kateterin uzun ucunu ventral kesi üzerinden çekin.
    7. Bifurkasyon ile kateter yerleştirme bölgesi arasındaki dış karotis arteriye, sıkılaştırmadan düğümlü bir bağ yerleştirin.
    8. Kateteri bağlayan düğümleri dikkatlice kesin, kateteri forsepsle çıkarın, damardaki düğümü sıkın ve tekrar bağlayın.
    9. Bağ uçlarını kesin ve yarayı dikin. Sürekli dikiş kullanın.

8. Trifenyltetrazolium klorür boyama değerlendirmesi

  1. Oklüzyondan 24 saat sonra sahte gruptan 6 ve CAE grubundan 6 hayvana, CAE'den sonraki 7. gün ise sahte gruptan 6 hayvana ve CAE grubundan 10 hayvana, 15 mg/kg tiletamin ve 15 mg/kg zolazepam + 10 mg/kg ksilazin hidroklorürür injekte ederek terminal anestezi uygulanır.
  2. Anestezinin cerrahi aşamasının 1.3. adımda açıklandığı gibi sağlandığını doğrulayın.
  3. 2 mL şırınga ve 24 G iğne ile kaudal vena kavadan tam kan örneği alın.
  4. Kafatasının dorsal tonozunu beyin dokusuna zarar vermeden açın.
  5. Dura mater'i inceleyin.
  6. Beyni mikrotom bıçağı ile frontal lobdan başlayarak 2 mm kalınlığında frontal dilimlere kesin.
  7. Bölümleri mikroskop slaytına yerleştirin.
  8. Dilimleri %1 triphenyltetrazolium klorür (TTC) çözeltisine yerleştirin ve termostatta 37 °C'de 10-12 dakika boyunca koyun.
  9. Tüm beyin bölümlerini inceleyin. TTC boyama renk değişimini gözlemleyin.
    NOT: Hasar görmemiş dokular parlak pembe boyanırken, lezyon dokular soluk pembe boyanır.
  10. Dilimleri her iki taraftan fotoğraflayın.
  11. Dilimleri %10 nötr tamponlu formalin çözeltisine sabitleyin.
  12. Bilimsel görüntü analizi yazılımında odak lezyonun alanını tahmin edin.

9. Hematoksilin ve eozin boyama değerlendirmesi

  1. Artan bir etanol pilinde (%70, %80, %100) sabit beyin dilimlerini dehidratla kullanın.
  2. Susuz dilimleri parafine batırın ve 7 mm kalınlığında dilimler yapın.
  3. Bölümleri hematoksilin ve eosin ile boyan.
  4. Geçirimli ışık mikroskobu kullanarak kesitlerin mikroskobik analizini yap.

10. İstatistiksel analiz

  1. İstatistiksel programda istatistiksel analiz yapın.
  2. Betimleyici istatistikler uygulayın (ortalamanın ortalama ± standart hatasını hesaplayın) ve sonuçları görselleştirmek için grafikler yapın.
  3. Her grubun normalliğini kontrol ettikten sonra, Duncan'ın rütbe kriterini kullanarak birden fazla karşılaştırma yapın.
  4. %5 anlamlılık seviyesinde farkları belirleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hayatta kalma ve genel durum
Hava baloncuğu uygulandıktan hemen sonra, tüm farelerde birkaç saniye boyunca belirgin bir titreme ve tüm motor aktivitelerin durması ve 1-2 dakika boyunca bilinç kaybı yaşandı. Bazı hayvanlar bilinç kazandıktan sonra 10-15 dakika boyunca patilerinin desteğini kaybetti.

CAE'den 3 saat sonra hayvanların hayatta kalma oranı %100 idi, ancak 24 saat sonra sağkalım oranı %80'e düştü ve 3. gün %60'a ulaştı....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

MCAO, sıçanlarda fokal iskemik felci modellemede yaygın bir yöntemdir ve trombus oluşumu, orta beyin arterinin lokal spazmı ve filament2 ile geçici tıkanma yoluyla sağlanır. Bu modellerin amacı (1) standart lezyon hacmi vealan 17 ile sinir beyindokusu 16'nın fokal apoptozunu sağlamak, (2) hayvanların nörolojik eksikliğini 2-7 günboyunca izlemektir. 18.

