Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Koroid pleksus epitelinin ve endotelinin ayrı analizi için insan kan-beyin-omurilik sıvı bariyerinin gelişmiş bir ortak kültür modeli

430 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69275

⸱

28 Kasım 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 3Department of Medical Statistics, Biomathematics and Information Processing, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

Bu makalede

Özet

Koroid pleksusun insan epitel ve endotel hücrelerinin ortak kültürü, kan-serebrospinal sıvı bariyerinin gelişmiş bir in vitro modelini oluşturmak için kuruldu. Epitel ve endotelin ayrı izolasyonunu seçilmiş koşullarda sonraki RNA hazırlığı ve transkripsiyonel analizi için tanımlıyoruz.

Özet

Yüksek perfuzlu koroid pleksus (CP), beynin ventriküler sisteminde yer alır ve bir kuboid epitelyum ile fenestratlı endotelyum dahil olmak üzere birkaç yapısal bileşenden oluşur ve kan-beyin-omurilik sıvısı bariyerinin (BCSFB) bulunduğu yerdir. CP'yi in vitro incelemek için çeşitli hücre kültürü düzenlemeleri düşünülebilir. Laboratuvarımız tarafından insan epitelyal CP papilloma (HIBCPP) hücrelerine dayanan, güçlü bariyer fonksiyonuna sahip ters hücre kültürü filtre modeli oluşturulmuş ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Son zamanlarda, stabil bir ölümsüzleştirilmiş insan CP endotel hücre hattı (iHCPEnC) üretebildik. Her iki hücre hattını birleştirerek, yalnızca HIBCPP hücrelerine kıyasla artan bariyer fonksiyonu geliştiren gelişmiş fonksiyonel iki hücre tipi bir model oluşturduk. Bu model hem CP epitelini hem de endotelini temsil ettiğinden, enfeksiyon, iltihap veya diğer durumlarda iki hücre tipi arasındaki etkileşimin incelenmesine olanak tanır. Bu protokolde, epitel ve endotel hücrelerin transkripsiyonel analizler için ayrılmasıyla birlikte bu iki hücre tipi modeli kurma yöntemlerini açıklıyoruz. Epitel ve endotel için özel PCR primerlerini tanımlıyoruz; bunlar iki hücre tipi arasında olası çapraz kontaminasyonu tespit etmeye hizmet ediyor. Bu modelde CP endotelinin epitel üzerindeki olası etkisini inflamatuar koşullarda incelemek için, lipopolisakkarit (LPS) tedavisi bağlamında seçilen genlerin ifade seviyeleri HIBCPP hücre fraksiyonunda analiz edildi. İleri CP in vitro modeli ve epitelyal ile endotel yanıtlarının ayrı ayrı analiz edilmesi imkanı, CP'nin biyolojik ve patolojik fonksiyonlarını içeren hücresel süreçler üzerine araştırmalar için önemli ilgi teşkil etmektedir.

Giriş

Koroid pleksüs (CP), beynin dört ventrikülünde yer alan farklı hücre popülasyonlarının yüksek derecede damarlanmış bir konglomeratıdır. Diğer işlevlerin yanı sıra, merkezi sinir sistemi (CNS) ile kan arasında fizyolojik bir bariyer olan yani kan-serebroomurilik sıvısı bariyeri (BCSFB) olarak görev yapar ve örneğin kan içinde dolaşan enfeksîyonel maddelerin beynin önlenmesini sağlar. CP, polarize epitel hücreleri dahil olmak üzere, dar ve yapışma bağlantıları ile desmozomlar içerir ve bazal membran üzerinde oturur. Epitel hücrelerinin yüzeyi, luminal yüzeydeki mikrovillusların varlığıyla büyütülür. Fenestralı endotel kapilyarları, fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri gibi bağ dokularıyla çevrili, bazazmembranı 1,2,3'ün altında yer alır. Yakın zamanda, CP endotel hücrelerinin epitel hücreleriyle birlikte BCSFB bütünlüğünü artırabildiği ve bu nedenle iltihap süreçleri sırasında beyin korumasında rol oynayabileceğibildirilmiştir 4,5.