Hava yönetimi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Rusya Bilim Vakfı tarafından desteklendi, proje no. 25-15-00037.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2 mL iğneli 3 bileşenli şırınga  LEIKO52322223G
Aladdin Tek infüzyon pompasıDünya Hassas AletleriAL-1000
SiprofloksasinPharmavet3897744%5 siprofloksasin çözeltisi
Bilgisayarlı sistem PowerLab 8/35 Sistemler3508-1090
DezinApteka.ru%0,5 klorheksidin biglukonat %70 etanol içinde
Dijital termometreB.Well Swiss AGLOT 0413
Elektronik dinamometre Kavrama Güç ÖlçeriBioMed Easy Technologies007231024415MC01
S100 Kalsiyum Bağlayıcı Protein B (S100B) için ELISA KitiCLOUD-CLONE CORP.(CCC)SEA567Ra48T
Balık oltasıÇapı 0,9 mm
Gaz anestezi sistemiUGO BASILE 21100
GraphPad istatistiksel yazılımıPrizmav.10
Oluklu İğne YönetmeniFisher ScientificKatalog no. 11-0012,7 cm
HeparinEndopharm. Moskova Endokrin Tesisi30122
ImageJUlusal Sağlık Enstitüleri ve Optik ve Hesaplamalı Enstrümantasyon Laboratuvarı
İnsülin şırıngasıSFM Hastane Ürünleri1603030.5 mL, U-100, 30G
Damar içi kateterKD TıpG24
İzofluran (İzoflurin)Vetpharma100 mL, 1000 mg/kg
Laboratuvar hayvanları için immobilizator laboratuvar hayvanlarıAçık BilimAE1001-R1
Işık mikroskobuZEISSAxio Scope.A1
Işık mikroskopisi slaytlarıTermo Bilimsel15442933
Tıbbi sınıf polietilen mikro boruScientific Commodities Inc.BB31695-PE/4İç çap: 0,76 mm
Tıbbi steril gazlı bezlerYeni hayat 45x29 CM
Mikro tüpSARSEDT AG & Şirket KGS0443781.5 mL
Mikropipet Eppendorf araştırma artıEppendorf200 µ L
Mikroskop slaytlarıFisher Scientific11562203
Mikrocerrahi forseps (kavisli)Kazan Tıbbi Aletler TesisiF0106
Mikrocerrahi penseps (düz)RWD Yaşam BilimleriF11029-11
Mikrotom bıçaklarıTermo Bilimsel3052835MX35 Premier+
Çok Koşullu SistemTSE Sistemleri131202-10
Nötr tamponlu formalinEtek1072024pH 6,8-7,2 
Emilmez Cerrahi Dikiş LavsanLintex2022-01
İridektomi için oftalmik makasCM InstrumenteAJ-410-05
Oksijen konsantratörüSilahlıYYT327009607F-3L
Fosfat tamponuAMRESCO2120C462
Piptte uçlarıServicebio200 µ L
FarelerLaboratuvar Hayvan Fidanlığı'ndan alınmıştır Pushchino" (www.spf-animals.ru), Rusya Bilimler Akademisi'ne bağlı Shemyakin-Ovchinnikov Biyoorganik Kimya Enstitüsü.
Soğutmalı Laboratuvar Çok Fonksiyonlu SantrifüjEppendorf5804 R
Rota-Rod Rotamex-5 COLUMBUS ENSTRÜMANTLARI210426
Makas METZENBAUM Medstandart-InstrumentMT-H-256
Cerrahi dikiş malzemesiYENIDEN UYARLANDI114/0042011124Kaproag 4/0
Cerrahi masaVetKormTorgVETBOT STL-1, TD00472
TelazolZoetis67291350 mg/mL tiletamin ve 50 mg/mL zolazepam 5 mL içinde
Trifeniltetrazolyum klorürDia-MTTC1809
KsilazinNITA-FARM15150mL'de %2 ksilazin hidroklorür