Bugüne kadar, insan epitelial CP papilloma (HIBCPP) hücrelerinin ters kültürü, yüksek transepiteliyal elektrik direnci (TEER) değerlerine ve güçlü bariyer fonksiyonuna sahip bir insan BCSFB'sini taklit etmek için en çok kullanılan in vitro modeldir. Hücresel işlevleri daha iyi anlamak ve aynı zamanda hayvan deneylerinden kaçınmak için in vitro deneylerden mümkün olduğunca çok bilgi almak önemlidir. İlk stabil ölümsüzleştirilmiş insan CP endotel hücre hattı (iHCPEnC) yakın zamandalaboratuvarımızda kuruldu 6,7. HIBCPP hücreleri ve iHCPEnC yardımıyla, BCSFB'yi daha gelişmiş bir şekilde taklit eden bir ortak kültür in vitro modeli oluşturabiliyoruz 8. Bu iki hücre tipi modeli kullanılarak, HIBCPP hücreleri ile iHCPEnC'nin birlikte kültürünün, yalnızca HIBCPP hücrelerine kıyasla TEER değerlerinin artmasına yol açtığını gösterebiliriz. Belirtmek önemlidir ki, iHCPEnC tek başına TEER 7,8 geliştirmez. Bu modelde kullanılan iki hücre tipinin ayrı hazırlanması ve sonraki analizleri, sağlıklı ve hastalıklı koşullarda etkileşimlerini incelememize olanak tanır.

Burada bu hedefe ulaşmak için iki farklı yaklaşımı tanımlıyoruz. Temel, her iki durumda da yaklaşımın HIBCPP hücrelerinin ters hücre kültürü modeline dayanmasıdır (Şekil 1). Yöntem 1, "doğrudan birlikte kültür" yöntemi, her iki hücreyi tek bir filtre girişinde içerir. HIBCPP hücreleri, iHCPEnC standartşekilde tohumlanmadan önce ters şekilde yetiştirilir ve standart 7,8 şeklinde üretilir. Yöntem 2, "membran-insert" kültürü, burada filtre insertlerinde kullanılan özelliklere sahip ayrı bir zar ekledik. Bu ek zar, HIBCPP hücrelerinin zaten tersleşmiş kültürde büyüdüğü bir filtre insertine yerleştirilir. iHCPEnC, standart kültür yöntemiyle ek membrana tohumlanıyor.

Hücrelerin RNA analizi için ayrılması, CP epitelinin ve endotelinin belirli koşullarda transkripsiyonel reaksiyonuna dair içgörüler sağlar. HIBCPP hücreleri ve iHCPEnC için özel PCR primerlerini tanımlıyoruz; bu primerler, her iki hücre tipinin başarılı ve temiz ayrılmasının doğrulanmasını sağlıyor. Lipopolisakkarit (LPS) tedavisinin ardından, enflamatuar koşullarda endotel varlığında CP epitelinin belirgin yanıtlarını incelemek için tarif edilen modelleri kullanıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. HIBCPP hücreleri

NOT: Aşağıda, HIBCPP hücrelerinin kültürü ve bakımını, ayrıca HIBCPP hücreleriyle ters hücre kültürü filtre eklerinin hazırlanmasını anlatıyoruz. Bu protokol, 12 delikli hücre kültürü filtre insertlerinde HIBCPP hücrelerinin büyümesi için tasarlanmıştır. 24 delikli hücre kültürü filtre insertlerinde HIBCPP hücrelerinin kültürü için ayrıntılı bir protokol ve eşlik eden video daha önceyayımlanmıştır 9.

  1. HIBCPP hücrelerinin kültüre alınması
    1. Oda sıcaklığında (RT) bir HIBCPP hücre şişesi eritin.
    2. Şişenin içeriğini %10 fetal buzağı serumu (FCS) ve 5 μg insülin/mL önceden ısıtılmış ortam (%10 HIBCPP ortamı) içeren 10 mL DMEM/HAMS-F12 ortamı ile yeniden askıya alın.
    3. Yeniden askıya alınmış HIBCPP hücrelerini bir T75 hücre kültür şişesine koyun ve %5CO2 ile 37 °C'de 24 saat kuluçka yapın.
    4. Hücreler tohumlandıktan 24 saat sonra DMSO'yu çıkarmak için termosun ortamını değiştirin.
    5. Hücreleri %90 birleşime kadar kültürleyin, bu adım yaklaşık 2 hafta sürer. Haftada iki kez malzemeyi değiştirin.
  2. HIBCPP hücrelerinin sürekli kültürü
    NOT: Sürekli kültür için, HIBCPP hücrelerini 1:3 oranında yeni T75 hücre kültür şişelerine ayırın.
    1. Kültür ortamını T75 termosundan çıkarın.
    2. Hücreleri bir kez 10 mL PBS ile yıkayın.
    3. PBS'yi kaldırın.
    4. HIBCPP hücrelerini %0,25 Tripsin-EDTA içeren 3 mL yardımıyla ayırın. Bu adım 37 °C'de yaklaşık 10-20 dakika sürer. Bu arada termosu Tripsin-EDTA ile hücre tabakasının tamamen kaplanmasını sağlamak için fırlat.
    5. 7 mL HIBCPP orta madde ekleyin ve RT'de 10 dakika boyunca 50 x g sıcaklıkta santrifüj yapın.
    6. Hücre pelletini 30 mL %10 HIBCPP ortamında yeniden askıya alın ve 3 yeni T75 şişesine yayın.
    7. Hücreleri %90 birleşime kadar kültürleyin; Hücreler yaklaşık 1 hafta içinde birleşmeye ulaşır.
    8. Haftada iki kez malzemeyi değiştirin.
      NOT: HIBCPP hücreleri büyüme engellenmez; bu nedenle, şişe birleşmeye başlar ve hücreler büyümeye devam eder ve çok katmanlar oluşturur.
  3. HIBCPP hücrelerinin ters kültürde tohumlanması
    1. Kültür ortamını T75 termosundan çıkarın.
    2. Hücreleri bir kez 10 mL PBS ile yıkayın.
    3. PBS'yi kaldırın.
    4. HIBCPP hücrelerini %0,25 Tripsin-EDTA içeren 3 mL yardımıyla ayırın. Bu adım 37 °C'de yaklaşık 10-20 dakika sürer. Bu arada termosu Tripsin-EDTA ile hücre tabakasının tamamen kaplanmasını sağlamak için fırlat.
    5. Bu arada, filtre eklerini hazırlayın. 12 kuyruklu filtre yerleştirmelerini ters konumda forseps yardımıyla 6 delikli bir hücre kültür plakasına dönüştürün ve önceden ısıtılmış %10 HIBCPP ortamıyla doldurun. Membranı, her filtre insertinin üzerine bir damla ortam ile önceden ıslatın.
    6. 17 mL %10 HIBCPP ortamı ile tripsinli hücreleri yeniden süspansiyona alın.
    7. RT'de 10 dakika boyunca 50 x g ile santrifüj yapın ve HIBCPP hücrelerini 1 ×10 6 hücre/mL konsantrasyonuna ayarlayın.
      NOT: HIBCPP hücreleri genellikle küçük aglomeratlar oluşturur. Filtre eklerine ekmeden önce tamamen çözülmesi gerekmez. Hücrelerin %90'ının tek olduğundan emin olun.
    8. HIBCPP hücrelerini 4 ×10-5 hücre yoğunluğuyla 12 kuyu filtre eklerinde ters bir şekilde tohumlayın.
    9. Hücre süspansiyonu zar tarafından alınana kadar bekle. 6 delikli hücre kültür plakasının kapağını kapatın.
    10. Ters çevrilmiş insertlerle birlikte plakaları kuluçka makinesine koyun.
    11. Tohumlamadan 24 saat sonra, penseps yardımıyla insertleri doğru yöne döndürerek yeni bir 12 delikli hücre kültür plakası oluşturun. Alt bölmeye 2 ml %10 HIBCPP ortamı, üst bölmeye ise 1 mL koyun.
    12. Hücreleri 5-6 gün boyunca ortam değişikliği olmadan bırakın ve TEER'in belirlenmesine ve ortak kültürün kurulmasına başlayın.

2. TEER'in Belirlenmesi

NOT: TEER değerlerinin belirlenmesi, bir MilliCell ERS2 ve bir chopstick elektrodu yardımıyla gerçekleştirilir. Hesaplama için hücre kültürü filtre eklerinden (Ohmboşluğu) hücre kültürü filtre eklerinden alınan boş ölçüm gereklidir.