Kaynaklar

  1. Søyland, M. H., Tveiten, A., Eltoft, A., Øygarden, H., Varmdal, T., Indredavik, B., et al. Wake-up stroke and unknown-onset stroke: Occurrence and characteristics from the nationwide Norwegian Stroke Register. Eur Stroke J. 7 (2), 143-150 (2022).
  2. Li, Y., Zhang, J. Animal models of stroke. Animal Model Exp Med. 4 (3), 204-219 (2021).
  3. Brunner, C., Korostelev, M., Raja, S., Montaldo, G., Urban, A., Baron, J. C. Evidence from functional ultrasound imaging of enhanced contralesional microvascular response to somatosensory stimulation in acute middle cerebral artery occlusion/reperfusion in rats: A marker of ultra-early network reorganization. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1690-1700 (2018).
  4. Buetefisch, C. M., Wei, L., Gu, X., Epstein, C. M., Yu, S. P. Neuroprotection of low-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation after ischemic stroke in rats. Ann Neurol. 93 (2), 336-347 (2023).
  5. Jin, R., Zhu, X., Li, G. Embolic middle cerebral artery occlusion (MCAO) for ischemic stroke with homologous blood clots in rats. J Vis Exp. (91), e51956(2014).
  6. Shpetko, Y. Y., Filippenkov, I. B., Denisova, A. E., Stavchansky, V. V., Gubsky, L. V., Limborska, S. A., et al. Isoflurane anesthesia's impact on gene expression patterns of rat brains in an ischemic stroke model. Genes. 14 (7), 1448(2023).
  7. Toung, T. J. K., Mehr, N., Mirski, M., Koehler, R. C. Embolic occlusion of internal carotid artery in conscious rats: Immediate effects of cerebral ischemia. Physiol Rep. 11 (4), e15613(2023).
  8. Yan, J., Liu, Y., Zheng, F., Lv, D., Jin, D. Environmental enrichment enhanced neurogenesis and behavioral recovery after stroke in aged rats. Aging-US. 15 (18), 9453-9463 (2023).
  9. Jin, X., Morais, A., Imai, T., Lamb, J., Nagarkatti, K., Boisserand, L. Determinants of outcome after endovascular middle cerebral artery occlusion in rats in the SPAN trial. Stroke. 56 (9), 2734-2747 (2025).
  10. Feng, Y., et al. Activation of testosterone-androgen receptor mediates cerebrovascular protection by photobiomodulation treatment in photothrombosis-induced stroke rats. CNS Neurosci Ther. 30 (2), e14574(2024).
  11. Gubskiy, I. L., et al. MRI guiding of the middle cerebral artery occlusion in rats aimed to improve stroke modeling. Transl Stroke Res. 9 (4), 417-425 (2018).
  12. Gupta, S., Sharma, U., Jagannathan, N. R., Gupta, Y. K. Neuroprotective effect of lercanidipine in middle cerebral artery occlusion model of stroke in rats. Exp Neurol. 288, 25-37 (2017).
  13. Gupta, Y. K., Sinha, K., Chaudhary, G. Transient focal ischemia induces motor deficit but does not impair the cognitive function in middle cerebral artery occlusion model of stroke in rats. J Neurol Sci. 203-204, 267-271 (2002).
  14. Shukla, P. K., et al. Neuroprotective effect of Acorus calamus against middle cerebral artery occlusion-induced ischaemia in rat. Hum Exp Toxicol. 25 (4), 187-194 (2006).
  15. Schäbitz, W. R., et al. Synergistic effects of a combination of low-dose basic fibroblast growth factor and citicoline after temporary experimental focal ischemia. Stroke. 30 (2), 427-432 (1999).
  16. Tang, H., et al. Delayed recanalization after MCAO ameliorates ischemic stroke by inhibiting apoptosis via HGF/c-Met/STAT3/Bcl-2 pathway in rats. Exp Neurol. 330, 113359(2020).
  17. Lee, K. Y., Bae, O. N., Weinstock, S., Kassab, M., Majid, A. K. Neuroprotective effect of asiatic acid in rat model of focal embolic stroke. Biol Pharm Bull. 37 (8), 1397-1401 (2014).
  18. Li, L., Rong, W., Ke, W., Hu, Z., Yip, S. P., Tong, K. Y. Muscle activation changes during body weight support treadmill training after focal cortical ischemia: A rat hindlimb model. J Electromyogr Kinesiol. 21 (2), 318-326 (2011).
  19. Palikov, V. A., et al. Experimental model of cerebral arterial air embolism in conscious rats. Bull Exp Biol Med. 177 (5), 668-672 (2024).
  20. Kusuda, K., Ibayashi, S., Sadoshima, S., Ishitsuka, T., Fujishima, M. Brain ischemia following bilateral carotid occlusion during development of hypertension in young spontaneously hypertensive rats--importance of morphologic changes of the arteries of the circle of Willis. Angiology. 47 (5), 455-465 (1996).
  21. Webster, J., Osborne, S., Rickard, C. M., Marsh, N. Clinically-indicated replacement versus routine replacement of peripheral venous catheters. Cochrane Database Syst Rev. 1 (1), CD007798(2019).
  22. Okuyama, S., et al. The arterial circle of Willis of the mouse helps to decipher secrets of cerebral vascular accidents in the human. Med Hypotheses. 63 (6), 997-1009 (2004).
  23. Mamo, Y. A. Cerebrovascular effects of vasoactive drugs: in vitro, in vivo and clinical investigations. Medicine. , 73874537(2015).
  24. Stangeland, H., Orgeta, V., Bell, V. Poststroke psychosis: A systematic review. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 89 (8), 879-885 (2018).
  25. Mercier, E., et al. Predictive value of S-100β protein for prognosis in patients with moderate and severe traumatic brain injury: Systematic review and meta-analysis. Br Med J (Clin Res Ed). 346, f1757(2013).
  26. Baig, M. U., Bodle, J. Thrombolytic Therapy. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2025).
  27. Murphy, R. P., Donnellan, J. A High-pressure solution for a high-pressure situation: Management of cerebral air embolism with hyperbaric oxygen therapy. Cureus. 11 (9), e5559(2019).
  28. Heinrichs, S. C., Koob, G. F. Application of experimental stressors in laboratory rodents. Curr Proto. Neurosci. Chapter 8 (Unit 8.4), (2006).
  29. Emms, H., Lewis, G. P. Sex and hormonal influences on platelet sensitivity and coagulation in the rat. Br J Pharmacol. 86 (3), 557-563 (1985).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Gaz Embolisinme ModeliN ron l mDavran sal BozukluklarOtonom BozukluklarHistopatolojik De i imlerPreklinik al malar
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.