  1. Çubuk elektrotunu kuru tutun. Ölçüme başlamadan önce, elektrodu dezenfeksiyon için %80 etanol içinde 10 dakika koyun.
  2. Sonrasında elektrodu PBS ile durulayın.
  3. Ölçüme başlamak: Elektrotun uzun ucunu kuyuğa, kısa ucunu ise tohumlanmış hücreleri içeren filtre girişine yerleştirin.
  4. 12 kuyruklu hücre kültürü filtre insertinin (Ohmörneği) Ohm değerini kaydedin.
  5. TEER şu şekilde hesaplanın: Ohm·cm2 = (Ohmörneği- Ohmboş) × 1.1 cm2.
  6. Ölçüm bittikten sonra elektrodu %80 etanol ile durulayın ve kuru saklayın.
    NOT: Farklı deneysel koşulların ölçümleri veya farklı hücre hatlarının ölçümleri arasında, çapraz kontaminasyonu önlemek için chopstick elektrodu dezenfekte edilip PBS ile durulandırılmalıdır.

3. iHCPEnC

  1. iHCPEnC'yi kültüre taşımak
    1. RT'de bir şişe iHCPEnC erit.
    2. Şişenin içeriğini önceden ısıtılmış 5 mL Tam Klasik Endotel Ortamı (iHCPEnC ortamı) ile yeniden askıya alın.
    3. 500 g'de RT'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Bu arada, yaklaşık 1 dakika boyunca 2 mL Bağlanma Faktörü ile bir T25 hücre kültürü şişesini kaplayın. Bağlanma Faktörünü aspire edin ve iHCPEnC tohumlanana kadar şişeyi bırakın.
    5. Hücre pelletini 5 mL iHCPEnC ortamıyla yeniden askıya alın ve hazırlanmış T25 hücre kültürü şişesine koyun.
    6. 37 °C'de %5CO2 ile 1 hafta boyunca ortam değiştirmeden kuluçka yapın.
  2. iHCPEnC'nin sürekli kültürü
    NOT: Sürekli kültür için, iHCPEnC 1:4 oranında yeni T25 hücre kültür şişelerine bölünün.
    1. iHCPEnC ortamını çıkarın ve hücreleri bir kez 3 mL PBS ile yıkayın. Hücrelerin ayrılmasından kaçınmaya dikkat edin.
    2. PBS'yi aspire edin.
    3. 1 mL Tripsin-EDTA yardımıyla birleşen iHCPEnC'yi ayırın. Bu adım RT'de yaklaşık 3-5 dakika sürer.
    4. Hücreleri 5 mL iHCPEnC ortamında yeniden süspansiyona alın.
    5. 500 g'de RT'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    6. Bu arada, her şişeye 2 mL Bağlanma Faktörü olan 4 yeni T25 termosunu kaplamak.
    7. Hücre pelletini 20 mL iHCPEnC ortamıyla yeniden askıya alın.
    8. Hazırlanan 4 mataşa için hücre süspansiyonundan 5 ml dağıtın.
    9. Yine, hücreleri 1 hafta boyunca ortam değiştirmeden kültürleyin. 1 hafta içinde birleşme noktasına ulaşacaklar.
      NOT: iHCPEnC hücreleri büyüme engellenir; bu nedenle, şişe birleşir ve kalan hücreler yüzer.

4. Ortak kültür deneylerine hazırlıklar

  1. Yöntem 1: "Doğrudan ortak kültür" (epitel ve endotel hücrelerinin her iki tarafta kültürlenmesi) için ek hiçbir şey hazırlamayın.
  2. Yöntem 2: "Membran yerleştirme" yöntemi için aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
    1. Ayrı bir Din-A-4 membranından 11 mm çapında bir delik demirin yardımıyla 12 delikli hücre kültürü filtresi inserti boyutunda zarlar deliklenin.
    2. Deşilmiş zarları Petri kabına koy.
    3. Deliklenmiş zarları ultraviyole (UV) ışığı (UV-C, 254 nm) kullanarak 60 dakika boyunca sterilize edin.
      NOT: Deliklenmiş ve sterilize edilmiş 12 kuyruklu hücre kültürü filtre inserti boyutunda membranlar önceden hazırlanabilir ve steril koşullarda saklanabilir.

5. Ortak kültürü kurmak

NOT: Bu aşamada, HIBCPP hücreleri iki hücre tipi in vitro kültür modeline zaten hazırlanmıştır. HIBCPP hücreleri 5 ila 6 gün boyunca yetiştirilmiştir (1.3.8-1.3.12 adımları karşılaştırın). HIBCPP hücreleri bir TEER (yaklaşık 20 Ohm·cm·cm2) geliştirmeye başlamalıdır.

  1. Her ikisi için, Yöntem 1 ("doğrudan ortak kültür") ve Yöntem 2 ("membran yerleştirme"), %10 HIBCPP ortamını %1 HIBCPP ortamı ile değiştirin. Bu amaçla, 12 kuyruklu bir hücre kültür plakasının bir kuyusuna 2 ml %1 HIBCPP ortamı konulur.
  2. Ters kültür içeren filtre insertini pipet ve forseps yardımıyla boşaltın ve filtre insertini hazırlanmış 12 kuyruklu standart konuma yerleştirin.
  3. Yöntem 2 ("membran-insert") için, filtre eklerini aşağıdaki şekilde hazırlayın:
    1. Deliklenmiş ve sterilize edilmiş zarı, forseps yardımıyla HIBCPP hücreleriyle hazırlanmış 12 delikli filtre insertine yerleştirin.
  4. Hücre kültür plakalarını iHCPEnC'nin tripsizasyonu için tekrar kuluçka içine alın (6. adımda açıklanmıştır).

6. Ortak kültürde iHCPEnC'nin tohumlanması ve yetiştirilmesi

NOT: Aşağıdaki bölümde, 12 delikli hücre kültürü filtre insertlerinde HIBCPP hücreleri ve iHCPEnC'nin ortak kültürünün oluşturulması anlatılır. HIBCPP hücrelerinin ve iHCPEnC'nin 24 delikli hücre kültürü filtre insertlerinde birlikte kültürlenmesi için ayrıntılı bir protokol dahaönce tanımlanmıştır 8. iHCPEnC'yi ayırmadan önce, ortak kültürü gerçekleştirmek için kaç hücre gerektiğini hesaplayın. Bir birleşen T25 hücre kültürü şişesi yaklaşık 5 ×10-5 hücre sağlar.

  1. iHCPEnC içeren birleşen T25 termosunun ortamını çıkarın.
  2. iHCPEnC'yi 3 mL PBS ile yıkayın. Hücrelerin ayrılmasından kaçının.
  3. PBS'yi kaldırın.
  4. 1 mL Tripsin-EDTA yardımıyla birleşen iHCPEnC'yi ayırın. Bu adım RT'de yaklaşık 3-5 dakika sürer.
  5. Hücreleri iHCPEnC ortamında 5 mL/T25 şişede yeniden askıya alın.
  6. Bir Neubauer odasındaki hücreleri say.
  7. 500 × g seviyesinde 5 dakika boyunca RT'de santrifüj yapın.
  8. Hücre pelletini iHCPEnC ortamında 1 ×10 5 hücre/mL nihai konsantrasyona yeniden süsküyle getirin.
  9. Hem Yöntem 1 ("doğrudan ortak kültür") hem de Yöntem 2 ("membran yerleştirme") : 700 μL iHCPEnC (7x105 hücre) tohumu 12 delikli filtre insertinde alın.
  10. Ortak kültür ve kontrollerin TEER değerlerini (yani HIBCPP hücresi ve sadece iHCPEnC kültürleri) ilk kez iHCPEnC tohumlandıktan 24 saat sonra ve ardından günlük olarak izleyin.

7. LPS tedavisi

NOT: Ortak kültürler, yalnızca HIBCPP hücre kültürlerine kıyasla daha yüksek TEER değerleri sunmalıdır (önerilen faktör: 1.5 veya daha üzer).

  1. Deneyler için kurulan hücre kültürü insertlerinin TEER değerlerini ölçmek ve kaydetmek.
  2. %1 HIBCPP ortamında 5 μg/mL LPS içeren bir master karışım hazırlayın.
  3. Her kuyu başına 2 mL %1 HIBCPP ortamı içeren yeni 12 kuyruklu plakalar hazırlayın.
  4. Penetrasyonları forseps ve pipetleme ile boşaltın.
  5. Ekleri hazırlanan kuyulara yerleştirin.
  6. Sırasıyla 1 mL LPS master mix veya %1 HIBCPP ortamı ekleyin (negatif kontrol).
  7. 37 °C'de 4 saat kuluçka yapın.
  8. 8. bölüme geçmeden önce TEER değerlerini ölçün ve kaydedin.

8. HIBCPP hücrelerinden RNA'nın ayrılması ve sonraki transkripsiyonel analiz için iHCPEnC'nin ayrı ayrılması

NOT: İki ayrı hücre fraksiyonu elde etmek ve ko-kültür modelinde kültürlenen hücrelerden çapraz kontaminasyonu önlemek için, hücre fraksiyonları dikkatlice insertten ayrı ayrı kazılır. Her filtre inserti için RNA izolasyonu adımlarını kesintisiz yapın (insertlerin kurumasına izin verilmez).

  1. Filtre insertlerini PBS ile bir kez yıkayın. Bu amaçla, 1,5 mL PBS/well içeren 12 kuyruklu hücre kültür plakaları hazırlanır.
  2. Hücre kültürü filtre yerleştirmelerini pipet ve forseps yardımıyla boşaltın. Insertleri PBS dolu 12 yuvalı hücre kültür plakasına yerleştirin.
  3. Insertlere 1 mL PBS ekleyin.
  4. Yöntem 1'e ("doğrudan birlikte kültür") iHCPEnC ve HIBCPP hücrelerini hazırlamak için aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
    1. PBS'yi insertten çıkarın ve boş ve kuru bir 12 kuyruklu hücre kültür plakasına yerleştirin.
    2. Pipet ucu ve 10-20 μL PBS pipetiyle yukarı aşağı turlama yardımıyla, iHCPEnC kazıma yoluyla insertten ayrılır.
    3. Bu hücre fraksiyonunu 350 μL RNA lizin tamponu içeren 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Hücreleri RNA lüzis tamponu ile doğru karıştırmak için yukarı aşağı pipet yapın.
    4. iHCPEnC fraksiyonunun hasadı tamamlandıktan sonra, inserti aşağı yukarı çevirerek hücre kültür plakasının kapağına çevirin.
    5. HIBCPP hücrelerini iHCPEnC fraksiyonu gibi membrandan çıkarır ve 350 μL RLT-β-merkaptoetanol içeren hazırlanmış 1,5 mL tüpte yerleştirir.
      NOT: Bir durum için birden fazla ko-kültür hazırlanırsa, her insert ve hücre fraksiyonu için 350 μL RNA lizis tamponu alın. Belirli bir koşulun tek hazırlanmış hücre fraksiyonları aynı kolonda ardışık olarak saflaştırılır.
  5. Yöntem 2'ye ("membran yerleştirme") için iHCPEnC ve HIBCPP hücrelerini hazırlamak için aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
    1. Ek zarı penss yardımıyla çıkarın ve 12 delikli hücre kültür plakasının kuru kapağına koyun. 100 μL RNA lizin tamponunu pipetle membrana iHCPEnC lizisi için yerleştirin.
    2. Bu 100 μL lizatı 250 μL RNA lizis tamponu içeren 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve iyi karıştırın.
    3. PBS'yi filtre insertinden çıkarın ve 12 kuyruklu bir hücre kültür plakasının kapağına aşağı yukarıya koyun. Insertin membranına 100 μL RNA lizin tamponu ekleyin ve HIBCPP hücre fraksiyonunu lizize edin.
    4. Bu 100 μL lizatı 250 μL RNA lizis tamponu içeren 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
  6. Üreticinin protokolüne göre RNA izolasyonu yapılmalıdır.
  7. RNA miktarını spektrofotometre kullanarak ölçün.
  8. Üretici tarafından tanımlandığı şekilde RNA örneklerinin ters transkripsiyonu ve qPCR analizini gerçekleştirin.
    NOT: Ortak kültürler HIBCPP hücrelerine kıyasla daha az iHCPEnC içerdiğinden, sonraki analizlere bağlı olarak iHCPEnC'den yeterli RNA'nın izole edilmesi için birkaç 12 delikli filtre inserti gereklidir. Farklı filtre eklerinin RNA lizatları bir havuza getirilmelidir. Ters transkripsiyon ve qPCR daha önce tarif edildiği gibiyapılabilir 6.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolde, Şekil 1'de şematik olarak gösterildiği gibi, hücre kültürü filtre insertlerinde epitel (HIBCPP hücreleri) ve endotel (iHCPEnC) içeren insan CP'sinin iki hücre tipi modelinin adım adım oluşturulmasını açıklıyoruz. Bu model sisteminde, HIBCPP hücreleri filtrenin alt tarafında ters bir şekilde yetiştirilirken, iHCPEnC ya insertin filtresinin üst tarafına ya da insertin membranının üstüne yerleştirilen ikinci bir filtreye yerleştirilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İnsan CP, bariyer oluşturan epitel ve genişletilmiş damar3 endoteli dahil olmak üzere birkaç farklı hücre tipinden oluşur. CP'nin endotel hücreleri fenestratlanmış olsa da, son araştırmalar BCSFB 4,7'de bariyer fonksiyonuna katkılarını göstermiştir. Organlarda endotel ile epitel arasındaki karmaşık etkileşimleri incelemek için, her iki hücre tipinin analizini sağlayan gelişmiş in vitro modeller ge...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, çıkar çatışması olmadığını belirtir.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,25 Tripsin-EDTALife Technologies 25200056
12 kuyu hücre kültür plakası StarLabCC7682-7512
12 kuluk filtre ekleri (3 & mikro; M gözenekleri)Greiner Biyografi Bir665631
24 kuyu hücre kültür plakası StarLabCC7672-7524
24 kuyu filtre yerleştirme  (0.4 µ M gözenekleri)Greiner Biyografi Bir662641
24 kuyu filtre inserti (3 & micro; M gözenekleri)Greiner Biyografi Bir662631
6 kuyu hücre kültür plakası StarLabCC7682-7506
AffinityScript cDNA Sentez Kiti (cDNA sentezi)Çevik600559
Bağlanma FaktörüHücre Sistemleri4ZO-500Complete Classic Endothelial Medium kitinin bir parçası.
Brilliant II SYBR Yeşil qPCR Master Mix (gerçek zamanlı PCR)Çevik600828
Çubuk elektrotuMilliporeMERSSTX01Bu ürün üretimi durduruldu.
Tam Klasik Endotel Ortamı (iHCPEnC ortamı)Hücre Sistemleri4ZO-500Kit, kaplama için malzeme, takviyeler ve Attachment Factor içerir.
DMEM/F-12 (1:1) fenollu (%10 HIBCPP ortam)Thermo Fisher31330-038
DMEM/F-12 (1:1) fenolsuz (%1 HIBCPP ortamı)Thermo Fisher11039-021
Fetal Baldır Serumu (FCS) (%1 ve %10 HIBCPP ortam)Thermo Fisher10270-106
İnsülin (%1 ve %10 HIBCPP ortamı)SigmaI9278
Lipopolisakkarit (LPS)SigmaL3024
MilliCell ERS2 MilliporeMERS00002Bu ürün üretimi durduruldu.
Nanodrop (Spektrofotometre)Termo BilimselND1000Bu ürün üretimi durduruldu.
No. 11 delikli demirWü rth880223211
PBSLife Technologies 14190169
Astar tasarım aracıNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Primers SigmaVC00021
Qiagen RNeasy mikroQiagen74004
RLT+b-ME (Qiagen Rneasy mikro kitinin bir parçası)Qiagen74004
T25 hücre kültürü şişesiSarstedt AG & Co KG83,39,10,002
T75 hücre kültürü şişesiSarstedt AG & Co KG83,39,11,002
TRAKETCH PET 3.0 cc (ayrı membran)SabeuSK4580
UV ışığıCarl RothH469.1

Kaynaklar

  1. Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiol Rev. 93 (4), 1847-1892 (2013).
  2. Schwerk, C., Schroten, H. In vitro models of the choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier: advances, applications, and perspectives. Hum Cell. 37 (5), 1235-1242 (2024).
  3. Ghersi-Egea, J. F., et al. Molecular anatomy and functions of the choroidal blood-cerebrospinal fluid barrier in health and disease. Acta Neuropathol. 135 (3), 337-361 (2018).
  4. Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
  5. Carloni, S., Rescigno, M. Unveiling the gut-brain axis:structural and functional analogies between the gut and the choroid plexus vascular and immune barriers. Semin Immunopathol. 44 (6), 869-882 (2022).
  6. Denzer, L., et al. Transcriptome and functional comparison of primary and immortalized endothelial cells of the human choroid plexus at the blood-cerebrospinal fluid barrier. Int J Mol Sci. 26 (4), 1779(2025).
  7. Muranyi, W., et al. Immortalized human choroid plexus endothelial cells enable an advanced endothelial-epithelial two-cell type in vitro model of the choroid plexus. iScience. 25 (6), 104383(2022).
  8. Herold, R., et al. Protocol for the setup and use of a human choroid plexus endothelial-epithelial two-cell-type in vitro model. STAR Protoc. 3 (4), 101816(2022).
  9. Dinner, S., et al. A choroid plexus epithelial cell-based model of the human blood-cerebrospinal fluid barrier to study bacterial infection from the basolateral side. J Vis Exp. (111), e54061(2016).
  10. Herold, R., et al. Capsule-dependent impact of MAPK signalling on host cell invasion and immune response during infection of the choroid plexus epithelium by Neisseria meningitidis. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 53(2021).
  11. Bernd, A., et al. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plexus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. 32 (9), 2973-2982 (2015).
  12. Dabbagh, F., Schroten, H., Schwerk, C. In vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier and their applications in the development and research of (neuro)pharmaceuticals. Pharmaceutics. 14 (8), 1729(2022).
  13. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nat Rev Neurosci. 16 (8), 445-457 (2015).
  14. Zhang, W. Y., Liu, Y., Zhang, H. Extracellular matrix: an important regulator of cell functions and skeletal muscle development. Cell Biosci. 11 (1), 65(2021).
  15. Clark, A. J., et al. Functional imaging in microfluidic chambers reveals sensory neuron sensitivity is differentially regulated between neuronal regions. Pain. 159 (7), 1413-1425 (2018).
  16. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  17. Augustin, H. G., Koh, G. Y. Organotypic vasculature: from descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science. 357 (6353), eaal2379(2017).
  18. Furtado, A., et al. Circadian rhythmicity of amyloid-beta-related molecules is disrupted in the choroid plexus of a female Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci Res. 101 (4), 524-540 (2023).
  19. Borkowski, J. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving IκBζ in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163(2014).
  20. Wiatr, M., et al. Distinct migratory pattern of naive and effector T cells through the blood-CSF barrier following Echovirus 30 infection. J Neuroinflammation. 16 (1), 232(2019).
  21. Speidel, A., et al. Transmigration of Trypanosoma brucei across an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier. iScience. 25 (4), 104014(2022).
  22. Haas, J., et al. The choroid plexus is permissive for a preactivated antigen-experienced memory B-cell subset in multiple sclerosis. Front Immunol. 11, 618544(2020).
  23. Nishihara, H., et al. Human CD4+ T cell subsets differ in their abilities to cross endothelial and epithelial brain barriers in vitro. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 3(2020).
  24. Erb, U., Schwerk, C., Schroten, H., Karremann, M. Review of functional in vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier in leukaemia research. J Neurosci Methods. 329, 108478(2020).
  25. Ho, K. H., et al. Activation of Wnt/β-catenin signaling is critical for the tumorigenesis of choroid plexus. Neuro Oncol. 27 (1), 106-122 (2025).
  26. Wagenaars, F., et al. Characterization of thyroid hormone transport in a human choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP) as an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier model. Mol Cell Endocrinol. 597, 112449(2025).
  27. Di Tommaso, N., Santopaolo, F., Gasbarrini, A., Ponziani, F. R. The gut-vascular barrier as a new protagonist in intestinal and extraintestinal diseases. Int J Mol Sci. 24 (2), 1470(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Koroid Pleksus EndotelyumuHIBCPP HücreleriÖlümsüzleştirilmiş Endotel HücreleriBariyer FonksiyonuIn Vitro ModelGen Ekspresyon AnaliziLipopolisakkarit Uygulaması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.